CN109706250A

CN109706250A - 引物组合及其在猪的种属鉴定和/或猪肉鉴定中的应用

Info

Publication number: CN109706250A
Application number: CN201811631623.3A
Authority: CN
Inventors: 张岩; 陈燕旌; 邢婉丽; 蔡美静; 程京
Original assignee: CapitalBio Corp
Current assignee: CapitalBio Corp
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2019-05-03

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及引物组合及其在猪的种属鉴定和/或猪肉鉴定中的应用。本发明提供了灵敏度高、特异性强、重复性好的LAMP恒温扩增引物，比现有技术中提供的引物性能更优异。本发明的优点在于高效、简便、快速、结果可实时观测的特点，从样品的处理到报告结果只需1h，后期可以适应简单的实验条件或现场实时检测的需求。

Description

引物组合及其在猪的种属鉴定和/或猪肉鉴定中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及引物组合及其在猪的种属鉴定和/或猪肉鉴定中的应用。

背景技术

肉是我们人类优质蛋白质和多种营养素的主要来源，含有丰富的必须氨基酸和多种微量元素。近年来，随着我国居民生活水平的提高，仅国内生产的肉类远不能满足市场需求，需要从国外进口部分肉类。这些因素为国内外不法商贩乘虚而入创造了条件，在市场上肉的掺假和欺诈行为也越来越受到人们的关注。其中，猪肉以其鲜美的口感和实惠的价格受到许多消费者的喜爱。但同时，猪肉也常常被用作掺假肉来冒充一些名为鱼丸、牛肉丸和羊肉串等半加工食品，且这种情况比比皆是。所以，为了保障消费者合法权益，确立有效的肉源性成份鉴定方法是十分必要。

对于现今社会而言，传统的依靠感官和经验的肉类形态鉴别方法已经不能满足市场对肉制品掺假现象进行控制监管的需要。目前对肉类产品的鉴定方法主要在蛋白质和核酸水平进行。在蛋白质水平，常用ELISA和高效液相色谱等技术进行检测，其局限性在于对仪器、试剂和样品处理要求高，且检测加工样品时特异性和准确性较差，费时费力。相对来说，检测核酸的方式更方便准确。在核酸水平，常用的核酸水平检测技术有PCR与实时荧光PCR。PCR技术是目前最常用的检测肉源性成分的方法，因为其具有较高的灵敏度、特异性和可操作性。但一般的PCR反应至少1.5h，且后期检测需要使用基因测序和凝胶电泳，而凝胶电泳中的EB具有强致癌性，具有一定的安全隐患。而实时荧光PCR需要昂贵的仪器及试剂，且反应时间至少1.5h，且对操作人员有较高要求，难以在基层得以推广。

现有技术公开了检测猪肉的LAMP引物，该引物在总反应时间60min内检测出的极限为500fg的核酸，其使用的可视化法是在反应结束后，观察反应后的体系是否变浑浊，这种方法虽然简便，但由于个体差异和没有标准的判读范围，很容易在结果判读时造成假阳或假阴的结果误判。另一种可视化方法是在反应后开盖加入染料使其显色，这个过程中极其容易造成产物污染，导致其他检测指标出现假阳性现象。而本发明中提到的检测猪肉的LAMP引物，在总反应时间50min内即能检测到200fg的核酸，且使用荧光法LAMP进行检测，可以实时观察结果，避免了造成污染的风险。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了特异性强，且能准确鉴定样品中猪肉的特异性LAMP引物组，和利用该引物组建立的检测方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了线粒体Cox1基因在猪的种属鉴定和/或猪肉鉴定中的应用。

本发明还提供了一种标志物，具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。

在此基础上，本发明提供了具有如SEQ ID NO:7所示序列的核苷酸作为标志物在猪的种属鉴定和/或猪肉鉴定中的应用。

在上述研究的基础上，本发明还提供了引物组合，包括：引物-F3、引物-B3、引物-FIP、引物-BIP、引物-LF和引物-LB；

所述引物-F3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(I)、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

(II)、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(III)、与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(IV)、如(I)、(II)或(III)所示序列的互补序列；

所述引物-B3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(V)、具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

(VI)、具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(VII)、与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(VIII)、如(V)、(VI)或(VII)所示序列的互补序列；

所述引物-FIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(IX)、具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；

(X)、具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(XI)、与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(XII)、如(IX)、(X)或(XI)所示序列的互补序列；

所述引物-BIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(XIII)、具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

(XIV)、具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(XV)、与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(XVI)、如(XIII)、(XIV)或(XV)所示序列的互补序列；

所述引物-LF具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(XVII)、具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；

(XVIII)、具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(XIX)、与SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(XX)、如(XVII)、(XVIII)或(XIX)所示序列的互补序列；

所述引物-LB具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(XXI)、具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；

(XXII)、具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失和/或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

(XXIII)、与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(XXIV)、如(XXI)、(XXII)或(XXIII)所示序列的互补序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组合中所述引物-F3、所述引物-B3、所述引物-FIP、所述引物-BIP、所述引物-LF和所述引物-LB的摩尔比为0.3：0.3：2.4：2.4：1：1。

本发明还提供了一种试剂盒，包括所述的引物组合。

本发明还提供了所述的引物组合或所述的试剂盒在猪的种属鉴定和/或猪肉鉴定中的应用。

在上述研究的基础上，本发明还提供了一种猪的种属鉴定的方法，包括如下步骤：

(1)获得待测样品的核酸；

(2)以步骤(1)提取的核酸为模板，分别采用如权利要求4或5所述的引物组合中的引物进行环介导等温扩增，获得扩增结果；

(3)根据所述扩增结果获得鉴定结果：如果可以实现特异性扩增，则待测样品为猪；如果不能实现特异性扩增，则待测样品不为猪。

此外，本发明还提供了一种猪肉的鉴定的方法，包括如下步骤：

(1)获得待测样品的核酸；

(3)根据所述扩增结果获得鉴定结果：如果可以实现特异性扩增，则待测样品为猪肉；如果不能实现特异性扩增，则待测样品不为猪肉。

在本发明的一些具体实施方案中，所述环介导等温扩增的反应体系为：0.3mM的外引物F3和B3各0.12μL；2.4mM的内引物FIP和BIP各0.96μL；1mM的环引物LF和LB各0.4μL；2×反应缓冲液10μL；1μL的待测样品核酸，加水至20μL体系。

在本发明的一些具体实施方案中，所述环介导等温扩增的反应温度为60℃～65℃，反应时间为50min。

本发明提供了灵敏度高、特异性强、重复性好的LAMP恒温扩增引物，比现有技术中提供的引物性能更优异。本发明的优点在于高效、简便、快速、结果可实时观测的特点，从样品的处理到报告结果只需1h，后期可以适应简单的实验条件或现场实时检测的需求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示20ng/μL的猪肉核酸DNA采用本发明的引物进行LAMP反应的实时荧光值与反应时间图；

图2示20ng/μL的含有猪Cox1基因的阳性质粒、猪肉核酸DNA、绵羊肉核酸DNA、黄牛肉核酸DNA、鸭肉核酸DNA、鸡肉核酸DNA采用本发明的引物进行LAMP反应的实时荧光值与反应时间图，考察引物的特异性，结果只有含有猪COX1基因的阳性质粒和猪肉核酸DNA出现阳性扩增；

图3(A)～图3(F)示20ng/μl的阳性对照样品质粒DNA以10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的稀释度进行梯度稀释后，采用本发明的引物进行LAMP反应的实时荧光值与反应时间图；

图4示200fg/μL的猪肉核酸DNA采用本发明的引物进行LAMP反应的实时荧光值与反应时间图，结果为灵敏度下的重复性(20/20)考察结果。

具体实施方式

本发明公开了一种引物组合及其在猪的种属鉴定和/或猪肉鉴定中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了一种特异性强，且能准确鉴定样品中猪肉的LAMP检测用引物，序列为：

外引物Pig-F3-2：5’-GTTGATTAGCTACCCTGCAC-3’(如SEQ ID NO:1所示)；

外引物Pig-B3-1：5’-GGAGAATAGGGGGAATCAG-3’(如SEQ ID NO:2所示)；

内引物Pig-FIP-2：5’-ATACAATGTCTAGGGAGGAATTAGCGGCGGCAATATTAAATGATC-3’(如SEQ ID NO:3所示)；

内引物Pig-BIP-1：5’-ATTACATGATACATATTATGTAGTCGCTGAACAAAGCCCCCTATAAT-3’(如SEQ ID NO:4所示)；

环引物Pig-LF-2：5’-TACGGTGAATAGGAAGATGAAGCC-3’(如SEQ ID NO:5所示)；

环引物Pig-LB-1：5’-ACACTTCCACTATGTCTTATCTATAGG-3’(如SEQ ID NO:6所示)。

所述引物是针对NCBI数据库中提供的猪的Cox1基因的压缩序列进行设计的；为了提高引物的灵敏度，通过文献调研，确定选用线粒体基因Cox1作为检测对象。在NCBI的nt数据库中共收集到244条猪的Cox1序列，使用BioEdit软件将收集到的序列进行比对，并进行压缩生成Consensus Sequence序列，此序列即为压缩序列。为了提高引物的特异性，本引物在设计时使用该压缩序列与其他物种的压缩序列进行了比对(其它物种包括：牦牛、黄牛、水牛、绵羊、山羊、驴、马、鸭、鹅、鸡、鼠、猫、狗、狐狸、兔子和人等常见物种)，最终确定了能保证该引物特异性无问题的一段序列进行了LAMP引物设计。因为引物该LAMP引物设计需要人为特异性区分其它物种，因此本发明从每个物种的序列比对压缩、到物种间差异性的对比，得到针对上述分析得到的代表性基因序列区段(如SEQ ID NO:7所示)，再通过人工设计的方法得到了多套引物组合，然后进行引物组合的筛选和修改优化等一系列工作，灵敏度、重复性和特异性都达到最好水平的引物组合，其对检测样品中是否含有猪成分具有极高的特异性和灵敏度。

SEQ ID NO:7：GTAAAAGTATTTAGTTGATTAGCTACCCTGCACGGCGGCAATATTAAATGATCRCCCGCAATACTATGAGCTCTRGGCTTCATCTTCCTATTCACCGTAGGAGGTCTAACGGGCATTGTACTAGCTAAYTCCTCCCTAGACATTGTATTACATGATACATATTATGTAGTCGCACACTTCCACTATGTCTTATCTATAGGAGCAGTGTTYGCCATTATAGGGGGCTTTGTTCACTGATTCCCCCTATTCTCCGGGTACACACTCAACCAAGCATGAGCAAAAATTCACTTTGTAAT。其中，R和Y为简并碱基，R为A/G，Y为C/T。

本发明的另一方面是提供一种特异性强，且能准确鉴定样品中猪肉的LAMP检测方法，其特征在于，使用上述的LAMP检测用引物进行LAMP扩增。

为了进一步优化上述的检测方法，本发明提供的技术方案还包括：

0.3mM的外引物F3和B3各0.12μL；2.4mM的内引物FIP和BIP各0.96μL；1mM的环引物LF和LB各0.4μL；2×反应缓冲液10μL；1μL的样品DNA，加灭菌纯化水至20μL体系。

上述LAMP检测反应条件为：60℃-65℃恒温50min。

优选地，上述LAMP检测反应条件为：65℃恒温50min。

上述的LAMP检测方法中，检测结果通过观察实时荧光PCR仪出峰时间。

本发明另一方面还提供一种特异性强，且能准确鉴定样品中猪肉的LAMP检测的方法，鉴定样品中猪肉的检测方法中包含有上述的LAMP检测用引物。

本发明提供了一种特异性强，且能准确鉴定样品中猪肉的LAMP引物组和应用方法。使用LAMP技术在实时荧光PCR仪中实时检测生肉、肉类加工食品等以肉为主的样品中的猪肉核酸DNA。本发明筛选到的引物灵敏度高、特异性强，建立的检测方法具有准确率高、检测时间短、结果可实时观测的优点，从样品处理到报告结果只需1h，操作简单，比其它PCR方法具有更高的特异性，比现有的同类方法具有更快的检测速度。

本发明提供的引物组合及其在猪的种属鉴定和/或猪肉鉴定中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1引物的制备

所用引物序列由生工公司合成。针对靶序列设计6条引物，包括两条内引物(FIP和BIP)和两条外引物(F3和B3)和两条环引物(LF和LB)，其核苷酸序列列于表1。

LAMP检测体系的具体配置为0.3mM的外引物F3和B3各0.12μL；2.4mM的内引物FIP和BIP各0.96μL；1mM的环引物LF和LB各0.4μL；2×反应缓冲液10μL；1μL的样品DNA，加灭菌纯化水至20μL体系。

所述LAMP检测反应条件为：65℃恒温50min。

表1.环介导等温扩增技术所用引物信息

实施例2核酸DNA模板的制备

严格无菌采集猪、绵羊、黄牛、鸡、鸭的新鲜肌肉组织50mg左右作为样品，然后采用天根动物组织基因组DNA提取试剂盒(磁珠法)分别提取各组织中的DNA。

实施例3特异性试验

分别以本实验室保存的含有猪COX1基因的阳性质粒(阳性对照)，灭菌纯化水(阴性对照)，猪肉DNA，绵羊肉DNA，黄牛肉DNA，鸡肉DNA和鸭肉DNA为模板建立LAMP反应体系，进行LAMP扩增检测；采用NanoDrop 2000C超微量分光光度计测定各基因组DNA浓度及纯度，并将所有样品的基因组DNA稀释为20ng/uL。

上述5种对照样品的基因组核酸DNA提取均使用天根动物组织基因组DNA提取试剂盒(磁珠法)完成；含有猪COX1基因的阳性质粒为康为世纪质粒DNA提取试剂盒完成。

按如下列原则判定LAMP反应结果。

结果判断为阳性反应的现象为：采用实时荧光PCR仪器进行扩增，观察实时荧光曲线，反应时间为50min，观察实时荧光曲线的出峰时间。以灭菌纯化水做阴性对照实验，阴性对照实验结果应为阴性。(见图2)

1)若Ct≤40，判定LAMP测试结果为阳性；

2)若Ct＞45，未出现1)中所述现象，判定LAMP测试结果为阴性；

3)若40＜Ct≤45，出现1)中所述现象，判定LAMP测试结果为可疑，需要重新实验；

4)对可疑结果重新实验后，若Ct≤45，出现1)中所述现象，判定LAMP测试结果为阳性，否则判断为阴性。

对其它未含有样品中猪肉基因组在反应的50min时间内未检测出(无实时荧光曲线)，显示为阴性反应。

表2.实验用肉类及LAMP检测结果

实施例4灵敏度及灵敏度下的重复性试验

将实施例1的阳性对照样品采用NanoDrop 2000C超微量分光光度计测定基因组DNA浓度及纯度，并将阳性对照样品质粒DNA稀释为20ng/μL，再将20ng/μl的阳性对照样品质粒DNA以10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的稀释度进行梯度稀释，最后使用本发明的LAMP测试方法对上述DNA样本进行测定。

当样品中猪肉核酸DNA的浓度为200fg/μL时(稀释度为10^-5)，反应阳性结果判读时间小于40min(实测Ct值＝30min)(图3)。

将实施例1的阳性对照样品采用NanoDrop 2000C超微量分光光度计测定基因组DNA浓度及纯度，并将阳性对照样品质粒DNA稀释为200fg/μL(即稀释到该引物所能检测到的最低浓度)，最后使用本发明的LAMP测试方法对上述DNA样本进行重复性测定。重复次数为20次。(图4)

因此，本发明所采用的LAMP检测方法定性实验的检测灵敏度至少可达到200fg/μL(稀释度为10^-3)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 博奥生物集团有限公司

<120> 引物组合及其在猪的种属鉴定和/或猪肉鉴定中的应用

<130> MP1832063

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gttgattagc taccctgcac 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggagaatagg gggaatcag 19

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atacaatgtc tagggaggaa ttagcggcgg caatattaaa tgatc 45

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

attacatgat acatattatg tagtcgctga acaaagcccc ctataat 47

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tacggtgaat aggaagatga agcc 24

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acacttccac tatgtcttat ctatagg 27

<210> 7

<211> 296

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<222> (55)..(55)

<223> r=A/G

<220>

<221> unsure

<222> (75)..(75)

<223> r=A/G

<220>

<221> unsure

<222> (129)..(129)

<223> y=C/T

<220>

<221> unsure

<222> (210)..(210)

<223> y=C/T

<400> 7

gtaaaagtat ttagttgatt agctaccctg cacggcggca atattaaatg atcrcccgca 60

atactatgag ctctrggctt catcttccta ttcaccgtag gaggtctaac gggcattgta 120

ctagctaayt cctccctaga cattgtatta catgatacat attatgtagt cgcacacttc 180

cactatgtct tatctatagg agcagtgtty gccattatag ggggctttgt tcactgattc 240

cccctattct ccgggtacac actcaaccaa gcatgagcaa aaattcactt tgtaat 296

Claims

1.线粒体Cox1基因在猪的种属鉴定和/或猪肉鉴定中的应用。

2.标志物，其特征在于，具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。

3.具有如SEQ ID NO:7所示序列的核苷酸作为标志物在猪的种属鉴定和/或猪肉鉴定中的应用。

4.引物组合，其特征在于，包括：引物-F3、引物-B3、引物-FIP、引物-BIP、引物-LF和引物-LB；

所述引物-F3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(I)、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

(IV)、如(I)、(II)或(III)所示序列的互补序列；

所述引物-B3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(V)、具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

(VIII)、如(V)、(VI)或(VII)所示序列的互补序列；

所述引物-FIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(IX)、具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；

(XII)、如(IX)、(X)或(XI)所示序列的互补序列；

所述引物-BIP具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(XIII)、具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

(XVI)、如(XIII)、(XIV)或(XV)所示序列的互补序列；

所述引物-LF具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(XVII)、具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；

(XX)、如(XVII)、(XVIII)或(XIX)所示序列的互补序列；

所述引物-LB具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

(XXI)、具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；

(XXIV)、如(XXI)、(XXII)或(XXIII)所示序列的互补序列。

5.如权利要求4所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合中所述引物-F3、所述引物-B3、所述引物-FIP、所述引物-BIP、所述引物-LF和所述引物-LB的摩尔比为0.3：0.3：2.4：2.4：1：1。

6.试剂盒，其特征在于，包括如权利要求4或5所述的引物组合。

7.如权利要求4或5所述的引物组合或如权利要求6所述的试剂盒在猪的种属鉴定和/或猪肉鉴定中的应用。

8.猪的种属鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)获得待测样品的核酸；

9.猪肉的鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)获得待测样品的核酸；

10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述环介导等温扩增的反应体系为：0.3mM的外引物F3和B3各0.12μL；2.4mM的内引物FIP和BIP各0.96μL；1mM的环引物LF和LB各0.4μL；2×反应缓冲液10μL；1μL的待测样品核酸，加水至20μL体系；

所述环介导等温扩增的反应温度为60℃～65℃，反应时间为50min。