CN203238265U - 一种弯曲菌多重pcr检测试剂盒 - Google Patents
一种弯曲菌多重pcr检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN203238265U CN203238265U CN 201320068824 CN201320068824U CN203238265U CN 203238265 U CN203238265 U CN 203238265U CN 201320068824 CN201320068824 CN 201320068824 CN 201320068824 U CN201320068824 U CN 201320068824U CN 203238265 U CN203238265 U CN 203238265U
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- campylobacter
- kit
- campylobacteria
- multiplex pcr
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Abstract
本实用新型涉及弯曲菌多重PCR检测试剂盒。一种空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、海鸥弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌、胎儿弯曲菌胚胎亚种多重PCR检测试剂盒，其包括：盒盖、盒体、能够嵌入所述盒体的装有酶反应混合物的容器、能够嵌入所述盒体的装有引物混合物的容器、能够嵌入所述盒体的装有阳性对照的容器、和能够嵌入所述盒体的装有水的容器。本实用新型所述的试剂盒优点在于：1、多重PCR方法操作简单快速，能同时检测5种常见致病弯曲菌；2、本试剂盒中的阳性对照包含待测五种菌的DNA模版，能监控多重体系中每对引物的工作情况；多重PCR体系中加入弯曲菌23S rRNA通用引物，能直接反应每个PCR体系中是否加入了细菌DNA模版，防止出现由于模版加入量不够出现的假阴性。
Description
技术领域
本实用新型涉及分子生物学检测领域，具体地说，本实用新型涉及一种弯曲菌多重PCR检测试剂盒。
背景技术
弯曲菌(Campylobacter spp)是一种重要的人兽共患病原菌，常引起动物腹泻、流产、禽类肝炎和蓝冠病，还可引起人类急性肠炎、格林巴利综合征、反应性关节炎、Reiter’s综合征等多种痰病，人类常因摄入被弯曲菌污染的食物和饮水而感染。研究表明，该菌少至500个也可致病，但很少发生死亡，死亡率为千分之一。最易感人群是5岁以下儿童和15-29岁的青年。该菌广泛存在于鸟、禽、猫、狗等动物体内，已涉及生的和未煮熟的鸡、生的和巴氏杀菌不彻底的牛奶、蛋制品、生火腿、未经氯处理的水。弯曲菌传统的鉴定方法主要是生化鉴定和血清学方法，操作繁琐，检测周期长。因此，建立快速、准确的检测方法对控制弯曲菌尤为重要且非常迫切。目前市售的弯曲菌检测试剂盒，检测致病菌种类少，并且多种PCR体系中无弯曲菌23S rRNA通用引物，在判断阴性菌时，无法推测是否为模版DNA加入量不够。
实用新型内容
本实用新型的目的是提供一种弯曲菌多重PCR检测试剂盒。
为了实现本实用新型的目的，本实用新型提供一种弯曲菌多重PCR检测试剂盒，包括：盒盖、盒体、能够嵌入所述盒体的装有酶反应混合物的容器、能够嵌入所述盒体的装有引物混合物的容器、能够嵌入所述盒体的装有阳性对照的容器、和能够嵌入所述盒体的装有水 的容器。
如本文中使用的，术语“能够嵌入盒体”是指根据需要容器可以自由地插入盒体和从盒体中取出。
优选地，所述容器是1.5mL离心管。该规格的试管可以大规模便捷地应用于分子生物学检测领域。
优选地，所述水是无菌去离子水。
优选地，本实用新型的试剂盒还包括设置在所述盒体上的两个孔洞。根据需要，所述两个孔洞可以不装有容器，在需要时，两个孔洞中也可以装有需要使用的容器，该容器中装有需要的试剂，这样就极大地方便了用户的使用。
优选地，所述装有引物混合物的容器装有检测空肠弯曲菌的引物、检测结肠弯曲菌的引物、检测海鸥弯曲菌的引物、检测乌普萨拉弯曲菌的引物、检测胎儿弯曲菌胚胎亚种的引物和弯曲菌属23SrRNA通用引物。
更优选地，检测空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）的引物（以下简称CJ）为：
上游引物：5’-ACTTCTTTATTGCTTGCTGC-3’
下游引物：5’-GCCACAACAAGTAAAGAAGC-3’。
更优选地，检测结肠弯曲菌（C.coli）的引物（以下简称CC）为：
上游引物：5’-GTAAAACCAAAGCTTATCGTG-3’
下游引物：5’-TCCAGCAATGTGTGCAATG-3’。
更优选地，检测海鸥弯曲菌（C.lari）的引物（以下简称CL）为：
上游引物：5’-TAGAGAGATAGCAAAAGAGA-3’
下游引物：5’-TACACATAATAATCCCACCC-3’。
更优选地，检测乌普萨拉弯曲菌（C.upsaliensis）的引物（以下简称CU）为：
上游引物：5’-AATTGAAACTCTTGCTATCC-3’
下游引物：5’-TCATACATTTTACCCGAGCT-3’。
更优选地，检测胎儿弯曲菌胚胎亚种（C.fetus subsp.fetus）的引物（以下简称CF）为：
上游引物：5’-GCAAATATAAATGTAAGCGGAGAG-3’
下游引物：5’-TGCAGCGGCCCCACCTAT-3’。
更优选地，弯曲菌属23S rRNA通用引物（以下简称23S rRNA）为：
上游引物：5’-TATACCGGTAAGGAGTGCTGGAG-3’
上游引物：5’-ATCAATTAACCTTCGAGCACCG-3’。
本实用新型所述的试剂盒优点在于：1、多重PCR方法操作简单快速，能同时检测5种常见致病弯曲菌；2、本试剂盒中的阳性对照包含待测五种菌的DNA模版，能监控多重体系中每对引物的工作情况；多重PCR体系中加入弯曲菌23S rRNA通用引物，能直接反应每个PCR体系中是否加入了细菌DNA模版，防止出现由于模版加入量不够出现的假阴性。
附图说明
图1是本实用新型所述的试剂盒的结构示意图。
图中：1、盒盖；2、盒体；3、装有酶反应混合物的容器；4、装有引物混合物的容器；5、装有阳性对照的容器；6、装有水的容器；7、第一孔洞；8、第二孔洞；9、100bp DNA Ladder（Takara）；10、阳性对照；11、C.spp.23S r RNA；12、C.fetus subsp.fetus；13、C.jejuni；14、C.lari；15、C.upsaliensis；16、C.coli；17、100bp DNA Ladder（Takara）；18、100bp DNA Ladder（Takara）；19、阳性对照；20、C.jejun DNA扩增产物；21、C.jejun DNA扩增产物；22、C.coli DNA扩增产物；23、C.coli DNA扩增产物。
具体实施方式
以下实施例用于说明本实用新型，但不用来限制本实用新型的范围。
实施例1
一种弯曲菌多重PCR检测试剂盒，包括：盒盖1、盒体2、能够嵌入所述盒体2的装有酶反应混合物的1.5mL离心管3、能够嵌入所述盒体2的装有引物混合物的1.5mL离心管4、能够嵌入所述盒体2的装有阳性对照的1.5mL离心管5、能够嵌入所述盒体2的装有无菌去离子水的1.5mL离心管6、设置在所述盒体2上的第一孔洞7、和设置在所述盒体2上的第二孔洞8。装有引物混合物的1.5mL离心管4中装有检测空肠弯曲菌的引物、检测结肠弯曲菌的引物、检测海鸥弯曲菌的引物、检测乌普萨拉弯曲菌的引物、检测胎儿弯曲菌胚胎亚种的引物和弯曲菌属23S rRNA通用引物。
实施例2
设计实施例1中所述试剂盒，其中：
装有酶反应混合物的1.5mL离心管3中装有500μL的Mater Mix，所述Mater Mix包含PCR反应所需的DNA聚合酶0.5U/10μL，dNTPMixture(dATP,dCTP,dGTP,dTTP各0.4mM)，MgCl24mM。
装有引物混合物的1.5mL离心管4中装有200μL Primer Mix，所述Primer Mix由上述6种引物配制而成；各引物浓度为：其中引物CC、CF、CJ、CL、CU浓度为12.5μM，引物23Sr RNA浓度为2.5μM，终浓度比为CC:CF:CJ:CL:CU:23Sr RNA＝0.1875μM:0.1875μM:0.25μM:0.625μM:0.625μM:0.125μM。
装有阳性对照的1.5mL离心管5中装有50μL的阳性对照，阳性对照包含空肠弯曲菌（C.jejuni）、结肠弯曲菌（C.coli）、检测海鸥弯曲菌（C.lari）、乌普萨拉弯曲菌（C.upsaliensis）、胎儿弯曲菌胚胎亚种（C.fetus subsp.fetus）的基因组DNA，浓度均为1ng/μL。
装有无菌去离子水的1.5mL离心管6中装有1mL的无菌去离子水。
使用上述试剂盒来配制20μL的多重PCR反应体系，其中：无菌去离子水4μL、2×Master Mix10μL、Primer Mix4μL、阳性对照2μL。使用该配制的多重PCR反应体系来进行检测，包括下列步骤：
进行PCR反应，其中PCR反应条件如下：
94℃预变性6min；
94℃变形30sec，59℃复性30sec，72℃延伸30sec，30个循环；
72℃延伸7min。
将扩增产物进行琼脂糖凝胶（2%）电泳检测，结果如图2所示。
结果可见，出现650bp及435bp条带为胎儿弯曲菌胚胎亚种（C.fetus subsp.fetus）、出现650bp及323bp条带为空肠弯曲菌（C.jejuni）、出现650bp及251bp条带为海鸥弯曲菌（C.lari）、出现650bp及204bp条带为乌普萨拉弯曲菌（C.upsaliensis）、出现650bp及126bp条带为结肠弯曲菌（C.coli）。
实施例3病原菌的检查
按照下列方式制备病原菌DNA：从平板上挑取适量菌落，加入含有200μL的无菌去离子水的灭菌离心管中，震荡混匀，菌悬液肉眼可见混浊即可。菌液煮沸10min，冷却至室温后，在13,000rpm下离心2min。将上清液移至新离心管中，即得到可用于本试剂盒检测的细菌DNA模版。目前，也可以使用市售试剂盒提取病原菌DNA。
按照和实施例2类似的方式制备20μL的PCR反应体系，其中无菌去离子水4μL、2×Master Mix10μL、Primer Mix4μL、病原菌DNA2μL。PCR反应在K960梯度热循环仪（杭州晶格）中进行，具体的参数条件如下：94℃预变性6min；94℃变性30sec，59℃复性30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸7min。
PCR扩增产物的鉴定
用1×TAE缓冲液配置成2%的琼脂糖凝胶溶液，微波炉加热使琼脂糖完全溶解，加入1/20000体积的Dye Gene Green核酸染料（天根生化科技（北京）有限公司），倒胶后取适量PCR产物（15μL）与6×LoadingBuffer混匀后，上样分析。90V电压下电泳30min后，在紫外凝胶成像系统下观察结果并拍照记录。出现650bp及435bp条带为胎儿弯曲菌胚胎亚种（C.fetus subsp.fetus）、出现650bp及323bp条带为空肠弯曲菌（C.jejuni）、出现650bp及251bp条带为海鸥弯曲菌（C.lari）、出现650bp及204bp条带为乌普萨拉弯曲菌（C.upsaliensis）、出现650bp及126bp条带为结肠弯曲菌（C.coli）。仅出现650bp23Sr RNA扩增片段为阴性。
Claims (4)
1.一种空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、海鸥弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌、胎儿弯曲菌胚胎亚种多重PCR检测试剂盒，其特征在于，包括：盒盖、盒体、能够嵌入所述盒体的装有酶反应混合物的容器、能够嵌入所述盒体的装有引物混合物的容器、能够嵌入所述盒体的装有阳性对照的容器、和能够嵌入所述盒体的装有水的容器。
2.根据权利要求1所述的空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、海鸥弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌、胎儿弯曲菌胚胎亚种多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述容器是1.5mL离心管。
3.根据权利要求1所述的空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、海鸥弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌、胎儿弯曲菌胚胎亚种多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述水是无菌去离子水。
4.根据权利要求1所述的空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、海鸥弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌、胎儿弯曲菌胚胎亚种多重PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括设置在所述盒体上的两个孔洞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201320068824 CN203238265U (zh) | 2013-02-05 | 2013-02-05 | 一种弯曲菌多重pcr检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201320068824 CN203238265U (zh) | 2013-02-05 | 2013-02-05 | 一种弯曲菌多重pcr检测试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN203238265U true CN203238265U (zh) | 2013-10-16 |
Family
ID=49315582
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201320068824 Expired - Lifetime CN203238265U (zh) | 2013-02-05 | 2013-02-05 | 一种弯曲菌多重pcr检测试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN203238265U (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103627633A (zh) * | 2013-11-27 | 2014-03-12 | 苏州东胜兴业科学仪器有限公司 | 一种聚合酶链反应试剂盒 |
| CN105695585A (zh) * | 2016-03-16 | 2016-06-22 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 一种弯曲菌六重pcr检测试剂盒 |
| CN110423828A (zh) * | 2019-08-15 | 2019-11-08 | 广州市疾病预防控制中心(广州市卫生检验中心) | 一种检测胎儿弯曲菌龟亚种的pcr试剂盒 |
-
2013
- 2013-02-05 CN CN 201320068824 patent/CN203238265U/zh not_active Expired - Lifetime
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103627633A (zh) * | 2013-11-27 | 2014-03-12 | 苏州东胜兴业科学仪器有限公司 | 一种聚合酶链反应试剂盒 |
| CN105695585A (zh) * | 2016-03-16 | 2016-06-22 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 一种弯曲菌六重pcr检测试剂盒 |
| CN110423828A (zh) * | 2019-08-15 | 2019-11-08 | 广州市疾病预防控制中心(广州市卫生检验中心) | 一种检测胎儿弯曲菌龟亚种的pcr试剂盒 |
| CN110423828B (zh) * | 2019-08-15 | 2023-11-03 | 广州市疾病预防控制中心(广州市卫生检验中心) | 一种检测胎儿弯曲菌龟亚种的pcr试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105671197B (zh) | 一种食源性致病菌单增李斯特菌的检测方法 | |
| CN102534041B (zh) | 金黄色葡萄球菌肠毒素a、b基因pcr同步检测试剂盒 | |
| CN102199665A (zh) | 沙门氏菌lamp快速检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN103276103B (zh) | 检测猪流行性腹泻病毒的rt-lamp核酸试纸条试剂盒及应用 | |
| CN203238265U (zh) | 一种弯曲菌多重pcr检测试剂盒 | |
| CN101363061B (zh) | 检测食品沙门氏菌的Taqman探针荧光定量PCR方法 | |
| CN102286631B (zh) | 多重pcr快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法 | |
| Bauer et al. | Recommendations for identifying pathogenic Vibrio spp. as part of disease surveillance programmes in recirculating aquaculture systems for Pacific white shrimps (Litopenaeus vannamei) | |
| CN102643912B (zh) | 一种检测水貂源性成分的扩增引物 | |
| CN103468806A (zh) | 扇贝致病性灿烂弧菌Vibrio splendidus的快速检测方法 | |
| CN103789430B (zh) | 一种快速检测血液中附红细胞体、钩端螺旋体、弓形虫的试剂盒及应用 | |
| CN103276104A (zh) | 检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的rt-lamp核酸试纸条试剂盒及应用 | |
| CN104004842A (zh) | 一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重pcr引物组及检测方法 | |
| CN101260438B (zh) | PCR-mtDNA检测鹌鹑源性成分的扩增引物及其检测试剂盒和使用方法 | |
| CN104988233A (zh) | 一种利用线粒体dna鉴别牛羊肉中狗肉的lamp检测方法 | |
| CN105177138A (zh) | 一种用于检测橡胶树白粉菌的引物、方法及应用 | |
| CN104946782A (zh) | 沙门菌和大肠杆菌O78双重Tem-PCR快速检测方法 | |
| CN101921869B (zh) | 焦磷酸测序技术鉴别新城疫病毒强毒株与弱毒株的方法 | |
| CN100507005C (zh) | 畜禽肉和水产品中常见致病菌多重pcr快速检测试剂盒及检测方法 | |
| CN103146827A (zh) | 用于同时检测沙门菌枸橼菌变形菌和爱德华菌的多重pcr引物及其设计方法 | |
| CN105779578A (zh) | 一种利用重组酶介导等温核酸扩增技术检测沙门氏菌的方法 | |
| CN101805788B (zh) | 基于scar分子标记快速检测副溶血弧菌的pcr特异扩增引物及检测试剂盒 | |
| CN103255202A (zh) | 霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌的三重pcr检测方法 | |
| CN103820536A (zh) | 一种肠炎沙门氏菌的检测方法 | |
| CN100419087C (zh) | 用于检测溶藻弧菌的引物序列及检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210806 Address after: Room 1832, building 18, 99 Kechuang 14th Street, Beijing Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing Patentee after: IPHASE PHARMACEUTICAL SERVICES Address before: 101111 room 1832, unit 2, building 18, No. 99, Kechuang 14th Street, Beijing Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing Patentee before: IPHASE BIOSCIENCES (BEIJING) Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CX01 | Expiry of patent term |
Granted publication date: 20131016 |
|
| CX01 | Expiry of patent term |