CN113215240A

CN113215240A - 研究不稳定斑块脑梗死与肠道菌群相关性的方法、诊断标记物及其应用

Info

Publication number: CN113215240A
Application number: CN202110399517.2A
Authority: CN
Inventors: 林力峰
Original assignee: Affiliated Hospital of Guangdong Medical University
Current assignee: Affiliated Hospital of Guangdong Medical University
Priority date: 2021-04-14
Filing date: 2021-04-14
Publication date: 2021-08-06

Abstract

本发明提供了一种研究不稳定斑块脑梗死与肠道菌群相关性的方法、诊断标记物及其应用，通过对不稳定斑块脑梗死患者和对比组的多方面研究，利用NIHSS评分、改良Rankin量表、ABCD2评分、16S rDNA高通量测试技术等方法进行分析测试，对粪菌的种类和数目变化进行跟踪，结合算法模型和人工智能，找到了不稳定斑块脑梗死与粪便中的菌群之间存在的一些相关性，可以间接预测脑梗死的发生以及预测脑梗死的类型。本发明通过对粪菌的测序，可以帮助医生进一步分辨出正常人与动脉硬化斑块稳定和斑块不稳定人群，这为脑梗死前期监测提供了新的思路。

Description

研究不稳定斑块脑梗死与肠道菌群相关性的方法、诊断标记物及其应用

技术领域

本发明涉及临床医学领域，具体涉及一种研究不稳定斑块脑梗死与肠道菌群相关性的方法、诊断标记物及其应用。

背景技术

近年来脑梗死的治疗水平得到改善，但大多数效果仍然不能令人满意，具有死亡率和残疾率高、预后差的特点。因此，研究脑梗死的发病机制并做好预防措施是控制疾病的经济有效的方法。

脑梗死的病因分型国际上目前主要采用TOAST分型，分为大动脉粥样硬化型、心源性栓塞型、小动脉闭塞型、其它病因型和不明原因型；国内亦采用中国缺血性卒中亚型(Chinese Ischemic Stroke Subclassification，CISS)分型，分为大动脉粥样硬化血栓形成、心源性栓塞、急性穿支小动脉闭塞(主要指穿支小动脉末端病变)、其他明确的病因和病因不明等五种类型，其中大动脉粥样硬化血栓形成又分主动脉弓动脉粥样硬化、颅内外大动脉动脉粥样硬化和穿支动脉动脉粥样硬化。大量横断面和前瞻性研究表明颈动脉粥样硬化严重程度与脑卒中、心肌梗死的发生以及心血管事件的风险密切相关，颈动脉超声检查是评价全身动脉硬化的一个“窗口”。国内外大量研究已经证实，除了传统危险因素外，颈动脉内膜中层厚度(Intima-media thickness，IMT)和斑块是心血管疾病风险评估的有效指标。颈动脉斑块是指颈动脉系统的任意一个血管节段存在突入管腔的回声结构，表面不光滑或局部IMT超过1.0mm。根据超声检查回声特征，将颈动脉斑块分为硬斑和软斑，硬斑回声增强，可伴有明显声影；软斑为弱回声等回声或混合回声，其后不伴声影，混合斑介于硬斑和软斑之间，软斑和混合斑属于不稳定斑块。颈动脉粥样硬化斑块与缺血性脑梗死的相关性密切，超声则能够对其作出准确评价，中、重型脑梗死的软斑比例高于轻型脑梗死的软斑比例。动脉粥样硬化病变的发展涉及各种机制，血小板的激活和聚集以及动脉内血栓的产生是关键事件。动脉粥样硬化斑块的形成，特别是不稳定斑块的形成，可显著增加脑梗死的发生率。

随着肠道菌群及其宏基因组学的开展，通过肠道菌群途径研究不稳定斑块脑梗死，有望发现脑梗死的新的危险因素，从中找出诊断标记物，以及新的防治干预措施。其中，人类粪菌组成主要由两种细菌门拟杆菌门或厚壁菌门构成，其构成人类肠道中存在的分类群的>90％。粪菌参与人体多种正常的生理代谢过程，帮助降解宿主自身不能消化的食物、合成维生素、参与胆汁酸代谢、影响脂肪酶活性、维护免疫系统的正常功能。近几年来，越来越多的研究者开始关注粪菌对脑功能的影响。粪菌通过脑-肠轴调节宿主大脑功能和行为，主要由免疫、迷走神经和神经内分泌途径构成。

但是目前还没有一项研究直接比较脑梗死个体血液、肠道微生物的多样性，没有探讨颈动脉斑块稳定性与粪菌、血菌的相关性，没有研究揭示在不稳定斑块急性脑梗死不同受试者之间的微生物群中观察到高水平的变异性，没有对急性脑梗死个体血液、肠道微生物相关性进行相关研究的报道。有鉴于此，确有必要提供一种解决上述问题的技术方案。

发明内容

本发明的目的之一在于：提供一种研究不稳定斑块脑梗死与肠道菌群相关性的方法，本发明通过探讨肠道菌群与不稳定斑块的相关性，找出了新的诊断标记物，为目前脑梗死治疗效果仍存在死亡率和残疾率高、预后差的问题提供一种新的防治干预措施。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种研究不稳定斑块脑梗死与肠道菌群相关性的方法，包括以下步骤：

对不稳定斑块脑梗死患者与对比组进行采集记录NIHSS评分、改良Rankin量表、ABCD2评分；并记录头部核磁共振或CT影像学检查结果及颈动脉彩超评估颈动脉内膜的中层厚度及斑块；

分别收集不稳定斑块脑梗死患者与对比组的粪便样品；

提取所述粪便样品的基因组DNA并检验所述粪便样品中的细菌DNA浓度；

利用PCR扩增所述DNA的16S rDNA基因的V3-4区域，然后16S rDNA高通量测试技术测序及对所述粪便样品的菌群进行数据分析，得到不稳定斑块脑梗死患者与肠道菌群的相关性关系。

优选的，所述对比组为稳定斑块脑梗死患者和健康人群。

优选的，所述PCR扩增的V3-4区域采用的引物为：

上游引物：5’-CCTACGGGRSGCAGCAG-3’；

下游引物：5’-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3’。

优选的，数据分析包括OUT分析和OUT丰度表分析。

优选的，所述OUT丰度表分析包括物种分类和丰度分析、Alpha多样性分析、Beta多样性分析、显著性差异分析法中的至少一种。

优选的，所述Alpha多样性分析中包括observed_species指数、chao1指数、shannon指数、simpson指数和PD_whole_tree指数；所述Beta多样性分析中包括PCoA分析；所述显著性差异分析中包括物种LEfSe差异分析、组间秩和检验分析、差异物种Spearman相关系数分析和优势环境因子与差异物种之间Spearman相关性分析。

本发明的目的之二在于，提供一种基于肠道菌群的不稳定斑块脑梗死的诊断标记物，所述诊断标记物由上述任一项所述的研究不稳定斑块脑梗死与肠道菌群相关性的方法中得到，所述诊断标记物为丛毛单胞菌属和/或丁酸弧菌属。

优选的，所述丛毛单胞菌属与颈动脉内膜中层厚度呈正相关关系；所述丁酸弧菌属与不稳定斑块脑梗死患者的NIHSS评分呈负相关关系。

本发明的目的之三在于，提供一种基于肠道菌群的不稳定斑块脑梗死的诊断标记物的应用，所述诊断标记物用于预防脑梗死复发和/或防止脑梗死后续加重的治疗。

相比于现有技术，本发明的有益效果在于：本发明通过对不稳定斑块脑梗死患者和对比组的多方面研究，利用NIHSS评分、改良Rankin量表、ABCD2评分、16S rDNA高通量测试技术等方法进行分析测试，对粪菌的种类和数目变化进行跟踪，结合算法模型和人工智能，找到了不稳定斑块脑梗死与粪便中的菌群之间存在的一些相关性，可以间接预测脑梗死的发生以及预测脑梗死的类型。另外，因脑梗死患者多合并高血压糖尿病心脏病等疾病，这将会导致某些致病菌增值，造成粪菌多样性的变化，本发明通过对粪菌的测序，可以帮助医生进一步分辨出正常人与动脉硬化斑块稳定和斑块不稳定人群，这为脑梗死前期监测提供了新的思路。

附图说明

图1为本发明各组样品粪菌的稀释曲线图(chao1指数)。

图2为本发明各组样品粪菌的稀释曲线图(observed species指数)。

图3为本发明三组粪菌的物种Venn图。

图4为本发明环境因子与差异物种之间Spearman相关性分析热图。

具体实施方式

为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施方式和说明书附图，对本发明及其有益效果作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

以下为本发明一些特定名词的解释：

NIHSS评分：美国国立卫生研究院卒中量表(national institutes of healthstroke scale，NIHSS)评分，评估病情严重程度，涉及意识水平、语言、凝视功能、面瘫等8项神经功能相关项目，总评分为45分，评分越高表示神经功能缺损程度越高。

改良Rankin量表(Modified Rankin Scale,mRS)：是用来衡量患者脑卒中后的功能恢复的结果，采用多维框架图来描述功能评估的四个水平，分别是病理、病损、残疾和残障，从0分的没有症状到5分的重度残疾。

ABCD2评分：TIA早期卒中风险预测工具(ABCD2量表)，用于预测短暂性脑缺血发作(TIA)后2天内的卒中风险，也可用于预测卒中的短期复发风险，量表评分最高为7分，6～7分为高危；4～5分为中危；1～3分为低危。

一、研究不稳定斑块脑梗死与肠道菌群的相关性

1、研究对象：采取病例对照的研究方法，纳入2018.09～2020.02在广东医科大学附属医院诊断为急性脑梗死并合并颈动脉斑块不稳定的患者(UPCI)为研究对象40例，斑块稳定性急性脑梗死患者(SPCI)和健康人(CON)各30例。本研究经广东医科大学附属医院医学伦理委员会的批准。入组的患者或家属签署知情同意书。

2、研究方法：

2.1一般资料：全面、详细进行受检者基本信息的采集，系统进行一般体格检查、神经系统专科查体，同时测量体温、血压、呼吸及脉搏等基本生命指标及记录年龄、性别、高血压病史、糖尿病史、吸烟史、饮酒史、NIHSS评分、改良Rankin量表、ABCD2评分、白细胞计数水平、总胆固醇水平、甘油三酯水平、低密度脂蛋白胆固醇水平、高密度脂蛋白胆固醇水平、血糖水平、同型半胱氨酸水平、头颅CT或MR、颈动脉彩超颈动脉内膜中层厚度(cIMT)及斑块、心脏彩超、心电图检查等相关指标。

2.2粪便样品采集：分别收集不稳定斑块脑梗死患者与对比组的粪便样品，并保存于粪菌DNA保存液中，于1小时内置于-80℃冰箱保存用于后续检测，避免反复冻融。

2.3粪便样品的DNA提取并检验浓度：采用

Fast DNA Stool Mini Kit(货号51604)试剂盒提取粪便微生物基因组DNA。

具体的：

①从-80℃冰箱取出粪便样品，使用2ml灭菌离心管称取180～220mg粪便，并将其置于冰上。

②向每个粪便样本中加1ml inhibit EX Buffer液，涡旋1min或者直至样本充分混匀。

③在70℃温育5min，如果细胞很难溶解可将温度增加到95℃，涡旋15s。

④样本20000rpm离心1min。

⑤用移液器取15ul蛋白酶K(proteinase K)于新的1.5ml离心管中。

⑥用移液器取200ul样本上清液加到含有蛋白酶K(Proteinase k)的离心管中。

⑦加入200ul Buffer AL并且涡旋15s，注意不要直接将蛋白酶K(Proteinase K)加到Buffer AL中，样本和Buffer AL充分混匀。

⑧70℃温育10min。

⑨加入200ul 96％～100％的乙醇，并涡旋混匀。

⑩小心的取600ul溶液于QIAamp吸附柱中。盖上盖子并离心1min后弃去含滤液的收集管，将QIAamp吸附柱放入新的2ml收集管中。

小心的打开QIAamp吸附柱，加入500ul Buffer AW1。离心1min后弃去含滤液的收集管，将QIAamp吸附柱放入新的2ml收集管中。

小心的打开QIAamp吸附柱，加入500ul Buffer AW2，离心3min后弃去含滤液的收集管。

将QIAamp吸附柱放入新的2ml收集管中，离心3min。

将QIAamp吸附柱转入一新的1.5ml离心管，用移液器取200ul Buffer ATE直接加入QIAamp膜中，室温下孵育1min，离心1min后提取DNA。

2.4 16S rDNA的扩增

(1)引物设计并合成：16S rDNA扩增选择区域为V3-4区，使用的通用引物为341F和806R。在通用引物的5’端加上适合Illumina NovaSeq PE250测序的index序列和接头序列，完成特异性引物的设计。

上游引物：5’-CCTACGGGRSGCAGCAG-3’；

下游引物：5’-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3’。

(2)PCR扩增：按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物，PCR正式试验采用KAPA HiFi HotstartReadyMix PCR Kit，如表1所示。

表1PCR扩增反应一览表

PCR反应体系设计容量为40ul，含有15μl 2×KAPA HiFi Hotstart Ready Mix，1μlForward Primer(5μM)，1μl Reverse Primer(5μM)，10ng Template DNA，补ddH2O至30μl。

(3)16S PCR扩增产物回收：扩增成功PCR产物后用2％琼脂糖凝胶检测，使用凝胶回收试剂盒切胶回收。

具体的：

①在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μl体积)。

②加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热(低熔点琼脂糖凝胶于40℃加热)，间断混合(每2-3min)，直至凝胶块完全熔化(约6-8min)。

③加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。当分离的DNA片段小于400bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇。

④吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管(试剂盒内提供)中，12,000rpm离心1min，弃滤液。

⑤将制备管放回2ml离心管，加500μl BufferW1，12,000rpm离心30s，弃滤液。

⑥将制备管放回2ml离心管，加700μl BufferW2，12,000rpm离心30s，弃滤液，以同样的方法再用700μl Buffer-W2洗涤一次12,000rpm离心1min。

⑦将制备管置回2ml离心管中，12,000rpm离心1min。

⑧将制备管置于洁净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加25-30μlEl去离子水，室温静置1min，12,000rpm离心1min洗脱DNA。

(4)文库浓度和大小检测：

①用Buffer AE清洗nanodrop的检测孔，直至空白对照为0.0ng/μl；

②输入样本的编号并检测样本浓度；

③检测完成后用ddH2O清洗nanodrop的检测孔3次，将检测的数据输出；

④制胶：100ml的×TAE溶液，加入1g的胶粉，微波炉加入沸腾至胶粉完全融合，待冷却后加入3ul的EB溶液，混匀，导入制胶槽中，静置30min，备用；

⑤DNA电泳的上样量为400ng，根据检测的浓度，确定每个样本上样的体积，如果样本的浓度太高，可以适当的稀释样本，同时将6×Loading buffer用ddH2O稀释5倍，取1-2ul的DNA+5-6ul的稀释后的Loading Buffer混匀；如果样本浓度太低，可适当增加样本的上样量；

⑥将样本按顺序加到胶孔中，接通电源，150V，30min；

⑦成像系统进行拍照，观察提取的DNA的完整性。

(5)文库定量检测：将纯化后PCR产物文库进行检测定量，之后按照每个样品的测序量要求，进行相应比例的混合。

2.5三者实验者的粪便16S rDNA的测序：

⑴测序文库预处理：

①测序文库定量、稀释；

②氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。

⑵Cluster簇生成：

①DNA片段的一端与引物基互补，固定在芯片flowcell上；

②另一端随机地与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥(bridge)”；

③PCR扩增，产生DNA簇；

④DNA簇线性化成为单链。

⑶测序

①在flowcell加入DNA聚合酶和4种荧光标记的dNTP，每次循环只掺入单种碱基；

②激光扫描flowcell表面，捕捉荧光信号，读取每条模板序列聚合上去的核苷酸种类；

③将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端粘性，继续掺入第二轮单种核苷酸碱基；

④依次统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。

2.6测序分析方法：

⑴测序数据统计与优化

通过Illumina平台进行Paired-End测序，Paired End Reads通过Reads之间的Overlap关系拼接成长Reads，并对拼接后的Reads进行质控，得到Clean Reads，通过Pandaseq软件利用重叠关系将双末端测序得到的成对Reads拼接成一条序列，得到高变区的长Reads，然后使用内部撰写的程序对拼接后的Reads进行如下处理，获取Clean Reads；去除平均质量值低于20的Reads；去除Reads含N的碱基数超过3个的Reads；Reads长度范围为220～500nt。

⑵得到OTU分析

①OTU聚类：首先我们将序列完全一样的Clean Reads根据其丰度大小进行排序，将其中的Singletons过滤掉(因为Singletons可能由于测序错误造成，故将这部分序列去除，不进行后期OTU聚类)，利用Usearch在0.97相似度下进行聚类，对聚类后的序列进行嵌合体过滤后，得到用于物种分类的OTU(Operational Taxonomic Units)，通过聚类操作，把序列根据彼此的相似性归类为许多小组，一个小组就是一个OTU，最后将所有Clean Reads比对到OTU序列上，将能比对上OTU的Reads提取出来，得到最终的Mapped Reads。

②抽平处理：不同样本对应的Reads数量差距较大，为避免因样品数据大小不同而造成分析时的偏差，我们在样品达到足够的测序深度的情况下，对每个样品进行随机抽平处理。测序深度用Alpha多样性指数来衡量。抽平参数必须在保证测序深度足够的前提下去选取。

③Core microbiome分析：根据样品的共有OTU以及OTU所代表的物种，可以找到Core microbiome(覆盖100％样品的微生物组)。

④OTU Venn图或花瓣图分析：根据每个样品的OTU在每个样品的丰度，计算出每个样品或组间共有和特有OTU，Venn图可以很好的反映组间共有以及组内特有的OTU数目。

⑤OTU PCA分析：PCA分析(Principal Component Analysis)，即主成分分析，是一种分析和简化数据集的技术。PCA分析可以初步的反映出不同处理或不同环境间的样品可能表现出分散和聚集的分布情况，从而可以判断相同条件的样品组成是否具有相似性。

⑶OUT丰度表分析

①物种注释结果统计：从各个OTU中挑选出丰度最高的一条序列，作为该OTU的代表序列，使用RDP方法，将该代表序列与已知物种的16S数据库(RDP，http://rdp.cme.msu.edu)进行比对，从而对每个OTU进行物种归类。根据物种注释情况，统计每个样品注释到各分类水平(Kingdom，Phylum，Class，Order,Family，Genus，Species)上的序列数目，由此可轻松了解注释到各分类水平的整体情况。

②物种丰度分析：根据物种注释结果，分别在门、纲、目、科、属分类等级对各个样品作物种profiling相应的柱状图。形成物种相对丰度柱状图，可以直观地查看各样品在不同的分类等级上相对丰度较高的物种和比例。在属分类等级，对Top10的物种丰度作Star图。一个星形图代表一个样品的物种相对丰度信息。每个星形图中的扇形代表一个物种，用不同颜色区分，用扇形的半径来代表物种相对丰度的大小，扇形的半径越长表示丰度高，反之丰度相对较低。

③物种聚类分析：根据样品中物种注释信息及丰度，从物种和样品两个层面进行物种丰度聚类，通过柱状图对比，利于观察样品之间的聚类关系以及物种组成差异。

④Rank Abundance曲线：将样品中的OTUs按相对丰度(或者包含的序列数目)由大到小排序得到对应的排序编号，再以OTUs的排序编号为横坐标，OTUs中的相对丰度(也可用该等级OTUs中序列数的相对百分含量)为纵坐标，将这些点用折线连接，即绘制得到RankAbundance曲线。Rank Abundance曲线可同时用于解释样品多样性的物种的丰度和均匀程度两个方面。物种的丰度由曲线在横坐标上的长度来反映，曲线越宽，表示物种的组成越丰富；物种组成的均匀程度由曲线的形状来反映，曲线越平坦，表示物种组成的均匀程度越高。

⑷Alpha多样性分析

①单个样品多样性分析：Alpha多样性(Alpha diversity)是对单个样品中物种多样性的分析，包括observed_species指数、chao1指数、shannon指数、simpson指数以及PD_whole_tree指数。利用QIIME软件计算样品的Alpha多样性指数的值，并作出相应的稀释曲线。稀释曲线是利用已测得16S rDNA序列中已知的各种OTUs的相对比例，来计算抽取n个(n小于测得Reads序列总数)Reads时各Alpha多样性指数的期望值，然后根据一组n值(一般为一组小于总序列数的等差数列)与其相对应的Alpha多样性指数的期望值作出曲线来，并作出Alpha多样性指数的统计表格。

②单个样品差异分析：分别对Alpha diversity的各个指数进行秩和检验分析(若两组样品比较则使用R中的wilcox.test函数，若两组以上的样品比较则使用R中的kruskal.test函数)，通过秩和检验筛选不同条件下的显著差异的Alpha Diversity指数。

⑸PCoA分析：为了进一步展示样品间物种多样性差异，使用主坐标分析(Principal Coordinates Analysis，PCoA)的方法展示各个样品间的差异大小。如果两个样品距离较近，则表示这两个样品的物种组成较相近。

⑹显著性差异分析

①物种LEfSe差异分析：LDA Effect Size(LEfSe分析)：LEfSe采用线性判别分析(LDA)来估算每个组分(物种)丰度对差异效果影响的大小，找出对样品划分产生显著性差异影响的群落或物种。LEfSe分析强调统计意义和生物相关性。

②组间秩和检验分析：使用秩和检验的方法对不同分组之间进行显著性差异分析，以找出对组间划分产生显著性差异影响的物种。对于两组间的差异分析采用R语言stats包的wilcox.test函数，对于两组以上的组间差异分析采用R语言stats包的kruskal.test函数。

③差异物种Spearman相关系数分析：使用LEfSe在各水平上或秩和检验在属水平上(或某一特定水平)，选择丰度Top30的差异物种，通过R软件的corrplot包绘制物种之间spearman相关性热图，并通过该热图可以发现物种之间重要的模式与关系。

④优势环境因子与差异物种之间Spearman相关性分析：使用属水平的物种和提供的环境因子，计算物种与环境因子之间的相关性，通过R软件corrplot包或gplots包绘制热图或者通过cytoscape软件绘制网络图，从而揭示物种与环境因子之间重要的关系。

3、研究结果

3.1UPCI组的患者NIHSS评分、ABCD2和改良Rankin量表评分水平、颈动脉彩超cIMT均高于其他两组，具有差异性(P<0.05)(如表2所示)。

表2

3.2UPCI组与SPCI组、CON组粪菌的16S rDNA测序分析

3.2.1OTU的生成

最终100例样本共获得有效序列3790367条，优化序列长度400-440bp。

3.2.2稀释曲线分析

不同样本对应的Reads数量差距较大，为避免因样品数据大小不同而造成分析时的偏差，我们在样品达到足够的测序深度的情况下，对每个样品进行随机抽平处理。测序深度用Alpha多样性指数来衡量。Alpha多样性反映的是单个样品内部的物种多样性，包括chao1指数和observed species指数。Chao1指数用来估计样品所含OTU的总数，Observed_species指数表示实际观测到的OTU数量。利用QIIME软件计算样品的Alpha多样性指数的值，并做出相应的稀释曲线。稀释曲线是利用已测得16S rDNA序列中已知的各种OTUs的相对比例，来计算抽取n个(n小于测得的Reads序列总数)Reads时各Alpha多样性指数的期望值，然后根据一组n值(一般为一组小于总序列数的等差数列)与其相对应的Alpha多样性指数的期望值做出曲线来，并作出Alpha多样性指数的统计表格。如图1和图2所示，横坐标表示从某个样品中随机抽取的Clean Reads数目，纵坐标表示单个样品内部物种多样性；图中一条曲线代表一个样品，随着测序深度的增加，各组样本曲线趋于平缓，说明测序的数据量合理，更多数据量只会产生少量新的物种(OTUs)，并不会随样本量的增加而显著增多，这表示测序数据量是比较合理。

3.2.3OTU Venn图分析

OTU Venn图分析根据每个样品的OTU在每个样品的丰度，计算出每个样品或组间共有和特有的OTU，Venn图可以很好的反映了组间共有以及组内特有的OTU数目。从图3所示三组有608个共有OTU，即三组样品具有较高的相似性，不稳定斑块脑梗死UPCI组有153个特有OTU，稳定斑块脑梗死SPCI组有55个特有OTU，健康对照CON组有29个特有OTU，提示三组分布存在差异性。

3.2.4物种分类和丰度分析

在门的水平上，三组的粪便菌群序列主要集中以下四个门：拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和梭杆菌门(Fusobacteria)。其中，拟杆菌门和厚壁菌门是各组样本中绝对的优势菌群。UPCI的拟杆菌门的丰度比稳定斑块脑梗死组SPCI和健康对照组CON都降低，UPCI组厚壁菌门与拟杆菌门的比率下降；而UPCI组的梭杆菌门(Fusobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)的丰度比SPCI组和CON对照组都升高。

在属的水平上，最大丰度排名前25的物种中，和门水平的菌群变化趋势相似，UPCI和稳定斑块脑梗死组SPCI和健康对照组CON的变化大致一致。与对照组SPCI组和CON组相比，UPCI组的毛罗菌属(Lachnospiracea)的丰度水平降低，UPCI组的梭杆菌属(Fusobacterium)和艾克曼菌属(Akkermansia)的丰度升高。

3.2.5Alpha多样性指数组间差异分析与主坐标PCoA分析

Alpha多样性是对单样本中物种多样性的分析，反映微生物群落的丰度和多样性。而为了进一步展示样品间物种多样性差异，使用主坐标分析(Principal CoordinatesAnalysis，PCoA)的方法展示各个样品间的差异大小。但结果提示，虽UPCI组和SPCI组较CON组的粪菌相比多样性都减少，物种多样性也存在差异，但差异均无统计学意义，这里不做过多赘述。

3.2.6物种LEfSe差异分析

LDA Effect Size(LEfSe分析)：LEfSe称组间群落差异分析，采用线性判别分析(LDA)来估算每个组分(物种)丰度对差异效果影响的大小，找出对样品划分产生显著性差异影响的群落或物种。LEfSe分析强调统计意义和生物相关性。结果表明，UPCI组与SPCI及CON对照组的粪菌结构具有明显的不同。UPCI组中多种条件致病菌，例如丛毛单胞菌属(Comamonas)、Hydrogenoanaerobacterium和脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)则出现了明显増加的现象，而拟杆菌属(Bacteroides)、丁酸弧菌属(Anaerostipes)等有益菌群明显减少。

3.2.7组间秩和检验PCA分析

使用秩和检验的方法对不同分组之间进行显著性差异分析，以找出对组间划分产生显著性差异影响的物种。但在属水平，三组标本的物种差异不明显。

3.2.8差异物种Spearman相关系数分析

使用LEfSe在各水平上或秩和检验在属水平上(或某一特定水平)，选择丰度Top30的差异物种，通过R软件的corrplot包绘制物种之间spearman相关性热图，并通过该热图可以发现物种之间重要的模式与关系。结果提示，霍尔德曼氏菌属(Holdemanella)与颤螺旋菌属(Oscillibacter)有明显的正相关关系，而与拟杆菌属(Bacteroides)有明显的负相关关系。

3.2.9环境因子与差异物种之间Spearman相关性分析

使用LEfSe差异分析的属水平差异物种和提供的环境因子，计算差异物种与环境因子之间的相关性，通过R软件corrplot包或gplots包绘制热图或者通过cytoscape软件绘制网络图，从而揭示物种与环境因子之间重要的关系。如图4所示，其中，图中横坐标代表环境因子，纵坐标代表物种，颜色的深浅直观展示物种与环境因子的相关性大小；同时进行相关性显著检验，当P<0.05，用+来标注显著性，当P<0.01，用*来标注显著性。结果提示，cIMT与丛毛单胞菌属(Comamonas)呈正相关关系，NIHSS评分与丁酸弧菌属(Anaerostipes)呈负相关关系。

二、诊断标记物

一种基于肠道菌群的不稳定斑块脑梗死的诊断标记物，所述诊断标记物由上述所述的研究不稳定斑块脑梗死与肠道菌群相关性的方法中得到，所述诊断标记物为丛毛单胞菌属和/或丁酸弧菌属。

三、诊断标记物的应用

一种基于肠道菌群的不稳定斑块脑梗死的诊断标记物的应用，所述诊断标记物用于预防脑梗死复发和/或防止脑梗死后续加重的治疗。

通过上述的实验，可以得出以下结论：不稳定斑块脑梗死患者出现了较明显的粪菌紊乱，其多种条件致病菌，例如丛毛单胞菌属(Comamonas)、Hydrogenoanaerobacterium和脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)则出现了明显増加的现象，而拟杆菌属(Bacteroides)、丁酸弧菌属(Anaerostipes)等有益菌群明显减少；且cIMT与丛毛单胞菌属(Comamonas)呈正相关关系，NIHSS评分与丁酸弧菌属(Anaerostipes)呈负相关关系。

由此，通过上述结论，本发明发现了不稳定斑块脑梗死患者变化明显的菌属，找到诊断不稳定斑块脑梗死的新生物标记，可以帮助医生进一步分辨出正常人与动脉硬化斑块稳定和斑块不稳定人群，这为脑梗死前期监测提供了新的思路。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还能够对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上述的具体实施方式，凡是本领域技术人员在本发明的基础上所作出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东医科大学附属医院

<120> 研究不稳定斑块脑梗死与肠道菌群相关性的方法、诊断标记物及其应用

<130> 2021

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> SEQ NO.1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<400> 1

cctacgggrsgcagcag 17

<210> SEQ NO.2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(23)

<400> 2

ggactacvvgggtatctaatc 21

Claims

1.一种研究不稳定斑块脑梗死与肠道菌群相关性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

分别收集不稳定斑块脑梗死患者与对比组的粪便样品；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对比组为稳定斑块脑梗死患者和健康人群。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的V3-4区域采用的引物为：

上游引物：5’-CCTACGGGRSGCAGCAG-3’；

下游引物：5’-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3’。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，数据分析包括OUT分析和OUT丰度表分析。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述OUT丰度表分析包括物种分类和丰度分析、Alpha多样性分析、Beta多样性分析、显著性差异分析法中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述Alpha多样性分析中包括observed_species指数、chao1指数、shannon指数、simpson指数和PD_whole_tree指数；所述Beta多样性分析中包括PCoA分析；所述显著性差异分析中包括物种LEfSe差异分析、组间秩和检验分析、差异物种Spearman相关系数分析和优势环境因子与差异物种之间Spearman相关性分析。

7.一种基于肠道菌群的不稳定斑块脑梗死的诊断标记物，其特征在于，所述诊断标记物由权利要求1～6任一项所述的研究不稳定斑块脑梗死与肠道菌群相关性的方法中得到，所述诊断标记物为丛毛单胞菌属和/或丁酸弧菌属。

8.根据权利要求7所述诊断标记物，其特征在于，所述丛毛单胞菌属与颈动脉内膜中层厚度呈正相关关系；所述丁酸弧菌属与不稳定斑块脑梗死患者的NIHSS评分呈负相关关系。

9.一种基于肠道菌群的不稳定斑块脑梗死的诊断标记物的应用，其特征在于，所述诊断标记物用于预防脑梗死复发和/或防止脑梗死后续加重的治疗。