CN113881757A - 一种基于crispr体系检测羊肉源基因的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子诊断领域，具体为一种基于CRISPR体系检测羊肉源基因的方法，本发明公开了一条羊的cr RNA，采用了RPA前置扩增与CRISPR/Cas12a体系两个步骤对羊肉源基因进行检测，具体为在扩增完成后，将扩增子加入CRISPR体系，由Cas12a‑cr RNA识别靶标并激活其反式切割活性，从而切断体系中的ss DNA荧光猝灭探针发出荧光指示信号，本发明能够将羊肉源基因特异性区分于牛，猪，鸡，鸭，驴，马，鼠，狐，兔，狗这10种肉类，在不依赖仪器的情况下，灵敏度达到10 pg/ul，而且检测时间仅需1h。

Description

一种基于CRISPR体系检测羊肉源基因的方法
技术领域
本发明属于生物检测技术，具体涉及基于CRISPR体系的羊肉源基因鉴定法。
背景技术
在高利润的驱动下，市场上肉类的质量不容乐观，肉类生产和加工过程中掺假的现象层出不穷。核酸检测技术是食品安全生物因素检测的趋势，经典的PCR技术早已沿用于肉类掺假领域，然而PCR技术需要长时间的变温过程，并且需要琼脂糖凝胶电泳通过凝胶成像仪进行定性分析，或者在PCR体系中加入染料或探针，使用qPCR仪进行定量分析。此后的LAMP（一种恒温检测方法），RPA（一种常温检测方法）等核酸扩增技术也逐步应用到食品安全领域，但是无论哪种核酸扩增技术在扩增过程中都会产生引物二聚体和非特异性扩增产物，这会出现假阳性的情况从而影响最终的结果判断。
发明内容
本发明公开了一条羊cr RNA，将其应用于RPA前置扩增结合CRISPR/Cas12a体系在不使用仪器的情况下对羊肉源DNA进行检测，并对该体系的特异性，灵敏度，进行实验验证，结果显示出该cr RNA具备特异性与体系灵敏度达到10 pg/ul。本发明所用的CRISPR/Cas12a系统的特异性避免了引物二聚体和非特异性扩增产物可能产生的假阳性的风险。
本发明采用如下技术方案：
一种基于CRISPR体系检测羊肉源基因的方法，包括以下步骤，在通用引物存在下，将模板DNA进行RPA扩增，然后将扩增产物加入CRISPR体系，反应结束后，根据产物在凝胶成像仪中的荧光现象，实现羊肉源基因的检测；所述CRISPR体系含有一条羊cr RNA。
本发明公开了通用引物、羊cr RNA在基于CRISPR体系检测羊肉源基因中的应用。
本发明中，通用引物能扩增11个动物物种线粒体基因片段，扩增子长117-122bp，具体为：上游引物：CTAAGGCACGTACATACCGCCCGTCACCCTC；下游引物：CACCTTCCGGTACACTTACCTTGTTACGACTT。羊cr RNA为AAUUUCUACUGUUGUAGAUCAUAUAUCAACCACACGAGA。
本发明中，模板DNA为肉源模板DNA，为牛、羊、猪、鸡、鸭、驴、马、鼠、狐、兔、狗中的一种或几种。
本发明中，RPA扩增的体系包括通用引物、RPA缓冲液、模板DNA、ddH2O、基础扩增试剂以及无机镁盐。优选的，RPA反应的温度为37℃，时间为15～30min，优选30min。
本发明中，CRISPR体系包括CRISPR酶、羊crRNA、ss DNA FQ报告探针、10×NEBbuff和RPA产物、ddH2O。CRISPR体系的反应时间为20～45 min，优选30 min。
本发明中，CRISPR体系反应结束后，使用凝胶成像仪目视观察荧光，如有荧光则说明样本DNA含有羊肉源基因，进一步的，可将反应液加入含有80 µl双蒸水的黑色96孔板中，使用酶标仪检测荧光强度，根据荧光强度对照，判断样本DNA是否含有羊肉源基因。
CRISPR系统是近年来新兴的一种基因编辑技术，现有技术利用其基因编辑系统对羊进行遗传修饰，将加速品种改良，提高动物生产性能，获得更加优质的农副产品。本发明使用通用引物对多个物种的线粒体DNA进行扩增，并首次给出一条羊crRNA，应用于构建的RPA结合CRISPR体系，并分别对体系的特异性，灵敏度进行验证。实验发现即便是在体系富含其他物种扩增产物的情况下，本发明所设计的cr RNA仍具有相当高的特异性，即只有羊样品发出高强度荧光，而其它10个物种的荧光强度与阴性对照相当。本发明所构建的体系在不依赖仪器的情况下能在1h内检测，仅仅需要一个具有稳定激发光的暗箱，就可以现场目视观测荧光。
附图说明
图1为11种模板RPA反应的扩增产物电泳图；
图2为实施例一凝胶成像仪目视观察荧光图；
图3为实施例一酶标仪探测的荧光强度图；
图4为实施例二灵敏度测试结果图；
图5为对比例灵敏度测试结果图。
具体实施方式
本发明的实验材料以及具体操作方法都是本领域常规方法，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，序列测序以及比对为现有常规技术。
主要仪器
Figure DEST_PATH_IMAGE001
主要试剂耗材
Figure 506817DEST_PATH_IMAGE002
实施例一
通用引物
上游引物：CTAAGGCACGTACATACCGCCCGTCACCCTC
下游引物：CACCTTCCGGTACACTTACCTTGTTACGACTT
该引物能扩增11个物种线粒体基因片段，扩增子长117-122bp。
羊的cr RNA，长度为39 bp：AAUUUCUACUGUUGUAGAUCAUAUAUCAACCACACGAGA。
DNA提取。依照柱式动物线粒体DNAout试剂盒的说明，依照步骤提取牛、羊、猪、鸡、鸭、驴、马、鼠、狐、兔、狗的DNA，并将其稀释至10ng/ul以准备加入在RPA中验证引物的通用性。
RPA反应。首先制备反应液：上游引物、下游引物（10µM）各2.4 µl；RPA缓冲液29.5µl；DNA模板 1 µl；ddH2O12.2 µl；然后将反应液与基础扩增试剂TwistAmp Basic混合，再加入2.5 μl 280mM的MgOAc溶液启动反应，在37℃放置30min反应完成；扩增产物可直接加入后续CRISPR体系，如若需要电泳验证扩增情况，则使用同体积抽提液（苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1）纯化扩增产物，混匀后12000rpm/min离心5min，取上清电泳。
琼脂糖凝胶电泳检测。琼脂板放入电泳池，贴紧边缘，mark(100bp)进样1.5µL，PCR产物进样4.5µL，RPA产物进样6µL。电泳程序：U=140V I=200mA t=30min。在RPA体系中分别加入牛，羊，猪，鸡，鸭，驴，马，鼠，狐，兔，狗的肉源基因组作为模板（10ng/µL），经RPA反应并纯化扩增产物，进行电泳，结果如图1所示。如图1所示，牛，羊，猪，鸡，鸭的目标条带单一且清晰明亮，显示出良好的通用性与扩增效率。
本发明公开的通用引物不仅对上述11中模板具有好的扩增性能，而且各扩增产物之间存在差异，通过将PCR扩增的产物测序，对11个物种的测序序列在NCBI中进行两两比对，绝大部分在NCBI中无法比对，重叠度低（＜40%），不统计其相似度，说明两条序列差异明显。且申请人给出按照引物的设计原则设计的另一对对比引物，其扩增效果以及特异性较差。可以参见申请人同日提交的另一申请“一对用于肉源鉴定的通用引物及其应用”，结果表明，本发明所设计的通用引物对的扩增产物具有良好的特异性，可以进行物种间的区分。
CRISPR体系的构建。CRISPR体系中包含终浓度为250nM Cas12a、500nM cr RNA、500nM ss DNA FQ探针（HEX-TTTTTTTT-BHQ1）、1 µl 10×NEB buff 2.1和1.5 µlRPA产物，用ddH2O将总体积调节至10µl，反应液在37℃孵育30 min，反应结束后使用凝胶成像仪目视观察荧光，再将反应液加入含有80 µl ddH2O的黑色96孔板中，使用酶标仪检测荧光强度。
本发明直接将上述11个物种的RPA扩增产物分别加入到CRISPR体系当中，通过凝胶成像仪目测荧光与酶标仪验证荧光强度，以验证本发明公开的上述羊的cr RNA是否具有出色的特异性，即只有加入羊肉源基因的CRISPR体系具有强烈荧光以区分其他物种。图2为CRISPR体系反应后在凝胶成像仪下的目视观测图像，图3为使用酶标仪探测的荧光强度图；可以看出本发明羊的cr RNA具有良好的特异性，能特异性的识别羊肉源靶标DNA。
实施例二
灵敏度的验证。将浓度为10 ng/ul的羊的线粒体DNA梯度稀释至1 pg/ul，使用实施例一所示的RPA结合CRISPR体系进行灵敏度的验证，结果显示本发明方法中，羊物种肉源基因的灵敏度能10 pg /ul，参见图4。
对比例
根据设计原则，设计了对比通用引物以及对比羊的cr RNA，具体如下：
上游引物：CAAGTCGTAACAAGGTAAGCGTACCGGAAAGTG
下游引物：GCTATCACCCAGCTCGGTAGGCATTTCACCTCTAC
对比羊的cr RNA：AAUUUCUACUGUUGUAGAUAACUGGAGAGUGGGAGGUUUUG
使用实施例二所示的方法进行灵敏度测试，结果见图5，最低为100pg /ul。
本发明使用通用引物对牛，羊，猪，鸡，鸭，驴，马，鼠，狐，兔，狗11个物种的线粒体DNA进行扩增，并首次给出羊crRNA，应用于构建的RPA结合CRISPR体系，并分别对体系的特异性，灵敏度进行验证，本发明的crRNA具有相当高的特异性，即只有羊样品发出高强度荧光，而其它10个物种的荧光强度与阴性对照相当。本发明所构建的体系在不依赖仪器的情况下能在1h内检测，仅仅需要一个具有稳定激发光的暗箱，就可以现场目视观测荧光。
序列表
<110> 苏州大学
<120> 一种基于CRISPR体系检测羊肉源基因的方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taaggcacgt acataccgcc cgtcaccctc 30
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accttccggt acacttacct tgttacgact t 31
<210> 3
<211> 39
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aauuucuacu guuguagauc auauaucaac cacacgaga 39
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctaaggcacg tacataccgc ccgtcaccct c 31
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caccttccgg tacacttacc ttgttacgac tt 32
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caagtcgtaa caaggtaagc gtaccggaaa gtg 33
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctatcaccc agctcggtag gcatttcacc tctac 35
<210> 6
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aauuucuacu guuguagaua acuggagagu gggagguuuu g 41

Claims (10)

1.一种基于CRISPR体系检测羊肉源基因的方法，其特征在于，包括以下步骤，在通用引物存在下，将模板DNA进行RPA扩增，然后将扩增产物加入CRISPR体系，反应结束后，根据产物在凝胶成像仪中的荧光现象，实现羊肉源基因的检测；所述CRISPR体系含有一条羊crRNA。
2.根据权利要求1所述基于CRISPR体系检测羊肉源基因的方法，其特征在于，通用引物中，上游引物为TAAGGCACGTACATACCGCCCGTCACCCTC；下游引物为ACCTTCCGGTACACTTACCTTGTTACGACTT。
3.根据权利要求1所述基于CRISPR体系检测羊肉源基因的方法，其特征在于，羊cr RNA为AAUUUCUACUGUUGUAGAUCAUAUAUCAACCACACGAGA。
4.根据权利要求1所述基于CRISPR体系检测羊肉源基因的方法，其特征在于，模板DNA为肉源模板DNA。
5.根据权利要求4所述基于CRISPR体系检测羊肉源基因的方法，其特征在于，肉源为牛、羊、猪、鸡、鸭、驴、马、鼠、狐、兔、狗中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述基于CRISPR体系检测羊肉源基因的方法，其特征在于，RPA扩增的体系包括通用引物、RPA缓冲液、模板DNA、ddH2O、基础扩增试剂以及无机镁盐；RPA反应的温度为37℃，时间为15～30min。
7.根据权利要求1所述基于CRISPR体系检测羊肉源基因的方法，其特征在于，CRISPR体系包括CRISPR酶、羊crRNA、ss DNA FQ报告探针、10×NEB buff和RPA产物、ddH2O；CRISPR体系的反应时间为20～45 min。
8.根据权利要求1所述基于CRISPR体系检测羊肉源基因的方法，其特征在于，CRISPR体系反应结束后，使用凝胶成像仪目视观察产物荧光，如有荧光则说明样本DNA含有羊肉源基因。
9.根据权利要求1所述基于CRISPR体系检测羊肉源基因的方法，其特征在于，使用酶标仪检测CRISPR体系反应产物的荧光强度。
10.通用引物、羊cr RNA在基于CRISPR体系检测羊肉源基因中的应用。
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