CN102747150B - 一种用anapc13基因检测秦川牛体型大小的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用ANAPC13基因检测秦川牛体型大小的方法，该方法采用PCR-SSCP技术结合DNA测序来检测牛ANAPC13基因变异位点。SSCP结果出现三种带型，测序结果发现两个变异位点，分别位于第一外显子17bp处的A→G突变和42bp处的C→T突变。后来测序验证发现，两个位点在98%的个体中属于连锁突变。因此，我们将三种带型分别型命名为AACC、AGCT和GGTT，并在秦川牛404个体中做了分型统计及其与体尺性状的关联分析。该方法是一种在DNA水平上筛查和检测与秦川牛生长发育性状密切相关的分子遗传标记，以用于秦川牛的辅助选择和分子育种，加快秦川牛良种繁育速度。通过基因型的分析比较，从而预测和确定该秦川牛的体型大小，操作简单、费用低、精确度高，可进行快速检测。

Description

一种用ANAPC13基因检测秦川牛体型大小的方法

技术领域

本发明属于动物学领域，特别是涉及一种用基因预示和检测秦川牛体尺大小的检测方法，该方法能够检测出秦川牛体长，体高，腰高，腰角宽，胸围和坐骨端宽。

背景技术

秦川牛历史悠久，公元前八世纪，关中就有“择良牛献主”的记载。劳动人民历来用大牛作种，要求种牛要一长（躯干长），二方（口方、尻方），三宽（额宽、胸宽、后躯宽），四紧（四蹄叉紧），五短（颈短、四肢短），非紫红不作种用。早在1950年，中国科学院院士，东北农学院教授许振英指出：“陕西关中平原的秦川牛，全身赤褐，身长体壮，发育匀称，无论役用肉用，可算全国最优秀的牛种”。1950年后，经过多年选育，特别是秦川肉牛产业化项目的实施，大力推动了秦川肉牛事业的发展。截止到2011年底，秦川牛及其改良牛在关中地区饲养量约150万头。

秦川牛还存在着生长较慢，增重不高，尻部尖斜，大腿肌肉不够充实，母牛乳房发育较差，产奶量不高等缺陷。秦川牛的发展方向应坚持本品种选育，纠正尻部尖斜，大腿肌肉不丰满等外形缺点，提高产肉性能，向肉役兼用方向发展。本品种选育，并不是单纯的保持原种的一切特征特性，不管它有没有缺点，而是在保留其固有优点的基础上，纠正其缺点，使之更上一层楼，成为经济价值较高的品种。

秦川牛经过五十多年的培育，通过人工授精技术广泛应用，中心产区秦川牛的体质外貌得到极大的改善，在中心产区，体高、体长、尻宽、腰宽都有不同程度的提高，特别在改良后躯上有了很大的提高，公牛后躯由尖斜转为方型。

体尺大小是评价黄牛品种优劣和生产性能高低的重要指标，而且研究牛体尺大小已经成为一个突出的问题。在长期的选育过程中，随着秦川牛从役用到现在的肉役兼用，一部分体形较小的个体已经遭到淘汰，但选育较大体形个体仍是秦川牛肉用选育的重要目标。对基因的多态性进行分析，目的在于探索该基因对肉牛生产性状的影响，为我国地方良种黄牛的肉用改良提供一定的理论依据。

一直以来，科学家们都在致力于研究影响人类身高的遗传因素，期待有一天能够为人类的生长发育提供一定的理论依据。Weedon等人在2007年就开始研究基因组与候选基因关联分析，但是成果不显著。但是随着最近基因组范围关联分析研究的发展（GWA），首先在人上发现了很多影响身高的遗传变异。尽管作用的机理不是很清楚，可以肯定的是，这些基因的变异引起了骨骼发育的信号通路的改变。

近些年来，细胞周期和与有丝分裂相关基因的功能研究越来越多，ANAPC13，也叫做APC13，或是Swm1，编码促进细胞分裂后期的复合体的组分之一，这是一种很大的泛素蛋白连接酶，它通过调控细胞周期的调控因子（例如B型细胞周期素）的退化来控制细胞周期的连续性。有研究表明该基因的变异显著影响人类的身高，目前关于该基因变异的研究较少，在牛上没有相关报道。

综上所述，国内外大量的研究报道都证实了基因可以用来预示和检测人的身高等外形特征，鉴于此，申请人在ANAPC13基因作为预示和检测中国黄牛该方法能够检测出黄牛体长、体高、腰高、尻长、腰角宽、胸深、胸围和坐骨端宽等指标的候选基因方面进行了研究。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种采用PCR-SSCP技术结合DNA测序的方法来检测牛ANAPC13基因的序列，通过两个变异位点基因型的分析、比较，从而预测和确定该黄牛的体型大小。

本发明的目的是按照以下步骤实现的：

一种用ANAPC13基因检测秦川牛体型大小的方法，其特征在于，包括下列步骤：

步骤一，采用传统的酚-氯仿提取法提取秦川牛全血基因组DNA，TE缓冲液溶解，稀释至100ng/μL。

步骤二，根据牛ANAPC13基因序列设计一对引物ANAPC13F和ANAPC13R，其中：

ANAPC13F：5’-CCTCGCCAAATGGACTCAC-3’；

ANAPC13R：5’-GAATGCCTTTTCCCCGCTA-3’；

步骤三，利用该对引物ANAPC13F和ANAPC13R对牛的基因组DNA进行PCR扩增，得到的扩增片段位于ANAPC13F和ANAPC13R表示的引物扩增的第一外显子区，长度为388bp，经分析为该基因的非编码区；

步骤四，扩增片段变性后，在10%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，银染和显色。

步骤五，对SSCP不同带型进行分类，测序结果发现两个变异位点，分别位于第一外显子17bp处的A→G突变和42bp处的C→T突变；变异的两个位点确定为连锁关系，分为三种基因型，命名为AACC、AGCT和GGTT，将其与秦川牛体尺性状关联分析；

步骤六，分析结果显示，AGCT型个体在体长，体高，腰高，腰角宽，胸围和坐骨端宽均极显著大于AACC型个体，但是三种基因型在胸深方面差异不显著。

本发明用ANAPC13基因检测秦川牛体型大小的方法，所带来的技术效果是：

1、通过检测碱基的突变而分类的基因型。

2、其中用于分析基因多态性的部位是外显子。

3、其中用于分析基因多态性的序列片段是由ANAPC13F和ANAPC13R表示的引物扩增的第一外显子区。

4、变异的两个位点确定为连锁关系，可分为三种基因型。

5、AGCT型个体在体长，体高，腰高，腰角宽，胸围和坐骨端宽均极显著大于AACC型个体（P<0.01），说明杂合基因型为优势基因型。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1）操作简单、费用低、精确度高，可进行快速检测。

2）使用本发明的ANAPC13基因型对秦川牛体型大小进行检测时，可决定秦川牛的体长，体高，腰高，腰角宽，胸围和坐骨端宽。

3）对于培育肉用黄牛来说无疑是一个极大的优势，而且可以带来显著的经济效益，将为中国养牛业带来广阔的发展前景和利润空间。

附图说明

图1是秦川牛ANAPC13基因第一外显子PCR-SSCP；

图2是秦川牛ANAPC13基因变异测序图谱。

以下结合具体实验和发明人给出的具体实施例对本发明作更详细的描述。

具体实施方式

一、实验材料

1.实验动物和性状测定

选取404同等饲养条件下的18～24月龄健康秦川牛母牛，每头颈静脉采血10mL，ACD抗凝（V（血液）:V（ACD）=6:1），轻微震荡混匀后-80℃保存备用，同时实地测量供试牛体高、体长、胸深、胸围、腰高、尻长、腰角宽、坐骨端宽等体尺指标。供试牛群分别来自西北农林科技大学肉牛研究中心、陕西省秦川牛良种繁育中心、陕西省秦川牛保种场和陕西中宝牧业有限公司四个场区。

实验牛所测定得性状包括：

体长，从肩胛前缘（肱骨突）到同侧坐骨结节后缘间的距离；

体高，又称鬐甲高，是自鬐甲最高点到地面的垂直高度；

腰高，又称十字部高，为两腰角连线中点至地面的垂直高度；

尻长，又称臀长，为腰角前缘至坐骨结节后缘间的距离；

腰角宽，两腰角外缘间的距离；

胸深，肩胛后缘胸部上、下之间的距离；

胸围，在肩胛骨后缘处作一垂线，用卷尺饶一周测量的距离；

坐骨端宽，也称臀端宽或尻宽，为两坐骨结节外缘间的宽度。

2.药品和酶

蛋白酶K购自德国默克公司；Tris饱和酚，EDTA，Tris，硼酸，甲醛，丙烯酰胺（Acr），N,N’-亚甲基双丙烯酰氨（Bis），二甲基亚砜（DMSO），N,N,N,N’-四甲基乙二胺（TEMED），含染料Reaction MIX，DNA Marker，琼脂糖等均购自大连宝生物公司；十二烷基磺酸钠（SDS），去离子甲酰氨购自北京鼎国生物技术有限公司；PCR产物纯化试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。

3.主要仪器

Gradient Cycler PTC-200基因扩增仪，冷冻高速离心机（CENTURION,英国），凝胶成像系统（Bio-Rad公司,美国），电泳槽、稳流稳压电泳仪、脱色摇床（六一仪器，北京），AB204-E型电子天平、MiLLi-Q超纯水仪和，日本松下微波炉及Eppendorf移液器。

二、实验方法

1、缓冲液与常规试剂的配制

1）10%SDS：10g SDS溶入90mL水中，加热至60℃助溶，加几滴浓HCl调节pH至7.2，定容至100mL。

2）l mol/L Tris·HCl（pH8.0）：12.114g Tris溶入80mL水中，用浓HCl调pH至8.0，加水定容至100mL，高压灭菌。

3）0.5mol/L EDTA（pH8.0）：18.6l g Na2EDTA·2H2O溶入80mL水中，加NaOH2g左右调pH至8.0，定容至100mL，高压灭菌。

4）2mol/L的NaCl：11.688g溶于水，定容至100mL，高压灭菌。

5）DNA提取液（100mL）：l mol/LTris·Cl（pH8.0）l mL，0.5mol/L EDTA（pH8.0）20mL，2mol/L的NaCl5mL，定容至100mL。

6）20mg/mL蛋白酶K：20mg蛋白酶K溶入l mL灭菌超纯水中，按200μL分装储存于-20℃。

7）3mol/L乙酸钠：40.8l g三水乙酸钠（NaAc·3H2O）溶于70mL水中用冰乙酸调pH至5.2，加水定容至100mL，高压灭菌。

8）50×TAE（贮存液）：242g Tris碱，57.1mL冰醋酸，100mL0.5mol/LEDTA（pH=8.0），加双蒸水定容至1L，工作液为1×TAE。

9）抗凝剂ACD：柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g，定容100mL水中，高压灭菌。每6mL的血液中加入1mL的ACD液。

10）PBS：在800mL蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2gKCl、1.44g Na2HPO4和0.24gKH2PO4，用HCl调节pH值到7.4，加水定容到1000mL，高压灭菌20min，室温保存。

2、引物的设计与合成

根据牛ANAPC13基因序列（GenBank登录号：NW_003103821），设计一对引物ANAPC13F和ANAPC13R，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，其中：

ANAPC13F：5’-CCTCGCCAAATGGACTCAC-3’；

ANAPC13R：5’-GAATGCCTTTTCCCCGCTA-3’。

3、牛基因组DNA的小量提取

按下列操作步骤进行：

1）冰冻血样室温融化，将约3mL全血加入7mL离心管中，加入等体积PBS缓冲液，混匀10min，12000rpm离心5min，弃上清，重复2次；

2）加入2mL STE，混匀5-10min，37℃水浴1h；

3）加入蛋白酶K（20mg/mL）至终浓度为100μg/μL，充分混匀；

4）再加入70μL SDS，于56℃水浴温和振荡，消化过夜至看不见粘稠血块；

5）加入等体积的Tris饱和酚、盖紧管盖、缓慢地来回颠倒混合至少10min，12000rpm、4℃离心10min；

6）将上清转移至一新的灭菌离心管中，用Tris饱和酚重复抽提一次；

7）再向上清中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)混合液，缓慢颠倒离心管10min，使溶液两相充分混匀，12000rpm、4℃离心10min；

8）转移上清至另一灭菌离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），同上再抽提一次;

9）向所收集的上清液中加入3mL的异丙醇(pH5.2)盖紧管盖，水平摇晃数次即可看到絮状DNA沉淀；

10）将DNA沉淀挑出，置于1.5mL灭菌离心管中，加入1mL75%的乙醇洗涤DNA沉淀两次，12000rpm、4℃离心10min；

11）小心倒掉乙醇，将离心管倒扣于纸巾上，置于37℃温箱干燥15min；

12）待乙醇完全挥发尽，加入100-200Μl TE溶液，4℃过夜以溶解DNA。

4、PCR反应

95℃，预变性5min；95℃，变性30sec，56.5℃，复性30sec，72℃延伸30sec，共35个循环；72℃延伸10min。

反应结束后，取PCR反应液（5μL）进行琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物。

5、PCR-SSCP分析

取PCR产物5μL，与8μL上样缓冲液（体积分数98%的去离子甲酰胺，质量浓度0.025g/L的溴酚蓝，质量浓度0.025g/L的二甲苯菁，10mmol/LEDTA（pH8.0））混合，98℃变性10min，迅速取出并插入冰水混合物中冰浴5～10min，然后分别加样于体积分数为10%聚丙烯酰胺凝胶中电泳，银染和显色。SSCP分析后，纯化不同带型个体的PCR产物，送交南京金斯瑞生物科技有限公司测序，对测序结果用DNAMAN软件进行比对。

6、统计模型建立

根据群体特点，构建线性模型如下：

Y_ijkl=μ+G_i+S_j+Bp_k+Ma_l+ε_ijkl，

式中，Y_ijkl：性状观察值，μ：群体平均值，G_i：基因型固定效应，S_j：性别固定效应，Bp_k：种场群固定效应，Ma_l：测量年龄效应，ε_ijkl：随机误差。

使用统计软件SAS中的GLM程序，使用最小二乘方法检验基因型与性状间的相关程度。

以下是发明人给出的实施例。

实施实例1：牛ANAPC13基因多态性与秦川牛群体体尺性状的相关

利用本发明的引物（ANAPC13F和ANAPC13R）对秦川牛群体404个个体的基因组DNA进行PCR扩增，得到的扩增片段位于ANAPC13F和ANAPC13R表示的引物扩增的第一外显子区，长度为388bp，经分析为该基因的非编码区；扩增片段变性后，在10%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，银染和显色。

结果如下：SSCP结果出现三种带型（图1），对SSCP不同带型进行分类，分别命名为AACC，AGCT和GGTT。然后挑选不同带型的个体送公司测序，测序结果（图2）与NCBI提交的序列比对发现两个变异位点，分别位于是第一外显子17bp处的A→G突变和42bp处的C→T突变。

NCBI上查询的牛ANAPC13基因（GenBank登录号：NW_003103821），其第一外显子的序列如下，放大标出的碱基即为发生变异的位点：

GGTTCTGGCT GCGCTGAGCC AGGGCTGGCA AAGGTTTCCCGCGCCCTAGC TTAGGTAGTG TAGGAGAGGA GCACGTTCGGGTTTCGGCCG ATCCTATCGG CCGAGGTCGT TGTCCTCACCTCATCCTCAT AACTACCTCC CTTACCGCAC GTCGGGAGGGTAGAAAGGGC TTACACGGCG GTCCTGGACG TCCCCCGCTTCCGCATTTGG TATAGCCCGC CTCGGGCCGG AAGCCGAGGCTGTGGGGCGG GATCCCACGC CTGTACGGAC GGTGGTGGCCCCAGAGGGTC ATATTTAGCG GGGAAAAGGC ATTCCAGGTTTGCTCTTTTA ACTACAAGCT TACGGAGCTC TAAAACAGAG

后来大规模测序验证发现，两个位点在98%的个体中属于连锁突变。

因此，申请人将三种带型分别型命名为AACC、AGCT和GGTT，将其与秦川牛体尺性状关联分析。

表1：ANAPC13基因多态位点与秦川牛肉质和胴体性状的关联分析

注：数值为平均数±标准差;不同的小写字母表示差异显著，不同的大写字母表示差异极显著，相同字母表示不显著。

关联分析结果显示（表1），AGCT型个体在体长，体高，腰高，腰角宽，胸围和坐骨端宽均极显著大于AACC型个体（P<0.01），然而三种基因型在胸深方面差异不显著。

Claims (1)

1.一种用ANAPC13基因检测秦川牛体型大小的方法，其特征在于，包括下列步骤：

步骤一，采用酚-氯仿提取法提取秦川牛全血基因组DNA，TE缓冲液溶解，稀释至100ng/μL；

步骤二，根据牛ANAPC13基因序列设计一对引物ANAPC13F和ANAPC13R，其中：

ANAPC 13F：5’-CCTCGCCAAATGGACTCAC-3’

ANAPC 13R：5’-GAATGCCTTTTCCCCGCTA-3’

步骤三，利用该对引物ANAPC13F和ANAPC13R对牛的基因组DNA进行PCR扩增，得到的扩增片段位于ANAPC13F和ANAPC13R表示的引物扩增的第一外显子区，长度为388bp，经分析为该基因的非编码区；

步骤四，扩增片段变性后，在10%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，银染和显色；

步骤五，对SSCP不同带型进行分类，分为三种基因型，测序结果发现两个变异位点，分别位于第一外显子17bp处的A→G突变和42bp处的C→T突变；变异的两个位点确定为连锁关系，命名为AACC、AGCT和GGTT，将其与秦川牛体尺性状关联分析；

步骤六，分析结果显示，AGCT型个体在体长，体高，腰高，腰角宽，胸围和坐骨端宽均极显著大于AACC型个体，但是三种基因型在胸深方面差异不显著。