CN101260438A - PCR-mtDNA检测鹌鹑源性成分的扩增引物及其检测试剂盒和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明主要涉及禽类源性成分的检测，尤其涉及鹌鹑源性成分的检测。一种用于检测鹌鹑源性成分的特异性PCR－mtDNA扩增引物，其主要特点是上下游长度均为18bp的核苷酸，序列为上游引物AF(18bp)：5，－TGAGCTCAATAGCCGCCA－3′；下游引物AR(18bp)：5′－TGGCTTAATGGTTGGGTG－3′。本发明的优点是，准确、快速、可靠的鉴别鹌鹑源性成分的方法和技术，对有效抵御禽流感及其它禽类疫病的传播和蔓延，具有重要的现实意义。本发明以灭菌超纯水对鹌鹑DNA模板进行稀释，使其浓度分别降低到12ng/ul、1.2ng/ul、120pg/ul、12pg/ul、1.2pg/ul、120fg/ul、12fg/ul、1.2fg/ul，然后进行PCR扩增。由PCR产物电泳结果可知，能检测到的最低浓度为：120pg/ul，即该引物的灵敏度是120pg/ul。

Description

PCR-mtDNA检测鹌鹑源性成分的扩增引物及其检测试剂盒和使用方法

技术领域：

本发明主要涉及禽类源性成分的检测，尤其涉及鹌鹑源性成分的检测。

背景技术：

疯牛病、禽流感、羊搔痒病在世界各地的蔓延和传染给人类的事例，引起了各国政府和消费者对肉食品、饲料安全性的高度关注。目前畜禽肉食品的动物源性成分的鉴别检测已涉及到肉食品的工业、进出口贸易、市场及餐饮业等领域。同时，国内外肉食品及饲料贸易市场中的检验检疫工作对高新技术的需求也越来越迫切。因此，研究出一种准确、快速、可靠的鉴别畜禽类动物源性成分的方法，就非常有必要。

目前，为了确定食物及饲料的真实成分，已经开发了很多对动物源性成分鉴别的方法，有物理、化学、免疫学和分子生物学等方法。

在分子生物学方法中，分子标记技术以其快速、准确、稳定、高效等优点显示出巨大的开发潜力和广阔的应用前景。目前在动植物源性成分鉴别检测中应用的分子标记主要包括核DNA、RNA、线粒体DNA(mtDNA)、和蛋白质分子标记等。PCR分子标记鉴别检测技术，具有特异性高、针对性强、灵敏度高、简便快速、对检测样品要求低(几乎所有的样本都可以作为PCR的材料，它只要求样本中有完整的靶序列核酸)，因此，无论是经过远途运输或低温保存多年的陈旧样本，都可以用于PCR扩增。

哺乳动物和禽类mtDNA在遗传上相对独立，是双链的超螺旋环状分子，具有基因组小(约16kb)、没有重复序列、生物个体内无组织特异性、每个细胞中含有大量线粒体基因组(哺乳动物约1000～2300个拷贝)等特点。因此，用mtDNA分子标记鉴别畜禽肉食品及饲料动物源性成分与核DNA分子标记相比，具有灵敏度高、精确度好、快速、降解小(加工过程中mtDNA保持较完整)、稳定易操作等优势。基于动物mtDNA的PCR分子标记技术的上述特点，因此在动物源性成分鉴别检测中的应用具有广阔的前景。

国外已对牛、绵羊、猪、鸡的源性成分进行了研究报道，国内对牛、绵羊、猪、鸡、驴、马、鹿属进行了研究报道。在用分子生物学方法鉴定检测动物源性成分的研究上，国内外尚未见到对鹌鹑源性成分鉴别检测的研究报道。

发明内容：

本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种PCR-mtDNA技术检测鹌鹑源性成分的扩增引物及其特异性引物的扩增条件。

本发明的另一目的是提供一种PCR-mtDNA检测鹌鹑源性成分的检测试剂盒。

本发明的还有一个目的是提供一种PCR-mtDNA检测鹌鹑源性成分的检测试剂盒的使用方法。

以解决准确、快速、可靠的用PCR-mtDNA技术鉴别鹌鹑源性成分。

本发明的目的可以通过采用以下技术方案来实现：一种用于检测鹌鹑源性成分的特异性PCR-mtDNA扩增引物，其主要特点是上下游长度均为18bp的核苷酸，序列如下：

上游引物AF(18bp)：5，-TGAGCTCAATAGCCGCCA-3′；

下游引物AR(18bp)：5′-TGGCTTAATGGTTGGGTG-3′。

所述的用于检测鹌鹑源性成分的特异性PCR-mtDNA扩增引物，所述的特异性PCR-mtDNA扩增引物的扩增条件为94℃预变性5min，1个循环，然后进入PCR循环：94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸20sec，设计35个循环，最后72℃延伸8min。

所述的用于检测鹌鹑源性成分的特异性PCR-mtDNA检测试剂盒，包括有：①10×PCR缓冲液，其中含Mg²⁺20mmoL/L；②dNTP，其中2.5mmoL/L；③上游引物AF，其中25pmoL/L；④下游引物AR，其中25pmoL/L；⑤Taq酶，其中2U/μL；⑥灭菌超纯水；⑦DNA模板。

所述的用于检测鹌鹑源性成分的特异性PCR-mtDNA检测试剂盒使用方法，包括有如下步骤：

(1)待检物DNA的提取；

(2)试剂盒中各组分与待检物DNA混合，按权利要求2的条件进行PCR扩增；

(3)PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，含有鹌鹑源性成分的检测物被引物AF+AR扩增出DNA限制性片段，阳性即为检测出含有鹌鹑源性成分。

所述的用于鹌鹑源性成分检测的PCR-mtDNA检测的试剂盒使用方法，所述的待检物DNA的提取有如下步骤：

①称取0.03g研碎的待检测物样品于高压灭菌后的1.5ml离心管中，加入500μl细胞裂解液消化；

②加入蛋白酶K10μl，浓度20mg/ml，慢速搅拌使之溶解并混匀，如需要可再次加入蛋白酶K，置于50℃水浴中消化过夜，适时混匀多次；

③将细胞裂解液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，温和地转动离心管混匀两相，使水相与酚形成乳状液；

④4℃13000rpm/min离心10min，小心从离心机中取出离心管，禁止晃动，可见有清晰的分层，上层为水相，提取的DNA便在这上层水相中，下层为酚相，一般为黄色，中间可见有白色的絮状物为蛋白质。用大口的tip头(用剪刀将1mlTip头口剪成大于3mm的口，使孔径变大，以免核酸通过吸头时发生机械剪切)小心吸出上层水相，移至另一干净离心管中，尽量不要吸出两相的交界面；

⑤加入RNase(1％)3μl(1.5μl/ml)，轻轻混匀37℃水浴1h；

⑥降至室温后，再加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇，其比例为25∶24∶1温和的混匀两相，振荡2min，形成均匀乳浊液；

⑦重复步骤④；

⑧加入等体积的氯仿∶异戊醇，其比例为24∶1，使两相充分混匀继续抽提；

⑨重复步骤④；

⑩在水相中加入1/10体积的3M NaAc混匀后，再加入两倍体积的预冷的无水乙醇，弃上清液；

用70％乙醇漂洗1次，13000rpm离心5min，弃上清液，将离心管倒置于灭菌的滤纸上10～15min使乙醇挥发，干燥10～15min；

加入30μl TE缓冲液，室温放置24h，然后4℃保存备用。

本发明的有益效果是，近年来随着数个国家高致病性禽流感的相继发生，除鸡以外已波及到人、天鹅、猫等，因感染禽流感而致死的人数不断增加，禽类食品和饲料的安全性已关系到人类的安危。因此，研究出准确、快速、可靠的鉴别禽类动物源性成分的方法和技术，对有效抵御禽流感及其它禽类疫病的传播和蔓延，具有重要的现实意义。本发明以灭菌超纯水对鹌鹑DNA模板进行稀释，使其浓度分别降低到12ng/ul、1.2ng/ul、120pg/ul、12pg/ul、1.2pg/ul、120fg/ul、12fg/ul、1.2fg/ul，然后进行PCR扩增。由PCR产物电泳结果可知，能检测到的最低浓度为：120pg/ul，即该引物的灵敏度是120pg/ul。

附图说明：

图1为鹌鹑、含鹌鹑源性成分的饲料、鸽子、鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鹧鸪、牛、羊、马、驴、鱼基因组DNA的电泳检测结果图；

图2鹌鹑PCR扩增产物电泳图；

图3鹌鹑特异性基因片段的PCR检测电泳图；

图中：1、2kb Marker；DNA；：2、鹌鹑；3、含鹌鹑源性成分的饲料；4、鸽；5、鸡；6、鸭；7、鹅；8、鸵鸟；9、鹧鸪；10、牛；11、羊；12、马；13、驴14、鱼；15、空白对照；

图4鹌鹑特异性PCR灵敏度验证结果检测电泳图。

具体实施方式：

以下对所示之最佳实施例作进一步详述：

实施例1：对鹌鹑、含鹌鹑源性成分的饲料、鸽、鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鹧鸪、牛、羊、马、驴、鱼动物的的检测验证实验。其编号为1、2kb Marker；DNA；：2、鹌鹑；3、含鹌鹑源性成分的饲料；4、鸽；5、鸡；6、鸭；7、鹅；8、鸵鸟；9、鹧鸪；10、牛；11、羊；12、马；13、驴14、鱼；15、空白对照。

(1)总DNA的提取：

采用酚氯仿抽提法，提取鹌鹑、含鹌鹑源性成分的饲料、鸽、鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鹧鸪、牛、羊、马、驴、鱼动物的基因组DNA，电泳检测结果如图1。提取基因组DNA均经紫外分光光度计测定其纯度和浓度。测定OD260/OD280值均为1.8左右，说明DNA纯度较高符合PCR扩增要求。

(2)PCR-mtDNA特异性引物的设计

比较GenBank中公布的各种动物线粒体基因序列，依据其物种保守序列设计出鉴别检测鹌鹑源性成分的PCR特异性引物(只能扩增出鹌鹑DNA特异性片段，而扩增不出其它动物DNA特异性片段)，引物如下：

上游引物AF(18bp)：5，-TGAGCTCAATAGCCGCCA-3′

下游引物AR(18bp)：5′-TGGCTTAATGGTTGGGTG-3′

扩增序列长度为245bp。

(3)鹌鹑PCR扩增

利用设计的特异性引物AF和AR，以鹌鹑为模板进行PCR扩增。

(3.1)PCR反应体系：

灭菌超纯水                       18.5μl；

10×PCR缓冲液(含Mg²⁺20mmoL/L)    2.5μl；

d NTP(2.5mmoL/L)                   0.5μl；

上游引物AF(25pmoL/L)               1.0μl；

下游引物AR(25pmoL/L)               1.0μl；

Taq酶(2U/μL)                      0.5μl；

灭菌超纯水                         18.5μl；

DNA模板                            1.0μl。

反应总体积为25.0μl

(3.2)PCR反应条件

扩增条件为94℃预变性5min，1个循环，然后进入PCR循环：94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸20sec，设计35个循环，最后72℃延伸8min。

扩增产物电泳结果如图2，可以看出，扩增出约245bp的DNA片段，与预期扩增的片段长度相符。

原理

1)模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃5min后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；

2)模板DNA与引物的复性：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至57℃，引物模板DNA单链的互补序列配对结合；

3)引物的延伸：DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列DNA序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-复性-延伸三个过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

(4)引物的特异性验证：

利用所设计鉴别检测鹌鹑源性成分的特异性引物AF和AR，分别以鹌鹑，含鹌鹑源性成分的饲料，鸽，鸡，鸭，鹅，鸵鸟，鹧鸪，牛，羊，马，驴、鱼的DNA为模板进行PCR扩增，验证引物的特异性。PCR产物电泳结果见(图3)，该引物能够从鹌鹑及含有鹌鹑成分的饲料样品的DNA中扩增出特异性的目的条带，扩增产物大小为245bp，而从其它动物组织的DNA中均没有能够扩增出目的条带。

(5)扩增鹌鹑DNA产物测序序列：

将鹌鹑PCR扩增产物进行纯化后送测序公司测序。测序结果经与GENEBANK比对分析表明：PCR特异性扩增产物的测序结果与鹌鹑的线粒体DNA的12sRNA基因区段完全一致，同源性为100％。

鹌鹑PCR产物测序序列结果：

tgagctcaat agccgccact aataagacag gtcaaggtat agcctatggg atggaagaaa    60

tgggctacat tttctaaaat agaacaaacg aaaaaggaca tgaaacctgg tccttggaag    120

gaggatttag cagtaaaatg ggatcacttt gcccacttta agatggccct gaggcacgta    180

cataccgccc gtcaccctct tcaaaagcta ctaataccga taaataacac ccaaccatta    240

agcca                                                                245

(6)特异性PCR的灵敏度验证：

以灭菌超纯水对鹌鹑DNA模板进行稀释，使其浓度分别降低到12ng/ul、1.2ng/ul、120pg/ul、12pg/ul、1.2pg/ul、120fg/ul、12fg/ul、1.2fg/ul，然后进行PCR扩增。由PCR产物电泳结果图(图4)可知，能检测到的最低线为：120pg/ul，即该引物的灵敏度是120pg/ul。

实施例2：对含有鹌鹑源性成分的饲料的PCR检测方法：

(一)提取DNA：

采用酚氯仿抽提法：(参照“分子克隆试验指南(第二版).北京：科学出版社，1995：34～60”)

①称取0.03g研碎的待检测物样品于高压灭菌后的1.5ml离心管中，加入500μl细胞裂解液消化；

②加入蛋白酶K(20mg/ml)10μl，慢速搅拌使之溶解并混匀，如需要可再次加入蛋白酶K，置于50℃水浴中消化过夜，适时混匀多次；

③将细胞裂解液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，温和地转动离心管混匀两相，使水相与酚形成乳状液；

④4℃13000rpm/min离心10min，小心从离心机中取出离心管，禁止晃动，可见有清晰的分层，上层为水相，提取的DNA便在这上层水相中，下层为酚相，一般为黄色，中间可见有白色的絮状物为蛋白质。用大口的tip头(用剪刀将1mlTip头口剪成大于3mm的口，使孔径变大，以免核酸通过吸头时发生机械剪切)小心吸出上层水相，移至另一干净离心管中，尽量不要吸出两相的交界面；

⑤加入RNase(1％)3μl(1.5μl/ml)，轻轻混匀37℃水浴1h；

⑥降至室温后，再加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)温和的混匀两相，振荡2min，形成均匀乳浊液；

⑦重复步骤④；

⑧加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，使两相充分混匀继续抽提；

⑨重复步骤④；

⑩在水相中加入1/10体积的3MNaAc混匀后，再加入两倍体积的预冷的无水乙醇，弃上清液；

用70％乙醇漂洗1次，13000rpm离心5min，弃上清液，将离心管倒置于灭菌的滤纸上10～15min使乙醇挥发，干燥10～15min；

加入30μl TE缓冲液，室温放置24h，然后4℃保存备用。

(二)引物合成：

将上游引物AF(18bp)：5，-TGAGCTCAATAGCCGCCA-3′；下游引物AR(18bp)：

5′-TGGCTTAATGGTTGGGTG-3′合成，每条引物各20D，用时稀释到25pmol/L

(三)PCR扩增

PCR反应试剂盒：

10×PCR缓冲液(含Mg²⁺20mmoL/L)          2.5μl

dNTP(2.5mmoL/L)                        0.5μl

AF(25pmoL/L)                           1.0μl

AR(25pmoL/L)                           1.0μl

Taq酶(2U/μL)                          0.5μl

DNA模板                                1.0μl

加灭菌超纯水至25μl。

将试剂盒中各组分与待检物DNA混合。

PCR反应条件：

94℃预变性5min，1个循环，然后进入PCR循环：94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸20sec，设计35个循环，最后72℃延伸8min。

(四)电泳检测：

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物电泳结果见(图3)

(五)检测结果：

含有鹌鹑源性成分的检测物会被引物AF+AR扩增出DNA特异性片段，即阳性。

实施例3：基因组DNA的提取试剂的制备：

(1)细胞裂解液的制备：

①1M Tris-HCl 250mL：

称30.285gTris，加水定容至250mL，加HCl调解pH至8.0，高压灭菌，4℃保存。

②0.5mol/L EDTA：

在100mL双蒸水中加入37.22g EDTA-Na₂.2H₂0，剧烈搅拌，用NaOH调节pH至8.0(约需4gNaOH)，定容至200mL，分装后高压灭菌，4℃保存。

③10％(m/v)SDS：

将10g SDS溶于90mL双蒸水中，加热至68℃(助溶几滴浓HCl，pH＝7.2)，加水定容至100mL，分装备用，室温保存，无须灭菌。

取1mol/L的Tris-HCl(pH8.0)2mL、0.5mol/L的EDTA(pH8.0)40mL、10％(m/v)的SDS 10mL，加灭菌双蒸水定容至200mL。

(2)20mg/ml蛋白酶K的制备：100mg蛋白酶K溶于5ml灭菌双蒸水，-20℃保存。

(3)氯仿∶异戊醇(24∶1)：将氯仿、异戊醇按24∶1的体积混合，置棕色瓶中4℃保存。

(4)苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)：按25∶24∶1的体积将苯酚、氯仿、异戊醇混合，置棕色瓶中保存于4℃。

(5)3M NaAc的制备：

称取40.8gNaAc.3H₂0，溶解，加水至100mL。高压灭菌15min，4℃保存。

(6)10mg/ml RNase A的制备：称取RNase A 10mg溶于10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl中于100℃加热煮沸15min灭活DNase，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。如为Sigma公司产品，一般则不需加热煮沸。

序列表

<110>深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心

<120>PCR-mtDNA检测鹌鹑源性成分的扩增引物及其检测试剂盒和使用方法

<211>245bp

<212>DNA

<400>

tgagctcaat agccgccact aataagacag gtcaaggtat agcctatggg atggaagaaa    60

tgggctacat tttctaaaat agaacaaacg aaaaaggaca tgaaacctgg tccttggaag    120

gaggatttag cagtaaaatg ggatcacttt gcccacttta agatggccct gaggcacgta    180

cataccgccc gtcaccctct tcaaaagcta ctaataccga taaataacac ccaaccatta    240

agcca                                                                245

Claims (5)

1.一种用于检测鹌鹑源性成分的特异性PCR-mtDNA扩增引物，其特征是上下游长度均为18bp的核苷酸，序列如下：

上游引物AF(18bp)：5，-TGAGCTCAATAGCCGCCA-3′；

下游引物AR(18bp)：5′-TGGCTTAATGGTTGGGTG-3′。

2.如权利要求1所述的用于检测鹌鹑源性成分的特异性PCR-mtDNA扩增引物，其特征是所述的特异性PCR扩增引物的扩增条件为94℃预变性5min，1个循环，然后进入PCR循环：94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸20sec，设计35个循环，最后72℃延伸8min。

3.如权利要求1所述的用于检测鹌鹑源性成分的特异性PCR-mtDNA检测试剂盒，其特征是包括有：①10×PCR缓冲液，其中含Mg²⁺20mmoL/L；②dNTP，其中2.5mmoL/L；③上游引物AF，其中25pmoL/L；④下游引物AR，其中25pmoL/L；⑤Taq酶，其中2U/μL；⑥灭菌超纯水；⑦DNA模板。

4.如权利要求3所述的用于检测鹌鹑源性成分的特异性PCR-mtDNA检测试剂盒使用方法，其特征是包括有如下步骤：

(1)待检物DNA的提取；

(2)试剂盒中各组分与待检物DNA混合，按权利要求2的条件进行PCR扩增；

(3)PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，含有鹌鹑源性成分的检测物被引物AF+AR扩增出DNA特异性片段，阳性即为检测出含有鹌鹑源性成分。

5.如权利要求4所述的用于鹌鹑源性成分检测的PCR-mtDNA检测的试剂盒使用方法，其特征是所述的待检物DNA的提取有如下步骤：

①称取0.03g研碎的待检测物样品于高压灭菌后的1.5ml离心管中，加入500μl细胞裂解液消化；

②加入蛋白酶K10μl，浓度20mg/ml，慢速搅拌使之溶解并混匀，如需要可再次加入蛋白酶K，置于50℃水浴中消化过夜，适时混匀多次；

③将细胞裂解液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，温和地转动离心管混匀两相，使水相与酚形成乳状液；

④4℃13000rpm/min离心10min，从离心机中取出离心管，禁止晃动，见有清晰分层，上层为水相，提取的DNA便在这上层水相中，下层为酚相，一般为黄色，中间有白色的絮状物为蛋白质；用大口的tip头吸出上层水相，移至另一干净离心管中，尽量不要吸出两相的交界面；

⑤加入RNase3μl，浓度1.5μl/ml，混匀37℃水浴1h；

⑥降至室温后，再加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇，其比例为25∶24∶1，温和的混匀两相，振荡2min，形成均匀乳浊液；

⑦重复步骤④；

⑧加入等体积的氯仿∶异戊醇，其比例为24∶1，使两相充分混匀继续抽提；

⑨重复步骤④；

⑩在水相中加入1/10体积的3M醋酸钠混匀后，再加入两倍体积的预冷的无水乙醇，弃上清液；

用70％乙醇漂洗1次，13000rpm离心5min，弃上清液，将离心管倒置于灭菌的滤纸上10～15min使乙醇挥发，干燥10～15min；

加入30μl TE缓冲液，室温放置24h，然后4℃保存备用。

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