CN100500863C

CN100500863C - 检测饲料中牛羊成分的方法

Info

Publication number: CN100500863C
Application number: CNB2005100249778A
Authority: CN
Inventors: 张苏华; 沈富林; 黄士新; 李洁; 周文骏; 王蓓; 孙亚云; 曹莹
Original assignee: SHANGHAI CITY LIVESTOCK VETERINARY STATION
Current assignee: Shanghai Animal Epidemic Prevention And Control Center (shanghai Veterinary Drug Feed Testing Institute And Shanghai Animal Husbandry Technology Promotion Center); Zhejiang Dean Biotechnology Co ltd
Priority date: 2005-04-08
Filing date: 2005-04-08
Publication date: 2009-06-17
Anticipated expiration: 2025-04-08
Also published as: CN1810988A

Abstract

本发明提供了快速定量检测饲料中的牛源性/羊源性成分的遗传标记和方法。具体地，本发明提供了饲料中的牛源性/羊源性成分D-loop区核苷酸序列，以及以该序列为基础设计的引物和探针。利用本发明方法可方便、快速、准确地定性检测和定量计数饲料中的牛源性/羊源性成分。

Description

检测饲料中牛羊成分的方法

技术领域

本发明涉及检测领域，更具体地涉及可用于检测饲料中的牛源性/羊源性成分的核苷酸序列和以此序列为基础检测饲料中的牛源性/羊源性成分的方法。

背景技术

近年来，国际上对动物源食品的安全性问题日益重视。我国农业部也先后发布了一些规定明令禁止从英国等疯牛病病源国进口反刍动物肉食品和肉骨粉，以及禁止使用反刍类动物源性蛋白饲料的规定。

目前国内外主要采用酶链免疫吸附(ELISA)、普通PCR、巢式PCR、免疫-PCR等方法检测饲料中牛羊源性成分(Multiplex polymerase chain reactionmethod for detection of bovine materials in foodstuffs，Gao HW，ZhangDB，Pan AH，Liang WQ，Liang CZ.J AOAC Int.2003 Jul-Aug；86(4)：764-7；Development of a PCR assay for the detection of animal tissues inruminant feeds.Bottero MT，Dalmasso IA，Nucera D，Turi RM，Rosati S，Squadrone S，Goria M，Civera T.J Food Prot.2003 Dec；66(12)：2307-12.)，这类方法，后续分析过程繁琐；灵敏度不够高；容易产生假阳性结果，造成误读；且定量误差大。例如，普通PCR法检测牛羊成分不仅耗时长，而且还需采用电泳、染色、酶切、测序等方法进行后续分析，无法满足日常的快速、高灵敏度等的检测要求。

为了进一步加强对饲料加工企业、畜牧养殖业中加工和使用的饲料中牛羊成分的管理和监测，确保广大市民食用“放心肉”，促进饲料加工业健康发展，本领域迫切需要开发灵敏度更高、特异性更好、操作更简便地检测饲料中的牛源性/羊源性成分的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种快速定性和定量检测饲料中的牛源性/羊源性成分的方法和试剂盒。

本发明的另一目的是提供快速定性和定量检测饲料中的牛源性/羊源性成分的遗传标记。

在本发明的第一方面，提供了一种用于检测饲料中的牛源性和/或羊源性成分的遗传标记物，其特征在于，它具有SEQ ID NO：1和/或2中连续的300-900个核苷酸。

在另一优选例中，所述的遗传标记物具有SEQ ID NO：1或2中连续的500-800核苷酸。

在本发明的第二方面，提供了一种用于检测饲料中的牛源性和/或羊源性成分的寡核苷酸，其长度为14-35个核苷酸，且其序列与SEQ ID NO：1或2所示的序列相同或互补。

在另一优选例中，所述的寡核苷酸的长度为20-30个核苷酸。

在另一优选例中，所述的寡核苷酸是引物或探针，并且所述的引物可扩增出对应于SEQ ID NO：1或2的PCR扩增产物(扩增产物的长度通常为150-800bp或更长)，更佳地所述的寡核苷酸选自SEQ ID NO：3-7。

在本发明的第三方面，提供了一种检测饲料中的牛源性和/或羊源性成分的试剂盒，它含有容器以及位于容器中的特异性扩增牛羊成分遗传标记物的引物对，所述的引物长度为14-35个核苷酸，

其中一个引物的序列与SEQ ID NO：1所示的序列相同，且另一个引物的序列与SEQ ID NO：1所示的序列互补，并且所述引物扩增出长度为300-1000bp的扩增产物；或者一个引物的序列与SEQ ID NO：2所示的序列相同，且另一个引物的序列与SEQ IDNO：2所示的序列互补，并且所述引物扩增出长度为300-1000bp的扩增产物。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有探针，所述探针的长度为14-18bp左右，且该探针的序列与SEQ ID NO：1或2所示的序列相同或互补。

在另一优选例中，所述引物对选自下组：SEQ ID NO：3-4；并且所述的探针是选自下组的一种或多种：SEQ ID NO：5、6、7。

在本发明的第四方面，提供了一种检测样品中的牛源性和/或羊源性成分的方法，它包括步骤：

(a)抽提样品的DNA；

(b)将抽提的DNA作为模板，用特异性扩增牛羊成分遗传标记物的引物对进行PCR扩增，其中所述的引物长度为14-35个核苷酸，且一个引物的序列与SEQ ID NO：1所示的序列相同，且另一个引物的序列与SEQ ID NO：1所示的序列互补，并且所述引物扩增出长度为300-1000bp的扩增产物；或者一个引物的序列与SEQ ID NO：2所示的序列相同，且另一个引物的序列与SEQ ID NO：2所示的序列互补，并且所述引物扩增出长度为300-1000bp的扩增产物；

(c)检测扩增产物是否存在，存在扩增产物就表示样品中存在牛羊成分。

在另一优选例中，所述的步骤(c)是同时通过用牛特异性探针、羊特异性探针或牛羊通用探针与目标序列DNA的特异性结合及引物对与目标序列的特异性结合来确定样品中存在牛羊成分，其中，与牛特异性探针结合表示存在牛成分，与羊特异性探针结合表示存在羊成分，与牛羊通用探针结合表示存在牛成分和羊成分中至少一种成分；

此外，步骤(c)还包括通过检测荧光信号的强弱来定性定量检测样品中的饲料中的牛源性/羊源性成分。

附图说明

图1显示了牛D-Loop区，其中第476-899位为D-Loop区。其中用下划线标出了特异性核苷酸探针和各探针确切位置。

图2显示了羊D-Loop区，其中第1-1212位为D-Loop区。其中用下划线标出了特异性核苷酸探针和各探针确切位置。

图3显示了羊探针的线性回归曲线。

图4显示了牛探针的线性回归曲线。

具体实施方式

本发明人经过深入而广泛的研究，首次发现了牛羊的D-Loop区的序列，特别适合作为检测牛羊成分的特征性的遗传标记物。在该遗传标记物的基础上，开发了特异性扩增饲料中的牛源性/羊源性成分遗传标记物或其片段的引物和试剂盒，从而首次实现了对饲料中的牛源性/羊源性成分的快速检测。

如本文所用，术语“牛羊特异性引物(对)”指这样的引物(对)，它能够特异性结合于牛和羊的D-loop区核苷酸序列，并扩增出含D-loop区核苷酸序列的扩增产物。

如本文所用，术语“牛特异性探针”指能够结合于牛的模板DNA，但不结合于羊的模板DNA的探针。

如本文所用，术语“羊特异性探针”指能够结合于羊的模板DNA，但不结合于牛的模板DNA的探针。

如本文所用，术语“牛羊通用探针”指既能够结合于牛的模板DNA，又能够结合于羊的模板DNA的探针。

如本文所用，术语“牛源性/羊源性成分”，“牛源性和/或羊源性成分”以及“牛羊成分”可互换使用，都指来源于牛和/或羊的成分。较佳地，所述的牛羊成分含有核酸物质。

本发明的主要理论基础是牛、羊、猪、鸡、鱼、马等动物虽然在进化上极为接近，但是在D-Loop区域之间却有较为明显的多态性，而且这种多态性不仅特别适合用于将牛羊区别于其他动物(包括哺乳动物)，而且还特别适合进一步将牛和羊区分开，因此特别适用于检测样品(包括饲料样品)中是否存在牛羊成分。

基于D-Loop区，发明人设计出多种核酸分子引物和探针。用这些引物和探针，发明人建立了快速、准确检测和定量计数饲料中的牛源性/羊源性成分的分子生物学方法。

本发明所提供的用于饲料中的牛源性/羊源性成分检测的遗传标记，其核苷酸序列(SEQ ID NO：3-7)位于D-Loop区中。其全序列及结构特征如SEQ ID NO：1-2和图1-2所示。该序列可用PCR法(如实施例1)得到；或者按该序列的核苷酸组成和顺序，在商业化的DNA自动合成仪上按常规方法合成得到。

应理解，牛羊的D-Loop区在自然界有多种天然变异形式。在SEQ ID NO：1中仅列出了牛的D-Loop区的序列，在SEQ ID NO：2中仅列出了羊的D-Loop区的序列。然而，在GenBank数据库中还列出了其他多种变体的核苷酸序列。基于这些序列同样可以设计引物和探针。

优选的引物是其序列在野生型序列和多种变体序列中都存在的引物，例如当引物对可以在90％以上牛羊的DNA提取物中特异性扩增出产物，并且在其他动物的DNA提取物中无法特异性扩增出产物，那么该引物对就是优选的。

本发明所述的特异性扩增饲料中的牛源性/羊源性成分的引物以及检测用探针，可根据本发明的遗传标记的序列(SEQ ID NO：1或2)进行设计，并通过常规的DNA合成方法合成而得(例如可以用商业化的DNA自动合成仪合成)。

本发明的这些引物可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。

本发明所述饲料中的牛源性/羊源性成分特异性核酸分子引物具有较好的种特异性。用本发明引物进行常规PCR反应，结果只能从含有饲料中的牛羊成分的材料的DNA提取物中扩增出大小为300-1000特异性PCR产物。因此，以本发明引物进行常规PCR反应，并通过判断相应大小PCR产物的有无可以准确、快速地检测饲料中的牛羊成分，而且所需的样品量很少。优选的PCR方法是荧光实时PCR法。

同时本发明中所述的探针具有极高的特异性，可直接与靶DNA杂交结合。一种优选的探针是Taqman探针，它可在PCR反应中直接实时地通过荧光信号反映扩增产物的存在与否以及数量的高低。

本发明的探针可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。将该序列的5’端用报告荧光基团如羧基荧光素(Carboxyfluorescein，FAM)等标记，3’端用淬灭荧光基团如TAMRA或Dabcyl等标记后即可用于对饲料中的牛源性/羊源性成分进行定性和定量分析的实时PCR反应。

将本发明的引物与Taqman探针技术结合，便得到了本发明的同时对饲料中的牛源性/羊源性成分进行定性检测和定量计数分析方法，即Real-Time PCR反应。这种分析方法不仅克服了常规定量PCR方法中的误差，而且分析所需的样品量少，检出极限低，灵敏度高。

本发明还提供了检测样品(如饲料)中的牛羊成分的试剂盒。该试剂盒含有容器以及装于容器内的本发明的牛羊特异性引物。此外，试剂盒还宜含有牛特异性探针、羊特异性探针或牛羊通用探针。

此外，在试剂盒中还可含有提取DNA所需的试剂，或PCR反应所需的试剂。

本发明方法的主要优点在于：

(1)高灵敏度地检测出饲料中的牛羊成分。

(2)方法简便，仅使用一套引物进行扩增。

(3)在很大范围内有非常好的线性关系，可以很准确地定量测定饲料中的牛羊成分。

(4)特异性高。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

饲料中的牛源性/羊源性成分特异性引物对和探针的设计和合成

根据在NCBI数据库中所列出的各种牛、羊、猪、鸡、鱼、马等的特征性序列，经过序列对比，从D-Loop区域选出合适的片段，然后采用ABI的PrimerExpress软件，针对牛、羊分别设计出了如下特异性非常高的引物及探针：

上游引物：5’GAG CTT AAT TAC CAT GCC G 3’(SEQ ID NO：3)；

下游引物：5’TTA TGT GTG AGC ATG GGC 3’(SEQ ID NO：4)；

牛探针：FAM-5’TTT CTT CAG GGC CAT C 3’-TAMRA(SEQ ID NO：5)；

羊探针：(FAM-5’AGG GAT CCC TCT TC 3’-TAMRA)(SEQ ID NO：6)；

通用探针：(FAM-5’AGG GAT CCC TCT TC 3’-TAMRA)(SEQ ID NO：7)；

其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。

牛的D-Loop区序列列于SEQ ID NO：1。羊的D-Loop区序列列于SEQ ID NO：2。各引物和探针的相应位置示于图1和图2。

其中SEQ ID NO：3和4构成的引物对和通用探针(SEQ ID NO：7)能够同时结合于牛羊的遗传物质-DNA上，因而能够检测到饲料中的各种牛或羊成分。而牛探针则只能够结合于牛的DNA，故只能检测到饲料中的各种牛成分；羊探针只能够结合于羊的DNA，故只能检测到饲料中的各种羊成分。

实施例2

对饲料中的牛源性/羊源性成分的检测

首先，用常规方法抽提各种饲料样品中的DNA样品，或者用以下抽提试剂盒抽提各种饲料样品中的DNA样品：

A.缓冲液1(100mmol/L Tris-HCl，pH＝8.0，0.20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl)

B.缓冲液2(乙醚，酚：氯仿：异戊醇＝24：25：1，10％ SDS)

C.洗涤缓冲液(70％乙醇，3mol/L醋酸钠)

D.蛋白酶K(干粉，10mg/管，使用时配成10mg/mL)

E.DNA吸附柱。

接着，在含以下成分的PCR反应体系(40μL)中，加入引物(各0.25μl，浓度20μM/L)和抽提的DNA：

A.20％甘油(10μL)

B.10×TaqMan缓冲液A(5μL)

C.25μM MgCl₂(10μL)，

D.dATP(1μL)，dCTP(1μL)，dGTP(1μL)，dUTP(1μL)

E.Gold Taq聚合酶(5U/μL，购自ABI公司)0.5μL

F.AmpErase UNG酶(1U/μL，购自ABI公司)0.5μL

G.ddH₂O(10μL)

按常规的PCR方法进行PCR反应，其中反应循环条件为，50℃ 2分钟，95℃预变性10分钟，95℃变性30秒，63℃退火延伸30秒，45个循环后，4℃保存。(注：对59-65范围内的多个退火温度进行了重复试验，结果以63℃作为最佳退火温度)。

然后在7000 Sequence Detection System(Appiied Biosystems，美国)实时荧光定量仪上，使用通用探针、牛探针或羊探针进行检测，判定样本中的成分及含量。

结果：

(1)特异性和检测限

表1和表2为退火温度为63℃时，牛及羊模板DNA的实时荧光定量反应的结果。实验结果表明，在63℃的退火温度下，该方法的特异性和灵敏度都能够得到较好的满足。在该反应条件下，牛、羊、鱼、鸡及猪的模板DNA互不干扰，交叉率为0％；且其检测限都至少达到了饲料浓度分别为0.1％的牛骨粉及0.1％羊骨粉。

表1 使用牛探针(SEQ ID NO：5)时本发明方法的特异性和检测限

样品	10％牛骨粉	1％牛骨粉	0.5％牛骨粉	0.1％牛骨粉	100％羊骨粉	纯鱼粉
样品	10％牛骨粉	1％牛骨粉	0.5％牛骨粉	0.1％牛骨粉	100％羊骨粉	纯鱼粉	Ct<sub>(336K)</sub>	20.98	27.00	28.31	32.11	未检出	未检出

表2 使用羊探针(SEQ ID NO：6)时本发明方法的特异性和检测限

样品	10％羊骨粉	1％羊骨粉	0.5％羊骨粉	0.1％羊骨粉	100％牛骨粉	纯鱼粉
样品	10％羊骨粉	1％羊骨粉	0.5％羊骨粉	0.1％羊骨粉	100％牛骨粉	纯鱼粉	Ct<sub>(336K)</sub>	19.14	20.97	24.04	27.75	未检出	未检出

(2)定量范围

结果如图3和图4所示。

图3为羊探针的线性回归曲线。观察图谱可以发现当羊骨粉含量为10％至90％时，其Ct值与羊骨粉的浓度之间呈现较好的线性相关性，相关系数R＝0.987。当羊骨粉浓度小于10％时，Ct值与羊骨粉浓度之间不再呈现线性相关。

图4为牛探针的线性回归曲线。观察图谱可以发现当牛骨粉含量为30％至90％时，其Ct值与羊骨粉的浓度之间呈现较好的线性相关性，相关系数R＝0.987。当牛骨粉浓度小于30％时，Ct值与牛骨粉浓度之间不再呈现线性相关。

实施例3

阴性样品及阳性样品的实验结果比对

为验证了本发明方法，采用实施例2中相同的方法，分别对20份盲样进行了检测。即先从研细的饲料样品中抽提出DNA，然后在在7000 SequenceDetection System(Applied Biosystems，美国)实时荧光定量仪上，使用通用探针检测样本，判定样本的阴阳性。若样本呈阳性，则进一步使用牛探针和羊探针进行检测，判定样本中的成分及含量。

检测结果如表3和表4所示，与实际成分相符。

表3：饲料中牛源性成分的检测

样品	牛60％	牛60％	牛10％	牛10％	牛5％	牛5％	牛0.5％	牛0.5％	羊100％	羊100％
样品	牛60％	牛60％	牛10％	牛10％	牛5％	牛5％	牛0.5％	牛0.5％	羊100％	羊100％	Ct(通用探针)	18.00	18.40	20.29	20.29	23.23	23.91	26.15	26.23	21.80	21.93
Ct(牛探针)	18.31	18.47	22.90	23.77	24.26	24.35	29.00	28.10	阴性	阴性	Ct(通用探针)	18.00	18.40	20.29	20.29	23.23	23.91	26.15	26.23	21.80	21.93

注：％为饲料的质量百分比；Ct值为循环域值

表4：饲料中羊源性成分的检测

样品	羊50％	羊50％	羊10％	羊10％	羊5％	羊5％	羊0.5％	羊0.5％	牛100％	牛100％
样品	羊50％	羊50％	羊10％	羊10％	羊5％	羊5％	羊0.5％	羊0.5％	牛100％	牛100％	Ct(通用探针)	20.63	21.04	23.88	23.78	27.25	27.85	31.28	32.94	17.65	17.95
Ct(羊探针)	16.42	16.40	18.94	18.65	19.65	19.15	22.65	23.15	阴性	阴性	Ct(通用探针)	20.63	21.04	23.88	23.78	27.25	27.85	31.28	32.94	17.65	17.95

注：％为饲料的质量百分比；Ct值为循环域值

实施例4

饲料中的牛羊成分快速检测和定量计数试剂盒

为了有利于本方法的商品化，特制备方便使用的试剂盒，盒中含有下列试剂和材料：

1.上游引物(SEQ ID NO：3)溶液(20μmol/L)

2.下游引物(SEQ ID NO：4)溶液(20μmol/L)

3.荧光物质标记的牛特异性探针、羊特异性探针、牛羊通用探针(SEQ IDNO：5-7)(各20μmol/L)

4.使用说明书(一份)

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海市畜牧兽医站

<120>检测饲料中牛羊成分的方法和试剂盒

<130>042819

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>911

<212>DNA

<213>牛(taurus)

<400>1

<210>2

<211>1212

<212>DNA

<213>羊(Hircus)

<400>2

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

<210>5

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>探针

<400>5

<210>6

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>探针

<400>6

<210>7

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>探针

<400>7

Claims

1.一种检测样品中的牛源性或羊源性成分的方法，其特征在于，它包括步骤：

(a)用以下抽提试剂盒抽提各种饲料样品中的DNA样品：

A.缓冲液1，其中含有100mmol/L Tris-HCl，0.20mmol/L EDTA，和500mmol/LNaCl，pH＝8.0，

B.缓冲液2，其中含有乙醚，酚，氯仿，异戊醇和10％SDS，酚：氯仿：异戊醇＝24：25：1，

C.洗涤缓冲液，其中含有70％乙醇，和3mol/L醋酸钠

D.每管10mg的蛋白酶K干粉，使用时配成10mg/mL，

E.DNA吸附柱；

(b)将抽提的DNA作为模板，用特异性扩增牛羊成分遗传标记物的引物对SEQIDNO：3和4进行PCR扩增，在40μL含以下成分的PCR反应体系中，加入浓度20μM/L的引物各0.25μl和抽提的DNA：

A.10μL 20％甘油，

B.5μL 10×TaqMan缓冲液A

C.10μL 25μM MgCl₂，

D.1μL dATP，1μL dCTP，1μL dGTP，和1μL dUTP，

E.0.5μL 5U/μL Gold Taq聚合酶，

F.0.5μL 1U/μL AmpErase UNG酶，

G.10μL ddH₂O

按常规的PCR方法进行PCR反应，其中反应循环条件为，50℃ 2分钟，95℃预变性10分钟，95℃变性30秒，63℃退火延伸30秒，45个循环后，4℃保存；和

(c)在美国Applied Biosystems的7000 Sequence Detection System实时荧光定量仪上使用牛特异性探针SEQ ID NO：5、或羊特异性探针SEQ ID NO：6进行检测，判定样品中的成分及含量。