CN105274247A - 一种用Pax7基因检测牛体尺体重的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用Pax7基因检测牛体尺体重的方法，包括牛血液基因组提取、引物设计、PCR反应、PCR-SSCP分析和统计模型建立，采用PCR-SSCP技术结合DNA测序检测牛Pax7基因变异位点，PCR-SSCP分析结果显示三种带型，测序后发现Pax7基因g.103976G>C突变位点，三种带型分别被命名为CC、CG和GG型，该突变位点位于Pax7基因外显子9，在牛群中进行分型统计及其与体尺性状的关联分析，发现GG型和CG型的体高和体斜长极显著高于CC型；GG型和CG型的体重显著高于CC型；在胸围、管围和坐骨端宽方面差异不显著。本发明操作简单、费用低、精确度高、可快速检测牛体尺体重。

Description

一种用Pax7基因检测牛体尺体重的方法

技术领域

本发明属于动物学领域，特别是涉及一种用Pax7基因检测牛体尺体重的方法。

背景技术

体型大小是体现牛品种生产性能高低的重要指标，因此体型大小已成为一个重要的问题。中国地方牛种，特别是南方牛种在长期自然选育和人工选育过程中，存在体型小、载肉量少的特点。通过人工选育，在保留南方牛种的地区适应性的基础上，提高南方牛种的体型，增加载肉能力是一个重要的选育目标。

分子标记辅助选择是随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，它可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种。分子生物技术的发展为分子标记辅助选择提供了理论基础和技术支持，通过检测功能基因的多态性，对不同基因型个体及生产性能进行关联分析，找出优势基因型和优势等位基因，用于动物的育种过程，能够很大程度的缩短育种时间，提高育种准确性。

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，是同一物种不同个体的染色体上遗传基因单个碱基的变化。在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP(codingSNP，cSNP)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。而这种改变常是导致生物性状改变的直接原因，因此这些SNPs作为遗传标记在群体遗传学中具有重要的意义。

动物的生长发育主要是肌肉的生产，也是肉用的主要目标。肌肉细胞主要来自于胚胎发育时的轴旁中胚层和侧中胚层两个部分。脊椎动物的胚胎发育期，轴旁中胚层形成以后随即裂为块状细胞团，所有的骨骼肌都来自体节的生肌节区。生成骨骼肌的肌节间质细胞为呈双极形或纺锤形的单核细胞，这类细胞仍然能够进行DNA复制和细胞分裂，将进一步分化为成肌细胞。成肌细胞的仍是单核细胞，但不进行DNA复制和有丝分裂，而是在生肌特异蛋白及其同工型的作用下，融合形成肌管。肌管是多核细胞，其中含有由肌动蛋白和肌球蛋白组成的肌原纤维。细胞核位居细胞的中央，随着肌原纤维的增多，细胞核向细胞的周边移动，这时的肌管就成为骨骼肌细胞或称肌纤维。脊椎动物的肌肉组织在个体出生以后，肌纤维的数目不再改变。肌肉的生长大多数依赖肌纤维长度增加和周径增大，而不是依赖于肌细胞数目的增多。

Pax基因是一个进化上比较保守的基因家族，该基因家族普遍存在于各种生物体中。Pax基因家族有9个单独功能的基因，Pax基因家族成员的主要功能是参与动物胚胎发生过程中细胞的分化和生长。

Pax家族中的Pax3和Pax7基因在小鼠肌肉发育过程中发挥重要作用，当Pax3和Pax7基因缺失时会导致肌肉发育的停止，Pax3和Pax7基因是肌祖细胞和卫星细胞的重要调节和标记基因，在脊椎动物的早期胚胎发育和后期肌肉生长、再生和修复过程中发挥重要作用。在动物的躯干肌肉、神经脊细胞、背侧神经管以及体节形成的过程中，Pax7可以取代Pax3基因发挥功能。

综上所述，国内外的大量研究报道都证实了基因可以用来检测动物的外形特征，鉴于此，申请人在Pax7基因作为检测牛体高、体斜长和体重等指标的候选基因方面进行了研究。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种采用PCR-SSCP技术结合DNA测序的方法来检测牛的Pax7基因的序列，通过变异位点基因型的分析比较，从而预测和确定牛的体尺大小和体重。

本发明解决上述问题的技术方案如下：一种用Pax7基因检测牛体尺体重的方法，包括牛血液基因组提取、引物设计、PCR反应、PCR-SSCP分析和统计模型建立，具体包括以下步骤：

(1)牛血液基因组提取：苯酚-氯仿提取法提取牛全基因组DNA后利用TE缓冲溶液溶解DNA，采用超微量分光光度计检测DNA浓度，最后稀释至50ng/μL，存于-20℃备用；

(2)引物设计：根据NCBI登陆的牛Pax7基因序列(登录号：AC_000159.1)，设计一对引物Pax7-9上游引物和Pax7-9下游引物，其中：

Pax7-9上游引物：5'-AGCCTCCCATCCTCAGTC-3'；

Pax7-9下游引物：5'-GGACCTCATCCCAGACAGC-3'；

(3)PCR反应：利用步骤(2)中设计的引物对牛的全基因组DNA进行PCR扩增，获得牛Pax7基因位于外显子9的309bp的片段，此区域为该基因的编码区；

(4)PCR-SSCP分析：扩增片段变性后，采用10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行银染和显色；SSCP分析后，纯化不同带型个体的PCR产物，分为三种基因型，测序后发现Pax7基因g.103976G>C突变位点，三种带型分别被命名为CC、CG和GG型，该突变位点位于Pax7基因外显子9；

(5)统计模型建立：根据牛群特点，建立固定模型，运用SPSS软件对数据进行分析，将碱基突变位点与皖东牛、大别山牛体尺体重进行关联分析，GG型和CG型的体高和体斜长极显著高于CC型；GG型和CG型的体重显著高于CC型；在胸围、管围和坐骨端宽方面差异不显著。

优选地，步骤(3)中PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃终延伸8min；4℃保存。

优选地，步骤(3)中获得的位于外显子9的309bp的基因片段为牛体尺性状选择的分子标记，为皖东牛、大别山牛生长发育的评定提供分子标记辅助选择。

本发明利用Pax7基因检测牛体尺体重的方法，所带来的技术效果是：(1)通过检测碱基的突变而分类的基因型；(2)其中用于分析基因多态性的部位是外显子；(3)其中用于分析基因多态性的序列片段是由Pax7-9上游引物和Pax7-9下游引物表示的引物扩增的第9外显子区域；(4)GG型和CG型的体高和体斜长极显著高于CC型；GG型和CG型的体重显著高于CC型。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)操作简单、费用低、精确度高，可进行快速检测；(2)使用本发明的Pax7基因型对皖东牛、大别山牛体尺体重进行检测时，可决定皖东牛、大别山牛的体高、体斜长和体重；(3)对于培育肉用黄牛来说是一个极大的优势，而且可带来显著的经济效益，为中国的养牛业带来广阔的发展前景和利润空间。

附图说明

图1是皖东牛Pax7基因外显子9的PCR扩增结果；

图2是皖东牛Pax7基因外显子9的PCR-SSCP结果；

图3是皖东牛Pax7基因变异序列测序图谱。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

一、试验材料

1、试验动物和性状测定

选取384头18-36月龄健康皖东牛母牛，193头18-36月龄健康大别山母牛，从牛的颈静脉采血5mL，置5mL肝素抗凝采血管，轻微震荡混匀后，-20℃冻存备用。皖东牛群体来自安徽省滁州市凤阳县大明农牧科技发展有限公司皖东牛保种场及定远和明光保种区，大别山牛来自金寨县安农农业科技有限公司。

所有牛只测定性状包括：

体斜长：从肩胛前缘到同侧坐骨结节后缘间的距离；

体高：自鬐甲最高点到地面的垂直高度。

胸围：在肩胛骨后缘处作一垂线，用卷尺饶一周测量。其松紧程度以能插入食指并可上下滑动为宜。

管围：前掌骨上1/3最细处的水平周长。

体重：电子地磅实际称量牛的体重。

2、药品和酶

蛋白酶K，三羟甲基氨基甲烷((Tris-Cl)，乙二氨四乙酸二钠(EDTA)，NaOH，无水乙醇，溴酚蓝，二甲基苯氰FF，丙烯酰胺，N，N'-亚甲双丙烯酰胺(Bis)，硝酸银，去离子甲酰胺，N，N，N，N'-四甲基乙二胺(TEMED)，甲醛，琼脂糖，DNA聚合酶、dNTPsMix、DNAMarkerI，溴化乙锭(EB)，过硫酸铵(AP)，PBS-缓冲液。

3、主要仪器

基因扩增仪，冷冻高速离心机，凝胶成像系统，电泳槽，稳流稳压电泳仪，脱色摇床，电子天平，超纯水仪，微波炉及移液器。

二、试验方法

1、试验所需试剂配制

(1)PBS-缓冲液：8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa₂HPO₄、0.24gKH₂PO₄，溶于800mL超纯水中，用HCl调pH至7.4，加水定容到1L，高压灭菌，室温保存。

(2)5mol/LNaOH：20gNaOH溶于80mL超纯水中，定容至100mL，高压灭菌。

(3)0.5mol/LEDTA：EDTA186.1g，溶于800mL超纯水中，用NaOH调pH至8.0，定容至1000mL，高压灭菌，4℃避光保存。

(4)1mol/LTris-HCl(pH8.0)：121.14gTris碱，溶于800mL超纯水，盐酸调pH至8.0，定容至1000mL，高压灭菌，4℃存放。

(5)10％SDS：10gSDS溶于80mL超纯水中，加热至68℃助溶，搅拌溶解，盐酸调pH至7.2，定容至100mL。

(6)70％乙醇：无水乙醇700mL，加水300mL。

(7)氯仿∶异戊醇(24:1)：异戊醇20mL加入到480mL的氯仿试剂瓶中，混匀。

(8)20mg/mLRNase：RNaseA溶于10mmol/LTris-HCl(pH为8.0)、15mmol/LNaCl，配成20mg/mL浓度，70℃加热10min，钝化DNA酶，-20℃保存。

(9)DNA抽提缓冲液(STE)：10mmol/LTris-HCl(pH为8.0)、0.1mol/LEDTA(pH为8.0)、20μg/mL胰RNA酶、0.5％SDS，室温保存。

(10)蛋白酶K：用超纯水配成20mg/mL，-20℃分装保存。

(11)2.0％的琼脂糖：0.40g的琼脂糖充分溶解于20mL1×TBE。

(12)10×TBE：108gTris碱、55g硼酸、9.3gEDTA溶于1000mL去离子水中。

(13)30％丙烯酰胺(29:1)：70mL超纯水中加入29g丙烯酰胺和1gN,N-二亚甲双丙烯酰胺；玻璃棒搅动，加热溶解后，定容至100mL，置棕色瓶中，室温保存。

(14)PCR-SSCP变性缓冲液：去离子甲酰胺9.9mL，5mol/LEDTA100μL，二甲苯青0.0125g，溴酚蓝0.0125g。

(15)银染染色液：0.1％硝酸银，称取0.5g硝酸银溶于500mL双蒸水，备用。

(16)银染显色液：2％氢氧化钠，称10g氢氧化钠溶于500mL水中，临用前加入甲醛1mL。

2、牛血液基因组提取

(1)600μL全血转入一个无菌的1.5mL离心管中，加入1倍体积的PBS缓冲液并混匀稀释，4℃12000rpm离心10min；

(2)用移液器弃去上清液，再加入1倍体积的PBS缓冲液，重复2～3次直至溶液澄清；

(3)用移液器弃去上清液，沉淀物中加入1倍体积DNA提取液并混匀使其悬浮；

(4)加入20μL20mg/mL的蛋白酶K并混匀，65℃的恒温水浴中消化12～16h，直至絮状沉淀不见，溶液澄清；

(5)冷却至室温，加入1倍体积的Tris-饱和酚(pH为8.0)，冰上温和摇动15min，使其充分混匀，4℃，12000rpm离心10min；

(6)上面水相用移液器移到一个无菌干净的1.5mL离心管中，同时加入0.5倍体积的Tris-饱和酚和0.5倍体积的氯仿抽提1次，冰上口底温和摇动10min，然后4℃、12000rpm离心10min；

(7)上面水相用移液器移到一个无菌干净的离心管中，加入1倍体积的氯仿，冰上口底摇动10min，然后4℃、12000rpm离心10min；

(8)上面水相用移液器移到一个无菌干净的离心管中，加入1倍体积的酚、氯仿、异戊醇混合液(25:24:1)，冰上口底摇动充分混匀20min，4℃、12000rpm离心10min，重复1次；

(9)上面水相用移液器移到一个无菌干净的1.5mL离心管中，加入2倍体积冰冷的无水乙醇，轻轻口底上下晃动多次，直到DNA析出，然后-20℃放置30～60min；

(10)4℃、12000rpm离心5min，加入500μL70％乙醇清洗2次；

(11)倾倒出乙醇，10min真空干燥或空气干燥4～5h；

(12)用超微量紫外分光光度计，在紫外光波长为260nm和280nm分别测定光密度值，计算DNA含量和OD260/OD280的比值，如OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化；

(13)按DNA浓度(ng)＝50×OD260×稀释倍数的公式计算DNA的浓度(ng/μL)，稀释至50ng/μL，存于-20℃备用。

3、引物设计

根据NCBI登陆的牛Pax7基因序列(登录号：AC_000159.1)，设计一对引物Pax7-9上游引物和Pax7-9下游引物，其中：

Pax7-9上游引物：5'-AGCCTCCCATCCTCAGTC-3'；

Pax7-9下游引物：5'-GGACCTCATCCCAGACAGC-3'；

4、PCR反应

模板DNA：1μL；Pax上游引物：0.25μL；Pax下游引物：0.25μL；Mix:：7.5μL；DNA聚合酶0.15μL；ddH₂O：5.85μL，总体系15μL。

PCR反应程序：94℃预变性5min，然后94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环，72℃终延伸8min，最后4℃保存。

反应结束后，取PCR液5μL进行2％的琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物。

5、PCR-SSCP分析

配制10％聚丙烯酰胺凝胶，混匀后快速灌胶至电泳槽，插入梳子，室温待胶聚合使用；

取5μLPCR产物，加入5μL上样缓冲液，98℃变性10min，迅速冰浴10min，使之变性；

聚丙烯酰胺凝胶中240V电压电泳1h，180V电压电泳12h，电泳后银染和显色。SSCP分析后，纯化不同带型个体的PCR产物，送上海生工生物科技有限公司测序，测序结果用DNAMAN软件分析。

6、统计模型建立

根据牛群特点，构建以下固定模型:

Y_jkl＝μ+Marker_j+Year_k+Yard_l+e_jkl

式中：Y_jkl：个体表型记录；μ：总体均数；Marker_j：标记基因型效应；Year_k：年龄效应；Yard_l：场地效应；e_jkl：随机误差；

运用SPSS(18.0)软件对数据进行分析，并用最小二乘法拟合线性模型(GLM)，对各标记基因型对经济性状的影响进行差异显著性检验。结果用平均数±标准差(X±SD)表述，以P<0.05为差异显著水平，以P<0.01为差异极显著水平。

以下是给出的实施例：

利用本发明的引物(Pax7-9上游引物和Pax7-9下游引物)对皖东牛384个体、大别山牛193个体的基因组DNA进行PCR扩增，得到的扩增片段位于牛Pax7基因的第九外显子，长度为309bp，为该基因的编码区；扩增片段变形后，在10％的聚丙烯酰氨凝胶电泳中电泳，银染和显色。

SSCP的结果出现3种带型，对SSCP的不同带型进行分类，分别命名为分别命名为CC、CG、GG型。三种带型分别送2个样品测序，将测序结果与NCBI登陆的牛Pax7基因序列(登录号：AC_000159.1)相比较，发现皖东牛Pax7基因g.103976G>C突变位点，该位点位于牛Pax7基因外显子9。

将该突变位点与皖东牛、大别山牛体尺体重性状进行关联分析；

表牛Pax7基因g.103976G>C突变位点与体尺体重性状的关联分析表

注：数值为平均数±标准差；同行数据肩标不同大写字母A、B表示差异极显著，肩标不同小写字母a、b表示差异显著。

关联分析结果显示GG型和CG型的体高和体斜长极显著高于CC型；GG型和CG型的体重显著高于CC型；在胸围、管围和坐骨端宽方面差异不显著。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本技术方案范围内，当可利用以上所述技术内容，做出的些许更动、修饰、演变的等同变化，均为本发明的等效实例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所做的任何等同变化的更动、修饰和演变，均属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (3)

1.一种用Pax7基因检测牛体尺体重的方法，包括牛血液基因组提取、引物设计、PCR反应、PCR-SSCP分析和统计模型建立，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)牛血液基因组提取：苯酚-氯仿提取法提取牛全基因组DNA后利用TE缓冲溶液溶解DNA，采用超微量紫外分光光度计检测DNA浓度，最后稀释至50ng/μL，存于-20℃备用；

(2)引物设计：根据牛Pax7基因序列设计一对引物Pax7-9上游引物和Pax7-9下游引物，其中：

Pax7-9上游引物：5'-AGCCTCCCATCCTCAGTC-3'；

Pax7-9下游引物：5'-GGACCTCATCCCAGACAGC-3'；

(3)PCR反应：利用步骤(2)中设计的引物对全基因组DNA进行PCR扩增，获得牛Pax7基因位于外显子9的309bp片段，此区域为该基因的编码区；

(4)PCR-SSCP分析：扩增片段变性后，采用10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行银染和显色；SSCP分析后，纯化不同带型个体的PCR产物，分为三种基因型，测序后发现Pax7基因g.103976G>C突变位点，三种带型分别被命名为CC、CG和GG型，该突变位点位于Pax7基因外显子9；

(5)统计模型建立：根据牛群特点，建立固定模型，运用SPSS软件对数据进行分析，将碱基突变位点与牛体型体重性状进行关联分析，结果显示GG型和CG型的体高和体斜长极显著高于CC型；GG型和CG型的体重显著高于CC型；在胸围、管围和坐骨端宽方面差异不显著。

2.根据权利要求1所述的一种用Pax7基因检测牛体尺体重的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃终延伸8min；4℃保存。

3.根据权利要求1所述的一种用Pax7基因检测牛体尺体重的方法，其特征在于，步骤(3)中获得的位于外显子9的309bp的基因片段为皖东牛与大别山牛的体型性状选择的分子标记，为牛生长发育的评定提供分子标记辅助选择。