KR20230113041A - 물질 p와 메타크릴레이트가 함유된 골조직 재생용 하이드로겔 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 물질 P와 메타크릴레이트가 함유된 골조직 재생용 하이드로겔 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 골조직 재생용 하이드로겔은 물리적·기계적으로 결손된 조직 내 적용 가능하도록 고분자를 화학적으로 설계하여 제조된 것으로, 생체 적합성 및 생체 내 분해 특성으로 결손 조직을 효과적으로 재생할 수 있다.
Description
본 발명은 물질 P와 메타크릴레이트가 함유된 골조직 재생용 하이드로겔 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 생체 적합성 및 생체 내 분해 특성을 가지고, 물리적·기계적으로 결손된 조직 내 적용 가능한 고분자를 형성하여 결손 조직 재생에 적합하도록 물질 P와 메타크릴레이트가 함유된 골조직 재생용 하이드로겔 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
심각한 골 손상의 주요 치료 방법으로는 손상된 골을 고정시키고 환자(자가 이식, autograft)또는 기증자(동종 이식 및 이종 이식, allograft and xenograft)에서 유래된 골을 이식하는 방법이 있다. 그러나, 골의 공급이 수요를 충족할 수 없고 이종 이식은 면역 거부 반응 및 동물 유래 바이러스에 의한 교차 감염을 일으킬 수 있기 때문에 이들 방법을 사용하는데는 한계가 있다. 이에, 부작용 없이 골 형성을 가속시키고 골 파괴를 억제하는 약물을 개발하고자 하는 시도가 있었으나, 아직까지 괄목할 만한 효과를 발휘하는 약물은 개발되지 못하였고, 1990년부터 골 재생을 위한 조직공학적 접근 방법이 새롭게 시도되고 있다.
골 조직 재생을 위한 생체 재료는 골 결손 부위를 지지하고, 골 결손 부위 주위의 자가 조직으로부터 자가 골 재생을 유도할 수 있다. 금속, 세라믹, 고분자 등이 생체 재료 지지체로 사용될 수 있지만, 금속과 세라믹의 사용은 이들의 낮은 생분해성과 불완전한 골조직 재생 효과 때문에 그 사용이 제한적이다.
이러한 문제점을 극복하기 위하여 고분자를 이용한 생체재료 기술이 급속히 발전하였고, 과거 생체불활성 (Bioinert)에서 최근에는 생체적합성 (Biocompatible)을 갖는 재료를 설계 및 개발하고 있으며 다양한 종류의 생체 재료가 연구되고 있다. 이 중 조직 재생용 생체 활성 지지체는 생체 재료 내 생리활성물질이 첨가되어 기존 생체재료의 한계를 극복하며, 조직재생에 유효한 효능을 보여 궁극적으로 결손 조직의 정상화를 목표로 한다.
하지만, 결손 조직을 효과적으로 재생하기 위해서는, 물리적·기계적으로 결손된 조직 내 적용 가능하도록 고분자를 화학적 설계하여야 하고, 생체 적합성 및 생체 내 분해 특성으로 결손 조직 재생에 적합한 환경을 제공해 주여야 한다.
본 발명자들은 본 기술분야의 상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위해 예의 노력한 결과, 생리활성물질인 물질 P와 메타크릴레이트가 첨가되어 있는 하이드로겔이 생체 적합성 물질로써 물리적·기계적으로 결손된 조직 내 적용된 후 생체 내 분해되며, 효과적으로 골 결손 부위를 재생할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 손상된 골조직에 이식되어 손상된 골조직을 효과적으로 재생시킬 수 있는 골조직 재생용 하이드로겔 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 물질 P(Substance P)와 메타크릴레이트(methacrylate)를 포함하는 하이드로겔을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 하이드로겔은 골조직 재생용인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 하이드로겔 내 물질 P의 농도는 10 내지 15 ㎍/ml인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 하이드로겔 내 메타크릴레이트의 농도는 0.1 내지 1 ml/g 인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 상기 하이드로겔 제조방법을 제공한다:
(a) 젤라틴 용액에 메타크릴레이트를 첨가한 후, 동결건조 시키는 단계;
(b) 광개시제가 첨가된 용액에 용해시키는 단계;
(c) 물질 P를 첨가하는 단계; 및
(d) UV 조사 후 결손 조직에 이식 가능한 형태로 형상화하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 젤라틴 용액에 메타크릴레이트를 첨가한 후 투석한 용액을 동결건조시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서 메타크릴레이트는 0.1 내지 1 ml/g의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서 물질 P는 10 내지 15 ㎍/ml 농도로 첨가되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 골조직 재생용 하이드로겔은 물리적·기계적으로 결손된 조직 내 적용 가능하도록 고분자를 화학적으로 설계하여 제조된 것으로, 생체 적합성 및 생체 내 분해 특성으로 결손 조직을 효과적으로 재생할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 골조직 재생용 하이드로겔 제조방법의 개략도이다.
도 2는 상기 제조방법으로 제조된 본 발명에 따른 하이드로겔을 나타낸다. (Scale bar = 2 mm)
도 3은 TNBS assay로 본 발명에 따른 하이드로겔의 치환도를 확인한 결과이다. LG는 저용량 메타크릴레이트 하이드로겔, HG는 고용량 메타크릴레이트 하이드로겔을 의미한다.
도 4는 젤라틴, 본 발명에 따른 하이드로겔 저용량 메타크릴레이트 하이드로겔 및 고용량 메타크릴레이트 하이드로겔의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 하이드로겔의 전계방사형 주사전자현미경 이미지를 나타낸다. 도 5A 및 도 5B는 저용량 메타크릴레이트 하이드로겔 (LG), 도 5C 및 도 5D는 고용량 메타크릴레이트 하이드로겔 (HG)을 나타내며, 도 5A 및 도 5C에서 scale bar = 500 ㎛ 이고, 도 5B 및 도 5D에서 scale bar = 50 ㎛ 이다.
도 6은 본 발명에 따른 하이드로겔의 기계적 물성을 나타낸다. 도 6A는 압축강도, 도 6B는 탄성 계수(G'), 점성 계수(G”도 6C는 손실계수 Tanδ도 6D는 점성을 나타낸다.
도 7은 본 발명에 따른 하이드로겔의 탈 이온수에서의 팽윤성을 측정한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 하이드로겔의 생분해율을 평가한 결과이다.
도 9는 본 발명에 따른 하이드로겔의 L-929 마우스 섬유아세포(ATCC Number CCL-1, NCTC Clone 929)에서의 세포독성을 평가한 결과로, 도 9A는 대조군 대비 본 발명에 따른 하이드로겔 처리시 세포생존률을 나타낸 그래프이고, 도 9B는 세포 생존 여부를 현미경으로 확인한 결과이다.
도 10은 백서 골결손모델에서 본 발명에 따른 하이드로겔의 신생골 형성 효과를 평가한 결과를 나타낸 것으로, 도 10A는 Micro-CT 이미지, 도 10B는 신생골 부피 측정 결과, 도 10C는 골 결손 부위에서의 전체 조직 부피 대비 신생골 부피비를 나타낸다.
도 11은 백서 골결손모델 내 본 발명에 따른 하이드로겔의 이식 후 8 주차 조직학적 분석 결과를 나타낸 것으로, 도 11A는 H&E 염색, 도 11B는 Toluidine Blue 염색 결과이다. Original Bone(OB) : 기존골, New Bone(NB) : 신생골, Fibrous Tissue(FT) : 섬유조직, Gel-Ma Hydrogel(GH) : 이식재, Scale bar : 1 cm.
도 2는 상기 제조방법으로 제조된 본 발명에 따른 하이드로겔을 나타낸다. (Scale bar = 2 mm)
도 3은 TNBS assay로 본 발명에 따른 하이드로겔의 치환도를 확인한 결과이다. LG는 저용량 메타크릴레이트 하이드로겔, HG는 고용량 메타크릴레이트 하이드로겔을 의미한다.
도 4는 젤라틴, 본 발명에 따른 하이드로겔 저용량 메타크릴레이트 하이드로겔 및 고용량 메타크릴레이트 하이드로겔의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 하이드로겔의 전계방사형 주사전자현미경 이미지를 나타낸다. 도 5A 및 도 5B는 저용량 메타크릴레이트 하이드로겔 (LG), 도 5C 및 도 5D는 고용량 메타크릴레이트 하이드로겔 (HG)을 나타내며, 도 5A 및 도 5C에서 scale bar = 500 ㎛ 이고, 도 5B 및 도 5D에서 scale bar = 50 ㎛ 이다.
도 6은 본 발명에 따른 하이드로겔의 기계적 물성을 나타낸다. 도 6A는 압축강도, 도 6B는 탄성 계수(G'), 점성 계수(G”도 6C는 손실계수 Tanδ도 6D는 점성을 나타낸다.
도 7은 본 발명에 따른 하이드로겔의 탈 이온수에서의 팽윤성을 측정한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 하이드로겔의 생분해율을 평가한 결과이다.
도 9는 본 발명에 따른 하이드로겔의 L-929 마우스 섬유아세포(ATCC Number CCL-1, NCTC Clone 929)에서의 세포독성을 평가한 결과로, 도 9A는 대조군 대비 본 발명에 따른 하이드로겔 처리시 세포생존률을 나타낸 그래프이고, 도 9B는 세포 생존 여부를 현미경으로 확인한 결과이다.
도 10은 백서 골결손모델에서 본 발명에 따른 하이드로겔의 신생골 형성 효과를 평가한 결과를 나타낸 것으로, 도 10A는 Micro-CT 이미지, 도 10B는 신생골 부피 측정 결과, 도 10C는 골 결손 부위에서의 전체 조직 부피 대비 신생골 부피비를 나타낸다.
도 11은 백서 골결손모델 내 본 발명에 따른 하이드로겔의 이식 후 8 주차 조직학적 분석 결과를 나타낸 것으로, 도 11A는 H&E 염색, 도 11B는 Toluidine Blue 염색 결과이다. Original Bone(OB) : 기존골, New Bone(NB) : 신생골, Fibrous Tissue(FT) : 섬유조직, Gel-Ma Hydrogel(GH) : 이식재, Scale bar : 1 cm.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 메타크릴레이트 Gel-MA 스펀지에 생리활성물질인 물질 P (Substance P)가 첨가된 하이드로겔을 제작하고, 그 형상, 기계적 물성과 함께 팽윤성, 생분해율을 평가하여 본 발명에 따른 하이드로겔이 골 결손 부위에 이식 가능한 물성을 가짐을 확인하였으며, 본 발명에 따른 하이드로겔이 세포독성 없이 생체에 안전하면서도 골 결손 동물 모델의 골 결손 부위에서 효과적으로 신생골을 형성할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 물질 P (Substance P)와 메타크릴레이트(methacrylate)를 포함하는 하이드로겔에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 하이드로겔은 골조직 재생용인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 물질 P는 타키키닌 신경펩타이드 계열(tachykinin neuropeptide family)의 운데카펩타이드(11개 아미노산 잔기의 사슬로 구성된 펩타이드)로, 신경 전달 물질과 신경 조절제로 작용하는 신경 펩타이드이다.
본 발명에 있어서, 물질 P의 환원된 아미노산 서열은 하기 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으며, C-말단이 아미드화와 되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
물질 P (서열번호 1)
Arg Pro Lys Pro Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met (RPKPQQFFGLM)
본 발명에 있어서, 상기 하이드로겔 내 물질 P의 농도는 5 내지 20 ㎍/ml, 바람직하게는 10 내지 15 ㎍/ml인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에 있어서, 물질 P의 농도가 5 ㎍/ml 이하인 경우, 미분화 간엽세포를 끌어들여 조골세포로 분화하기에 부족한 문제점이 있고, 20 ㎍/ml 이상인 경우, 파골세포의 NK-2 수용체를 탈감작(desensitization) 시켜 파골세포 괴사의 문제점이 있을 수 있으며, 10 내지 15 ㎍/ml의 농도에서 가장 효과적으로 조골세포 분화가 일어난다.
본 발명에서 사용되는 용어, '메타크릴레이트'는 메타크릴산의 유도체로, 상기 유도체에는 메타크릴산(CH2C(CH3)CO2H), 이의 염(예: CH2C(CH3)CO2 -Na+), 이의 에스테르(예: CH2C(CH3)CO2CH3 또는 메틸 메타크릴레이트) 및 이들의 중합체를 포함한다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 메타크릴레이트는 하기 화학식 1로 표시될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
[화학식 1]
본 발명에 있어서, 메타크릴레이트는 아크릴레이트 폴리머를 형성하는 폴리머 플라스틱의 일반적인 모노머로, 메타크릴레이트는 이중 결합이 반응성이 매우 높기 때문에 쉽게 중합체를 형성할 수 있고, (메트)아크릴레이트라는 용어가 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 하이드로겔 내 메타크릴레이트의 농도는 0.1 내지 1 ㎖/g 인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에 있어서, 하이드로겔 내 메타크릴레이트의 농도가 0.1 ㎖/g 이하인 경우에는, 파골세포로 인한 골 흡수가 일어나는 시점보다 하이드로겔이 더 빠르게 생분해되거나 정상적인 가교반응이 발생하지 않을 수 있고, 1 ㎖/g 이상인 경우에는, 생체 내 이식되었을 때 하이드로겔이 생분해되지 않고 결손 부위 내 잔존하며 신생골 형성을 방해하기 때문에, 메타크릴레이트의 농도는 0.1 내지 1 ㎖/g (v/w) 가 바람직하며, 특히 저용량 메타크릴레이트 하이드로겔 제작을 위한 메타크릴레이트의 농도는 0.2 내지 0.3 ㎖/g (v/w) 바람직하고, 0.25 ㎖/g이 가장 바람직하다.
본 발명은 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 상기 하이드로겔의 제조방법에 관한 것이다:
(a) 젤라틴 용액에 메타크릴레이트를 첨가한 후, 동결건조 시키는 단계;
(b) 광개시제가 첨가된 용액에 용해시키는 단계;
(c) 물질 P를 첨가하는 단계; 및
(d) UV 조사 후 결손 조직에 이식 가능한 형태로 형상화하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 젤라틴 용액은 젤라틴 분말을 탈이온수에 약 8 내지 12%, 바람직하게는 약 10% (w/v) 농도로 용해시켜 제조되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서 메타크릴레이트는 0.1 내지 1.0 ml/g의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 할 수 있고, 저용량 메타크릴레이트 하이드로겔 제조를 위하여 0.1 내지 0.5 ㎖/g의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 할 수 있으며 있으며, 바람직하게는 0.2 내지 0.3 ㎖/g의 농도, 가장 바람직하게는 0.25 ㎖/g의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 젤라틴 용액에 메타크릴레이트를 첨가한 후 분획 분자량 약 12-14 kDa의 투석막으로 투석시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서의 투석은 셀룰로오스 투석막을 사용하여 35 내지 45 ℃에서, 약 5 내지 10일간 투석하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서 투석한 용액은 동결건조시켜, Gel-MA 스폰지를 형성시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 광개시제는 1-하이드록시사이클로헥실 페닐 케논, 2-하이드록시-2-메틸-1-페닐-프로판-1-온, 비스(2,8-디메톡시벤조일)-2,4,4-트리메틸페닐 포스핀 옥사이드(DMBAPA), 비스(2,4,6-트리메틸벤조일)-페닐포스핀옥사이드(Irgacure 819), 2,4,6-트리메틸벤질디페닐 포스핀 옥사이드 및 2,4,6-트리메틸벤조일 디페닐포스핀 옥사이드, 벤조인 메틸 에스테르, 및 캄포르퀴논과 에틸 4-(N,N-디메틸아미노)벤조에이트의 배합물이 예시될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 광개시제는 바람직하게는 UV 광개시제일 수 있고, UV 광개시제는 Darocur 1173, Darocur 2959(Ciba Specialty Chemicals) 및 Irgacure 2959, LAP, VA-086, eosin Y/triethanolamine를 포함할 수 있다.
상기 광개시제는 반응 혼합물의 광중합을 개시시키는데 유효한 양으로, 예를 들면 반응성 단량체의 100부당 약 0.01 내지 약 2 중량부로 반응 혼합물중에 사용될 수 있다. 반응 혼합물의 중합은, 사용된 중합 개시제에 따라 자외선에 의해 개시시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 광개시제 이외에도, 본 기술분야에 널리 알려진 중합 개시제로 중합 반응을 유도할 수 있다.
그러나, 상기 중합 반응은 광개시제 없이 e-빔을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 중합 개시제는 방향족 알파-하이드록시 케톤, 알콕시옥시벤조인, 아세토페논, 아실 포스핀 옥사이드 및 3급 아민 및 디켄톤, 이의 혼합물 등과 같은 광개시제를 포함된다.
그러나, 광개시제가 사용되는 경우, 본 발명에 따른 제조방법의 바람직한 개시제는 Irgacure 2959이고, 바람직한 중합 개시의 방법은 UV일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 광개시제가 첨가된 용액은 0.01 내지 1.0%, 바람직하게는 0.05% Irgacure 2959를 포함하는 PBS용액일 수 있으며, 상기 Gel-MA 스펀지는 상기 Irgacure 2959를 포함하는 PBS용액에 약 10 내지 20% 바람직하게는 약 15% (w/v)의 농도로 용해되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 Irgacure 2959를 포함하는 PBS용액에 Gel-MA 스펀지를 용해한 후, 이 중 약 2 내지 4 ml, 바람직하게는 3ml을 취하여 약 30 내지 45ug, 바람직하게는 약 38ug의 물질 P를 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서 물질 P는 10 내지 15 ㎍/ml, 바람직하게는 12.6 ㎍/ml (2 ㎍/sample) 농도로 첨가되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 물질 P를 첨가한 후, 상기 용액은 0.22 um syringe로 필터링하고, 플레이트에 분주하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 플레이트에 분주한 용액은 분당 약 0.1 내지 1.0 J/cm2, 바람직하게는 약 0.3 J/cm2 선량률로 약 1 내지 20 분, 바람직하게는 약 10분간 UV 조사하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 두개골, 치조골 결손 등과 같이 골 손상 내지 골 손실이 발생하였을 때, 골 결손 부위에 식립되어 골 결손 부위를 지지하고, 골 결손 부위 주위의 자가 조직으로부터 자가 골 재생을 유도할 수 있는 골조직 재생용 스캐폴드(Scaffold)의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 일 예에 따른 골 조직 재생용 스캐폴드(Scaffold)는 전술한 골조직 재생용 하이드로겔 또는 하이드로겔을 구성하는 구성성분을 포함하는 하이드로겔 조성물을 포함하거나 이들 중 어느 하나로 구성될 수 있다.
본 발명에 따른 골조직 재생용 하이드로겔은 그 자체로 골 세포를 효과적으로 증식시킬 수 있으며, 본 발명에 따른 골조직 재생용 하이드로겔 조성물에 골조직 재생에 도움이 되는 추가성분을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 포함할 수 있는 추가성분은 해면골조각, 치밀골조각, 트리칼슘인산, 다이칼슘인산, 펜타칼슘 하이드록시아파타이트(pentacalcium hydroxylapatite), 테트라칼슘 포스페이트 모녹사이드(tetracalcium phosphate monoxide), 무수칼슘설페이트, 칼슘 설페이트 헤미하이드레이트(calcium sulfate hemihydrate), 칼슘 설페이트 디하이드레이트(calcium sulfate dihydrate), 키토산, 콜라겐, 덱스트란, 스타치, 항진균제, 항바이러스제, 항박테리아제, 비타민, 아미노산, 펩티드, 파이브로넥틴 및 면역억제제로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 추가성분은 물질 P와 함께 하이드로겔에 캡슐화된 형태로 존재하기 때문에 장기간 지속적으로 방출되며, 골조직 재생을 촉진하는 효과가 있다.
다른 양태로서, 본 발명에 따른 골조직 재생용 하이드로겔은 골재생용 이식체로 제공될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "이식체(또는 임플란트, implant)"는, 인체 내에서 손상된 부위를 대체 및 수복하기 위하여 사용되는 인공 장기나 이식용 재료 등을 포함하는 것으로, 기관 장기에 이식할 수 있는 성형된 부품, 예컨대 막, 고정 박판, 입체적 또는 공간적 부품, 또는 나사, 핀, 리벳, 압정 등의 고정 수단 등과 같이 치료 중에 조직을 지지하거나 부착시키는 용도, 또는 조직을 다른 조직으로부터 분리시키는 용도에 사용되는 것을 의미한다. 상기 본 발명의 이식체는 골 대체용일 수 있다. 본 발명의 이식체는 생체적합성이 향상되어 세포 부착에 유리할 뿐만 아니라 생체 내 결손부위에 적합하도록 성형이 가능하고, 생체 내에 이식한 후 하이드로겔 내부에 매립된 물질 P가 시간이 지남에 따라 방출되고, 하이드로겔이 생분해된 공간에 신생골이 형성되어 우수한 골재생 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명은 골재생을 위한 동종 골 이식법, 자가 줄기세포 치료법, 자가 성장인자농축물을 이용하는 방법, 동종 줄기세포 치료법, 화학적 자극법, 전기 자극법, 저강도 펄스초음파(LIPUS) 법, 내부 고정법, 및 외부의 고정으로부터 선택되는 하나 이상의 골재생 방법과 함께 사용될 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 상기 하이드로겔을 골조직 재생을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 골조직 재생방법을 제공할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 골조직 재생을 위한 상기 하이드로겔의 용도를 제공할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 골조직 재생을 위한 이식체 또는 스캐폴드의 제조를 위한 상기 하이드로겔의 용도를 제공할 수 있다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[제조예]
1. 재료
본 발명에 따른 골조직 재생용 하이드로겔 제조를 위해 사용된 물질은 다음과 같다:
젤라틴 분말 (Type B, ~ 75 Bloom, 20-25 kDa), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)
메타크릴 무수물 용액 (Methacrylate anhydride solution, contains 2,000 ppm topanol A as inhibitor, 94%), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)
광개시자(1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propanone, Irgacure 2959), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)
2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid solution (TNBS), Thermo scientific (Rockford, IL 61105, USA)
셀룰로오스 투석망 (Dialysis tubing cell㎕ose membrane, 12-14 kDa), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)
Substance P acetate salt hydrate (≥95% (HPLC), powder), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)
2. 제조방법
본 발명에 따른 골조직 재생용 하이드로겔 제조방법은 다음과 같다:
젤라틴 분말을 탈이온수에 10% (w/v) 농도로 용해시키고, 메타크릴레이트를 저용량은 0.25 ㎖/g (v/w), 고용량은 1 ㎖/g (v/w) 농도로 0.5 ㎖/min의 속도로 넣어준 뒤 50 ℃에서 600 RPM의 속도로 교반하였다. 분획 분자량 12-14 kDa의 셀룰로오스 투석막을 이용하여 40℃에서 7일간 투석하였다. 투석된 용액을 동결건조 하였다 (Gel-MA 스폰지). 0.05% Irgacure 2959가 함유된 PBS에 Gel-MA 스폰지를 15% (w/v) 농도로 용해시키고, 용액 3.0 ㎖을 채취하였다. 물질 P 38 μg을 첨가하고, 0.22 μm 시린지 필터링 후 플레이트에 분주하였다. 분당 0.3 J/cm2 선량률로 약 10분 동안 UV를 조사한 후, 지름 8.0 mm 형태의 샘플을 제작하였으며, 샘플 내 최종 물질 P (Substance P)의 양은 2 ㎍/sample (12.6 ㎍/ml) 이다.
실시예 1. 치환도 분석
제조된 본 발명에 따른 하이드로겔의 치환도는 TNBS assay를 통해 확인하였다. 치환도는 완충용액의 흡광도 값을 제외한 후 아래의 식에 따라 계산하였다:
Degree of Substitution (%) = {1-(Ac/Ao)} x 100
먼저 반응용 완충용액인 0.1 M 중탄산 나트륨(Sodium bicarbonate, pH 8.5) 용액을 사용해 TNBS 용액을 0.01% (w/v)으로 희석시켜 TNBS 용액을 만들었다. 다음 Gel-MA 스폰지를 0.1 M 중탄산 나트륨 용액에 200 ug/ml (w/v)의 농도로 E-tube에 완전히 녹여 샘플 용액을 만들었다. Gel-MA 샘플 용액 500 ㎕과 250 ㎕의 희석된 TNBS 용액을 넣은 후 2 시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 반응의 정지와 안정화를 위해 250 ㎕의 10% 도데실 황산 나트륨(Sodium dodecyl sulfate, SDS)과 125 ㎕의 1N 염화 수소(Hydrogen Chloride, HCL)를 각각의 E-tube에 넣어주었다. 반응이 종료된 최종 용액은 96 well plate에 옮긴 뒤 분광 광도계(Spectrophotometer, m㎕tiskan, thermo fisher scientific, Vantaa, Finland)를 이용하여 335 nm의 흡광도에서 측정하여 하이드로겔의 치환도를 획득하였다.
그 결과, 도 3에서와 같이 저용량 메타크릴레이트 하이드로겔(LG)은 약 50%의 치환도를 나타내었고, 고용량 메타크릴레이트 하이드로겔(HG)은 약 80%의 치환도를 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 2. 화학적 결합 확인
메타크릴레이트의 첨가에 따라 젤라틴의 라이신 기와 반응하여 화학적으로 Gel-Ma 중합체를 형성하는지 1H-NMR 스펙트럼으로 검증하였다.
Gel-MA 스폰지를 중수(Deuterium oxide, D2O)에 6 mg/ml (w/v) 의 농도로 녹여주었다. 충분히 교반한 뒤 0.056%의 농도로 테트라메틸실란(Tetramethylsilane, TMS)를 넣고, 핵자기공명장치(Nuclear Magnetic Resonace, NMR, Bruker, AVANCE III 500)를 이용해 500 MHz에서 측정하였다. 1H NMR 스펙트럼에 대한 화학적 이동 (δ은 테트라메틸실란 (δ0.00) 또는 내부 참조로서, 적당한 잔여 용매 피크에 비례하여 ppm (parts per million)으로 기록된다. 다중도 (M㎕tiplicities)는 단일 (s), 이중 (d), 삼중 (t), 사중 (q), 다중 (m) 및 광역 (br)으로 주어진다. 결합 상수 (J)는 Hz로 표시된다. 스펙트럼에서 1.8 ppm에서의 피크는 -CH2NH로써 methacrylamide의 methyl protons의 피크 값이고, 2.8 - 3.0 ppm에서의 피크는 -C(CH3)=CH2로써 반응하지 않은 lysine 기의 lysine methylene 피크 값을 나타내며, 5.3 - 5.5 ppm은 =CH2로써 lysine 기와 hydroxyl lysine 기의 methacrylamide 에서의 acrylic protons의 피크 값을 나타낸다. 7 - 7.3 ppm에서의 피크는 방향족 아미노산의 피크로, 반응에 관여하지 않아 기준으로 표기하였다.
그 결과, 도 4에서와 같이 메타크릴레이트의 첨가에 따라 젤라틴과 중합하여 각각 저용량 메타크릴레이트 하이드로겔(LG) 및 고용량 메타크릴레이트 하이드로겔(HG) 모두에서 중합체가 형성됨을 확인하였다.
실시예 3. 형태학적 분석
본 발명에 따른 골조직 재생용 하이드로겔 내 포어(pore)를 전계방사형 주사전자현미경, SU8220 Field Emission Scanning Electron Microscope (FE-SEM, Hitachi, Japan)으로 촬영하였다.
그 결과, 도 5에서와 같이 저용량 메타크릴레이트 하이드로겔(LG)은 지름이 약 60 내지 80μm, 고용량 메타크릴레이트 하이드로겔(HG)은 지름이 약 40 내지 60μm인 포어를 형성하는 것을 확인하였다.
실시예 4. 기계적 물성 분석
본 발명에 따른 골조직 재생용 하이드로겔의 기계적 강도를 측정하였다.
35 mm 직경의 parallel-plate를 가지는 Rheometer (MARS III, Thermo Fisher Scientific, Germany) 위에 하이드로겔을 올려두고 0.2 mm/s의 속도로 측정기를 움직여 하이드로겔을 압축한 뒤 기계적 강도를 확인하였다. 또한, 복합 점도를 측정하기 위해 비파괴 스위프 진동 시험(non-destructive sweep oscillation test)을 진행하였으며, 각 진동수는 0.1 ~ 100 rad/s의 속도로 조절하였고, 변형율은 0.01 %로 하였다.
그 결과, 도 6A에서와 같이 저용량 메타크릴레이트 하이드로겔의 압축강도는 약 200kPa, 고용량 메타크릴레이트 하이드로겔의 압축강도는 300kPa로 확인되었다. 도 6B에서와 같이 저용량 메타크릴레이트 하이드로겔의 탄성 계수(G')는 약 240 Pa, 고용량 메타크릴레이트 하이드로겔의 탄성 계수(G')는 약 1350 Pa로 확인되었고, 저용량 메타크릴레이트 하이드로겔의 점성 계수(G'')는 약 40 Pa, 고용량 메타크릴레이트 하이드로겔의 점성 계수(G'')는 약 650 Pa로 확인되어, 탄성 계수의 값이 점성 계수의 값보다 높기 때문에 겔의 특성을 가진 것을 확인하였다. 또한, G' 의 값 변화량에 대한 G''의 값 변화율을 나타내는 손실 계수(Tanδ는 메타크릴레이트 하이드로겔의 치환도가 높을수록 증가하는 것을 확인하였고, 두 메타크릴레이트 하이드로겔의 복합 점도 값을 비교하였을 때 저용량 메타크릴레이트 하이드로겔에 비해 고용량 메타크릴레이트 하이드로겔이 약 6배 높은 복합 점도 값을 가진 것으로 확인되어,
두 하이드로겔 모두 기계적 물성이 골 재생 과정 동안 충분한 지지체 역할을 할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5. 팽윤성 분석
골조직 재생용 하이드로겔이 팽윤 성질을 가지는 경우, 하이드로겔 내에 수분을 함유할 수 있기 때문에 수용성 물질의 담지가 가능하고 체내 삽입 시, 삼투압에 의한 주변조직으로의 담지 약물 방출이 가능하다. 더불어 하이드로겔을 구성하는 기반 물질의 고유 특성, 표면 개질 방법, 분해속도 설정에 따라 담지 가능한 물질, 방출 속도, 담지 용량 등의 조절에 용이한 장점이 있다.
이에 본 발명에 따른 물질 P를 첨가하여 제조된 저용량 메타크릴레이트 하이드로겔(LG)과 물질 P를 첨가하여 제조된 고용량 메타크릴레이트 하이드로겔(HG)를 탈이온수에 넣고 24 시간 동안 37℃로 유지하였다. 24 시간 뒤 하이드로겔 표면의 탈 이온수를 제거하고 무게를 측정하고, Ws로 표기하였다. 무게를 잰 하이드로겔을 동결 건조 과정을 거치고 무게를 측정하여, Wd로 표기하였다. 팽윤율은 아래의 식에 따라 계산하였다.
Swelling ratio (%) = (Ws-Wd)/Wd x 100
그 결과, 도 7에서와 같이 저용량 메타크릴레이트 하이드로겔의 팽윤율(swelling ratio)은 약 95%, 고용량 메타크릴레이트 하이드로겔의 팽윤율은 약 85%를 나타내어 가교 밀도의 차이로 물질의 방출 속도를 용이하게 조절할 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. 생분해율 평가
골조직 재생용 하이드로겔은 결손 조직 이식 후 생분해되어 신생골을 형성하여야 하는바, 본 발명에 따른 하이드로겔의 생분해율을 평가하였다.
각각의 하이드로겔의 무게를 측정하고, W0로 표기하였다. 측정한 하이드로겔을 인산완충식염수(PBS)에 넣고 37℃로 유지시켜주었다. 3 일차와 7 일차에 인산완충식염수에 담긴 하이드로겔을 꺼내 건조시킨 후 무게를 측정하고, 이를 Wd로 표기하였다.
두 그룹의 생분해율은 아래의 식에 따라 계산하였다.
Biodegradation ratio (%) = (W0-Wd)/W0 x 100
그 결과, 도 8에서와 같이 저용량 메타크릴레이트를 함유하는 하이드로겔의 생분해율은 약 32%, 고용량 메타크릴레이트를 함유하는 하이드로겔의 생분해율은 약 8% 정도로 평가되어, 저용량 메타크릴레이트를 함유하는 하이드로겔의 생분해율이 훨씬 높은 것으로 확인되었다.
실시예 7. 세포독성 평가
본 발명에 따른 하이드로겔을 생체 내 적용하기 위해서는 안정성 평가가 수반되어야 하는바, 본 발명에 따른 하이드로겔을 세포에 처리하고 세포독성을 평가하였다.
이를 위하여, 정성적 평가와 정량적 평가를 실시하였다. 본 발명에 필요한 세포는 10% (v/v) 소 태아 혈청(Fetal Bobin Serum, FBS)과 100 units/ml의 Penicillin과 100 ug/ml의 Streptomycin을 첨가한 L-glutamine Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI 1640 Medium; Gibco)을 이용해 배양하였고, 인큐베이터에서 5% CO2 와 37℃로 조건을 유지하였다. 먼저 정성적 평가는 용출법을 이용해 현미경으로 관찰하였다. L-929 마우스 섬유아세포(ATCC Number CCL-1, NCTC Clone 929)를 1 x 105 cell/ml의 농도로 6 well plate에 2 ml씩 넣어준 후 24 시간 동안 배양하였다. 동시에 음성대조군(무 처치군), 양성 대조군(High density poly ethylene, HDPE), 저용량 메타크릴레이트 하이드로겔, 고용량 메타크릴레이트 하이드로겔을 준비하여 0.2 g/ml (w/v)의 농도로 RPMI 배지에 2 g을 넣고, 37℃의 항온 수조에서 24시간동안 용출하였다. 24 시간이 지난 후, 6 well plate의 미디어를 제거하고, 인산완충식염수로 씻어준 뒤 각 well에 24 시간 용출한 용출물과 음성대조군, 양성대조군을 2 ml씩 넣어 주었다. 정성적 평가를 위해 0 시간과 24 시간이 지난 후의 세포를 현미경을 통해 관측하였다.
정량적 평가는 Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo)을 이용해 측정하였다, 실험 방법은 제조사의 프로토콜을 따라 다음의 순서로 진행하였다. 먼저 L-929 섬유아세포를 1 x 105 cell/ml의 농도로 96 well plate에 200 ㎕씩 넣어준 후 24 시간 동안 배양하였다. 동시에 대조군, 저용량 메타크릴레이트 하이드로겔, 고용량 메타크릴레이트 하이드로겔을 준비하여 0.2 g/ml (w/v)의 농도로 RPMI 배지에 2g을 넣고, 37℃의 항온 수조에서 24 시간 동안 용출하였다. 24 시간 후, 96 well plate의 미디어를 제거하고, 인산완충식염수로 씻어준 뒤 각 well에 24 시간 용출한 용출물과 음성대조군, 양성대조군을 200 ㎕씩 넣어 주었다. 24 시간 배양 후, 미디어를 제거하고 인산완충식염수로 씻어주었다. 소 태아 혈청을 제외한 RPMI 배지에 10% (v/v)의 농도로 희석시킨 CCK 용액을 200 ㎕씩 적용한 후 5% CO2 와 37℃의 조건에서 3 시간동안 반응시켰다. 반응 후의 세포를 450 nm에서 분광 광도계를 이용해 흡광도를 측정하여 관측하였다.
그 결과, 도 9에서와 같이 본 발명에 따른 물질 P를 첨가하여 제조된 저용량 메타크릴레이트 하이드로겔(LG)과 물질 P를 첨가하여 제조된 고용량 메타크릴레이트 하이드로겔(HG) 모두 24시간 동안 조골세포 생존률이 90% 이상으로 확인되어, 본 발명에 따른 하이드로겔이 세포 독성 없이 의료기기의 생물학적 안전에 관한 공통기준규격을 만족함을 확인하였다.
실시예 8. Micro-CT를 이용한
in vivo
평가
치조골 재생 실험에 가장 널리 쓰이는 실험을 위해 8 주령의 평균 몸무게가 260 내지 280 g이고, 성별은 웅성인 백서 (Sprague- Dawley, SD rats) 40 마리를 ㈜코아텍에서 공급받아 사용하였다.
식수 및 사료를 자유 급이하며 1 주 간의 순화 과정을 거친 후, 군 분리를 통해 군 당 평균 270 g으로 나누어주었다. 백서는 30 mg/kg의 Tiletamine, Zolazepam 혼합제(Zoletil, Virbac S.A., Carroscedex, France)와 10 mg/kg의 Xylazine hydrochloride (Rompun, Bayer HealthCare, Leverkusen, Germany)를 복강 투여하여 마취를 하였다. 마취된 백서의 수술을 위해 술부 주변을 제모하고, 술부를 중심으로 알코올과 포비돈으로 각 3 회씩 소독을 하였다. 전두골에서 후두골까지 두정골의 상부의 피부를 약 3 cm 정도 절개하고, 골막부분을 박리하여 두정골을 노출시켰다. 의료용 드릴(Micro motor handpiece, STRONG 207A)을 이용해 시상봉합을 중심으로 지름 8 mm의 골 결손을 일으켜 골 결손 모델을 만들었다. (Defect Size = 8.0 mm). 실험 그룹 당 8 마리씩 각각 G1(무처치군), G2(Substance P), G3(Gelatin+Substance P), G4(LG+Substance P), G5(HG+Substance P)의 5개 그룹으로 분류하였다. G2의 Substance P 적용량은 타 처치군의 용량과 동일한 2 ug을 인산완충식염수에 용해시켜 적용하였다. G3의 젤라틴과 Substance P 적용량은 G4, G5의 Gel-MA 하이드로겔의 용량과 동일하게 적용하였다. G4, G5의 Gel-MA 하이드로겔은 적용 시 8 mm 생검용 펀처(Biopsy puncher, kai medical, japan)를 이용해 결손 부위와 동일한 크기로 적용하였다. 하이드로겔의 삽입이 끝난 백서의 피하조직과 피부조직을 봉합하고, 포비돈으로 술부를 소독하였다. 실험이 끝난 실험동물은 5 mg/kg의 Gentamicin sulfate(신풍겐타마이신주 80mg, 신풍)과 0.2 mg/kg Meloxicam (Metacam, boehringer ingelheim)을 3 일간 피하투여로 주사해주었다. 각 이식제를 결손 부위에 이식한 후, 각각 4 주, 8 주 기간 경과 후, micro-CT(Quantum FX, Perkin Elmer, Waltham, MA 02451 USA)를 이용하여 골재생의 정도를 평가하였다.
그 결과, 도 10에서와 같이 8 주차에 물질 P를 첨가하여 제조된 저용량 메타크릴레이트 하이드로겔을 적용한 두정골 내 골 결손 부위에서 골조직 재생이 두드러지게 관찰되었다.
실시예 9. 조직학적 분석
실시예 8에 따른 이식 8주 경과 후, H&E 및 Toluidine Blue 조직 염색을 수행하였다. 얻어진 두개골 조직은 10% 포르말린 용액에 2 주간 고정한 뒤, 10% EDTA 용액에 넣어 탈회 과정을 2 주간 진행하였다. 탈회까지 끝난 조직은 흐르는 물에서 수세 과정을 거친 후 알코올에서 탈수시키고, 조직처리(Tissue-Tek VIP 6, Sakura Finetek Japan) 과정을 수행하였다. 파라핀에 포매(Tissue-Tek TECTM 5, Sakura Finetek Japan) 한 후 파라핀 블록을 4 마이크로 두께로 박절(Accu-Cut SRMTM 200 Rotary Microtome, Sakura Finetek Japan)하여 절편을 만들고 탈 파라핀, 함수과정을 거쳐 증류수로 세척하였다. H&E 염색(BBC, U.S.A.) 및 봉입은 자동염색장비(Tissue-Tek Prisma & GlasTMg2, Sakura Finetek Japan)를 사용하여 진행하였다. Toluidine Blue염색은 Toluidine Blue Solution (ScyTek, U.S.A.)으로 10분 반응시키고 세척한 후 탈수과정을 거쳐 봉입하였다. 염색된 슬라이드는 광학현미경을 이용해 평가하였다.
그 결과, 도 11에서와 같이 대조군과 비교할 때, 특히 물질 P를 첨가하여 제조된 저용량 메타크릴레이트 하이드로겔을 적용한 실험군에서 신생골이 골 결손부위 내 효과적으로 분포되어 있음을 확인할 수 있었다.
반면, 물질 P를 첨가하여 제조된 고용량 메타크릴레이트 하이드로겔을 적용한 실험군에서는 상대적으로 신생골이 골 결손부위 내에 제대로 분포하지 못하는 것으로 확인되었는데, 이는 저용량 메타크릴레이트 하이드로겔은 8주 이후 결손 부위에서 분해되어 신생골 형성에 적합한 환경을 제공할 수 있으나, 고용량 메타크릴레이트 하이드로겔은 8주 이후에도 결손 부위 내 잔존하며 신생골 형성을 방해하는 결과에 의한 것으로 해석된다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Daegu-Gyeongbuk Medical Innovation Foundation
KYUNGPOOK NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION
<120> Hydrogel for bone regeneration comprising Substance P and
methacrylate
<130> 1070430
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Substance P
<400> 1
Arg Pro Lys Pro Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met
1 5 10
Claims (8)
- 물질(Substance) P와 메타크릴레이트(methacrylate)를 포함하는 하이드로겔.
- 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔은 골조직 재생용인 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
- 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔 내 물질 P의 농도는 10 내지 15 ㎍/ml인 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
- 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔 내 메타크릴레이트의 농도는 0.1 내지 1.0 ㎖/g 인 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
- 다음 단계를 포함하는 제1항의 하이드로겔 제조방법:
(a) 젤라틴 용액에 메타크릴레이트를 첨가한 후, 동결건조 시키는 단계;
(b) 광개시제가 첨가된 용액에 용해시키는 단계;
(c) 물질 P를 첨가하는 단계; 및
(d) UV 조사 후 결손 조직에 이식 가능한 형태로 형상화하는 단계.
- 제5항에 있어서, 상기 (a) 단계는 젤라틴 용액에 메타크릴레이트를 첨가한 후 투석한 용액을 동결건조시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 메타크릴레이트는 0.1 내지 1.0 ml/g의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 물질 P는 10 내지 15 ㎍/ml 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는, 방법.
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| KR101736280B1 (ko) | 2015-03-12 | 2017-05-16 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
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2022
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| KR101736280B1 (ko) | 2015-03-12 | 2017-05-16 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
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