CN112852938B - 一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的引物组及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的引物组及应用。本发明提供了一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的成套引物。本发明提供的成套引物，由序列1‑序列78所示的引物组成。本发明建立的一种针对39种临床常见耐药基因的扩增子测序检测分析方法。该方法具有快速、高效、高靶向、特异性强等技术优点，适用于临床和畜牧养殖业中多种耐药基因的流行和差异分析。

Description

一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的引物组 及应用

技术领域

本发明属于微生物基因高通量测序技术领域，具体涉及一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的引物组及应用。

背景技术

宏基因组学(Metagenomics)，又称微生物环境基因组学、元基因组学。通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA，构建宏基因组文库，利用宏基因组测序对微生物进行高通量测序，分析环境样品中的全部微生物组成、微生物多样性及其相应功能，进而探究微生物与环境、微生物及宿主之间的关联。宏基因组学在微生物组学的基础上发展而来的，不依赖于微生物的分离培养，可用于研究难培养或不可培养的微生物中的天然产物和处于沉默状态的天然产物，极大地提高了宏基因组样品中微生物资源的利用程度。通过对宏基因组样品进行深度测序分析，可以揭示或者评估环境中真实的物种多样性和遗传多样性，也可用于新型微生物活性物质(或新基因)的发现。目前，宏基因组学研究主要包括全基因组测序和靶向重测序两种手段。

与全基因组测序(WGS)不同，靶向重测序技术是直接对样品中感兴趣的基因组区域进行分离、富集和测序。该方法更加地经济和高效，且具有更高的灵敏度，检测限可可低至0.1％。此外，靶向重测序地后续分析速度相对于WGS跨越性的提升。例如，宏基因组中，外显子仅占1％左右，却包含了却大部分已知突变，将外显子区域分离出后后进行单独测序，在后续的分析工作中，能降低99％的工作量，极大程度上简化了分析过程、加快了分析速度。

目前，Ion AmpliSeq技术是全球公认的靶向新一代测序(NGS)金标准，是一种基于扩增子的富集方法。其是最快、最简单、且最具可扩展性的NGS解决方案，目前还没有相应的替代品。目前Ion AmpliSeq技术主要针对16S rDNA分析、遗传突变和疾病筛查等领域，目前尚未由针对抗生素耐药基因的相关设计。

2019年联合国发布的一份报告显示，抗生素耐药性问题日益严重，如不利己采取应对措施，抗生素闹妖行疾病造成的死亡将会快速增加。到2050年，抗生素耐药性疾病每年可能造成1000万人死亡，对经济的破环相当于2008年的金融危机。近年来，革兰氏阳性细菌对各类抗生素的耐药情况日益增长，给临床上感染性疾病的治疗造成了极大地困难。其中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VRE)是目前院内感染的重要病原菌之一，其治疗手段十分有限。对于宏基因组样品中耐药基因的测序和分析，能够更好的对环境中耐药基因的流行传播、遗传突变等进行分析，为临床上的疾病诊断和治疗提供一定的依据。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的成套引物。

本发明提供的成套引物，由序列1-序列78所示的引物组成。

上述成套引物由引物组1和引物组2组成；

所述引物组1由序列1至序列44所示的引物组成；

所述引物组2由序列45至序列78所示的引物组成。

本发明另一个目的是提供一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的多重PCR试剂。

本发明提供的多重PCR试剂，由PCR试剂1和PCR试剂2组成；

所述PCR试剂1包括权利要求2所述中的引物组1，

所述PCR试剂2包括权利要求2所述中的引物组2。

上述多重PCR试剂中，所述引物组1中的各条引物在所述PCR试剂1中的浓度均为400nMol/L；

所述引物组2中的各条引物在所述PCR试剂2中的浓度均为400nMol/L。

本发明还有一个目的是提供一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或上述的多重PCR试剂。

上述的引物组或上述的多重PCR试剂或上述的试剂盒在如下1)-3)中至少一种或者具有如下1)-3)中至少一种功能的产品中的应用也是本发明保护的范围：

1)构建革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序文库；

2)革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序；

3)检测待测样本中革兰氏阳性菌耐药基因。

本发明还提供了如下方法：

本发明提供了一种检测待测样本中革兰氏阳性菌耐药基因的方法，包括如下步骤：

1)用上述多重PCR试剂中PCR试剂1和PCR试剂2分别对待测样本进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物1和多重PCR扩增产物2；

2)将所述多重PCR扩增产物1和所述多重PCR扩增产物2进行混合，制备扩增子文库；

3)测序所述扩增子文库，实现检测待测样本中革兰氏阳性菌耐药基因。

本发明提供了一种对待测样本中革兰氏阳性菌耐药基因进行测序的方法，包括如下步骤：

1)用上述的多重PCR试剂中PCR试剂1和PCR试剂2分别对待测样本进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物1和多重PCR扩增产物2；

2)将所述多重PCR扩增产物1和所述多重PCR扩增产物2进行混合，制备扩增子文库；

3)测序所述扩增子文库，实现检测待测样本中革兰氏阳性菌耐药基因。

上述革兰氏阳性菌耐药基因为如下39种耐药基因：ermB、ermF、ermG、ermY、fosB、gyrA、lnuA、lnuB、lsaB、mecA、mphC、msrA、msrD、pbp1a、pbp5、tetK、tetL、tetS、VanC、VanG、vatE、vgaA、aac6-II、aph2-Id、blaZ、cfr、ermA、ermC、ermT、fexA、fosA3、lsaE、mefA、optrA、pbp2a、tetM、tetO、vanA和vgaE基因。

本发明设计了一套引物组合，由引物池1和引物池2构成，共包含39对引物，每对引物对应的扩增子片段大小范围是125-275bp，能够高效、特异地对耐药基因进行靶向扩增。本发明基于Ion Ampliseq技术的高通量扩增子靶向测序panel，针对宏基因组DNA中的特定耐药基因进行靶向测序，进而分析环境中耐药基因的分布和遗传进化，将抗生素耐药基因与环境、抗生素耐药基因与宿主关联起来。本发明建立的一种针对39种临床常见耐药基因的扩增子测序检测分析方法。该方法具有快速、高效、高靶向、特异性强等技术优点，适用于临床和畜牧养殖业中多种耐药基因的流行和差异分析。

附图说明

图1为高通量扩增子简易测序流程图。

图2为扩增子测序文库构建原理图(参考Ion AmpliSeq^TM Library Kit 2.0说明书)。

图3为抗生素耐药基因设计分布图。

图4为样品所构建文库Ampliseq检测结果。

图5为6例样品宏基因组测序与Ampliseq基因检出数对比。

图6为16例样品宏基因组测序与Ampliseq基因配对reads数对比。

图7为6例样品抗生素耐药基因分析图。

图8为6例样品宏基因组测序和宏基因组测序的比较。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中主要试剂及仪器

表1为主要仪器及试剂

实施例1、革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的引物组及扩增子测序方法的建立

一、革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的引物组的制备

参考ResFinder文库，通过统计和分析选出目前较为常见、流行广泛的革兰氏阳性菌耐药基因，共39种，在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上分别下载基因序列(见文件：AMR20190804.fasta)。

图1为高通量扩增子简易测序流程图。图2为扩增子测序文库构建原理图(参考IonAmpliSeq^TM Library Kit 2.0说明书)。图3为抗生素耐药基因设计分布图。

通过多次设计、分析和比对，获得最终的引物池，扩增子长度范围为125bp-275bp，包括两个引物池(primer pool 1和primer pool 2)，共39对引物，具体见表2所示。

表2为39个革兰氏阳性菌耐药基因的扩增引物

上表中，第3列的序列编号依次为序列1至序列78中的单数，第4列的序列标号依次为序列1至序列78中的双数。

primer pool 1由ermB、ermF、ermG、ermY、fosB、gyrA、lnuA、lnuB、lsaB、mecA、mphC、msrA、msrD、pbp1a、pbp5、tetK、tetL、tetS、VanC、VanG、vatE和vgaA基因的扩增引物(序列1-序列44)组成，primer pool2由aac6-II、aph2-Id、blaZ、cfr、ermA、ermC、ermT、fexA、fosA3、lsaE、mefA、optrA、pbp2a、tetM、tetO、vanA和vgaE基因的引物组成(序列45-序列78)。

二、扩增子测序方法的建立

1、多重PCR制备扩增子(2primer pools)

提取待测样本的宏基因组DNA，以宏基因组DNA为模板，分别采用primer pool 1和primer pool 2进行2个体系的多重PCR扩增。

多重PCR扩增反应体系如下表3所示：

表3为多重PCR扩增反应体系

试剂	体积
		5×IonAmliseq<sup>TM</sup> HiFi Mix	5μL
DNA模板(2-100ng)	≤7.5μL
		无核酸水	补至体系为12.5μL

将上述多重PCR扩增反应体系充分混匀，分别转移5μL至两个PCR管中，随后分别加入5μL的primer pool 1和5μL的primer pool 2，形成2个含有引物的多重PCR扩增反应体系，每个反应体系中各个引物的终浓度均为200nmol/L，且各引物比例一致；分别轻轻涡旋或吹打混匀后简单离心，进行多重PCR扩增，得到primer pool1多重PCR扩增产物和primerpool 2多重PCR扩增产物。

上述多重PCR扩增的反应程序为：酶激活：99℃，2min；变性：99℃，15s；退火和延伸60℃，4min，21±3个循环。

上述产物若长时间不使用，可保存在-20℃。

2、扩增子文库的构建

1)多重PCR产物连接Adapter

下述步骤所涉及试剂均包含在中Ion Xpress^TM adapters(美国Thermo公司，4471250)和Ion AmpliSeq^TM Library Kit 2.0试剂盒(美国Thermo公司，4480441)中，具体步骤如下：

将上述1得到的primer pool 1多重PCR扩增产物和primer pool 2多重PCR扩增产物小心混合，使得样品产物的总体积为20μL，并向体系中加入2μL FuPa Reagent(IonAmpliSeq^TM Library Kit 2.0试剂盒中)孵育(表4)，部分消化引物和Adapter，得到多重PCR产物；

表4为孵育条件

温度	时间
		50℃	10min
55℃	10min
		60℃	20min
10℃	最多1h

多重PCR产物孵育结束后，按表5配制反应体系(严格按照表中顺序添加)，将barcode连接至多重PCR产物的两端，得到连接产物。

反应程序见表6：

表5为barcode连接反应体系

表6为barcode连接反应程序

温度	时间
		22℃	30min
68℃	5min
		72℃	5min
10℃	最多24h

上述产物若长时间不使用，可保存在-20℃。

2)、扩增子文库纯化：

将KAPA PureBeads(购于美国Beckman公司，005328-13-1)从4℃冰箱内取出，室温环境下放置30min，涡旋使其混匀。将上述1)得到的连接产物转入新的1.5mL离心管中，加入1.5倍体积(μL)的KAPA pure beads，吹打，使DNA与磁珠充分混匀，室温条件下孵育5分钟。再将离心管置于磁力架上静置2-3min，待混合液体变澄清后，小心弃掉上清，注意不要吸到磁珠。加入150μL新配置好的70％乙醇，轻柔地上下颠倒5次后，磁力架上孵育至液体澄清，弃掉上清，重复洗涤一次。吸弃乙醇后，开盖，室温放置约5min，将磁珠晾干。

向晾干的KAPA Pure Beads中加入50μL Low TE(购于美国Thermo公司，4480441)，涡旋使TE与磁珠充分混匀，简单离心，室温条件下静置至少2min。将离心管置于磁力架上，静置至少2min，待溶液完全澄清后，吸取上清液至新的PCR管中，得到扩增子文库。

制备好的文库可长期放置于-20℃。

3、扩增子文库定量和检测

1)、文库定量

采用荧光定量试剂盒Ion Library

Quantitation Kit(购于美国Thermo公司，4468802)测定扩增子文库的浓度，具体步操作骤如下：

标准品梯度稀释：将标准品文库E.coli DH10B(购于美国Thermo公司，4468802)(～68pM)10倍梯度稀释，稀释后浓度分别为：6.8pM、0.68pM、0.068pM、0.0068pM和0.00068pM。

(1)样品稀释：取制备好的文库，加入198μL无核酸水，稀释成100倍。稀释后的文库可长期放置于-20℃冰箱中。

(2)配制荧光定量反应体系(表7)：

表7为文库荧光定量反应体系

(4)时荧光定量PCR反应程序为：95℃2min，1个循环；95℃15s，60℃1min，40个循环。

(5)扩增子文库浓度计算：依据梯度稀释的标准品构建标准曲线，并计算出待测文库的具体浓度，根据浓度将样品文库定量到40～60pM后上机。

2)扩增子文库测序(Amplicon测序)

将所有待测文库等量混合，最终取25μL进行扩增子测序(Ion S5系统)。

实施例2、高通量扩增子测序的引物组革兰氏阳性菌耐药基因检测中的应用按照实施例1的二的方法进行：

1、多重PCR制备扩增子(2primer pools)

共检测20例畜禽源的样本和2例人源的样品(见表8)。所述粪便和环境样本均可从中国农业大学处获得。

提取表8所示的粪便和环境样本的宏基因组DNA，分别以各个样本的宏基因组DNA为模板，按照实施例1的二的方法扩增，得到primer pool 1多重PCR扩增产物和primerpool 2多重PCR扩增产物。

表8为待测样本信息

2、扩增子文库的构建

与实施例1的方法二相同。

3、扩增子文库定量和检测

与实施例1的方法二相同。文库定量结果如图4所示，标准品文库E.coli DH10B所构建标准曲线的线性关系良好；扩增曲线平滑且平行性良好。待测样品浓度在标准曲线检测范围内，说明文库定量结果准确可靠。

提取表8全部1-22例样品测序数据进行分析和比对，并对原始数据进行筛选(seqkit)，过滤掉质量值小于20或者大于10的不确定核苷酸，获得最终的数据。对测序的质量进行评估，ISP的装载率在90％以上，测序准确度大于98％，测序片段长度在设计长度范围内(125-275bp)，序列比对耐药基因(表1中的耐药基因)成功率为93％，≥Q20的质量值在90％以上(图5，A：ISP Loading率；B：比对成功的数据比例；C：测序读长分布；D：测序准确度)，说明测序结果精确可靠，设计的扩增引物效率高、特异性好。

图6为表8所示样品1-16的抗生素耐药基因分布图。如图中所示，在环境宏基因组样品中同时检测出多种耐药基因，且不同样品之间耐药基因分布丰度有明显差异。

选取表8所示的样品17-22同时进行本发明扩增子测序和宏基因组测序，对本方法进行评估和验证，测序数据量见表9。

表9为样品测序数据量

通过比较宏基因组测序和本发明方法的扩增子测序的结果，发现本方法靶向测序单个样品所需的数据量远远小于宏基因组测序，且可以测出宏基因组测序5G数据量条件下无法测出的一些耐药基因(图7，样品17-22)，耐药基因的平均reads数大约使宏基因组测序的1000倍(图8，样品17-22)，极大程度上提高了测序速度、效率以及耐药基因的检出率，在保证结果精确可靠的同时，更加的经济、高效，大大减少了工作量。

上机结果显示，测序质量良好，Barcode能够正常识别，文库定量结果较为准确。所有样品均可以正确区分，且各样品数据量比例接近均一。片段大小在正常范围内、准确度高、基因比对成功率高，结果真实可靠。

由此说明，本发明所提供的一种构建耐药基因高通量扩增子测序文库的方法成功建立。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110>中国农业大学

<120>一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的引物组及应用

<160> 78

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

ttctacagtt tcaattccct aacaaacaga 30

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<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

ggaatgcttt catcctaaac caaaagtaaa 30

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<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

gttttacggg tcagcacttt actattga 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

ttaggaattt tgcagttccg aaatttcc 28

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

agatgaaaaa gataacatct ttgaaatagg tgc 33

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<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial sequence

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tggcagcata ccttacaaca taagcacaa 29

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

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tctctagcgt tacttttaat gactgaagta ga 32

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

aaaggattta aagaacatta acttcgaaca att 33

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

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gggctgacat tttagttgaa agtg 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

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ttgaaagaaa atgaagtaaa tatt 24

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gatctacgac a 11

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 14

aagcatgaag aatatgggta tttagatatt 30

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<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial sequence

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attgcaaacg ttaagaatct tactgagt 28

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 16

aaaaatgagt acggaacaga ggtagttatt 30

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<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 17

ctcaagctga ggactgggaa tt 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

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aatttctcat gaccgtaact tt 22

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<212> DNA

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aaagtgtatg atgagctata tgagaacgg 29

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<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial sequence

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ggggacttac atccaggaca tataatgg 28

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<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 22

gtttgctatg gaatcaggag aatcg 25

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<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 23

agacggtagt ttaatgagtg aactcc 26

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<211> 28

<212> DNA

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<400> 24

caatttggga tatacaagaa gatggcac 28

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

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<400> 25

cacaggttca tggtatttta gcgg 24

<210> 26

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

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gaatacgaac aatttattgc ggaacgt 27

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actactgcct atatgatgac t 21

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<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

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ggggatcgta tcaagtaact cgtg 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 30

tgttagctga tactggatat ggac 24

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aaggtttgtt ttatagcgtt ttattttggc 30

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<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

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tatgttaact ttttcgatag gaacagcagt 30

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<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

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gggctgtcat tcaccaaaac agtt 24

<210> 34

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 34

agtcgttgtt actagttggc tgatca 26

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<211> 27

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<213> Artificial sequence

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ataccgttca ttatctgttt tggatgg 27

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aaaatgtgac cgtcctacca gg 22

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<212> DNA

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tctgtcaaaa tcggttattt tagc 24

<210> 45

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 45

gaaagaacca aataggtact cgattagt 28

<210> 46

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 46

gggacaaacc ggatatttgg atggcaaaaa cga 33

<210> 47

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 47

aaaaagttac tatccaggga attaaagggt 30

<210> 48

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 48

gtttgatgga agatgatgaa gaatacggca 30

<210> 49

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 49

ttttaagtgc atgtaattca aacagttcac 30

<210> 50

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 50

aattcagata agagatttgc ctatgcttcg 30

<210> 51

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 51

tagcttatat catgttgcct ggtgtaa 27

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 52

tgatacgata caatcctaca 20

<210> 53

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 53

gattgcaaaa tctgcaacga gcttt 25

<210> 54

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 54

ggctttgaag catgcaaatg tcacta 26

<210> 55

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 55

actgccattg aaatagacca taaattatgc 30

<210> 56

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 56

aatacaaaac gctcattggc attact 26

<210> 57

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 57

aaccgccatt gaaatagatc ctaaattatg 30

<210> 58

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 58

tagtggaata tggatttgct aaaa 24

<210> 59

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 59

caggctggaa tgatattgtt gcc 23

<210> 60

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 60

gtaagtgcac tcgatgcaga caaggttggt gt 32

<210> 61

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 61

gtcgctggat gagcagcg 18

<210> 62

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 62

aatctggcgc agcggct 17

<210> 63

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 63

atatgcgtat tccggcaata taagttc 27

<210> 64

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 64

ttgtttcctg cttattgatg aacctaca 28

<210> 65

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 65

cgcgatggtc ttgtcta 17

<210> 66

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 66

aatgcggtta cgccactttt agta 24

<210> 67

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 67

caggtggtca gcgaactaag atagctttta t 31

<210> 68

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 68

ataaaggtaa ttattca 17

<210> 69

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 69

atttttcctt gccttagaat taagcaaaa 29

<210> 70

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 70

gaatatggtt gcagcaggat atattg 26

<210> 71

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 71

tcatttcaaa atgcagttat ggaaggga 28

<210> 72

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 72

gcatacaacg atgctcctaa atattgtg 28

<210> 73

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 73

actttgaaat ttatgcaccg caggaat 27

<210> 74

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 74

gaatagccgt atagataagg ttcggc 26

<210> 75

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 75

ggtgtatgga aaatgtgcga aaaacc 26

<210> 76

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 76

tttgtatgga caaatcgttg acatacatc 29

<210> 77

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 77

tgcaattagc atttaatgaa aagccaggat 30

<210> 78

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 78

aaaaacacag cagcagattg cat 23

Claims (9)

1.一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的成套引物，由序列1-序列78所示的引物组成；

所述革兰氏阳性菌耐药基因为如下39种耐药基因：ermB、ermF、ermG、ermY、fosB、gyrA、 lnuA、lnuB、lsaB、mecA、mphC、msrA、msrD、pbp1a、pbp5、tetK、tetL、tetS、VanC、VanG、vatE、 vgaA、aac6-II、aph2-Id、blaZ、cfr、ermA、ermC、ermT、fexA、fosA3、lsaE、mefA、optrA、 pbp2a、tetM、tetO、vanA和vgaE基因。

2.根据权利要求1中所述的成套引物，其特征在于：所述成套引物由引物组1和引物组2组成；

所述引物组1由序列1至序列44所示的引物组成；

所述引物组2由序列45至序列78所示的引物组成。

3.一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的多重PCR试剂，由PCR试剂1和PCR试剂2组成；

所述PCR试剂1包括权利要求2所述中的引物组1，

所述PCR试剂2包括权利要求2所述中的引物组2；

所述革兰氏阳性菌耐药基因为如下39种耐药基因：ermB、ermF、ermG、ermY、fosB、gyrA、 lnuA、lnuB、lsaB、mecA、mphC、msrA、msrD、pbp1a、pbp5、tetK、tetL、tetS、VanC、VanG、vatE、 vgaA、aac6-II、aph2-Id、blaZ、cfr、ermA、ermC、ermT、fexA、fosA3、lsaE、mefA、optrA、 pbp2a、tetM、tetO、vanA和vgaE基因。

4.根据权利要求3所述的多重PCR试剂，其特征在于：所述引物组1中的各条引物在所述PCR试剂1中的浓度均为400nMol/L；

所述引物组2中的各条引物在所述PCR试剂2中的浓度均为400nMol/L。

5.一种用于革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序的试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物组或权利要求3或4所述的多重PCR试剂；

所述革兰氏阳性菌耐药基因为如下39种耐药基因：ermB、ermF、ermG、ermY、fosB、gyrA、 lnuA、lnuB、lsaB、mecA、mphC、msrA、msrD、pbp1a、pbp5、tetK、tetL、tetS、VanC、VanG、vatE、 vgaA、aac6-II、aph2-Id、blaZ、cfr、ermA、ermC、ermT、fexA、fosA3、lsaE、mefA、optrA、 pbp2a、tetM、tetO、vanA和vgaE基因。

6.权利要求1或2所述的引物组或权利要求3或4所述的多重PCR试剂或权利要求5所述的试剂盒在构建革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序文库中的应用；所述革兰氏阳性菌耐药基因为如下39种耐药基因：ermB、ermF、ermG、ermY、fosB、gyrA、lnuA、lnuB、lsaB、 mecA、mphC、msrA、msrD、pbp1a、pbp5、tetK、tetL、tetS、VanC、VanG、vatE、vgaA、aac6-II、 aph2-Id、blaZ、cfr、ermA、ermC、ermT、fexA、fosA3、lsaE、mefA、optrA、pbp2a、tetM、tetO、 vanA和vgaE基因。

7.权利要求1或2所述的引物组或权利要求3或4所述的多重PCR试剂或权利要求5所述的试剂盒在革兰氏阳性菌耐药基因高通量扩增子测序中的应用；所述革兰氏阳性菌耐药基因为如下39种耐药基因：ermB、ermF、ermG、ermY、fosB、gyrA、lnuA、lnuB、lsaB、mecA、mphC、 msrA、msrD、pbp1a、pbp5、tetK、tetL、tetS、VanC、VanG、vatE、vgaA、aac6-II、aph2-Id、blaZ、 cfr、ermA、ermC、ermT、fexA、fosA3、lsaE、mefA、optrA、pbp2a、tetM、tetO、vanA和vgaE基因。

8.权利要求1或2所述的引物组或权利要求3或4所述的多重PCR试剂或权利要求5所述的试剂盒在检测待测样本中革兰氏阳性菌耐药基因中的应用，所述应用为非疾病诊断治疗目的；所述革兰氏阳性菌耐药基因为如下39种耐药基因：ermB、ermF、ermG、ermY、fosB、 gyrA、lnuA、lnuB、lsaB、mecA、mphC、msrA、msrD、pbp1a、pbp5、tetK、tetL、tetS、VanC、VanG、 vatE、vgaA、aac6-II、aph2-Id、blaZ、cfr、ermA、ermC、ermT、fexA、fosA3、lsaE、mefA、optrA、 pbp2a、tetM、tetO、vanA和vgaE基因。

9.一种检测待测样本中革兰氏阳性菌耐药基因的方法，所述方法为非疾病诊断治疗目的，所述方法包括如下步骤：

1）用权利要求3或4所述的多重PCR试剂中PCR试剂1和PCR试剂2分别对待测样本进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物1和多重PCR扩增产物2；

2）将所述多重PCR扩增产物1和所述多重PCR扩增产物2进行混合，制备扩增子文库；

3）测序所述扩增子文库，实现检测待测样本中革兰氏阳性菌耐药基因；

所述革兰氏阳性菌耐药基因为如下39种耐药基因：ermB、ermF、ermG、ermY、fosB、gyrA、 lnuA、lnuB、lsaB、mecA、mphC、msrA、msrD、pbp1a、pbp5、tetK、tetL、tetS、VanC、VanG、vatE、 vgaA、aac6-II、aph2-Id、blaZ、cfr、ermA、ermC、ermT、fexA、fosA3、lsaE、mefA、optrA、 pbp2a、tetM、tetO、vanA和vgaE基因。

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