TWI763157B - 檢測康氏馬加鰆或棘鰆之特異性引子、含有該引子對之檢測套組及以該引子對進行檢測之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係揭露一種檢測康氏馬加鰆或棘鰆之特異性引子、含有該引子對之檢測套組及以該引子對進行檢測之方法，其中，該特異性引子係能與待測樣本進行擴增反應後，分析擴增產物之表現而判斷待測樣本中是否含有目標產物及/或定量目標產物，進而能夠用以作為準確判斷待測樣本中是否含有或是否為康氏馬加鰆或棘鰆之工具。
Description
本發明係有關於動物鑑定及檢測方法，特別係指一種檢測康氏馬加鰆及棘鰆之特異性引子、含有該引子對之檢測套組及以該引子對進行檢測之係能夠專一性雜交至康氏馬加鰆或棘鰆之DNA片段，進而能夠用以作為準確判斷待測樣本中是否含有或是否為康氏馬加鰆或棘鰆之工具。
按，魚類為人類重要之動物性蛋白質來源，並且根據研究，攝取魚肉能夠預防許多疾病，例如代謝症候群、心血管疾病等，而被認為較其他肉類健康，因此，魚類及其相關產品之市場需求量增加。惟，魚之品質及捕獲量係受到許多因素影響，以致於市場價格波動大，當需求大於供應時，部分業者為能從中獲取利益，則會從事水產品詐欺行為，例如水產品摻假、假冒標示、以低價物種取代高價物種等。該些錯標或是假冒水產品行為，不僅是一種欺騙消費者之行為，更會大幅降低水產品之可追溯性，使得食品安全暴露於高度風
險下，亦會使消費者健康面臨不可知之風險，例如食用錯標水產品引發過敏反應、誤食含有毒素之魚類所製成之水產品。
目前對於魚種鑑定之方法包含有外觀特徵鑑定法、蛋白質分析法、定序法等；其中，外觀鑑定法僅能適用於外觀完整之魚類，並且需要經驗才能判斷正確；蛋白質分析法雖然可以被應用於水產品上，但是檢測過程費時費力，並且檢測正確率會受到溫度或蛋白質活性影響；定序法成本昂貴，並使用於成分複雜之加工品上時，準確度會到雜質影響而下降，故無法廣泛地被應用。
本發明之主要目的係在於提供一種特異性引子對，其係能夠專一性雜交至康氏馬加鰆或棘鰆之DNA片段，用以作為準確判斷待測樣本中是否含有或是否為康氏馬加鰆或棘鰆之工具。
本發明之次一目的係在提供一種檢測樣本中是否來自或含有康氏馬加鰆/棘鰆之套組，其係至少含有一用以與康氏馬加鰆或棘鰆之DNA片段專一性雜交之引子對。
本發明之另一目的係在於提供一種檢測樣本中是否來自或含有康氏馬加鰆/棘鰆之方法，其係透過將特異性引子對與待測樣本進行擴增反應後，分析擴增產物之表現而判斷待測樣本中是否含有目標產物及/或定量目標產物。
緣是，為能達成前述目的，本發明係揭露一種引子對，其係能夠專一性地與康氏馬加鰆或棘鰆之DNA片段雜交。
於本發明之一實施例中，該引子對係包含有一第一引子及一第二引子，而能與康氏馬加鰆之DNA片段專一性雜交，其中，該第一引子之核酸序列編碼為SEQ ID No.：5，該第二引子之核酸序列編碼為SEQ ID No.：6。
於本發明之另一實施例中，該引子對係包含有一第三引子及一第四引子，而能與康氏馬加鰆之DNA片段專一性雜交，其中，該第三引子之核酸序列編碼為SEQ ID No.：7，該第四引子之核酸序列編碼為SEQ ID No.：8。
於本發明之又一實施例中，該引子對係包含有一第五引子及一第六引子，而能與棘鰆之DNA片段專一性雜交，其中，該第五引子之核酸序列編碼為SEQ ID No.：9或SEQ ID No.：11，該第六引子之核酸序列編碼為SEQ ID No.：10。
為能使上述引子對被商業化，本發明之一實施例係揭露一種檢測套組，其係至少包含有上述任一引子對及/或一檢測所需試劑，而透過該引子對與待測樣本進行反應，分析反應結果後，即可得知待測樣本中是否含有或是否來自康氏馬加鰆或棘鰆。
於本發明之次一實施例中係揭露一種檢測樣本中是否來自或含有康氏馬加鰆或棘鰆之方法，其係將待測樣本與上述任一引子對進行聚合酶鏈鎖反應反應，得到擴增產物後，再分析擴增產物及/或其表現，當分析結果為當該分析結果為該擴增產物中含有一目標產物時，判斷該待測樣本來自或含有康氏馬加鰆或棘鰆，而當該分析結果為該擴增產物中不含有該目標產物時，判斷該待測樣本非來自或不含有康氏馬加鰆或棘鰆。
其中，當本發明所揭方法係在於檢測樣本中是否來自或含有康氏馬加鰆時，檢測樣本之濃度至少為10pg。
其中，當本發明所揭方法係在於檢測樣本中是否來自或含有棘鰆時，檢測樣本之濃度至少為100pg。
於本發明之一實施例中，所使用之引子對的核酸序列分別為SEQ ID No.：5及SEQ ID No.：6時，目標產物之大小為122bp，意即分析擴增產物中是否為或含有大小為122bp之物質，可以得知擴增產物中是否有目標產物，而當擴增產物中含有或為大小為122bp之物質時，表示擴增產物中具有或含有目標產物，可知待測樣本係來自或含有康氏馬加鰆。
於本發明之一實施例中，所使用之引子對的核酸序列分別為SEQ ID No.：7及SEQ ID No.：8時，目標產物之大小為468bp，意即分析擴增產物中是否為或含有大小為486bp之物質，可以得知擴增產物中是否有目標產物，而當擴增產物中含有或為大小為486bp之物質時，表示待測樣本係來自或含有康氏馬加鰆；
於本發明之另一實施例中，所使用之引子對的核酸序列分別為SEQ ID No.：9及SEQ ID No.：10，目標產物之大小為425bp，當擴增產物中含有或為大小為425bp之物質時，表示擴增產物中具有或含有目標產物，可知待測樣本係來自或含有棘鰆。
於本發明之又一實施例中，所使用之引子對的核酸序列分別為SEQ ID No.：11及SEQ ID No.：10，該目標產物之大小為374bp。當擴增產物中含有或為大小為374bp之物質時，顯示待測樣本中含有目標產物，而推知待測樣本係來自或含有棘鰆。
於本發明之另一實施例中，該步驟C係得以螢光強度分析該擴增產物之表現，判斷該擴增產物中是否含有該目標產物或/及該目標產物之含量。
圖1係顯示SC-f1/SC-r1引子對於康氏馬加鰆COI序列上之黏合位置及方向。
圖2係顯示SC-f3/SC-r3引子對於康氏馬加鰆COI序列上之黏合位置及方向。
圖3係顯示AS-f1/AS-r1引子對於棘鰆COI序列上之黏合位置及方向。
圖4係顯示AS-f2/AS-r1引子對於棘鰆COI序列上之黏合位置及方向。
圖5係為各魚類樣本之PCR產物以膠體電泳分析之結果(一)，其中，使用之引子對為SC-f1/SC-r1引子對。
圖6係為各魚類樣本之PCR產物以膠體電泳分析之結果(二)，其中，使用之引子對為SC-f1/SC-r1引子對。
圖7係為各魚類樣本之PCR產物以膠體電泳分析之結果(一)，其中，使用之引子對為SC-f3/SC-r3引子對。
圖8係為各魚類樣本之PCR產物以膠體電泳分析之結果(二)，其中，使用之引子對為SC-f3/SC-r3引子對。
圖9係為各魚類樣本之PCR產物以膠體電泳分析之結果(一)，其中，使用之引子對為AS-f1/AS-r1引子對。
圖10係為各魚類樣本之PCR產物以膠體電泳分析之結果(二)，其中，使用之引子對為AS-f1/AS-r1引子對。
圖11係為各魚類樣本之PCR產物以膠體電泳分析之結果(一)，其中，使用之引子對為AS-f2/AS-r1引子對。
圖12係為各魚類樣本之PCR產物以膠體電泳分析之結果(二)，其中，使用之引子對為AS-f2/AS-r1引子對。
圖13係以SC-f3/SC-r3引子對檢測康氏馬加鰆不同DNA濃度之PCR結果。
圖14係以AS-f1/AS-r1引子對檢測康氏馬加鰆不同DNA濃度之PCR結果。
圖15係為各魚類樣本以SC-f3/SC-r3引子對進行qPCR後，進行螢光偵測之結果。
圖16係為各魚類樣本以SC-f3/SC-r3引子對進行qPCR後，進行溶解溫度分析之結果。
圖17係為各魚類樣本於不同DNA濃度下，以SC-f3/SC-r3引子對進行qPCR後，進行螢光偵測之結果。
圖18係為各魚類樣本於不同DNA濃度下，以SC-f3/SC-r3引子對進行qPCR後，進行溶解溫度之結果。
本發明所指「康氏馬加鰆(Scomberomorus commerson)」，俗稱土魠，其在生物分類系統中為：動物界(Animalia)、脊索動物門(Chordata)、輻鰭魚綱(Actinopterygii)、鱸形目(Perciformes)、鯖科(Scombridae)、馬鮫屬(Scomberomorus)。
本發明所指「棘鰆(Acanthocybium solandri)」，俗稱石喬，與康氏馬加鰆之外型差異僅在於頭部大小。
實例一：收集樣本
收集27種魚類樣本，其中，包含22個新鮮魚肉(編號為SC01~SC06、AS01~AS03、SG01~SG07、SN01~SN03、SS01~SS03)及5個熟魚塊樣本(編號為FP01~FP05)。
將新鮮魚類樣品分別進行基因組DNA(genomic DNA)萃取後，以PCR進行各樣本COI基因之擴增及分析，得到魚類各樣本之物PCR產物，其中，PCR中所使用之引子對如下表1所示，PCR條件為：94℃最初變性2分鐘後，94℃、30秒；黏合53℃、30秒；延展72℃、1分鐘；35個循環；最後延展72℃、10分鐘。
將各魚類樣本之PCR產物進行膠體電泳分析，確認增幅出之產物(COI基因)約為702bp。將各樣本之PCR產物純化後，利用pGEM-T載體系統進行基因轉殖，並篩選出基因重組細菌，進行核酸定序，得到各魚類樣本之COI基因序列，並於於NCBI之核酸序列資料庫(BLAST GenBank)進行比對，分析鑑定出各魚類樣品之鹼基組成百分比及魚種，如表2所示。
實例二：設計引子對
將該27個魚類樣品分別進行基因組DNA(genomic DNA)萃取後，以PCR進行各樣本COI基因之擴增及分析，得到魚類各樣本之物PCR產物，其中，PCR條件係如實例一中所述，使用引子對如上表1所示。
將各樣本之PCR產物純化後，利用pGEM-T載體系統進行基因轉殖，並篩選出基因重組細菌，進行核酸定序後，使用MEGA7比對各魚類樣本之COI基因序列，選擇同源性較低之COI基因序列設計康氏馬加鰆及棘鰆之特異性引子對，如下表3所示。
將表3所示各引子對上傳至NCBI之Primer-BLAST確認序列特異性。如圖1至圖4所示，SC-f1/SC-r1之引子對黏合位置為康氏馬加鰆序列位置386~407及486~507處；SC-f3/SC-r3之引子對黏合位置為康氏馬加鰆序列位置100~123及546~567處；AS-f1/AS-r1之引子對黏合位置為棘鰆序列位置137~160及540~561處；AS-f2/AS-r1之引子對黏合位置為棘鰆序列位置188~212及540~561。
實例三：PCR反應之特異性分析
將27種魚類樣本分別以實例一設計之各引子對進行PCR反應，其中，PCR反應條件係如實例一中所述。將各魚類樣本之PCR產物以膠體電泳分析(2% agarose gel，0.5X TBE buffer)，進行染色，經UV照射後以電腦影像分析系統紀錄分析結果，結果如表4及圖5至圖12所示。
由圖5及圖6之結果可知，以SC-f1/SC-r1作為引子對進行PCR，編號為SC01~SC06之樣本(條帶1~6)、編號為SG01~SG04之樣本(條帶7~10)確實分別有被檢測到大小為122bp之產物，而電泳圖中未發現其他新鮮魚類樣本有條帶，並且，編號為FP01~FP04之熟魚塊樣本亦有被擴增出大小為122bp之產物。
由圖7及圖8之結果可知，以SC-f3/SC-r3作為PCR反應之引子對時，編號為SC01~SC06及編號為SG01~SG04之樣本分別有被檢測到擴增出大小為168bp之產物，而其他新鮮魚類樣本中並未檢出，且編號為FP01~FP04之熟魚塊樣本亦有被擴增出大小為468bp之產物。
由圖9至圖12之結果可知，分別以AS-f1/AS-r1及AS-f2/AS-r1作為PCR反應之引子對時，僅有編號為AS01~AS03之樣本中有被擴增出大小為425bp之PCR產物。
將上述檢測分析結果與表2之結果比對，顯示本發明所揭SC-f1/SC-r1、SC-f3/SC-r3、AS-f1/AS-r1及AS-f2/AS-r1引子對分別具高度特異性；具體來說，SC-f1/SC-r1及SC-f3/SC-r3引子對係能夠用於區分土魠及低價物種，以及區分種間之差異；並且，SC-f1/SC-r1及SC-f3/SC-r3引子對係分別能夠用於檢測加工水產品是否來自或含有康氏馬加鰆或臺灣馬加鰆；且AS-f1/AS-r1及AS-f2/AS-r1引子對係能夠用於鑑定出待測樣本是否為棘鰆或是為由棘鰆所製成之水產品。
實例四：PCR反應之靈敏度分析
將康氏馬加鰆樣本中所萃取之DNA，以Quant-It dsDNA BR分析套組定量後進行序列稀釋(Template DNA 1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、0.1fg)，分別加入含有SC-f3/SC-r3引子對之PCR反應液後，進行PCR擴增反應；將棘鰆樣本中所萃取之DNA，以Quant-It dsDNA BR分析套組定量後進行序列稀釋(Template DNA 1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、0.1fg)，分別加入含有AS-f1/AS-r1引子對之PCR反應液中後，進行PCR擴增反應；其中，PCR反應液中含有0.5μl引子(10μM)，反應條件為以95℃最初變性3分鐘後，95℃、5秒；黏合65℃、10秒；延展72℃、5秒；40個循環。檢測結果如圖13及圖14所示。
由圖13之結果可知，SC-f3/SC-r3引子組對於康氏馬加鰆之PCR檢測極限為10pg；由圖14之結果可知，AS-f1/AS-r1引子對對於棘鰆PCR檢測極限為100pg。
實例五：即時定量聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)之特異性分析
取27個魚類樣本，分別以SC-f3/SC-r3引子對進行Real-time PCR，其中，PCR反應液中含有0.5μl引子(5μM)，反應條件為95℃最初變性3分鐘後，95℃、5秒；黏合65℃、10秒；延展72℃、5秒。40個循環。檢測結果如圖15及圖16所示，其中，圖15之螢光閾值(Threshold))設置0.11。
由圖15之結果可知，康氏馬加鰆之陽性檢體(編號為SC01-SC06)的Ct值為20.1~22.7；其餘魚種的Ct值為31.0~33.3，其與陰性對照組數值相近(Ct值為33.9)；而熟魚塊(編號為FP01~FP05)之Ct值分別為17.8、27.5、18.3、18.9及33.2。將圖15之結果與圖7及圖8進行比對，可知qPCR之結果與PCR之結果一致。更進一步來說，由此結果可知，本發明所揭各引子對係能夠用於判斷待測樣本中之參偽可能性，意即當待測樣本之Ct value明顯較高時，可判斷待測樣本中不含有康氏馬加鰆之可能性為高。
由圖16之結果可知，康氏馬加鰆之陽性檢體(編號為SC01-SC06)的溶解溫度值為86℃，在約83℃處亦出現波峰；陰性對照之溶解溫度值為77℃，其中，日本馬加鰆之溶解溫度值雖然與康氏馬加鰆之溶解溫度值相似，但螢光量較低，與陰性對照相近，其餘魚種則與陰性對照組一致；編號為FP01、FP03、FP04之熟魚塊樣本的溶解溫度值與陽性檢體一致，顯示其內應含有康氏馬加鰆或是由康氏馬加鰆所製成，而編號為FP05之熟魚塊樣本的溶解溫度值與陰性對照組一致，顯示其內不含有康氏馬加鰆。
實例六：Real-time PCR之靈敏度分析
取自27個魚類樣本萃取之DNA分別稀釋為不同濃度(Template DNA 1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、0.1fg)，再以SC-f3/SC-r3引子對進行qPCR擴增反應，其中，反應液中含有0.5μl primer(10μM)；反應條件為以95℃最初變性3分鐘後，95℃、5秒；黏合65℃、10秒；延展72℃、5秒，40個循環。檢測結果如圖17及圖18所示。
由圖17及圖18之結果可知，當康氏馬加鰆樣本濃度小於10pg時，易被引子二聚體干擾造成結果誤差，故將以SC-f3/SC-r3引子對進行qPCR之檢測極限為10pg，其與實例四之結果一致。
<110> 國立澎湖科技大學
<120> 檢測康氏馬加鰆或棘鰆之特異性引子、含有該引子對之檢測套組及以該引子對進行檢測之方法
<160> 11
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成
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<210> 2
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<223> 合成
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<212> DNA
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<213> 人工序列
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<223> 合成
<400> 11
Claims (12)
- 一種引子對，其係包含有一第一引子及一第二引子，其中，該第一引子之核酸序列編碼為SEQ ID No.：5，該第二引子之核酸序列編碼為SEQ ID No.：6。
- 一種引子對，其係包含有一第三引子及一第四引子，其中，該第三引子之核酸序列編碼為SEQ ID No.：7，該第四引子之核酸序列編碼為SEQ ID No.：8。
- 一種引子對，其係包含有一第五引子及一第六引子，其中，該第五引子之核酸序列編碼係選擇由SEQ ID No.：9及SEQ ID No.：11所組成之群，該第六引子之核酸序列編碼為SEQ ID No.：10。
- 一種檢測樣本中是否來自或含有康氏馬加鰆之方法，其包含有下列步驟：A.取一待測樣本；B.將該待測樣本以請求項1或2所述引子對進行聚合酶鏈鎖反應反應，得到一擴增產物；C.分析該擴增產物及/或其表現，得到一分析結果，當該分析結果為該擴增產物中含有一目標產物時，判斷該待測樣本來自或含有康氏馬加鰆，而當該分析結果為該擴增產物中不含有該目標產物時，判斷該待測樣本非來自或不含有康氏馬加鰆。
- 如請求項4所述檢測樣本中是否來自或含有康氏馬加鰆之方法，其中，該步驟C係以分子量比對法分析該擴增產物中是否含有該目標產物；當該引子對之核酸序列分別為SEQ ID No.：5及SEQ ID No.：6時，該目標產 物之大小為122bp，而當該引子對之核酸序列分別為SEQ ID No.：7及SEQ ID No.：8時，該目標產物之大小為468bp。
- 如請求項4所述檢測樣本中是否來自或含有康氏馬加鰆之方法，其中，該步驟C係以螢光強度分析該擴增產物之表現，判斷該擴增產物中是否含有該目標產物或/及該目標產物之含量。
- 如請求項4所述檢測樣本中是否來自或含有康氏馬加鰆之方法，其中，該步驟A中該待測樣本之濃度至少為10pg。
- 一種檢測樣本中是否來自或含有棘鰆之方法，其包含有下列步驟：A.取一待測樣本；B.將該待測樣本以請求項3所述引子對進行聚合酶鏈鎖反應反應，得到一擴增產物；C.分析該擴增產物及/或其表現，得到一分析結果，當該分析結果為該擴增產物中含有一目標產物時，判斷該待測樣本來自或含有棘鰆，而當該分析結果為該擴增產物中不含有該目標產物時，判斷該待測樣本非來自或不含有棘鰆。
- 如請求項8所述檢測樣本中是否來自或含有棘鰆之方法，其中，該步驟C係以分子量比對法分析該擴增產物中是否含有該目標產物；當該引子對之核酸序列分別為SEQ ID No.：9及SEQ ID No.：10時，該目標產物之大小為425bp，而當該引子對之核酸序列分別為SEQ ID No.：11及SEQ ID No.：10時，該目標產物之大小為374bp。
- 如請求項8所述檢測樣本中是否來自或含有棘鰆之方法，其中，該步驟C係以螢光強度分析該擴增產物之表現，判斷該擴增產物中是否含有該目標產物或/及該目標產物之含量。
- 如請求項8所述檢測樣本中是否來自或含有棘鰆之方法，其中，該步驟A中該待測樣本之濃度至少為100pg。
- 一種套組，其包含有一如請求項1至3中任一項所述之引子對。
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|---|
| 期刊韕Herwerden L., et al.,韕"Development and application of microsatellite markers for Scomberomorus commerson (Perciformes; Teleostei) to a population genetic study of Arabian Peninsula stocks",韕Fisheries Research,韕 Vol. 79韕,韕2006,韕page 258–266.韕; * |
| 期刊韕Lin W.F., et al., 韕"Application of species-specific PCR for the identification of dried bonito product (Katsuobushi)", 韕Food Chemistry,韕Vol. 106,韕,韕2008,韕page 390–396.韕 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW202221141A (zh) | 2022-06-01 |
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