CN104388573B - 利用交叉引物和双探针恒温扩增检测牛肉源成分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了属于食品质量控制检测方法领域的用于交叉引物和双探针恒温扩增检测牛肉源成分的引物组，该引物组由一对外围引物、一对交叉引物和一对检测探针引物组成，具体由SEQ ID No：1‑SEQ ID No：6所示的核苷酸序列组成。本发明还公开了含有上述引物组的检测试剂盒，以及利用交叉引物和双探针恒温扩增检测牛肉源成分的方法。本发明引物组特异性强，只能用于检测牛肉源成分，与其他羊肉、鼠肉、鸡肉等肉类的基因无交叉反应，灵敏度高；其次，本发明方法检测速度快，检测效率高；此外不需要复杂仪器设备，仅用恒温水浴即可，方便实用，扩增产物通过试纸条进行检测结果的判读，尤其适用在基层现场检测。

Description

利用交叉引物和双探针恒温扩增检测牛肉源成分的方法
技术领域
本发明属于食品质量控制检测方法领域，具体涉及用于交叉引物和双探针恒温扩增检测牛肉源成分的引物组，以及含有该引物组的检测试剂盒，还涉及利用交叉引物和双探针恒温扩增检测牛肉源成分的方法。
背景技术
肉制品是人体蛋白质的重要来源。不同动物源的肉品质、价格上存在较大差异，由于利益的驱动，不法商人肉掺假现象时有发生，严重损害消费者利益，也带来食品安全问题。对动物源性成分进行现场检测，是解决肉掺假市场监管问题的有效方法。
牛肉相对于鼠肉和兔肉价格较高，是被掺假的对象之一。目前，对于牛肉源成分的区分和鉴定主要是利用核酸序列的特异性，即利用核酸扩增技术。常规PCR检测和荧光定量PCR检测是应用最广的核酸扩增技术，但是PCR技术需要PCR仪或荧光定量PCR仪，主要适合在实验室，而不利于在基层实验室推广应用等(罗家琴等,中国农业科学.2008,41(7):2112-2119；Kaur J等.2010,21(11):1536–1544.doi:10.1016/j.foodcont.2010.03)。
动物种源的定性检测要求所建立的体系具有较高的灵敏度，进而可检测到样品中某种动物源的存在与否。因此，目前的定性检测研究多将目的片段定位于多拷贝基因，例如线粒体基因，多数细胞皆含大量线粒体，且每个线粒体中含数拷贝线粒体DNA，从而可使检测限达到较低水平，提高灵敏度。分析比对鼠、牛、羊上的线粒体基因组序列，本发明选用具有牛属代表性的线粒体基因组中的ATP8基因作为检测牛属的目标核酸序列。
交叉引物恒温扩增技术(Crossing Priming Isothermal Amplification，CPA)(专利号为：ZL200810134583.1)是杭州优思达生物技术公司结合了恒温核酸扩增技术和核酸试纸条快速检测技术而发明的一种操作简单、时间短、成本低的检测技术，已广泛用于病原体检测等领域。该技术还具有特异性强、灵敏度高的特点，特别适合用于现场检测。目前该技术结合胶体金核酸试纸条的检测方法已被用在诸如沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌、结核分歧杆菌、恶性疟疾、霍乱弧菌、志贺氏菌、瓜果类斑病菌等病原菌的检测(祁军等.食品研究开发，2013,34(2):67-70；祁军等.中国媒介生物学及控制杂志，2013,24(3):204-207)。
经检索，没有发现交叉引物恒温扩增技术用于动物肉源检测方面的报道。
发明内容
针对目前动物源成分检测中存在的需要专门仪器设备和专门技术人才、检测方法复杂和检测速度慢等问题，本发明目的在于提供用于交叉引物和双探针恒温扩增核酸序列检测牛源性成分的引物组。
本发明另一目的在于提供利用交叉引物和双探针恒温扩增检测牛源性成分的试剂盒。
本发明第三目的在于提供利用交叉引物和双探针恒温扩增检测牛源性成分的方法。
实现本发明的技术方案如下：
本发明用于交叉引物和双探针恒温扩增检测牛源性成分的引物组，由一对外围引物、一对交叉引物和一对检测探针引物组成；
其中所述的一对外围引物为：
正向外围引物BOS4s：5’-CGATAAGGGCTACGAGAGG-3’(SEQ ID No:1)，
反向外围引物BOS5a：5’-AGATCATTGTCAGTCATGTTG-3’(SEQ ID No:2)，
所述的交叉引物为：
正向交叉引物BOS2a1s：
5’-TGGGAAAAATAGTAGAAAGTTGATTGTTGGTGTCAGTTCTGGATTG-3’(SEQ ID No:3)，
反向交叉引物BOS1s2a：
5’-TTGTTGGTGTCAGTTCTGGATTGTGGGAAAAATAGTAGAAAGTTGA-3’(SEQ ID No:4)，
所述一对检测探针引物为：
检测探针引物BOS1s2a*：
5’-TTGTTGGTGTCAGTTCTGGATTGTGGGAAAAATAGTAGAAAGTTGA-3’(SEQ ID No:5)，
检测探针引物BOSHP*：5’-ATTTCCAACACAAAACT-3’(SEQ ID No:6)；
其中BOS1s2a*的5’端标记修饰生物素，BOSHP*的5’端标记修饰荧光素FAM。
本发明利用交叉引物和双探针恒温扩增检测牛源性成分的试剂盒，包括下列6个部分，分别为核酸检测试纸条、SSC缓冲液、恒温扩增反应液、Bst DNA聚合酶液、无菌双蒸水以及阳性对照；其中所述的恒温扩增反应液(A管)括上述的一对外围引物、一对交叉扩增引物和一对检测探针引物，以及Thermol pol buffer、dNTPs溶液。
上述试剂盒中所述的核酸检测试纸条是指3号核酸检测试纸条，可于杭州优思达生物技术有限公司购买。
上述试剂盒中所述的SSC缓冲液的组成成分及其比例为：0.3mol/L NaCl,0.03mol/L柠檬酸钠,用1mol/L HCl调节pH至7.0。
所述的SSC缓冲液制备方如下：按照比例称取17.53g氯化钠、8.82g柠檬酸钠·2H2O，用800mL水溶解，用少量盐酸调pH值至7.0，定容1升，过滤后高压灭菌使用。
上述试剂盒中所述的恒温扩增反应液(A管)的组成成分及其比例为：正向外围引物BOS4s 0.125μmol/L，反向外围引物BOS5a 0.125μmol/L，正向交叉引物BOS2a1s 1μmol/L，反向交叉引物BOS1s2a 0.5μmol/L，检测探针引物BOS1s2a*0.5μmol/L，检测探针引物BOSHP*0.5μmol/L，dNTPs溶液0.25mmol/L，Betiane甜菜碱0.25M，1×Thermol pol buffer。
上述试剂盒中所述的1×Thermol pol buffer的组成成分及其比例为：10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl、2mM MgSO4、0.1％TritonX-100、pH8.8；
上述试剂盒中所述的Bst DNA聚合酶液(B管)为Bst DNA聚合酶液(8U/μL)，可于市场上购买。
上述试剂盒中所述的无菌双蒸水(C管)可作为阴性对照或补足反应体系用。所述的无菌双蒸水的制备方法为双蒸水经高压灭菌后，分装到灭菌的小管中。
上述试剂盒中所述的阳性对照(D管)为含有牛线粒体ATP8基因片段的质粒DNA。所述的牛线粒体ATP8基因片段由SEQ ID No:9所示的核苷酸序列组成。
上述试剂盒中所述的阳性对照,按照如下方法制备：(1)提取新鲜牛肉的基因组DNA，(2)以牛肉的基因组DNA为模板，以BOS3F(SEQ ID No：7)和BOS3R(SEQ ID No：8)为引物进行PCR扩增，得大小为271bp的ATP8基因片段PCR扩增产物；(2)将271bp的PCR扩增产物与pEASY-T1克隆载体链接，转化到Transl-T1感受态细胞中，IPTG诱导蓝白斑产生，取白色菌落，先用牛的引物(BOS3F(SEQ ID No：7)和BOS3R(SEQ ID No：8))进行菌落PCR验证；将阳性重组子摇菌培养，采用试剂盒提取质粒DNA，以质粒DNA为模板，以M13引物进行PCR扩增；PCR验证与预期片段相一致的质粒送上海生物工程技术有限公司测序；测序正确(见SEQ IDNo:9)的重组子菌落继续摇菌培养，用试剂盒提取质粒DNA，得阳性DNA样品；
其中所述的BOS3F和BOS3R引物为：
BOS3F：5’-GCCATATACTCTCCTTGGTGACA-3’(SEQ ID No:7)
BOS3R：5’-GTAGGCTTGGGAATAGTACGA-3’(SEQ ID No:8)。
本发明利用交叉引物和双探针恒温扩增检测牛源性成分的方法，包括以下步骤：
(1)、提取待测牛肉源样品基因组DNA；利用SDS、蛋白酶K常规哺乳动物DNA提取方法或者其他商业上使用的动物基因组DNA提取试剂盒提取待测样品的总DNA作为待测样品DNA模板；
(2)、利用上述试剂盒配制恒温扩增反应液：反应体系(25ul)：恒温扩增反应液(A管)20ul，Bst DNA聚合酶液(B管)1ul，双蒸水(C管)3ul，待测样品DNA或阳性对照(D管)分别为1ul或空白对照(C管)1ul；
先按反应体系依次向反应管中加入双蒸水(C管)、恒温扩增反应液(A管)、Bst DNA聚合酶液(B管)的和待测样品DNA或阳性对照(D管)，移液器吹打混匀(阳性对照应在阴性对照和所有样品之后加入)；
(3)、交叉引物恒温扩增程序：将反应管放置恒温水浴锅内，63℃温浴60-70min；
(4)、扩增产物的检测：将扩增产物滴加到核酸试纸条的加样区，再将核酸试纸条放入SSC缓冲液中，5～10min后通过试纸条的显色进行判读，扩增产物通过核酸检测试纸条进行判读；若结果为阳性，则样本中含有检测的核酸，试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区，一条位于检测区；若结果是阴性，则只有质控区出现一条红色条带，检测区没有条带。
上述方法中所述的核酸检测试纸条是指3号核酸检测试纸条，可从杭州优思达生物技术有限公司购买。
所述的引物组在检测牛源性成分上的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下突出优点和有益效果：(1)特异性强，本发明所用的线粒体ATP8基因是牛属特异性的，只能用于检测牛肉源成分，与其他羊肉、鼠肉、鸡肉等肉类的基因无交叉反应；(2)检测速度快，与传统的检测方法相比，本发明将检测时间缩短到100min，明显提高了检测效率；(3)方便实用，扩增产物通过一次性试纸条进行检测，5～10min即可完成检测结果的判读，尤其适用在基层现场检测。(4)不需要复杂仪器设备。
附图说明
图1.为以不同加工牛肉DNA为模板进行PCR扩增的线粒体ATP8基因271bp片段的电泳检测图谱；其中1为新鲜牛肉，2为熏制切片的熟肉，3为新鲜牛肉，4为尖椒牛柳牛肉。
图2.为节选的不同组引物的CPA扩增后检测结果电泳图谱；其中1、2分别为第1,2组引物，3为第7组引物。
图3.内外引物浓度比优化的CPA扩增后检测电泳图谱；其中1为体系1，2为体系2，3为体系3。
图4.探针浓度优化的CPA扩增后核酸试纸条检测照片；其中1.BOSHP*和BOS1s2a*分别为0.4和0.4μmol/L，2.BOSHP*和BOS1s2a*分别为0.5和0.4μmol/L；3.BOSHP*和BOS1s2a*分别为0.6和0.4μmol/L。
图5.CPA反应体系建立的电泳检测图谱，1为未加DNA模板对照，2为添加DNA模板体系处理，3为添加模板常温放置。
图6.CPA反应体系的试纸条检测结果照片，其中1为未加DNA模板的对照处和2为添加DNA模板处理2，3为添加模板常温放置。
图7.本发明方法检测检测羊、鼠、鸡肉结果照片，其中1为羊肉，2为鼠肉，3为鸡肉，4为牛肉，5为牛肉。
具体实施方式：
下面的实施例仅用于对本发明作进一步的解释和说明，但是本发明的保护范围不限于实施例。如无特别说明，下述实施例中所用的试验方法和试剂皆为本领域技术人员熟知的常规技术和试剂。下述实施例中引物与探针由上海生工生物工程技术有限公司合成、Thermo pol Buffer(热聚合缓冲液)和Bst DNA pol多聚酶购自北京纽英伦生物技术有限公司、dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司、Betiane(甜菜碱)购自阿拉丁试剂有限公司。
实施例1牛肉源成分特异性基因区段的确定
选用新鲜牛肉样品，用动物组织DNA试剂盒(杭州新景生物试剂开发有限公司，以下同)提取的牛肉基因组DNA为模板，用PCR检测牛肉线粒体ATP8基因检测的一对正反向引物(即引物BOS3F/3R：SEQ ID No：7/8))进行PCR扩增，PCR反应体系(Taq酶0.25μL，TaqBuffer 2μL，dNTPs 2μL，BOS3F 1μL，BOS3R 1μL，模板3μL，加双蒸水10.75μL)，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测结果(见图1，泳道1)。PCR产物送上海生物工程技术有限公司测序验证，测序结果与预期的271bp序列一致。
用动物组织DNA试剂盒分别提取鼠肉、羊肉、鸡肉、鸭肉的基因组DNA为模板，以BOS3F/3R引物(SEQ ID No：7/8)，分别PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测均未得到明显的DNA条带。说明牛肉线粒体ATP8基因的271bp的基因片段是牛属特异性的，可用于牛肉源成分的特异性检测。
实施例2不同加工的牛肉样品中牛肉线粒体ATP8基因PCR扩增检测
选用新鲜牛肉、熏制品牛肉、尖椒牛柳样品，碾磨成牛肉松，各取0.25mg样品；利用动物组织DNA试剂盒分别进行DNA提取；采用PCR反应体系同实施例1(Taq酶0.25μL，TaqBuffer 2μL，dNTPs 2μL，BOS 3F 1μL，BOS3R 1μL，模板3μL，加双蒸水10.75μL)，经PCR扩增后电泳检测不同来源的牛肉样品均获得一致的271bp片段(见图1)。说明不管加工方式如何，利用牛肉线粒体ATP8基因的271bp的基因片段都可以对牛肉进行特异性的检测。
实施例3本发明恒温扩增反应体系中交叉引物设计和筛选
试验设计：参考CPA反应(Fang RD等.Journal of C linical Microbiology,2009,47(3):847；Xu GL等.Scientific Reports,2012,2:246.doi:10.1038/srep00246)和LAMP在线软件(http://primerexplorer.jp/e/)设计引物体系、利用oligo 7、primer 5等软件分析引物参数，共在PCR扩增271bp区段序列内设计了7组交叉引物(其中6组被淘汰交叉引物的未列出)，目的片段是150bp-250bp之间，在设计引物时要求：引物中的G、C碱基含量高；要避免引物间形成二聚体；扩增片段之间的距离；避免形成发夹结构。综合以上因素我们经过多次筛选，第7组引物为本发明交叉引物，如下：
其中所述的一对外围引物为：
正向外围引物BOS4s：5’-CGATAAGGGCTACGAGAGG-3’(SEQ ID No:1)，
反向外围引物BOS5a：5’-AGATCATTGTCAGTCATGTTG-3’(SEQ ID No:2)，
述的交叉引物为：
正向交叉引物BOS2a1s：
5’-TGGGAAAAATAGTAGAAAGTTGATTGTTGGTGTCAGTTCTGGATTG-3’(SEQ ID No:3)，
反向交叉引物BOS1s2a：
5’-TTGTTGGTGTCAGTTCTGGATTGTGGGAAAAATAGTAGAAAGTTGA-3’(SEQ ID No:4)。
以新鲜牛肉提取的DNA为模板或以实施例1中PCR扩增的271bp产物为模板，添加dNTPs、Betiane(甜菜碱)、Bst DNA聚合酶液后，实验组内引物多种比例、浓度相互组合，63℃温浴在60-90minCPA反应实验。以271bp(即CK)作为对照，将设计的7组不同组交叉引物恒温反应后，琼脂糖凝胶电泳电泳检测。结果第1,2组交叉引物多次实验检测结果几乎没有条带，设计的第3,4,5,6组交叉引物检测结果逐渐有阶梯式的条带出现，在第7组交叉引物设计之后得到清晰的检测结果(见图2，为节选的不同组引物的CPA扩增后检测结果电泳图谱；其中泳道1、2分别为第1、2组引物，泳道3为第7组引物结果。经多次实验筛选将第7组的引物体系确定为本发明交叉引物。
实施例4 CPA反应内外引物浓度优化试验
对实施例3筛选的第7组引物体系浓度比例(表1)进行优化。设计不同内外引物浓度组合的25μL反应体系。其中外引物浓度范围在0.2～0.4μmol/L，内引物浓度范围在0.4μmol/L～0.8μmol/L。63℃恒温水浴60min进行CPA扩增。
表1 CPA反应内外引物浓度优化体系
试剂 实验1 实验2 实验3
10×Thermo pol buffer 2.5μL 2.5μL 2.5μL
10μmol/LBOS 4s 1.0μL 1.0μL 0.5μL
10μmol/L BOS5a 1.0μL 1.0μL 0.5μL
10μmol/L BOS2a1s 2.0μL 4.0μL 4.0μL
10μmol/L BOS1s2a 2.0μL 4.0μL 4.0μL
2.5mM dNTPs 4.0μL 4.0μL 4.0μL
8U Bst DNA聚合酶 1.0μL 1.0μL 1.0μL
模板(牛DNA) 1.0μL 1.0μL 1.0μL
1M甜菜碱 2.0μL 2.0μL 2.0μL
去离子水 8.5μL 4.5μL 5.5μL
Total 25μL 25μL 25μL
实验1、实验2、实验3的内外引物浓度比分别为1:2、1:4、1:8。经电泳检测(2％的琼脂糖凝胶，90V，400mA，30min)，结果(见图3)实验1和实验3结果相近，试验2结果相对实验1和实验3结果没有较清楚的条带。试验3条带明显，确定CPA体系中最佳内外引物浓度比为1:8。
实施例5检测探针引物浓度优化筛选试验
(1)对标记引物BOS HP(标记FAM)进行优化(如表2)，即体系1、体系2、体系3，分别设置标记引物浓度0.4、0.5和0.6μmol/L进行反应。
表2 CPA体系中探针浓度的优化试验体系
试剂 体系1 体系2 体系3
10x Thermo pol buffer 2.5μL 2.5μL 2.5μL
2μmol/LBOS 4s 1.25μL 1.25μL 1.25μL
2μmol/L BOS5a 1.25μL 1.25μL 1.25μL
10μmol/L BOS2a1s 2.0μL 4.0μL 4.0μL
10μmol/L BOS1s2a 1.0μL 1.0μL 1.0μL
2.5mM dNTPs 4.0μL 4.0μL 4.0μL
8U Bst DNA聚合酶 1.0μL 1.0μL 1.0μL
模板(牛DNA) 1.0μL 1.0μL 1.0μL
1M甜菜碱 2.0μL 2.0μL 2.0μL
5μmol/L HP* 2.0μL 2.5μL 3.0μL
10μmol/LBOS 1s2a* 1.0μL 1.0μL 1.0μL
去离子水 8.5μL 4.5μL 5.5μL
Total 25μL 25μL 25μL
CPA反应条件为：63℃恒温水浴60min。
(2)扩增产物的检测：扩增结束后取10μL扩增产物滴加到核酸试纸条的加样区。将试纸条放入含有200μL缓冲液的微孔板中。2-3min后即可通过试纸条的显色进行判读。试纸条结果(图4)如下：左侧为BOS HP**分别为0.4和0.4μmol/L呈阳性；中间BOS HP*BOS 1s2a*分别为0.5和0.4μmol/L，呈阳性；右侧BOS HP*BOS 1s2a*分别为0.6和0.4μmol/L，呈弱阳性。
综合分析确定标记引物BOS1s2a*的终浓度为0.4μmol/L，反向交叉引物BOS1s2a的终浓度为0.4μmol/L，选择标记引物HP*浓度为0.4μmol/L。
实施例6 CPA反应体系的建立及核算试纸条试验
(1)根据优化后的内外引物浓度比和标记引物浓度，设计CPA反应体系(见表3)，其中对照处理1和阳性处理(加入牛肉DNA模板)63℃恒温水浴60min，对照处理2(加入牛肉DNA模板)常温放置60min。
表3 CPA反应体系的设计
试剂 对照处理1 阳性处理 对照处理2
10x Thermo pol buffer 2.5μL 2.5μL 2.5μL
2μmol/L BOS4s 1.25μL 1.25μL 1.25μL
2μmol/L BOS5a 1.25μL 1.25μL 1.25μL
10μmol/L BOS2a1s 4.0μL 4.0μL 4.0μL
10μmol/L BOS1s2a 1.0μL 1.0μL 1.0μL
2.5mM dNTPs 4.0μL 4.0μL 4.0μL
8U Bst DNA聚合酶 1.0μL 1.0μL 1.0μL
模板(牛肉) / 1.0μL 1.0μL
1M甜菜碱 2.0μL 2.0μL 2.0μL
5μmol/L BOSHP* 2.0μL 2.0μL 2.0μL
10μmol/L BOS 1s2a* 1.0μL 1.0μL 1.0μL
去离子水 7.0μL 4.0μL 0μL
Total 25μL 25μL 25μL
(2)扩增结果检测
a.电泳检测：经电泳检测(2％的琼脂糖凝胶，90V，400mA，30min)，结果(见图5)未加模板对照处理1和添加模板体系室温放置的处理2(泳道1，3)电泳检测结果均没有扩增条带，阳性处理(泳道2)可见清晰的条带
b.试纸条检测：未加模板对照处理1和添加模板体系室温放置的处理2(试纸条1,3)检测结果为阴性，阳性处理(试纸条2)检测结果为阳性(见图6)。电泳结果与核酸试纸条检测结果相一致，说明建立的CPA体系能够进行牛肉源成分进行鉴别。
实施例7利用交叉引物和双探针恒温扩增检测牛源性成分的试剂盒制备
配制牛肉源成分恒温扩增反应核酸检测试剂盒包括：
(1)恒温扩增反应液(A管)：包括外围引物、交叉扩增引物、检测引物(探针)、Thermol pol buffer、dNTPs溶液；其20次用量扩增反应液(共400ul)的制备配方如下：
表4.恒温扩增反应液组成成分及其比例
试剂 浓度 加入量(μL)
正向外围引物BOS4s 2μmol/l 25
反向外围引物BOS5a 2μmol/l 25
正向交叉引物BOS2a1s 10μmol/l 40
反向交叉引物BOS1s2a 10μmol/l 20
检测探针引物BOS1s2a* 10μmol/l 20
检测探针引物BOSHP* 5μmol/l 40
dNTPs溶液 2.5mmol/l 80
Betiane甜菜碱 1M 40
Thermol pol buffer 10× 50
ddH2O 60
(2)Bst DNA聚合酶液(B管)：Bst DNA聚合酶液(8U/μL)共22μL；
(3)无菌双蒸水,多管(C管)：阴性对照和补足体系用；
(4)阳性对照(D管)：为含有牛线粒体ATP8基因片段的质粒DNA；按照本领域常规方法制备。
(5)核酸检测试纸条：3号核酸检测试纸条2包，共20条(购于杭州优思达生物技术有限公司)。
(6)2×SSC缓冲液的配制：称取17.53g氯化钠、8.82g柠檬酸钠·2H2O，用800ml水溶解，用少量盐酸调pH值至7.0，定容1升，过滤后高压灭菌使用。
(7)阴性对照：其制备方法为双蒸水经高压灭菌后，分装到灭菌的小管中。
实施例8利用交叉引物和双探针恒温扩增检测牛源性成分的方法对比试验
(一)试验样品：以牛肉、羊肉、鼠肉、鸡肉的基因为待测样品。
(二)试验方法：
(1)利用实施例7制备的试剂盒配制测肉类进行恒温扩增反应体系(见表5)，
表5 恒温扩增反应体系(25ul)
试剂 待测肉类样品(ul)
A管 20
B管 1
C管 3
D管 0
模板 1
(2)扩增产物的检测：扩增结束后取10μL扩增产物滴加到核酸试纸条的加样区，将试纸条放入含有200μLSSC缓冲液的微孔板中，2-3min后即可通过试纸条的显色进行判读。
结果(见图7)经试纸条检测羊、鼠、鸡肉类的基因后试纸条结果显示为阴性，检测新鲜牛肉试纸条结果为阳性。
从上述试验结果可知，本发明的引物组对牛肉源成分是特异性强，用本发明方法检测灵敏度高，检测速度快，方法简单。

Claims (5)

1.用于交叉引物和双探针恒温扩增检测牛源性成分的引物组，其特征在于由一对外围引物、一对交叉引物和一对检测探针引物组成；
其中所述的一对外围引物为：
正向外围引物BOS4s：5’-CGATAAGGGCTACGAGAGG-3’(SEQ ID No:1)，
反向外围引物BOS5a：5’-AGATCATTGTCAGTCATGTTG-3’(SEQ ID No:2)；
所述的交叉引物为：
正向交叉引物BOS2a1s：
5’-TGGGAAAAATAGTAGAAAGTTGATTGTTGGTGTCAGTTCTGGATTG-3’(SEQ ID No:3)，
反向交叉引物BOS1s2a：
5’-TTGTTGGTGTCAGTTCTGGATTGTGGGAAAAATAGTAGAAAGTTGA-3’(SEQ ID No:4)，
所述一对检测探针引物为：
检测探针引物BOS1s2a*：
5’-TTGTTGGTGTCAGTTCTGGATTGTGGGAAAAATAGTAGAAAGTTGA-3’(SEQ ID No:5)，
检测探针引物BOSHP*：5’-ATTTCCAACACAAAACT-3’(SEQ ID No:6)；
其中BOS1s2a*的5’端标记修饰生物素，BOSHP*的5’端标记修饰荧光素FAM。
2.利用交叉引物和双探针恒温扩增检测牛源性成分的试剂盒，其特征在于包括下列6个部分，分别为核酸检测试纸条、SSC缓冲液、恒温扩增反应液、Bst DNA聚合酶液、无菌双蒸水以及阳性对照；其中所述的恒温扩增反应液包括权利要求1所述的一对外围引物、一对交叉扩增引物和一对检测探针引物，以及Thermol pol buffer和dNTPs溶液；所述的恒温扩增反应液的组成成分及其比例为：正向外围引物BOS4s 0.125μmol/L，反向外围引物BOS5a0.125μmol/L，正向交叉引物BOS2a1s 1μmol/L，反向交叉引物BOS1s2a0.5μmol/L，检测探针引物BOS1s2a*0.5μmol/L，检测探针引物BOSHP*0.5μmol/L，dNTPs溶液0.25mmol/L，Betiane甜菜碱0.25M，1×Thermol pol buffer；所述的SSC缓冲液的组成成分及其比例为：0.3mol/L NaCl，0.03mol/L柠檬酸钠，用1mol/L HCl调节pH至7.0；所述的1×Thermol polbuffer的组成成分及其比例为：10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl、2mM MgSO4、0.1％TritonX-100、pH8.8；所述的Bst DNA聚合酶液为Bst DNA聚合酶液8U/μL；所述的阳性对照为含有牛线粒体ATP8基因片段的质粒DNA；所述的牛线粒体ATP8基因片段由SEQ IDNo:9所示的核苷酸序列组成。
3.按照权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的核酸检测试纸条是指购自杭州优思达生物技术有限公司的3号核酸检测试纸条。
4.利用交叉引物和双探针恒温扩增检测牛源性成分的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、提取待测牛肉源样品基因组DNA；
(2)、利用权利要求2所述的试剂盒配制恒温扩增反应液：反应体系25ul：恒温扩增反应液20ul，Bst DNA聚合酶液1ul，双蒸水3ul，待测样品DNA或阳性对照分别为1ul或空白对照1ul；其配制方法为先按反应体系依次向反应管中加入双蒸水、恒温扩增反应液、Bst DNA聚合酶液和待测样品DNA或阳性对照，移液器吹打混匀；
(3)、将反应管放置恒温水浴锅内，63℃温浴60-70min；
(4)、将扩增产物滴加到核酸试纸条的加样区，再将核酸试纸条放入SSC缓冲液中，5～10min后通过试纸条的显色进行判读，扩增产物通过核酸检测试纸条进行判读；若结果为阳性，则样本中含有检测的核酸，试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区，一条位于检测区；若结果是阴性，则只有质控区出现一条红色条带，检测区没有条带。
5.权利要求1所述的引物组在检测动物食品牛源性成分上的应用。
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