CN108271394A - 用于预测沙门氏菌属物种对抗微生物剂的抗性的基因测试 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及确定患者感染对抗微生物药物治疗可能具有抗性的沙门氏菌属物种的方法，选择对感染了具有抗生素抗性的沙门氏菌属的患者的治疗的方法，和确定沙门氏菌属物种细菌微生物的抗生素抗性谱的方法，以及用于这些方法的计算机程序产品。在示例性的方法中，样品1用于分子测试2，然后进行采集分子指纹3。随后将结果与参考文库4进行比较，并报告结果5。
Description
本发明涉及确定患者感染对抗微生物药物治疗可能具有抗性的沙门氏菌属(Salmonella)物种的方法，选择感染了可能具有抗性的沙门氏菌属菌株的患者的治疗的方法，和确定沙门氏菌属物种细菌微生物的抗微生物药物如抗生素的抗性谱的方法，以及用于这些方法的计算机程序产品。
抗生素抗性是药物抗性的一种形式，从而使微生物亚群如细菌物种的菌株，尽管暴露于抗生素类药物，但也可存活并增殖。对于个体患者以及主要公共卫生问题而言，这是严重的健康问题。细菌感染的及时治疗需要分析获得自患者的临床分离株的抗生素抗性，以选择有效的疗法。通常，出于此目的，将鉴定的抗性与某一微生物(即ID)关联是必要的。
抗菌药物抗性(ADR)代表了主要的健康负担。根据正在监督的世界卫生组织的抗微生物抗性全球报告，ADR在欧洲每年导致25,000例死亡，在美国每年导致23,000例死亡。在欧洲，额外的250万住院日导致15亿欧元的社会成本。在美国，2百万的直接疾病成本导致200亿美元的直接成本。总成本估计高得多，将国内生产总值(GDP)降低达1.6％。
沙门氏菌是属于肠杆菌科的革兰氏阴性，有鞭毛的兼性厌氧杆菌。抗原结构的确定允许临床上鉴定生物体，并将其分配到九个血清组(A-I)之一，每个血清组包含许多血清型(serovars/serotypes)。
沙门氏菌是普遍存在的人类和动物病原体，并且沙门氏菌病在世界各地都很常见。人类沙门氏菌病的临床范围从常见的沙门氏菌肠胃炎(腹泻、腹部绞痛和发烧)至伤寒(包括伤寒热)，其是危及生命的发热性系统性疾病，需要立刻进行抗生素治疗。特定的血清型显示强烈的产生特定综合征的倾向(伤寒沙门氏菌(S typhi)、甲型副伤寒沙门氏菌(Sparatyphi-A)和肖氏沙门氏菌(S schottmuelleri)产生伤寒；猪霍乱沙门氏菌(Scholeraesuis)产生败血症或病灶感染；鼠伤寒沙门氏菌(S typhimurium)和肠炎沙门氏菌(S enteritidis)产生肠胃炎)；然而，有时，任何血清型都可以产生任何综合征。
通常，较为严重的感染发生在婴儿、50岁以上的成人以及患有使人衰弱疾病的受试者中。
在2013年CDC(美国疾病控制与预防中心)的题为“美国抗生素抗性威胁”的最新报告中，耐药性的非伤寒沙门氏菌被列在构成严重威胁水平的细菌中。非伤寒沙门氏菌在美国每年造成约120万例疾病，23,000例住院和450例死亡。估计每年直接医疗费用是3.65亿美元。值得关注的是，监测数据显示越来越多比例的非伤寒沙门氏菌耐受头孢曲松(ceftriaxone)或环丙沙星(ciprofloxacin)，这些药物代表了通常用于治疗严重沙门氏菌病的抗生素类别。考虑到在CDC完成测试的所有抗生素的类别，CDC所测试的约5％的非伤寒沙门氏菌耐受5类或更多类的抗生素。
一般而言，细菌针对抗微生物治疗的抗性机制很大一部分依赖于生物体的遗传。各自的基因或分子机制在细菌基因组中编码或者在可在不同细菌之间互换的质粒上编码。最常见的抗性机制包括：
1)外排泵是位于膜内的高亲和力反向运输系统，其将抗生素运输至细胞外，例如针对四环素的抗性。
2)特定的酶以使抗生素丧失其活性的方式对抗生素进行修饰。在链霉素的情况下，抗生素被化学修饰，以使其不再结合核糖体，从而不再阻止蛋白合成。
3)产生降解抗生素的酶，从而使其失活。例如，青霉素酶是一组剪切青霉素分子的β内酰胺环的β-内酰胺酶。
此外，一些病原体显示出针对药物的天然抗性。例如，生物体可以缺乏针对抗生素的运输系统，或者生物体中不存在抗生素分子的靶标。
原则上对药物敏感的病原体可以通过既有遗传物质的修饰(例如，抗生素抗性的自发突变，其在感染中以约1/1亿个细菌的频率发生)或者从其它来源获得新的遗传物质而变得具有抗性。一个实例是水平基因转移，其是这样的过程：DNA小包中包含的遗传物质可在同一物种的单个细菌之间，甚至在不同物种之间转移。水平基因转移可以通过转导、转化或接合发生。
通常，通过在不同浓度的这些试剂中培养微生物来进行针对抗微生物剂的敏感性/抗性的测试。
简言之，将琼脂平板接种患者样品(例如，尿、痰、血液、粪便)过夜。在第二天，通过培养或者利用质谱法，用各个克隆鉴定生物体。基于生物体的身份，接种含有增加浓度的用于处理这些生物体的药物的新平板，并另外生长12-24小时。使用抑制生长的最低药物浓度(最小抑菌浓度-MIC)以确定对所测试的药物的敏感性/抗性。该过程耗费至少2至3个工作日，期间以经验为主对患者进行治疗。尤其是在患有危及生命的疾病的患者中或者为了克服抗生素的普遍滥用，需要显著降低的结果效率(time-to-result)。
近期的发展包括用于快速细菌鉴定的基于PCR的测试试剂盒(例如，BiomerieuxBiofire Tests，Curetis Unyvero Tests)。利用这些测试，对于非常有限数目的药物而言，检测所选择的抗性基因座是可能的，但是不能给出与基于培养的AST的关联。质谱法越来越多地用于鉴定临床样品中的病原体(例如，Brruker Biotyper)，并且正在进行研究以建立检测针对抗生素的敏感性/抗性的方法。
对于一些药物而言，已知找到至少两个靶标，例如在环丙沙星(drug bank ID00537；http：//www.drugbank.ca/drugs/DB00537)的情况下，靶标包括DNA拓扑异构酶IV、DNA拓扑异构酶II和DNA回旋酶。可以预期，对于其它药物而言也是这样的情况，尽管还未鉴定出各自的第二靶标。在常见的调节情况下，两个相关的基因位点将自然显示出共相关或冗余。
已知药物抗性可与遗传多态性相关。这适用于病毒，其中在临床实践中建立了抗性测试(例如，HIV基因型分型)。最近，已显示，抗性在细菌甚至更高级生物体(如人类)中也具有遗传原因，其中肿瘤对某些细胞抑制剂的抗性可与基因组突变相关。
Wozniak等人(BMC Genomics 2012，13(Suppl 7)：S23)基于基因型和表型数据公开了金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中的药物抗性的遗传决定因子。Stoesser等人利用全基因组序列数据，公开了大肠杆菌(Escherichia coli)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)分离株的抗微生物敏感性的预测(J Antimicrob Chemother2013；68：2234-2244)。
Chewapreecha等人(Chewapreecha等人(2014)Comprehensive Identificationof single nucleotid polymorphisms associated with beta-lactam resistancewithin pneumococcal mosaic genes.PLoS Genet 10(8)：el004547)利用类似的方法鉴定出革兰氏阳性肺炎链球菌(Streptococcus Pneumonia)中的突变。
快速且准确地检测沙门氏菌属物种感染以及预测对抗微生物疗法的应答代表了高度未满足的临床需求。
通过本发明解决了这一需求。
发明概述
本发明的发明人通过下述解决该需求：进行一大组沙门氏菌属临床分离株的全基因组测序，并将基因突变谱与基于标准培养的抗微生物敏感性测试进行比较，目标是开发可利用分子测试用以检测细菌对抗微生物药物的敏感性/抗性的测试。
本发明的发明人对于对抗微生物药物如抗生素类药物敏感或具有抗性的沙门氏菌属物种细菌的基因组进行了广泛研究。基于该信息，现可以提供基于在核苷酸水平的各个基因或突变的对沙门氏菌属菌株的抗性模式的详细分析。这一分析包括鉴定对各个抗微生物药物如抗生素类药物以及它们集群的抗性。这不仅允许确定对单个抗微生物药物如抗生素类药物的抗性，还允许确定对抗微生物药物组(例如，抗生素类如内酰胺类或喹诺酮类抗生素)的抗性，甚至对所有相关抗生素类药物的抗性。
因此，本发明将极大地促进用于治疗患者沙门氏菌属感染的合适的抗微生物药物如抗生素类药物的选择，从而极大地提高诊断和治疗的质量。
根据第一方面，本发明公开了确定患者感染对抗微生物药物治疗可能具有抗性的沙门氏菌属物种的诊断方法，其也可被描述为确定患者感染具有抗微生物药物如抗生素抗性的沙门氏菌属的方法，其包括下述步骤：
a)获得或提供来自患者的包含或疑似包含至少一种沙门氏菌属物种的样品；
b)确定来自以下表1或表2中所列的基因的组中的至少两种基因中至少一个突变的存在，其中存在所述至少两个突变表明所述患者感染了具有抗微生物药物抗性如抗生素抗性的沙门氏菌属菌株。
本文中，患者感染对抗微生物药物治疗可能具有抗性的沙门氏菌属物种意味着，患者感染沙门氏菌属物种，其中不清楚所述沙门氏菌属物种对用特定抗微生物药物的治疗是否敏感或者其对所述抗微生物药物是否具有抗性。
在上述步骤b)以及相应步骤中，确定至少两种基因中的至少一个突变，以使总共确定至少两个突变，其中两个突变位于不同的基因中。
表1：基因列表
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| leuB | recF | emrA | glyQ | dcp |
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| yjbC | nadB | UMN798_3160 | hutU | envC |
| UMN798_3889 | UMN798_1629 | bcfB | degQ | UMN798_1331 |
| trg | uvrC | polB | hpcD | UMN798_1628 |
| UMN798_1701 | glgS | plsB | yjcC | feoB |
| misL | dxr | hemF | rnfG | yhjB |
| UMN798_1163 | UMN798_0394 | alkA | nhaA | lspA |
表2：基因列表
| recN | hemH | UMN798_3428 | metE | yijD |
| UMN798_4831 | UMN798_1939 | copS | UMN798_0628 | UMN798_4878 |
| leuB | recF | emrA | glyQ | dcp |
| thiH | UMN798_1612 | UMN798_2909 | UMN798_1680 | UMN798_4073 |
| yjbC | nadB | UMN798_3160 | hutU | envC |
| UMN798_3889 | UMN798_1629 | bcfB | degQ | UMN798_1331 |
| trg | uvrC | polB | hpcD | UMN798_1628 |
| UMN798_1701 | glgS | plsB | yjcC | feoB |
| misL | dxr | hemF | rnfG | yhjB |
| UMN798_1163 | UMN798_0394 | alkA | nhaA | lspA |
根据第二方面，本发明涉及选择感染了可能具有抗性的沙门氏菌属菌株，例如感染了具有抗微生物药物(例如抗生素)抗性的沙门氏菌属的患者的治疗的方法，其包括下述步骤：
a)获得或者提供来自患者的包含或疑似包含至少一种沙门氏菌属物种的样品；
b)确定来自上述表1或表2中所列的基因的组中的至少两种基因中至少一个突变的存在，其中存在所述至少两个突变表明对一种或多种抗微生物药物如抗生素类药物的抗性；
c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物；以及
d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于治疗沙门氏菌属感染的一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物。
本发明第三方面涉及确定沙门氏菌属物种细菌微生物的抗微生物药物如抗生素的抗性谱的方法，其包括：
获得或提供沙门氏菌属物种多种临床分离株的基因序列的第一数据集；
提供沙门氏菌属物种多种临床分离株的抗微生物药物如抗生素的抗性的第二数据集；
将所述第一数据集的基因序列与沙门氏菌属至少一个，优选一个参考基因组进行比对，和/或至少部分组装所述第一数据集的基因序列；
分析所述第一数据集的基因序列的基因变体，以获得基因变体的第三数据集；
将所述第三数据集与所述第二数据集关联，并对所述关联进行统计学分析；以及
确定沙门氏菌属的基因组中与抗微生物药物如抗生素抗性相关的基因位点。
此外，本发明第四方面涉及确定属于沙门氏菌属物种的细菌微生物的抗微生物药物如抗生素抗性谱的方法，其包括下述步骤：
a)获得或者提供包含或疑似包含所述细菌微生物的样品；
b)如通过本发明的第三方面所述方法确定的，确定所述细菌微生物的至少一种基因中突变的存在；
其中突变的存在表明对抗微生物药物如抗生素的抗性。
此外，本发明第五方面公开了确定患者感染对抗微生物药物治疗可能具有抗性的沙门氏菌属物种的诊断方法，如第一方面所述，其也可被描述为确定患者感染具有抗微生物药物如抗生素抗性的沙门氏菌属的方法，其包括下述步骤：
a)获得或者提供来自患者的包含或疑似包含属于沙门氏菌属物种的细菌微生物的样品；
b)如通过本发明的第三方面所述方法确定的，确定属于沙门氏菌属物种的细菌微生物的至少一种基因中至少一个突变的存在，其中存在所述至少一个突变表明所述患者感染具有抗微生物药物抗性如抗生素抗性的沙门氏菌属。
第六方面还公开了选择感染了可能具有抗性的沙门氏菌属菌株(例如感染了具有抗微生物药物抗性如抗生素抗性的沙门氏菌属)的患者的治疗的方法，其包括下述步骤：
a)获得或者提供来自患者的包含或疑似包含属于沙门氏菌属物种的细菌微生物的样品；
b)如本发明的第三方面所述方法确定的，确定属于沙门氏菌属物种的细菌微生物的至少一种基因中至少一个突变的存在，其中存在所述至少一个突变表明对一种或多种抗微生物药物如抗生素类药物的抗性；
c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物；以及
d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于治疗沙门氏菌属感染的一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物。
本发明第七方面涉及获得、分别确定沙门氏菌属物种细菌微生物的抗微生物药物如抗生素抗性谱的方法，其包括：
获得或者提供沙门氏菌属物种临床分离株的基因序列的第一数据集；
提供沙门氏菌属物种多种临床分离株的抗微生物药物，例如抗生素抗性的第二数据集；
将所述第一数据集的基因序列与沙门氏菌属至少一个，优选一个参考基因组进行比对，和/或至少部分组装所述第一数据集的基因序列；
分析所述第一数据集的基因序列的基因变体，以获得第一数据集的基因变体的第三数据集；
将所述第三数据集与所述第二数据集关联，并对所述关联进行统计学分析；以及
确定所述第一数据集的沙门氏菌属基因组中与抗微生物药物如抗生素抗性相关的基因位点。
根据第八方面，本发明公开了计算机程序产品，其包含可执行的指令，所述指令被执行时实施本发明的第三、第四、第五、第六或第七方面所述的方法。
从属权利要求公开了本发明的其它方面和实施方案，并且其可以从下述描述、附图和实施例中得出，但不限于此。
附图说明
附图应当阐明本发明的实施方案，并传达其进一步的理解。与描述相结合，它们将作为本发明的概念和原理的解释。结合附图，可以得到其它实施方案和许多所阐明的优势。附图的要素相对于彼此不一定是按比例的。除非另外指明，相同的、功能等同的以及作用相同的特性和组件在附图的图中用同一参考编号表示。
图1示意性地示出了根据本发明的方法的诊断测试的读取概念。
本发明的详细描述
定义
除非另外限定，否则本文使用的技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的具有相同的含义。
本发明中的“抗微生物药物”指一组药物，其包括抗生素、抗真菌剂、抗原生动物剂和抗病毒剂。根据某些实施方案，抗微生物药物是抗生素。
术语“核酸分子”指具有确定序列的多核苷酸分子。其包括DNA分子、RNA分子、核苷酸类似物分子及其组合和衍生物，如掺入核苷酸类似物的DNA分子或RNA分子或者eDNA。
术语“核酸序列信息”涉及可来源于核酸分子的序列的信息，所述核酸分子的序列是例如序列自身或者与参考序列相比的序列上的变异。
术语“突变”涉及与参考序列相比的序列上的变异。此类参考序列可以是在主要的野生型生物体或者参考生物体(例如限定且已知的细菌株或亚株)中确定的序列。例如，突变是一个或多个核苷酸的缺失、一个或多个核苷酸的插入、或者一个或多个核苷酸的取代、一个或一系列核苷酸的重复、一个或一系列核苷酸的易位，以及特别地，单核苷酸多态性(SNP)。
在本发明的背景下，“样品”是包含来自细菌微生物的至少一种核酸分子的样品。样品的实例是：细胞、组织、体液、活检标本、血液、尿液、唾液、痰、血浆、血清、细胞培养上清液、拭子样品等。根据某些实施方案，样品是患者样品(临床分离株)。
被称为下一代测序的新的且高效的核酸测序方法已开启了大规模基因组分析的可能性。术语“下一代测序”或“高通量测序”指高通量测序技术，其将测序过程并行，一次产生数千条或数百万条序列。实例包括大规模平行信号测序(MPSS)、聚合酶克隆测序(Polonysequencing)、454焦磷酸测序、Illumina(Solexa)测序、SOLiD测序、离子半导体测序、DNA纳米球测序、Helioscope(TM)单分子测序、单分子SMRT(TM)测序、单分子实时(RNAP)测序、纳米孔DNA测序、通过杂交进行的测序、扩增子测序、GnuBio。
在描述中，术语“微生物(microorganism)”包含术语微生物(microbe)。除非另外或者明显指明，微生物的类型没有特别限制，并且其例如包括细菌、病毒、真菌、微小的藻类和原生动物及其组合。根据某些方面，微生物指一种或多种沙门氏菌属物种，尤其是猪霍乱沙门氏菌(Salmonella_choleraesuis)、都柏林沙门氏菌(Salmonella_dublin)、肠道沙门氏菌亚利桑那亚种(Salmonella_enterica_ssp_arizonae)、肠道沙门菌双亚利桑那亚种(Salmonella_enterica_ssp_diarizoniae)、肠炎沙门氏菌(Salmonella_enteritidis)、鸡沙门氏菌(Salmonella_gallinarum)、沙门氏菌A群(Salmonella_Group_A)、沙门氏菌B群(Salmonella_Group_B)、沙门氏菌C群(Salmonella_Group_C)、沙门氏菌D群(Salmonella_Group_D)、海德尔堡沙门氏菌(Salmonella_heidelberg)、迈阿密沙门氏菌(Salmonella_miami)、纽波特沙门氏菌(Salmonella_newport)、巴拿马沙门氏菌(Salmonella_panama)、甲型副溶血性沙门氏菌(Salmonella_parahaemolyticus_A)、甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella_paratyphi_A)、乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella_paratyphi_B)、鸡白痢沙门氏菌(Salmonella_pullorum)、森夫顿堡沙门氏菌(Salmonella_senfienberg)、沙门氏菌种(Salmonella_species)、沙门氏菌种_Lac_--，_ONPG_+(Salmonella_species_Lac_--，_ONPG_+)、沙门氏菌种_Lac_+，_ONPG_+(Salmonella_species_Lac_+，_ONPG_+)、沙门氏菌亚属I(Salmonella_subgenus_I)、沙门氏菌亚属II(Salmonella_subgenus_II)、沙门氏菌亚属IV(Salmonella_subgenus_IV)、沙门氏菌亚群_I_Suc+(Salmonella_subgroup_I_Suc+)、田纳西沙门氏菌(Salmonella_tennessee)和/或伤寒沙门氏菌(Salmonella_typhi)。
本描述中提及微生物包括提及一种微生物以及多种微生物，例如两种、三种、四种、五种、六种或者更多种微生物。
本发明中的脊椎动物指含有椎骨的动物，其包括哺乳动物-包括人类、鸟类、爬行动物、两栖动物和鱼类。因此本发明不仅适用于人类医学，还适用于兽医学。
根据某些实施方案，本发明的方法中的患者是脊椎动物，更优选哺乳动物，并且最优选人类患者。
在示例性地详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文所述的方法的过程步骤的具体组成部分，因为此类方法可以改变。还应当理解，本文使用的技术仅出于描述具体实施方案的目的，并且其不意图具有限制性。必须注意，除非上下文另外明确规定，如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括单数和/或复数指示物。例如，本文使用的术语“一个/一种”可以理解为一个单个的实体或者意味着“一个或多个/一种或多种”实体。还应当理解，除非上下文另外明确规定，复数形式包括单数和/或复数指示物。此外，应当理解，如果给出由数值限定的参数范围，则认为所述范围包含这些限制值。
关于抗微生物药物，例如抗生素类药物的剂量，其参考人类和兽医学中建立的药理学原理。例如，Forth，Henschler，Rummel″Allgemeine und spezielle Pharmakologieund Toxikologie″，第9版，2005，pp.781-919，其可用作指南。关于即用型药剂的配制，参考″Remington，The Science and Practice of Pharmacy″，第22版，2013，pp.777-1070。
基因序列的组装可以通过任何已知的方法进行，并无特别限定。
根据某些实施方案，利用比对所发现的突变也可与无比对的方法进行比较或匹配，例如，用于检测单个碱基交换的方法，例如基于通过组装发现的重叠群。例如，可将获得自测序的读取组装成重叠群并可将重叠群相互比较。
根据第一方面，本发明涉及确定患者感染对抗微生物药物治疗可能具有抗性的沙门氏菌属物种的诊断方法，其也可被描述为确定患者感染具有抗微生物药物如抗生素抗性的沙门氏菌属的方法，其包括下述步骤：
a)获得或者提供来自患者的包含或者疑似包含至少一种沙门氏菌属物种的样品；
b)确定来自下述基因的至少两种基因中至少一个突变的存在：recN、hemH、UMN798_3428、metE、yijD、UMN798_4831、UMN798_1939、copS、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、recF、emrA、glyQ、dcp、thiH、UMN798_1612、UMN798_2909、UMN798_1680、UMN798_4073、yjbC、nadB、UMN798_3160、hutU、envC、UMN798_3889、UMN798_1629、bcfB、degQ、UMN798_1331、trg、uvrC、polB、hpcD、UMN798_1628、UMN798_1701、glgS、plsB、yjcC、feoB、misL、dxr、hemF、rnfG、yhjB、UMN798_1163、UMN798_0394、alkA、nhaA和lspA，其中存在所述至少两个突变表明所述患者感染具有抗微生物剂如抗生素抗性的沙门氏菌属菌株。
在该方法以及本发明的其它方法中，可以以任何方式，优选无创的方式提供或者获得样品，并且可以例如作为体外样品提供或者作为体外样品制备。
根据某些方面，通过本发明的任何方法确定至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种基因中的突变，例如至少两种基因或者至少三种基因中的突变。并非仅测试单个基因或突变体，数个变体位点的组合可以提高预测的准确性，并进一步降低受其它因素影响的假阳性结果。因此，特别优选确定选自表1或表2的2、3、4、5、6、7、8或9种(或更多种)基因中突变的存在。
对于上述基因，即表1和表2中所示基因，可以观察到针对至少一种抗微生物药物如抗生素的抗性的最大可能性，其p值小于10-30，尤其小于10-40，这表明数值的高显著性(n＝636；α＝0.05)。关于表1和表2的细节可获得自实施例中公开的表3和表4(4a、4b、4c)。在确定了至少两种含有突变的基因的情况下，可以高可能性地确定抗微生物药物如抗生素的抗性。因此，表1中的基因代表在沙门氏菌属物种的基因组中观察到突变的50种最佳基因，而表2中的基因代表，对于如下所述的沙门氏菌属物种的抗微生物药物如抗生素敏感性测试，可以观察到交叉相关的50种最佳基因。
根据某些实施方案，该方法以及本发明的其它方法中的获得或提供来自患者的包含或疑似包含至少一种沙门氏菌属物种的样品，可以包括下述：
例如提供或者获得脊椎动物(例如人类)的样品，以及通过未特别限定的记录核酸的已知方法来记录核酸序列(例如DNA或RNA序列)。例如，可以通过测序方法记录核酸，其中任何测序方法均适合，尤其是这样的测序方法：可在短时间内对大批样品成分，如血液样品成分中包含的核酸和/或核酸片段和/或其部分进行分析，包括至少一种目标微生物，尤其是至少一种沙门氏菌属物种的核酸和/或核酸片段和/或其部分。例如，可以利用聚合酶链式反应(PCR)，尤其是多重PCR或高通量测序或下一代测序，优选利用高通量测序进行测序。对于测序，优选使用体外样品。
通过测序获得的数据可以是任何形式，并且其随后可用于通过已知的下述方法来鉴定待鉴定的微生物如沙门氏菌属物种的核酸，从而鉴定基因：例如指纹分析法、比较基因组和/或与目标微生物的一个或多个物种的至少一个或多种基因组，即参考基因组进行比对等，形成沙门氏菌属物种的比对基因的第三数据集-排除来自其它来源(例如脊椎动物)的其它数据。参考基因组未具体限定，并且可以取自数个数据库。可将不同的参考基因组或多于一个的参考基因组用于比对，这取决于微生物。利用参考基因组-以及来自其它物种(例如，沙门氏菌属物种)的基因组的数据-可以获得各个物种以及不同物种(例如，沙门氏菌属物种)的整批样品的基因中的突变。
例如，在全基因组相关研究中，使目标点(例如，突变)参考一个恒定参照，以提高标准化是有用的。在个体之间具有高的基因组一致性和99％相同的序列的人类的情况下，这是简单的，并且代表了标准，因为相应的参考基因组可获自数据库。但是在引发传染性疾病的微生物(例如，细菌和病毒)的情况下，这要困难的多。一种可能性是依靠包含某种属的全部序列的虚拟的泛基因组。另一可能性是分析所有可获得的参照，这要复杂的多。其中从数据库(例如，RefSeq)提取全部n个参照，并将其与新测序的细菌基因组k进行比较。在这之后，应用矩阵(定位的读取％，覆盖的基因组％)估计哪一参照最适于所有新细菌。但是，进行nxk个完全比对。如同沙门氏菌属的情况，尽管有大量的参照，仍可获得稳定的结果。
根据某些实施方案，将沙门氏菌属物种的基因组参考一个参考基因组。但是，对于其它微生物，其不排除使用多个参考基因组。在本发明的方法中，根据某些实施方案，沙门氏菌属的参考基因组是NCBI中注释的NC_017046。参考基因组是本申请所附的序列表的SEQID NO 1。
参考序列获自沙门氏菌属菌株NC_017046
(http：//www，genome.jp/dbget-bin/www_bget？refseq+NC_017046)
基因座NC_017046 4876219 bp DNA环形(circular)CON01-MAR-2015
定义肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清型菌株798(Salmonella entericasubsp.enterica serovar Typhimurium str.798)，全部基因组。
登录号(ACCESSION) NC_017046
版本(VERSION) NC_017046.1 GI：383494824
DBLINK BioProject：PRJNA224116
BioSample：SAMN02604223
Assembly：GCF_000252875.1
关键词(KEYWORDS) RefSeq.
来源(SOURCE) 肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清型菌株
798
生物体(ORGANISM) 肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清型菌株
798
细菌；变形菌门；γ变形菌纲；肠杆菌目；
肠杆菌科；沙门氏菌属
参考文献 1(碱基1至4876219)
作者(AUTHORS) Patterson，S.K.，Borewicz，K.，Johnson，T.，Xu，W.
和Isaacson，R.E.
名称(TITLE) Characterization and differential gene expression between two phenotypic phase variants in Salmonella entericaserovarTyphimurium
期刊(JOURNAL) PLoS ONE 7(8)，E43592(2012)
PUBMED 22937065
参考文献 2(碱基1至4876219)
作者(AUTHORS) Borewicz，K.，Johnson，T.J.和Isaacson，R.E.
标题(TITLE) 直接提交
期刊(JOURNAL) 2012年1月28日提交，Veterinary and Biomedical Sciences，University of Minnesota，1971 Commonwealth Avenue，205 Vet Science，SaintPaul，MN 55108，USA
可选地或者此外，可以用已知的方法，例如通过重新组装或者定位组装来至少部分组装第一数据集的基因序列。未特别限定序列组装，并且可以使用任何已知的基因组组装程序，例如基于Sanger、454、Solexa、Illumina、SOLid技术等，及其杂交物/混合物。
根据某些实施方案，可在鉴定目标核酸之后，移出与目标微生物(例如沙门氏菌属物种)不同来源的核酸的数据，例如通过过滤数据。此类数据可以，例如包含患者的核酸，所述患者为例如脊椎动物(如人类)和/或其它微生物等。这可以通过例如Meyerson等人2002年开发的计算减法完成。为此，与脊椎动物等的基因组进行比对也是可能的。对于比对，数种比对工具都是可用的。以这种方式可以大幅降低来自样品的原始数据量。
在此类“过量”数据移出之后，也可以如上所述进行指纹分析和/或比对和/或组装等，形成沙门氏菌属物种比对和/或组装的基因的第三数据集。
利用这些技术，可以获得不同物种的目标微生物(例如沙门氏菌属物种)的含有突变的基因。
当如下所述，例如在吸收有抗微生物药物如抗生素的板上利用标准培养方法，测试针对抗微生物药物如抗生素的这些相同物种对多种抗微生物药物如抗生素的敏感性时，这些抗微生物药物如抗生素敏感性测试的结果然后可与各自微生物(例如沙门氏菌属)的基因组中的突变相互参考/关联。利用一些，例如50或超过50、100或超过100、200或超过200、300或超过300、400或超过400、500或超过500或者600或超过600种不同的微生物物种，例如不同的沙门氏菌属物种，可以利用已知的方法，对获得的这些数目的物种的突变与抗微生物药物(例如抗生素)的敏感性之间的相互参考数据进行统计学分析。
关于培养方法，可将样品例如培养过夜。在第二天，可以通过培养或者利用质谱法将各个克隆用于微生物鉴定。基于微生物的身份，接种含有增加浓度的用于处理这些生物体的药物的新平板，并另外生长12-24小时。可以使用抑制生长的最低药物浓度(最小抑菌浓度-MIC)确定所测试的抗生素的敏感性/抗性。
可以以常规方式进行核酸/基因突变与抗微生物药物(例如抗生素)抗性的关联，并且未特别限定。例如，可将抗性与某些基因或者基因中的某些突变(例如SNP)关联。关联之后，可以进行统计学分析。
此外，基因突变与抗微生物药物(例如抗生素)抗性之间的关联的统计学分析未被具体限定，并且可以例如用50或更多、100或更多、200或更多、300或更多、400或更多、500或更多、或者600或更多的样品大小n，以及例如0.05或更小，例如0.05，优选0.01或更小的显著性水平(α-误差-水平)，根据例如数据的量，以不同的方式进行，例如利用方差分析(ANOVA)或者学生t-检验进行。可以获得基因组中各个基因和/或各个位点以及所测试的所有抗生素、一组抗生素或者单个抗生素的统计值。如果需要，也可以调整获得的p值用于统计误差。
为了统计学上合理的结果，应当抽取大量个体，其中n＝50、100、200、300、400、500或600，以及显著性水平(α-误差-水平)为，例如0.05或更小，例如0.05，优选0.01或更小。根据某些实施方案，对于n＝200、300、400、500或600，可以获得尤其显著的结果。
为了统计学上合理的结果，应当抽取大量个体，其中n＝50或更多、100或更多、200或更多、300或更多、400或更多、500或更多、或者600或更多，以及显著性水平(α-误差-水平)为，例如0.05或更小，例如0.05，优选0.01或更小。根据某些实施方案，对于n＝200或更多、300或更多、400或更多、500或更多、或者600或更多，可以获得尤其显著的结果。
在针对多于600，例如636个沙门氏菌属的个体物种已经实施以上步骤之后，对于基因突变与抗微生物药物(例如抗生素)抗性之间的统计学最佳关联，获得表1和表2中公开的数据。因此，这些基因中的突变被证明是抗微生物药物(例如抗生素)抗性的有效标志物。
根据另一方面，本发明第二方面涉及选择对感染了可能具有抗性的沙门氏菌属菌株，例如感染了具有抗微生物药物(例如抗生素)抗性的沙门氏菌属的患者的治疗的方法，其包括下述步骤：
a)获得或提供来自患者的包含或疑似包含至少一种沙门氏菌属物种的样品；
b)确定来自下述基因的至少两种基因中至少一个突变的存在：recN、hemH、UMN798_3428、metE、yijD、UMN798_4831、UMN798_1939、copS、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、recF、emrA、glyQ、dcp、thiH、UMN798_1612、UMN798_2909、UMN798_1680、UMN798_4073、yjbC、nadB、UMN798_3160、hutU、envC、UMN798_3889、UMN798_1629、bcfB、degQ、UMN798_1331、trg、uvrC、polB、hpcD、UMN798_1628、UMN798_1701、glgS、plsB、yjcC、feoB、misL、dxr、hemF、rnfG、yhjB、UMN798_1163、UMN798_0394、alkA、nhaA和lspA，其中存在所述至少两个突变表明对一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物的抗性；
c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物；以及
d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于沙门氏菌属感染的治疗的一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物。
在该方法中，步骤a)获得或者提供样品以及步骤b)确定存在至少一个突变，与第一方面的方法中的相同。
然后，步骤c)中鉴定的至少一种或多种抗微生物药物如抗生素类药物是基于步骤b)中获得的结果，并且将其和与突变关联的抗微生物药物如抗生素类药物相对应。一旦排除这些抗微生物药物(例如抗生素)，可以在步骤d)中选择适用于治疗的剩余的抗微生物药物(例如抗生素类药物/抗生素)。
在描述中，关于同一基因，第一和第二方面的参考也适用于第14、15、16和17方面，除非上下文明确指明它们不适用。
根据某些实施方案，第一或第二方面的方法以及本发明的其它方法中的抗微生物药物，例如抗生素选自β-内酰胺类、β-内酰胺类抑制剂、喹啉类及其衍生物、氨基糖苷类、聚酮类、各种四环素以及叶酸合成抑制剂中的至少一种，尤其是选自β-内酰胺类、β-内酰胺类抑制剂、喹啉类及其衍生物、氨基糖苷类和聚酮类、各种四环素中的至少一种。
在本发明的方法中，可以根据某些实施方案确定沙门氏菌属对一种或多种抗微生物药物(例如抗生素类药物)的抗性。
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，抗微生物药物，例如抗生素类药物选自内酰胺类抗生素，以及确定下述基因中突变的存在：recN、hemH、UMN798_3428、metE、yijD、UMN798_4831、UMN798_1939、copS、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、recF、emrA、glyQ、dcp、thiH、UMN798_1612、UMN798_2909、UMN798_1680、UMN798_4073、yjbC、nadB、UMN798_3160、hutU、envC、UMN798_3889、UMN798_1629、bcfB、degQ、UMN798_1331、trg、uvrC、polB、hpcD、UMN798_1628、UMN798_1701、glgS、plsB、yjcC、feoB、misL、dxr、hemF、rnfG、yhjB、UMN798_1163、UMN798_0394、alkA、nhaA、lspA。
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，抗微生物药物，例如抗生素类药物选自氨基糖苷类抗生素，以及确定下述基因中突变的存在：recN、hemH、UMN798_3428、metE、yijD、UMN798_4831、UMN798_1939、copS、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、recF、emrA、glyQ、dcp、thiH、UMN798_1612、UMN798_2909、UMN798_1680、UMN798_4073、yjbC、nadB、UMN798_3160、hutU、envC、UMN798_3889、UMN798_1629、bcfB、degQ、UMN798_1331、trg、uvrC、polB、hpcD、UMN798_1628、UMN798_1701、glgS、plsB、yjcC、feoB、misL、dxr、hemF、rnfG、yhjB、UMN798_1163、UMN798_0394、alkA、nhaA、lspA。
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，抗微生物药物，例如抗生素类药物选自聚酮类抗生素，优选四环素类抗生素，以及确定下述基因中突变的存在：recN、hemH、UMN798_3428、metE、yijD、UMN798_4831、UMN798_1939、copS、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、recF、emrA、glyQ、dcp、thiH、UMN798_1612、UMN798_2909、UMN798_1680、UMN798_4073、yjbC、nadB、UMN798_3160、hutU、envC、UMN798_3889、UMN798_1629、bcfB、UMN798_1331、trg、uvrC、polB、hpcD、UMN798_1628、UMN798_1701、glgS、plsB、yjcC、feoB、misL、dxr、hemF、rnfG、yhjB、UMN798_1163、UMN798_0394、alkA、nhaA、lspA。
根据某些实施方案，抗微生物药物是抗生素/抗生素类药物。
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，确定核酸序列信息或者突变的存在包括确定基因中单个位点处单核苷酸的存在。因此，本发明包括这样的方法，其中检测单个核苷酸位点处的单核苷酸多态性或突变的存在。
根据某些实施方案，本发明的方法中的抗生素类药物选自：阿莫西林/克拉维酸钾(Amoxicillin/K Clavulanate，AUG)、氨苄西林(Ampicillin，AM)、氨曲南(Aztreonam，AZT)、头孢唑林(Cefazolin，CFZ)、头孢吡肟(Cefepime，CPE)、头孢噻肟(Cefbtaxime，CFT)、头孢他啶(Ceftazidime，CAZ)、头孢曲松(Ceftriaxone，CAX)、头孢呋辛(Cefuroxime，CRM)、头孢噻吩(Cephalotin，CF)、环丙沙星(Ciprofloxacin，CP)、厄他培南(Ertapenem，ETP)、庆大霉素(Gentamicin，GM)、亚胺培南(Imipenem，IMP)、左氧氟沙星(Levofloxacin，LVX)、美罗培南(Meropenem，MER)、哌拉西林/他唑巴坦(Piperacillin/Tazobactam，P/T)、氨苄西林/舒巴坦(Ampicillin/Sulbactam，A/S)、四环素(Tetracycline，TE)、妥布霉素(Tobramycin，TO)以及甲氧苄啶/磺胺甲恶唑(Trimethoprim/Sulfamethoxazole，T/S)。
本发明的发明人出人意料地发现，某些基因中的突变不仅表明对单种抗微生物药物(例如抗生素类药物)的抗性，还表明对包含数种药物的组的抗性
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，基因来自表1或表2，抗生素类药物选自内酰胺类抗生素，并且检测就参考基因组NC_017046而言，至少一种下述基因中的突变：recN、hemH、UMN798_3428、metE、yijD、UMN798_4831、UMN798_1939、copS、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、recF、emrA、glyQ、dcp、thiH、UMN798_1612、UMN798_2909、UMN798_1680、UMN798_4073、yjbC、nadB、UMN798_3160、hutU、envC、UMN798_3889、UMN798_1629、bcfB、degQ、UMN798_1331、trg、uvrC、polB、hpcD、UMN798_1628、UMN798_1701、glgS、plsB、yjcC、feoB、misL、dxr、hemF、rnfG、yhjB、UMN798_1163、UMN798_0394、alkA、nhaA、lspA。
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，基因来自表1或表2，抗生素类药物选自氨基糖苷类抗生素，并且检测就参考基因组NC_017046而言，至少一种下述基因中的突变：recN、hemH、UMN798_3428、metE、yijD、UMN798_4831、UMN798_1939、copS、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、recF、emrA、glyQ、dcp、thiH、UMN798_1612、UMN798_2909、UMN798_1680、UMN798_4073、yjbC、nadB、UMN798_3160、hutU、envC、UMN798_3889、UMN798_1629、bcfB、degQ、UMN798_1331、trg、uvrC、polB、hpcD、UMN798_1628、UMN798_1701、glgS、plsB、yjcC、feoB、misL、dxr、hemF、rnfG、yhjB、UMN798_1163、UMN798_0394、alkA、nhaA、lspA。
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，基因来自表1或表2，抗生素类药物选自聚酮类抗生素，优选四环素类抗生素，并且检测就参考基因组NC_017046而言，至少一种下述基因中的突变：recN、hemH、UMN798_3428、metE、yijD、UMN798_4831、UMN798_1939、copS、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、reeF、emrA、glyQ、dcp、thiH、UMN798_1612、UMN798_2909、UMN798_1680、UMN798_4073、yjbC、nadB、UMN798_3160、hutU、envC、UMN798_3889、UMN798_1629、bcfB、UMN798_1331、trg、uvrC、polB、hpcD、UMN798_1628、UMN798_1701、glgS、plsB、yjcC、feoB、misL、dxr、hemF、rnfG、yhjB、UMN798_1163、UMN798_0394、alkA、nhaA、lspA。
对于特定的抗微生物药物(例如抗生素)，可以确定以上基因中的特定位点，其中观察到高统计学显著性。本发明的发明人发现，对于针对给定的抗生素类药物的抗性的存在，除了表明针对抗生素的抗性的上述基因外，单核苷酸多肽性(＝SNP′s)也可具有高显著性。这些在核苷酸水平上的多态性分析可进一步改善并促进沙门氏菌属中对抗微生物药物(例如抗生素)的药物抗性的确定。
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，基因来自表1或表2，抗生素类药物选自内酰胺类抗生素，并且检测就参考基因组NC_017046而言，至少一种下述核苷酸位点中的突变：2833888、546961、3334479、4191057、4366486、4724403、1895588、1139812、637461、4779417、131219、4062015、2983118、3861998、1548464、4397111、1574737、2840330、1650934、3966175、4436188、2780306、3075942、855087、3582301、3772654、1590194、25574、3536122、1313897、1673475、1994028、115342、1148509、1589819、1672517、3379140、4478134、4523874、3686566、3976726、258966、2558379、1487086、3799879、1163470、409259、2208848、46695、56998、3582354、3335426、1673444。
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，基因来自表1或表2，抗生素类药物选自氨基糖苷类抗生素，并且检测就参考基因组NC_017046而言，至少一种下述核苷酸位点中的突变：2833888、546961、3334479、4191057、4366486、4724403、1895588、1139812、637461、4779417、131219、4062015、2983118、3861998、1548464、4397111、1574737、2840330、1650934、3966175、4436188、2780306、3075942、855087、3582301、3772654、1590194、25574、3536122、1313897、1673475、1994028、115342、1148509、1589819、1672517、3379140、4478134、4523874、3686566、3976726、258966、2558379、1487086、3799879、1163470、409259、2208848、46695、56998、3582354、3335426、1673444。
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，基因来自表1或表2，抗生素类药物选自聚酮类抗生素，优选四环素类抗生素，并且检测就参考基因组NC_017046而言，至少一种下述核苷酸位点中的突变：2833888、546961、3334479、4191057、4366486、4724403、1895588、1139812、637461、4779417、131219、4062015、2983118、3861998、1548464、4397111、1574737、2840330、1650934、3966175、4436188、2780306、3075942、855087、3582301、3772654、1590194、25574、1313897、1673475、1994028、115342、1148509、1589819、1672517、3379140、4478134、4523874、3686566、3976726、258966、2558379、1487086、3799879、1163470、409259、2208848、46695、56998、3582354、3335426、1673444。
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，抗生素类药物是CFZ，并且检测就参考基因组NC_017046而言，至少一种下述核苷酸位点中的突变：4779417、2983118、1548464、1574737、3772654、1313897。
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，抗生素类药物是GM，并且检测就参考基因组NC_017046而言，至少一种下述核苷酸位点中的突变：2840330、25574、3536122、115342、1148509、3379140、4478134、3686566、1487086、3799879、1163470、2208848、46695、56998、3335426。
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，抗生素类药物是CF，并且检测就参考基因组NC_017046而言，至少一种下述核苷酸位点中的突变：2833888、546961、3334479、4191057、4366486、4724403、1895588、1139812、637461、4779417、131219、4062015、2983118、3861998、1548464、4397111、1574737、1650934、4436188、3075942、855087、3582301、3772654、1590194、1313897、1673475、1994028、1589819、1672517、3976726、3582354、1673444。
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，抗生素类药物是TE，并且检测就参考基因组NC_017046而言，至少一种下述核苷酸位点中的突变：2833888、546961、3334479、4191057、4366486、4724403、1895588、1139812、637461、4779417、131219、4062015、2983118、3861998、1548464、4397111、1574737、2840330、1650934、3966175、4436188、2780306、3075942、855087、3582301、3772654、1590194、25574、1313897、1673475、1994028、115342、1148509、1589819、1672517、3379140、4478134、4523874、3686566、3976726、258966、2558379、1487086、3799879、1163470、409259、2208848、46695、56998、3582354、3335426、1673444。
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，抗生素类药物是A/S，并且检测就参考基因组NC_017046而言，至少一种下述核苷酸位点中的突变：2833888、546961、3334479、4191057、4366486、4724403、1895588、1139812、637461、4779417、131219、4062015、2983118、3861998、1548464、4397111、1574737、2840330、1650934、3966175、4436188、2780306、3075942、855087、3582301、3772654、1590194、25574、3536122、1313897、1673475、1994028、115342、1148509、1589819、1672517、3379140、4478134、4523874、3686566、3976726、258966、2558379、1487086、3799879、1163470、409259、2208848、46695、56998、3582354、3335426、1673444。
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，抗生素类药物是CRM，并且检测就参考基因组NC_017046而言，至少一种下述核苷酸位点中的突变：2833888、546961、3334479、4191057、4366486、4724403、1895588、1139812、637461、4779417、131219、4062015、2983118、3861998、1548464、4397111、1574737、2840330、1650934、3966175、4436188、2780306、3075942、855087、3582301、3772654、1590194、25574、3536122、1313897、1673475、1994028、115342、1148509、1589819、1672517、3379140、4478134、4523874、3686566、3976726、258966、2558379、1487086、3799879、1163470、409259、2208848、46695、56998、3582354、3335426、1673444。
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，抗生素类药物是P/T，并且检测就参考基因组NC_017046而言，至少一种下述核苷酸位点中的突变：2833888、546961、3334479、4191057、4366486、4724403、1895588、1139812、637461、4779417、131219、4062015、2983118、3861998、1548464、4397111、1574737、2840330、1650934、3966175、4436188、2780306、3075942、855087、3582301、3772654、1590194、25574、3536122、1313897、1673475、1994028、115342、1148509、1589819、1672517、3379140、4478134、4523874、3686566、3976726、258966、2558379、1487086、3799879、1163470、409259、2208848、46695、56998、3582354、3335426、1673444。
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，抗生素类药物是TO，并且检测就参考基因组NC_017046而言，至少一种下述核苷酸位点中的突变：2833888、546961、3334479、4191057、4366486、4724403、1895588、1139812、637461、4779417、131219、4062015、2983118、3861998、1548464、4397111、1574737、2840330、1650934、3966175、4436188、2780306、3075942、855087、3582301、3772654、1590194、25574、3536122、1313897、1673475、1994028、115342、1148509、1589819、1672517、3379140、4478134、4523874、3686566、3976726、258966、2558379、1487086、3799879、1163470、409259、2208848、46695、56998、3582354、3335426、1673444。
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，抗生素类药物是AM，并且检测就参考基因组NC_017046而言，至少一种下述核苷酸位点中的突变：2833888、546961、3334479、4191057、4366486、4724403、1895588、1139812、637461、4779417、131219、4062015、2983118、3861998、1548464、4397111、1574737、2840330、1650934、3966175、4436188、2780306、3075942、855087、3772654、25574、3536122、1313897、1994028、115342、1148509、3379140、4478134、4523874、3686566、3976726、258966、2558379、1487086、3799879、1163470、409259、2208848、46695、56998、3335426。
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，抗生素类药物是AUG，并且检测就参考基因组NC_017046而言，至少一种下述核苷酸位点中的突变：2833888、546961、3334479、4191057、4366486、4724403、1895588、1139812、637461、4779417、131219、4062015、2983118、3861998、1548464、4397111、1574737、2840330、1650934、3966175、4436188、2780306、3075942、855087、3582301、3772654、1590194、25574、3536122、1313897、1673475、1994028、115342、1148509、1589819、1672517、3379140、4478134、4523874、3686566、3976726、258966、2558379、1487086、3799879、1163470、409259、2208848、46695、56998、3582354、3335426、1673444。
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，确定属于沙门氏菌属物种的细菌微生物针对1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16、17、18、19、20或21种抗生素类药物的抗性。
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，检测的突变是这样的突变：其导致来源于所检测的突变所定位的各个基因的多肽中改变的氨基酸序列。根据该方面，所检测的突变因而导致了多肽的截短版本(其通过突变产生新的终止密码子)或在各个位点处具有氨基酸改变的多肽的突变版本。
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，确定核酸序列信息或者突变的存在包括确定至少两种基因的部分序列或者全部序列。
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，确定核酸序列信息或者突变的存在包括确定沙门氏菌属物种基因组的部分或全部序列，其中所述基因组的部分或全部序列包含所述至少两种基因的至少部分序列。
根据本发明第一和/或第二方面的某些实施方案，确定核酸序列信息或者突变的存在包括利用下一代测序或者高通量测序方法。根据本发明第一和/或第二方面的优选实施方案，通过下一代测序或高通量测序方法确定沙门氏菌属物种细菌微生物的部分或全部基因组序列。
在另一第三方面，本发明涉及确定沙门氏菌属物种细菌微生物的抗微生物药物(例如抗生素)抗性谱的方法，其包括：
获得或者提供沙门氏菌属物种多种临床分离株的基因序列的第一数据集；
提供沙门氏菌属物种多种临床分离株的抗微生物药物如抗生素抗性的第二数据集；
将所述第一数据集的基因序列与沙门氏菌属至少一个，优选一个参考基因组进行比对，和/或至少部分组装所述第一数据集的基因序列；
分析所述第一数据集的基因序列的基因变体，以获得基因变体的第三数据集；
将所述第三数据集与所述第二数据集关联，并对所述关联进行统计学分析；以及
确定沙门氏菌属的基因组中与抗微生物药物如抗生素抗性相关的基因位点。
可以如本发明第一方面的方法所述，实施不同的步骤。
当提及第二数据集时，其中所述第二数据集例如包含分别是多种临床分离株的一组抗微生物药物(例如抗生素)抗性，在本发明的范围内，这还可以指自我学习数据库，不管何时分析新样品，均可以将该样品列入第二数据集，从而扩展该数据库。因此第二数据集不一定是静止的，并且由于自我学习，其可以通过外部输入或者通过并入新数据来扩展。但是，这不局限于本发明的第三方面，反而适用于本发明提及第二数据集的其它方面，其不一定必须涉及抗微生物药物抗性。在适用的情况下，例如在第三方面，这同样适用于第一数据集。
根据某些实施方案，利用费舍尔检验进行本发明的方法中的统计学分析，其中p＜10-6，优选地p＜10-9，特别地p＜10-10。
根据某些实施方案，本发明第三方面的方法以及相关方法，例如根据第7和10方面的方法可以包括将不同的基因位点相互关联，例如在至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种基因中。这样，可以达到甚至更高的统计学显著性。
根据第三方面的方法以及如上所述的相关方法的某些实施方案，通过在提供有不同浓度的抗微生物药物(例如抗生素)的琼脂板上培养沙门氏菌属物种的临床分离株提供第二数据集，以及通过采用抑制各沙门氏菌属物种生长的最小浓度的板来获得第二数据。
根据第三方面的方法以及相关方法的某些实施方案，抗生素选自下述中的至少一种：β-内酰胺、β-内酰胺抑制剂、喹啉类及其衍生物、氨基糖苷、四环素以及叶酸合成抑制剂，优选为阿莫西林/克拉维酸钾、氨苄西林、氨曲南、头孢唑林、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢呋辛、头孢噻吩、环丙沙星、厄他培南、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、美罗培南、哌拉西林/他唑巴坦、氨苄西林/舒巴坦、四环素、妥布霉素以及甲氧苄啶/磺胺甲恶唑。
根据第三方面的方法以及相关方法的某些实施方案，第三数据集中的基因序列包含在来自下述的至少一种基因中：recN、hemH、UMN798_3428、metE、yijD、UMN798_4831、UMN798_1939、copS、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、recF、emrA、glyQ、dcp、thiH、UMN798_1612、UMN798_2909、UMN798_1680、UMN798_4073、yjbC、nadB、UMN798_3160、hutU、envC、UMN798_3889、UMN798_1629、bcfB、degQ、UMN798_1331、trg、uvrC、polB、hpcD、UMN798_1628、UMN798_1701、glgS、plsB、yjcC、feoB、misL、dxr、hemF、rnfG、yhjB、UMN798_1163、UMN798_0394、alkA、nhaA以及lspA，或者来自表5，优选表5a中所列的基因。
根据第三方面的方法以及相关方法的某些实施方案，沙门氏菌属基因组中与抗微生物药物(例如抗生素)抗性相关的基因位点至少包含在来自下述的一种基因中：recN、hemH、UMN798_3428、metE、yijD、UMN798_4831、UMN798_1939、copS、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、recF、emrA、glyQ、dcp、thiH、UMN798_1612、UMN798_2909、UMN798_1680、UMN798_4073、yjbC、nadB、UMN798_3160、hutU、envC、UMN798_3889、UMN798_1629、bcfB、degQ、UMN798_1331、trg、uvrC、polB、hpcD、UMN798_1628、UMN798_1701、glgS、plsB、yjcC、feoB、misL、dxr、hemF、rnfG、yhjB、UMN798_1163、UMN798_0394、alkA、nhaA和lspA。
根据第三方面的方法以及相关方法的某些实施方案，基因变体含有点突变、高至四个碱基的插入和或缺失和/或移码突变。
本发明第四方面涉及确定属于沙门氏菌属物种的细菌微生物的抗微生物药物(例如抗生素)抗性谱的方法，其包括下述步骤：
a)获得或者提供包含或者疑似包含所述细菌微生物的样品；
b)如通过本发明第三方面的方法确定的，确定所述细菌微生物至少一种基因中突变的存在；
其中存在突变表明对抗微生物药物(例如抗生素类药物)的抗性。
此处的步骤a)和b)可以如第一方面以及本发明的下述方面所述进行实施。
利用此方法，可以确定沙门氏菌属物种基因组中与抗微生物药物(例如抗生素)抗性相关的任何突变，并且可以建立完整的抗微生物药物(例如抗生素)抗性谱。
图1示意性地示出了如该方面所述的诊断测试的简单读取概念。
根据图1，例如利用下一代测序(NGS)将样品1(例如来自患者的血液)用于分子测试2，然后进行分子指纹分析3(例如在NGS的情况下)，组装所选择的基因组/质粒区域的序列或者全基因组。然后将其与参考文库4进行比较，即将选择的序列或者全序列与一个或多个参考序列进行比较，并将突变(SNP，序列-基因添加/缺失等)与参考文库中参考菌株的敏感性/参考谱关联。本文的参考文库4包含许多基因组，并且其不同于参考基因组。然后报告结果5，其包括ID(病原体鉴定)，即样品中鉴定的全部(病原性的)物种列表，以及AST(抗微生物敏感性测试)，即包含所列的全部物种的敏感性/抗性谱的列表。
本发明第五方面涉及确定患者感染对抗微生物药物治疗可能具有抗性的沙门氏菌属物种的诊断方法，其也可被描述为确定患者感染具有抗微生物药物(例如抗生素)抗性的沙门氏菌属的方法，其包括下述步骤：
a)获得或者提供来自患者的包含或者疑似包含属于沙门氏菌属物种的细菌微生物的样品；
b)如通过本发明第三方面的方法确定的，确定所述属于沙门氏菌属物种的细菌微生物的至少一种基因中至少一个突变的存在，其中存在所述至少一个突变表明所述患者感染具有抗微生物药物(例如抗生素)抗性的沙门氏菌属。
此外，在此，可以如本发明第一方面所述，实施步骤a)和b)。
根据该方面，可以利用测序方法确定患者感染沙门氏菌属，以及与常规方法相比，在较短时间内确定沙门氏菌属物种对抗微生物药物(例如抗生素)的抗性。
本发明第六方面涉及选择对感染了可能具有抗性的沙门氏菌属菌株，例如感染了具有抗微生物药物(如抗生素)抗性的沙门氏菌属的患者的治疗的方法，其包括下述步骤：
a)获得或者提供来自患者的包含或疑似包含属于沙门氏菌属物种的细菌微生物的样品；
b)如通过本发明第三方面的方法确定的，确定属于沙门氏菌属物种的细菌微生物的至少一种基因中至少一个突变的存在，其中存在所述至少一个突变表明对一种或多种抗微生物药物(例如抗生素类药物)的抗性；
c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物；以及
d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于治疗沙门氏菌属感染的一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物。
可以与本发明第二方面类似地实施该方法，并且其使得可以为任何未知的沙门氏菌属物种感染快速选择合适的抗生素治疗。
本发明第七方面涉及获得、分别确定沙门氏菌属细菌微生物的抗微生物药物(例如抗生素)抗性谱的方法，其包括
获得或者提供沙门氏菌属物种临床分离株的基因序列的第一数据集；
提供沙门氏菌属物种多种临床分离株的抗微生物药物(例如抗生素)抗性的第二数据集；
将所述第一数据集的基因序列与沙门氏菌属至少一个，优选一个参考基因组进行比对，和/或至少部分组装所述第一数据集的基因序列；
分析所述第一数据集的基因序列的基因变体，以获得第一数据集的基因变体的第三数据集；
将所述第三数据集与所述第二数据集关联，并对所述关联进行统计学分析；以及
确定第一数据集的沙门氏菌属基因组中与抗微生物药物(例如抗生素)抗性相关的基因位点。
利用该方法，可以确定沙门氏菌属未知分离株的抗微生物药物(例如抗生素)抗性。
根据某些实施方案，沙门氏菌属的参考基因组是NCBI中注释的NC_017046。根据某些实施方案，利用费舍尔检验实施本发明的方法中的统计学分析，其中p＜10-6，优选地p＜10-9，特别地p＜10-10。此外，根据某些实施方案，该方法还包括将不同基因位点相互关联，例如在至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或者十种基因中。
本发明第八方面涉及计算机程序产品，其包含计算机可执行的指令，所述指令被执行实施本发明第三、第四、第五、第六或第七方面所述的方法。
在某些实施方案中，计算机程序产品是其上存储有用于执行所述方法的计算机程序的程序指令或程序代码的产品。根据某些实施方案，计算机程序产品是存储介质。这同样适用于以下提及的方面，即本发明第十一方面的计算机程序产品。如上所示，本发明的计算机程序产品可以自我学习，例如对于第一和第二数据集而言。
为了从高度复杂的遗传数据中获得最可能的信息并开发用于诊断和治疗用途以及本发明方法的可稳定适用于临床常规过程的最优模型，全面的计算机模拟分析可能是必要的。所提出的原则是基于不同方法的组合，例如与至少一个，优选多个参考基因组进行比对和/或组装基因组，以及将例如来自各个患者的各样品中存在的突变与所有参照及药物(例如抗生素)关联，以及寻找发生于数种药物和数种菌株中的突变。
利用以上步骤，产生了一系列突变和基因。这些可以储存在数据库中，并且统计模型可以源自所述数据库。统计模型可以基于至少一种或多种基因中的至少一个或多个突变。可以自突变和基因组合成可训练的统计模型。可以产生此类模型的算法的实例是关联规则、支持向量机(Support Vector Machines)、决策树、决策森林、判别分析、聚类方法(Cluster-Method)以及更多算法。
训练的目标是在常规程序期间允许可再现的、标准化的应用。
为此，例如，可将来自待诊断患者的微生物的基因组或者部分基因组进行测序。然后，可从序列数据得到核心特征，其可用于预测抗性。这些是用于最终模型的数据库中的点，即至少一个突变或者至少一种基因，以及突变的组合等。
可将对应的特征用作统计模型的输入，从而使得能够进行新患者的预后。不仅可将关于例如沙门氏菌属物种的所有微生物针对所有药物(例如抗生素)的所有抗性的信息整合进计算机决策支持工具中，还可将对应的指令(例如EUCAST)整合进计算机决策支持工具中，以便仅给出与指令一致的治疗建议。
本发明第九方面涉及第八方面的计算机程序产品在获取沙门氏菌属物种细菌微生物的抗微生物药物(例如抗生素)抗性谱或者在本发明第三方面的方法中的用途。
在第十方面，公开了选择感染沙门氏菌属物种的细菌微生物的患者的治疗的方法，其包括：
获得或者提供来自患者的包含细菌微生物的至少一种临床分离株的基因序列的第一数据集；
提供所述细菌微生物多种临床分离株的抗微生物药物(例如抗生素)抗性的第二数据集；
将所述第一数据集的基因序列与所述细菌微生物的至少一个，优选一个参考基因组进行比对，和/或至少部分组装所述第一数据集的基因序列；
分析所述第一数据集的基因序列的基因变体，以获得所述第一数据集的基因变体的第三数据集；
将所述第三数据集与所述细菌微生物多种临床分离株的抗微生物药物(例如抗生素)抗性的第二数据集关联，并对所述关联进行统计学分析；
确定所述第一数据集的细菌微生物的临床分离株基因组中与抗微生物药物(例如抗生素)抗性相关的基因位点；以及
选择用一种或多种抗微生物药物(例如抗生素类药物)对患者进行治疗，所述药物不同于确定与抗微生物药物(例如抗生素)抗性相关的基因位点时所鉴定的药物。
此外，可以如前述类似的步骤实施上述步骤。在该方法以及类似的方法中，比对不是必要的，因为在产生基因组或基因组序列之后，可将未知样品与第二数据集直接关联，从而可以确定突变和抗微生物药物(抗生素)抗性。可以例如利用已知技术组装第一数据集。
根据某些实施方案，可以利用费舍尔检验进行本发明的方法中的统计学分析，其中p＜10-6，优选地p＜10-9，特别地p＜10-10。此外，根据某些实施方案，该方法还包括将不同的基因位点相互关联。
本发明第十一方面涉及计算机程序产品，其包含计算机可执行的指令，所述指令被执行实施第十方面所述的方法。
根据本发明第十二方面，公开了确定患者感染对抗微生物药物治疗可能具有抗性的沙门氏菌属物种的诊断方法，其也可被描述为确定患者感染具有抗微生物药物(例如抗生素)抗性的沙门氏菌属的方法，其包括下述步骤：
a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含至少一种沙门氏菌属物种的样品；
b)确定来自表5，优选表5a中所列的一组基因的至少两种基因中至少一个突变的存在，其中存在所述至少两个突变表明所述患者感染具有抗微生物药物(例如抗生素)抗性的沙门氏菌属。
本发明第十三方面公开了选择对感染了具有抗微生物药物(例如抗生素)抗性的沙门氏菌属的患者的治疗的方法，其包括下述步骤：
a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含至少一种沙门氏菌属物种的样品；
b)确定来自表5中所列的一组基因的至少两种基因，优选来自表5a中所列的一组基因的至少两种基因中至少一个突变的存在，其中存在所述至少两个突变表明对一种或多种抗微生物药物(例如抗生素类药物)的抗性：
c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物；以及
d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物，并且适用于治疗沙门氏菌属感染的一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物。
此外，可以如前述类似的方法中所述，例如，如本发明第一和第二方面中所述，实施上述步骤。在本发明第十二和十三方面以及本发明第二十三方面中，涵盖了本发明的方法中考虑的所有类别的抗生素。
表5：基因列表
本文表5中的基因如下：
recN、hemH、UMN798_3428、metE、yijD、UMN798_4831、UMN798_1939、copS、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、reeF、emrA、glyQ、dcp、thiH、UMN798_1612、UMN798_2909、UMN798_1680、UMN798_4073、yjbC、nadB、UMN798_3160、hutU、envC、UMN798_3889、UMN798_1629、befB、degQ、UMN798_1331、trg、uvrC、polB、hpcD、UMN798_1628、UMN798_1701、glgS、plsB、yjcC、feoB、misL、dxr、hemF、rnfG、yhjB、UMN798_1163、UMN798_0394、alkA、nhaA、lspA、UMN798_3890、ycbB、malS、dmsC、UMN798_0020、UMN798_1618、UMN798_1617、UMN798_4717、UMN798_0389、kdpD、hisB、UMN798_2727、UMN7983918、UMN798_4753、UMN798_4936、yhdM、UMN798_0631、UMN798_1337、UMN798_1550、iroE、pheT、hofC、gyrA、torS、UMN798_1114、UMN798_2482、rseB、hycC、ttk、cpdB、UMN798_4882、rob、creA、UMN798_2202、dppA、adiY、UMN798_0653、gmm、UMN798_0179、UMN798_3553、UMN798_4061、hrpB、UMN798_0975、gcvP、UMN798_0654、pnp、ytfF、UMN798_1632、和fhuD。
表5a：基因列表
本文表5a中的基因如下：
recN、hemH、UMN798_3428、metE、yijD、UMN798_4831、UMN798_1939、copS、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、recF、emrA、glyQ、dcp、thiH、UMN798_1612、UMN798_2909、UMN798_1680、UMN798_4073、yjbC、nadB、UMN798_3160、hutU、envC、UMN798_3889、UMN798_1629、bcfB、degQ、UMN798_1331、trg、uvrC、polB、hpcD、UMN798_1628、UMN798_1701、glgS、plsB、yjcC、feoB、misL、dxr、hemF、rnfG、yhjB、UMN798_1163、UMN798_0394、alkA、nhaA、lspA、UMN798_3890、ycbB、malS、dmsC、UMN798_0020、UMN798_1618、UMN798_1617、UMN798_4717、UMN798_0389、kdpD、hisB、UMN798_2727、UMN798_3918、UMN798_4753、UMN798_4936、yhdM、UMN798_0631、UMN798_1337、UMN798_1550、iroE、pheT、hofC、torS、UMN798_1114、UMN798_2482、rseB、hycC、ttk、cpdB、UMN798_4882、rob、creA、UMN798_2202、dppA、adiY、UMN798_0653、gmm、UMN798_0179、UMN798_3553、UMN798_4061、hrpB、UMN798_0975、gcvP、UMN798_0654、pnp、ytfF、UMN798_1632以及fhuD。
根据某些实施方案，在本发明的任何方法中确定至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或者十种基因中的突变，例如至少两种基因或者至少三种基因中的突变。并非仅对单个基因或突变体进行测试，一些变体位点的组合可以提高预测准确性，并进一步减少受其它因素影响的假阳性结果。因此，尤其优选确定选自表5，优选表5a的2、3、4、5、6、7、8或9(或者更多)种基因中突变的存在。
此外，根据某些实施方案，沙门氏菌属的参考基因组还是NCBI中注释的NC_017046。根据某些实施方案，利用费舍尔检验进行本发明的方法中的统计学分析，其中p＜10-6，优选地p＜10-9，特别地p＜10-10。此外，根据某些实施方案，方法还包括将不同的基因位点相互关联。本发明第一和第二方面的实施方案的其它方面也适用。
根据本发明第十二和/或十三方面以及本发明第十八方面的方法的某些实施方案，抗微生物药物是抗生素。根据某些实施方案，抗生素是内酰胺类抗生素，以及检测表6中所列基因中的至少一种的突变，或者表6中所列位点(在表中表示为POS)中的至少一种的突变。
表6：内酰胺类抗生素列表(七种抗生素)
FDR：根据FDR(Benjamini Hochberg)方法进行确定(Benjamini Hochberg，1995)
根据本发明第十二和/或十三方面以及本发明第十八方面的方法的某些实施方案，抗生素是CF、CFZ、CRM、P/T、AM、A/S以及AUG中的至少一种，以及检测下述基因中的至少一种的突变：UMN798_4878、emrA、dcp、UMN798_1612、UMN798_3889、UMN798_1331、UMN798_3890、ycbB、malS、dmsC、UMN798_0020、UMN798_1618、UMN798_1617、UMN798_4717、UMN798_0389，或者检测下述位点中的至少一种的突变：4779417、2983118、1548464、1574737、3772654、1313897、3774253、1042088、3872045、1530443、20803、1581225、1580429、4617911、401518。
根据本发明第十二和/或十三方面以及本发明第十八方面的方法的某些实施方案，抗生素是喹诺酮类抗生素，以及检测表7中所列基因中的至少一种(例如，torS)的突变，或者表7中所列位点(在表中表示为POS)中的至少一种(例如，位点4048606)的突变。
表7：喹诺酮类抗生素列表(所有2种)
| 基因名称 | POS | 抗生素 | p值(FDR) | genbank蛋白登录号 |
| gyrA | 2373180 | CP；LVX | 3,47827E-22 | YP_005397662.1 |
| gyrA | 2373169 | CP | 2,22208E-21 | YP_005397662.1 |
| torS | 4048606 | TE；CP | 1,09183E-10 | YP_005399143.1 |
根据本发明第十二和/或十三方面以及本发明第十八方面的方法的某些实施方案，抗生素是cP和LVX中的至少一种，以及检测gyrA中的突变，或者检测位点2373180中的突变。
根据本发明第十二和/或十三方面以及本发明第十八方面的方法的某些实施方案，抗生素是CP，以及检测gyrA、torS的基因中的至少一种(例如torS)的突变，或者位点2373169、4048606中的至少一种(例如4048606)的突变。
根据本发明第十二和/或十三方面以及本发明第十八方面的方法的某些实施方案，抗生素是氨基糖苷类抗生素，以及检测表8中所列的基因中的至少一种的突变，或者检测表8中所列的位点(在表中表示为POS)中的至少一种的突变。
表8：氨基糖苷类抗生素列表
根据本发明第十二和/或十三方面以及本发明第十八方面的方法的某些实施方案，抗生素是TO和GM中的至少一种，以及检测下述基因中的至少一种的突变：UMN798_2909、bcfB、degQ、polB、hpcD、glgS、plsB、feoB、rnfG、UMN798_3428、yhjB、UMN798_1163、alkA、nhaA、lspA，或者检测下述位点中的至少一种的突变：2840330、25574、3536122、115342、1148509、3379140、4478134、3686566、1487086、3335426、3799879、1163470、2208848、46695、56998。
根据本发明第十二和/或十三方面以及本发明第十八方面的方法的某些实施方案，抗生素是聚酮类抗生素，以及检测表9中所列的基因中的至少一种的突变，或者检测表9中所列的位点(在表中表示为POS)中的至少一种的突变。
根据本发明第十二和/或十三方面以及本发明第十八方面的方法的某些实施方案，抗生素是TE，以及检测下述基因中的至少一种的突变：recN、hemH、UMN798_3428、metE、yijD、UMN798_4831、UMN798_1939、copS、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、recF、emrA、glyQ、dcp、recN、hemH，或者检测下述位点中的至少一种的突变：2833888、546961、3334479、4191057、4366486、4724403、1895588、1139812、637461、4779417、131219、4062015、2983118、3861998、1548464、2833888、546961。
表9：聚酮类列表，优选四环素
本发明第十四方面涉及确定患者感染对抗微生物药物治疗可能具有抗性的沙门氏菌属物种的诊断方法，其也可被描述为确定患者感染具有抗微生物药物(例如抗生素)抗性的沙门氏菌属的方法，其包括下述步骤：
a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含至少一种沙门氏菌属物种的样品；
b)确定来自下述基因的至少一种基因中至少一个突变的存在：recN、hemH、UMN798_3428、metE、yijD、UMN798_4831、UMN798_1939、copS、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、recF、glyQ、dcp、thiH、UMN798_1612、UMN798_2909、UMN798_1680、UMN798_4073、yjbC、UMN798_3160、hutU、envC、UMN798_3889、UMN798_1629、bcfB、degQ、UMN798_1331、trg、uvrC、polB、hpcD、UMN798_1628、UMN798_1701、glgS、plsB、yjcC、feoB、misL、dxr、hemF、rnfG、yhjB、UMN798_1163、UMN798_0394、alkA、nhaA以及lspA，优选来自下述基因的至少一种基因中至少一个突变的存在：hemH、UMN798_3428、UMN798_4831、UMN798_1939、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、glyQ、dcp、thiH、UMN798_1612、UMN798_2909、UMN798_1680、UMN798_4073、yjbC、UMN798_3160、UMN798_3889、UMN798_1629、bcfB、degQ、UMN798_1331、trg、hpcD、UMN798_1628、UMN798_1701、glgS、yjcC、misL、hemF、rnfG、UMN798_1163、UMN798_0394以及nhaA，其中存在所述至少一个突变表明所述患者感染具有抗微生物药物(例如抗生素)抗性的沙门氏菌属。
本发明第十五方面涉及选择对感染了具有抗微生物药物(例如抗生素)抗性的沙门氏菌属的患者的治疗的方法，其包括下述步骤：
a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含至少一种沙门氏菌属物种的样品；
b)确定来自下述基因的至少一种基因中至少一个突变的存在：recN、hemH、UMN798_3428、metE、yijD、UMN798_4831、UMN798_1939、copS、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、recF、glyQ、dcp、thiH、UMN798_1612、UMN798_2909、UMN798_1680、UMN798_4073、yjbC、UMN798_3160、hutU、envC、UMN798_3889、UMN798_1629、bcfB、degQ、UMN798_1331、trg、uvrC、polB、hpcD、UMN798_1628、UMN798_1701、glgS、plsB、yjcC、feoB、misL、dxr、hemF、rnfG、yhjB、UMN798_1163、UMN798_0394、alkA、nhaA以及lspA，优选来自下述基因的至少一种基因中至少一个突变的存在：hemH、UMN798_3428、UMN798_4831、UMN798_1939、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、glyQ、dcp、thiH、UMN798_1612、UMN798_2909、UMN798_1680、UMN798_4073、yjbC、UMN798_3160、UMN798_3889、UMN798_1629、bcfB、degQ、UMN798_1331、trg、hpcD、UMN798_1628、UMN798_1701、glgS、yjcC、misL、hemF、rnfG、UMN798_1163、UMN798_0394以及nhaA，其中存在所述至少一个突变表明对一种或多种抗微生物药物(例如抗生素类药物)的抗性；
c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物；以及
d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于沙门氏菌属感染的治疗的一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物。
此外，在第十四和第十五方面，上述步骤与第一或第二方面中的那些步骤相对应，尽管仅检测至少一种基因中的突变。
本发明第十六方面涉及治疗感染了具有抗微生物药物(例如抗生素)抗性的沙门氏菌属的患者的方法，其包括下述步骤：
a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含至少一种沙门氏菌属物种的样品；
b)确定来自下述基因的至少一种基因中至少一个突变的存在：recN、hemH、UMN798_3428、metE、yijD、UMN798_4831、UMN798_1939、copS、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、recF、glyQ、dcp、thiH、UMN798_1612、UMN798_2909、UMN798_1680、UMN798_4073、yjbC、UMN798_3160、hutU、envC、UMN798_3889、UMN798_1629、bcfB、degQ、UMN798_1331、trg、uvrC、polB、hpcD、UMN798_1628、UMN798_1701、glgS、plsB、yjcC、feoB、misL、dxr、hemF、rnfG、yhjB、UMN798_1163、UMN798_0394、alkA、nhaA以及lspA，优选来自下述基因的至少一种基因中至少一个突变的存在：hemH、UMN798_3428、UMN798_4831、UMN798_1939、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、glyQ、dcp、thiH、UMN798_1612、UMN798_2909、UMN798_1680、UMN798_4073、yjbC、UMN798_3160、UMN798_3889、UMN798_1629、bcfB、degQ、UMN798_1331、trg、hpcD、UMN798_1628、UMN798_1701、glgS、yjcC、misL、hemF、rnfG、UMN798_1163、UMN798_0394以及nhaA，其中存在所述至少一个突变表明对一种或多种抗微生物药物(例如抗生素类药物)的抗性；
c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物；
d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于沙门氏菌属感染的治疗的一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物；以及
e)用所述一种或多种抗微生物药物(例如抗生素类药物)治疗所述患者。
本发明第十七方面涉及治疗感染了具有抗微生物药物(例如抗生素)抗性的沙门氏菌属的患者的方法，其包括下述步骤：
a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含至少一种沙门氏菌属物种的样品；
b)确定来自下述基因的至少两种基因中至少一个突变的存在：recN、hemH、UMN798_3428、metE、yijD、UMN798_4831、UMN798_1939、copS、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、recF、emrA、glyQ、dcp、thiH、UMN798_1612、UMN798_2909、UMN798_1680、UMN798_4073、yjbC、nadB、UMN798_3160、hutU、envC、UMN798_3889、UMN798_1629、bcfB、degQ、UMN798_1331、trg、uvrC、polB、hpcD、UMN798_1628、UMN798_1701、glgS、plsB、yjcC、feoB、misL、dxr、hemF、rnfG、yhjB、UMN798_1163、UMN798_0394、alkA、nhaA以及lspA，其中存在所述至少两个突变表明对一种或多种抗微生物药物(例如抗生素类药物)的抗性；
c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物；
d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于沙门氏菌属感染的治疗的一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物；以及
e)用所述一种或多种抗微生物药物(例如抗生素类药物)治疗所述患者。
本发明第十八方面涉及治疗感染了具有抗微生物药物(例如抗生素)抗性的沙门氏菌属的患者的方法，其包括下述步骤：
a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含至少一种沙门氏菌属物种的样品；
b)确定来自表5，优选表5a中所列的一组基因的至少两种基因中至少一个突变的存在，其中存在所述至少两个突变表明对一种或多种抗微生物药物(例如抗生素类药物)的抗性；
c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物；
d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于沙门氏菌属感染的治疗的一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物；以及
e)用所述一种或多种抗微生物药物(例如抗生素类药物)治疗所述患者。
本发明第十九方面涉及治疗感染了具有抗微生物药物(例如抗生素)抗性的沙门氏菌属的患者的方法，其包括下述步骤：
a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含至少一种沙门氏菌属物种的样品；
b)确定来自表10中所列的一组基因，优选来自表11中所列的一组基因的至少一种基因中至少一个突变的存在，其中存在所述至少一个突变表明对一种或多种抗微生物药物(例如抗生素类药物)的抗性；
c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物；
d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于沙门氏菌属感染的治疗的一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物；以及
e)用所述一种或多种抗微生物药物(例如抗生素类药物)治疗所述患者。
此外，在本发明第十六至十九方面中，步骤a)至d)与本发明第二方面的方法中的步骤类似。可以充分实施步骤e)而不受限制，并且可以例如无创地实施。
本发明第二十方面涉及确定患者感染可能对抗微生物药物治疗具有抗性的沙门氏菌属物种的诊断方法，其也可被描述为确定患者感染具有抗微生物药物(例如抗生素)抗性的沙门氏菌属的方法，其包括下述步骤：
a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含至少一种沙门氏菌属物种的样品；
b)确定来自表10中所列的一组基因，优选来自表11中所列的一组基因的至少一种基因中至少一个突变的存在，其中存在所述至少一个突变表明所述患者感染具有抗微生物药物(例如抗生素)抗性的沙门氏菌属。
表10：基因列表
| recN | hemH | UMN798_3428 | metE | yijD |
| UMN798_4831 | UMN798_1939 | copS | UMN798_0628 | UMN798_4878 |
| leuB | recF | pnp | glyQ | dcp |
| thiH | UMN798_1612 | UMN798_2909 | UMN798_1680 | UMN798_4073 |
| yjbC | ytfF | UMN798_3160 | hutU | envC |
| UMN798_3889 | UMN798_1629 | bcfB | degQ | UMN798_1331 |
| trg | uvrC | polB | hpcD | UMN798_1628 |
| UMN798_1701 | glgS | plsB | yjcC | feoB |
| misL | dxr | hemF | rnfG | yhjB |
| UMN798_1163 | UMN798_0394 | alkA | nhaA | lspA |
| UMN798_3890 | UMN798_1632 | malS | dmsC | UMN798_0020 |
| UMN798_1618 | UMN798_1617 | UMN798_4717 | UMN798_0389 | kdpD |
| hisB | UMN798_2727 | UMN798_3918 | UMN798_4753 | UMN798_4936 |
| yhdM | UMN798_0631 | UMN798_1337 | UMN798_1550 | iroE |
| pheT | hofC | fhuD | torS | UMN798_1114 |
| UMN798_2482 | rseB | hycC | ttk | cpdB |
| UMN798_4882 | UMN798_0654 | creA | UMN798_2202 | dppA |
| adiY | UMN798_0653 | gcvP | UMN798_0179 | UMN798_3553 |
| UMN798_4061 | hrpB | UMN798_0975 |
表11：基因列表
| UMN798_1632 | hemH | UMN798_3428 | ytfF | pnp |
| UMN798_4831 | UMN798_1939 | UMN798_0654 | UMN798_0628 | UMN798_4878 |
| leuB | gcvP | UMN798_0975 | glyQ | dcp |
| thiH | UMN798_1612 | UMN798_2909 | UMN798_1680 | UMN798_4073 |
| yjbC | UMN798_4061 | UMN798_3160 | UMN798_3553 | UMN798_0179 |
| UMN798_3889 | UMN798_1629 | bcfB | degQ | UMN798_1331 |
| trg | UMN798_0653 | adiY | hpcD | UMN798_1628 |
| UMN798_1701 | glgS | dppA | yjcC | UMN798_2202 |
| misL | creA | hemF | rnfG | UMN798_4882 |
| UMN798_1163 | UMN798_0394 | cpdB | nhaA | ttk |
| UMN798_3890 | hycC | malS | dmsC | UMN798_0020 |
| UMN798_1618 | UMN798_1617 | UMN798_4717 | UMN798_0389 | kdpD |
| hisB | UMN798_2727 | UMN798_3918 | UMN798_4753 | UMN798_4936 |
| yhdM | UMN798_0631 | UMN798_1337 | UMN798_1550 | iroE |
| pheT | rseB | UMN798_2482 | torS | UMN798_1114 |
本发明第二十一方面涉及选择感染了具有抗微生物药物(例如抗生素)抗性的沙门氏菌属的患者的治疗的方法，其包括下述步骤：
a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含至少一种沙门氏菌属物种的样品；
b)确定来自表10中所列的一组基因，优选来自表11中所列的一组基因的至少一种基因中至少一个突变的存在，其中存在所述至少一个突变表明对一种或多种抗微生物药物(例如抗生素类药物)的抗性；
c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物；以及
d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于沙门氏菌属感染的治疗的一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物。
此外，在第二十和第二十一方面，其步骤与第一和第二方面中的那些步骤相对应，尽管仅确定至少一种基因中的突变。
实施例
现在将参考本发明的一些实施例详细描述本发明。但是这些实施例是说明性的，并且不限制本发明的范围。
实施例1
除了经典的抗微生物剂敏感性测试之外，还对一组636个样品的相同分离株进行全基因组测序。这允许进行全基因组相关性研究，以找到与针对一种或数种药物的抗性显著相关的基因组和质粒中的基因变体(例如，点突变、小的插入和缺失、较大的结构变体、质粒拷贝数增加、基因剂量效应)。该方法还允许将基因组中的相关位点相互比较。
在该方法中，涵盖了遗传抗性的不同来源以及细菌变得具有抗性的不同方式。通过测量在广泛的地理区域内并经过三十年的宽时间跨度收集的临床分离株，试图产生远超出实验室产生的抗性机制的人工步骤的全貌。
为此，将一组具有5种不同作用模式的21种临床相关抗微生物剂放在一起，并测量21种药物对沙门氏菌属分离株的最小抑制浓度(MIC)。
以下给出了详细步骤：
细菌菌株
本发明的发明人从Siemens Healthcare Diagnostics(West Sacramento，CA)的微生物菌株保藏中心选择了636种沙门氏菌属菌株用于敏感性测试和全基因组测序，尤其是来自以下的菌株：猪霍乱沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠道沙门氏菌亚利桑那亚种、肠道沙门菌双亚利桑那亚种、肠炎沙门氏菌、鸡沙门氏菌、沙门氏菌A群、沙门氏菌B群、沙门氏菌C群、沙门氏菌D群、海德尔堡沙门氏菌、迈阿密沙门氏菌、纽波特沙门氏菌、巴拿马沙门氏菌、甲型副溶血性沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、森夫顿堡沙门氏菌、沙门氏菌种、沙门氏菌种_Lac_--，_ONPG_+、沙门氏菌种_Lac_+，_ONPG_+、沙门氏菌亚属I、沙门氏菌亚属II、沙门氏菌亚属IV、沙门氏菌亚群_I_Suc+、田纳西沙门氏菌以及伤寒沙门氏菌。
抗微生物剂敏感性测试(AST)板
按照临床实验室标准协会(CLSI)的建议准备冷冻参考AST板。板中包含下述抗微生物剂(其中括号内显示μg/ml浓度)：阿莫西林/克拉维酸钾(0.5/0.25-64/32)、氨苄西林(0.25-128)、氨苄西林/舒巴坦(0.5/0.25-64/32)、氨曲南(0.25-64)、头孢唑林(0.5-32)、头孢吡肟(0.25-64)、头孢噻肟(0.25+128)、头孢他啶(0.25-64)、头孢曲松(0.25-128)、头孢呋辛(1-64)、头孢噻吩(1-64)、环丙沙星(0.015-8)、厄他培南(0.12-32)、庆大霉素(0.12-32)、亚胺培南(0.25-32)、左氧氟沙星(0.25-16)、美罗培南(0.12-32)、哌拉西林/他唑巴坦(0.25/4-256/4)、四环素(0.5-64)、妥布霉素(0.12-32)以及甲氧苄啶/磺胺甲恶唑(0.25/4.7-32/608)。在使用临床分离株之前，用QC菌株对AST板进行测试。当QC结果符合CLSI16所述的QC范围时，认为AST板对于用临床分离株进行的测试是可接受的。
接种物制备
在含有5％羊血(BBL，Cockeysville，Md.)的胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂上培养分离株，并将其在35±1℃的环境空气中培养18-24h。将分离的克隆(4-5个大克隆或者5-10个小克隆)转移至3ml无菌接种水(Siemens)中，并乳化至0.5McFarland标准的最终浊度。向含有普朗尼克-F的25ml接种水(Siemens)中添加2ml的该悬液。利用特别用于冷冻AST板的培养箱(Siemens)，将5μl的细胞悬液转移至AST板的各个孔中。将接种的AST板在35±1℃的环境空气中孵育16-20h。板的结果可以目测读取，以及确定最小抑菌浓度(MIC)。
DNA提取
在含有5％羊血的胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂上培养各个革兰氏阴性细菌分离株的四条划线，以及在含有50μl不含核酸酶的水(AM9930，Life Technologies)的1.5ml无菌收集管中制备细胞悬液。将细菌分离株样品在-20℃下保存直至核酸提取。使用组织制备系统(TPS)(096D0382-02_01_B，Siemens)和组织制备试剂(TPR)试剂盒(10632404B，Siemens)从这些细菌分离株中提取DNA。在提取之前，将细菌分离株在室温解冻，并在2000G下沉淀5秒。在4小时内，将DNA提取方案DNAext用于48种分离株样品的完全的总核酸提取以及各自50μl的洗脱物。然后将总核酸洗脱物转移至96孔qPCR检测板(401341，Agilent Technologies)内，用于RNA酶A消化、DNA定量以及板DNA浓度标准化过程。向50μl的总核酸洗脱物中添加根据制造商的说明书稀释于不含核酸酶的水中的RNA酶A(AM2271，Life Technologies)，最终工作浓度为20ug/ml。利用Siemens扩增和检测设备将消化酶和洗脱物的混合物在37℃孵育30分钟。利用Quant-iTTM PicoGreen dsDNAAssay(P11496，Life Technologies)，根据分析试剂盒的说明书定量来自RNA酶消化的洗脱物的DNA，以及在Siemens扩增和检测设备上确定荧光。利用Excel 2007进行数据分析。在文库制备之前，将25μl定量的DNA洗脱物转移至新的96孔PCR板中用于板DNA浓度标准化。使用来自TPR试剂盒的洗脱缓冲液调整DNA浓度。然后将标准化的DNA洗脱物板在-80℃保存直至文库制备。
下一代测序
在文库制备之前，利用Qubit 2.0荧光计(Qubit dsDNA BR Assay Kit，LifeTechnologies)和Agilent 2200磁带机(Genomic DNA ScreenTape，AgilentTechnologies)对分离的细菌DNA进行质量控制。根据制造商的说明书，利用NexteraXT DNA样品制备试剂盒和96Indexes的NexteraXT Index试剂盒(Illumina)，制备96孔形式的NGS文库。利用KAPA SYBR FAST qPCR MasterMix试剂盒(Peqlab)在ViiA 7实时PCR系统(LifeTechnologies)上，在基于qPCR的方法中定量所得到的测序文库。利用TruSeq PE Clusterv3和TruSeq SBS v3测序化学(Illumina)，在Illumina Hiseq2000或Hiseq2500测序仪上，每道混合96个样品用于配对末端测序(2x 100bp)。利用高通量测序数据的FastQC质量控制工具(Babraham Bioinformatics Institute)确定基础的测序质量参数。
数据分析
利用BWA 0.6.1.20，将636种沙门氏菌属样品的原始配对末端测序数据定位于沙门氏菌属参照(NC_017046)。将得到的SAM文件分类，转换为BAM文件，并利用Picard工具包1.104(http：//picard.sourceforge.net/)标记PCR副本。使用Genome Analysis Toolkit3.1.1(GATK)21以招募200种沙门氏菌属样品组的SNP以及插入缺失(参数：-倍性1-glmBOTH-stand_call_conf 30-stand_emit_conf 10)。将VCF文件合并为单个文件，并进行SNP(QD＜2.0||FS＞60.0||MQ＜40.0)以及插入缺失(QD＜2.0||FS＞200.0)的质量过滤。利用SnpEff22对检测的变体进行注释，以预测编码效应。对于各个注释位点，考虑所有沙门氏菌属样品的基因型。对于某一MIC浓度(断点)，将沙门氏菌属样品分为两组：低抗性组(对于所考虑的药物，具有较低的MIC浓度)和高抗性组(具有较高的MIC浓度)。为了寻找最佳断点，对所有阈值进行评估，并用依赖于2x2列联表(具有参考基因型或者变体基因型的沙门氏菌属样品的数目对比属于低和高抗性组的样品的数目)的费舍尔精确检验计算p值。对于某一基因组位点和药物，计算的最佳断点是产生最低p值的阈值。为了进一步分析，考虑含有非同义改变以及p值＜10-9的位点。
由于药物抗性的可能原因是基因复制，对基因剂量依赖性进行评估。对于各个样品，利用BED工具确定各个位点的基因组覆盖度。从参考组装NC_017046.gff提取基因范围，并计算每个基因标准化的中值覆盖度。为了比较低抗性分离株和高抗性分离株，计算最佳曲线下面积(AUC)。为了排除假象，考虑对于基因而言具有大于0的中值覆盖度的所有样品中至少20％的组，并且每组包含多于15种样品，并进一步评估AUC＞0.75的情况。
为了包含关于如何获取抗性机制的不同方式的数据，分析超过三十年收集的沙门氏菌属分离株，以便还可发现水平基因转移。
详细地，实施下述步骤：将待测试的沙门氏菌属菌株接种于琼脂板上，并在生长条件下培养24小时。然后，选取克隆，并在生长培养基中，在给定的一系列稀释的抗生素类药物的存在下，将其在生长条件下培养16-20小时。通过观察浊度确定细菌生长。
接下来，寻找与表型抗性测试的结果高度相关的突变。
对于测序，利用Nextera文库制备物来制备样品，随后利用HiSeq 2500系统配对末端测序进行多重测序。使用BWA定位数据(Li H.和Durbin R.(2010)Fast and accuratelong-read alignment with Burrows-Wheeler Transform.Bioinformatics，Epub.[PMID：20080505])，并且利用samtool招募SNP(Li H.*，Handsaker B.*，Wysoker A.，Fennell T.，Ruan J.，Homer N.，Marth G.，Abecasis G.，Durbin R.and 1000 Genome Project DataProcessing Subgroup(2009)The Sequence alignment/map(SAM)format andSAMtools.Bioinformatics，25，2078-9.[PMID：19505943])。
作为参考基因组，确定NCBI中注释的NC_017046最适合。
将突变与基因匹配，并计算氨基酸改变。利用不同的算法(SVM，同源建模)，计算导致可能具有致病性/抗性的氨基酸改变的突变。
总之，对沙门氏菌属物种636种不同临床分离株的全基因组和质粒进行测序，以及对于所有生物体，如上所述，进行针对21种治疗形式的经典的抗微生物剂敏感性测试(AST)。从经典的AST获得了含有636行(分离株)和21列(21种药物的MIC值)的表。各表条目包括各个分离株和各个药物的MIC。将遗传数据定位于NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中注释的沙门氏菌属的不同参考基因组，并选择最佳参照作为模板用于比对-NCBI中注释的NC_017046。此外，进行组装，并且证实测序的基因组满足成为参考基因组的所有质量标准。
接下来，评估基因变体。该方法产生了这样的表：列中含有基因位点，以及636行中含有同样的分离株。各表条目包括各个分离株的各个位点处的遗传决定因子(A、C、T、G、小的插入和缺失，...)。
在下一步中，进行不同的统计学检验：
1)为了将抗性/敏感性与基因位点进行比较，我们计算了列联表，并利用费舍尔检验确定显著性；
2)为了将不同位点相互比较，我们计算了不同基因位点之间的相关性；
3)为了检测基因剂量效应，例如基因(基因组中或者质粒上的基因)的丧失或获得，我们计算了具有抗性和不具有抗性的分离株各个位点的覆盖度(即，多少读取定位于当前位点)。
首先从这些数据中选择具有最佳p值的50种基因，用于突变列表以及相关抗生素抗性列表，其代表表1和表2。
表3和表4a、表4b和表4c中提供了所有基因位点、药物、药物类别、受影响的基因等的完整列表，其中表3与表1对应，并且表示确定基因中的突变之后具有最低p值的基因，以及表4，表4a、4b和4c分别与表2对应，并且表示在将突变与对各个抗生素的抗生素抗性相关联之后具有最低的p值的基因。
此外，对分别针对具有大多数抗生素类药物的各个抗生素类别以及各个抗生素具有最佳p值的数据进行评估，其公开于表5-9中。
在表3-9中，如下设计列：
基因名称：受影响的基因；
POS：沙门氏菌属参考基因组中的SNP/变体的基因组位点(参见上文)；
p值：利用费舍尔精确检验计算的显著性数值(根据FDR(Benjamini Hochberg)方法确定(Benjamini Hochberg，1995))；
genbank蛋白登录号：与基因相对应的蛋白的(NCBI)登录号。
表中还显示了抗生素/药物类别、与突变显著相关的抗生素的数目(在所有抗生素中或者在某些类别中)以及相关抗生素。
基于包含4个域的列联表，利用费舍尔精确检验计算p值：#具有抗性的样品/野生型；#具有抗性的样品/突变体；#不具有抗性的样品/野生型；#不具有抗性的样品/突变体。
检验是基于样品在4个域中的分布。平均分布指示无显著性，而聚簇至两个域则表明显著性。
获得下述结果：
-检测了基因位点与抗微生物剂之间共大约55.800种不同的关联(p值＜10-10)。
-这些中的最大的部分是点突变(即单碱基变换)；
-达到的最高显著性是10-49；
-除了这些，发现了高达4个碱基的插入或缺失；
-此外，发现了针对四种不同的药物类别的与抗性相关的潜在基因测试；
·β-内酰胺(包括青霉素、头孢菌素(Cephalosporins)、碳青霉烯(Carbapenems)、单环β-内酰胺(Monobactams))，
·喹诺酮，尤其是氟喹诺酮，
·氨基糖苷，
·聚酮，尤其是四环素，
-在3,874种不同的基因中观察到突变
尽管在表中仅呈现了各基因中的最佳突变，但是对于各基因发现了一批不同的SNP。以下表12和表13中显示了表3中给出的两种基因的多个SNP的实例。
表12：基因bcfB(genbank蛋白登录号YP_005395534.1)中统计学显著的SNP(表头分别如表3和表4)
*：(四环素)
表13：基因nhaA(genbank蛋白登录号YP_005395552.1)中统计学显著的SNP(表头分别如表3和表4)
*：(四环素)
对于其它基因也获得了类似的结果，但是为了简洁起见将其省略。
此外，通过全面比较单个SNP与抗生素敏感性/抗性相关的显著性水平以及SNP的组合与抗生素敏感性/抗性相关的显著性水平来证明各个SNP的协同效应。对于2个SNP的代表性实例，相比于任一单独的SNP的关联(由示例性的不同抗生素给出)，2个SNP的协同联合的显著性水平得到改善，其数值示于表14。
表14：2个SNP联合的协同增加
POS1、2＝用于组合的位点1、2；Ref＝参考碱基；Alt＝样品中可交替的碱基；Improv＝与单个SNP的最小p值相比的改善
例如，在最后一个实例中，对于AM，位点3582301和46695的153.8％的改善是由于p值从2.27248e-06变为1.4778e-06。
此外，在各自基因中对于其它SNP获得了类似的结果。
直接来自患者样品的用于组合病原体鉴定和抗微生物剂敏感性测试的基因测试可以使产生可行性结果的时间从数天显著降低至数小时，从而使得能够进行靶向治疗。此外，该方法对中心实验室无限制，但可以开发允许进行各个测试的定点照护装置。此类技术连同本发明的方法和计算机程序产品可以使护理发生变革，例如在密集护理单元或者对于一般入院而言。此外，利用本发明的方法甚至可以实现如实时爆发监控的应用。
并非仅利用单个变体，数个变体位点的组合可以改善预测的准确性，并进一步降低受其它因素影响的假阳性结果。
与利用MALDI-TOF MS的方法相比，本发明的方法具有下述优势：其涵盖几乎全部基因组，从而使得我们能够鉴定可能与抗性相关的潜在的基因组位点。尽管MALDI-TOF MS还可用于鉴定细菌蛋白中的点突变，但是该技术仅检测蛋白的子集，并且这些蛋白中并非所有的均被同等良好地覆盖。此外，某些相关菌株的鉴定和区分并不总是可行的。
本发明的方法允许计算最佳断点，用于将分离株分为抗性组和敏感组。本发明的发明人设计了灵活的软件工具，除了最佳断点之外，其还允许考虑通过为在不同国家应用GAST而准备的不同指南(例如欧洲和美国指南)所限定的数值。
本发明的发明人证明，本发明的方法能够鉴定已知作为药物靶标的基因中的突变，以及检测潜在的新靶点。
当前方法使得能够
a.在一个诊断测试中鉴定并验证用于基因鉴定和敏感性/抗性测试的标志物；
b.验证已知的药物靶标和作用模式；
c.检测可能的新的抗性机制，其导致用于新疗法的推定的新的靶标/第二靶标基因。
Claims (15)
1.确定患者感染对抗微生物药物如抗生素的治疗可能具有抗性的沙门氏菌属(Salmonella)物种的诊断方法，其包括下述步骤：
a)获得或者提供来自所述患者的包含或疑似包含至少一种沙门氏菌属物种的样品；
b)确定来自下述基因的至少两种基因中至少一个突变的存在：recN、hemH、UMN798_3428、metE、yijD、UMN798_4831、UMN798_1939、copS、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、recF、emrA、glyQ、dcp、thiH、UMN798_1612、UMN798_2909、UMN798_1680、UMN798_4073、yjbC、nadB、UMN798_3160、hutU、envC、UMN798_3889、UMN798_1629、bcfB、degQ、UMN798_1331、trg、uvrC、polB、hpcD、UMN798_1628、UMN798_1701、glgS、plsB、yjcC、feoB、misL、dxr、hemF、rnfG、yhjB、UMN798_1163、UMN798_0394、alkA、nhaA和lspA，其中存在所述至少两个突变表明所述患者感染了具有抗微生物药物抗性如抗生素抗性的沙门氏菌属菌株。
2.选择对感染了可能具有抗性的沙门氏菌属菌株的患者的治疗的方法，其包括下述步骤：
a)获得或提供来自所述患者的包含或疑似包含至少一种沙门氏菌属物种的样品；
b)确定来自下述基因的至少两种基因中至少一个突变的存在：recN、hemH、UMN798_3428、metE、yijD、UMN798_4831、UMN798_1939、copS、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、recF、emrA、glyQ、dcp、thiH、UMN798_1612、UMN798_2909、UMN798_1680、UMN798_4073、yjbC、nadB、UMN798_3160、hutU、envC、UMN798_3889、UMN798_1629、bcfB、degQ、UMN798_1331、trg、uvrC、polB、hpcD、UMN798_1628、UMN798_1701、glgS、plsB、yjcC、feoB、misL、dxr、hemF、rnfG、yhjB、UMN798_1163、UMN798_0394、alkA、nhaA和lspA，其中存在所述至少两个突变表明对一种或多种抗微生物药物如抗生素类药物的抗性；
c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物；以及
d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于治疗沙门氏菌属感染的一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物。
3.如前述权利要求中的一项或多项所述的方法，其中所述方法包括确定沙门氏菌属对一种或多种抗微生物药物，例如抗生素类药物的抗性。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述抗微生物药物，例如抗生素类药物选自内酰胺类抗生素，并且确定下述基因中突变的存在：recN、hemH、UMN798_3428、metE、yijD、UMN798_4831、UMN798_1939、copS、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、recF、emrA、glyQ、dcp、thiH、UMN798_1612、UMN798_2909、UMN798_1680、UMN798_4073、yjbC、nadB、UMN798_3160、hutU、envC、UMN798_3889、UMN798_1629、bcfB、degQ、UMN798_1331、trg、uvrC、polB、hpcD、UMN798_1628、UMN798_1701、glgS、plsB、yjcC、feoB、misL、dxr、hemF、rnfG、yhjB、UMN798_1163、UMN798_0394、alkA、nhaA和/或lspA；和/或
其中所述抗微生物药物，例如抗生素类药物选自氨基糖苷类抗生素，并且确定下述基因中突变的存在：recN、hemH、UMN798_3428、metE、yijD、UMN798_4831、UMN798_1939、copS、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、recF、emrA、glyQ、dcp、thiH、UMN798_1612、UMN798_2909、UMN798_1680、UMN798_4073、yjbC、nadB、UMN798_3160、hutU、envC、UMN798_3889、UMN798_1629、bcfB、degQ、UMN798_1331、trg、uvrC、polB、hpcD、UMN798_1628、UMN798_1701、glgS、plsB、yjcC、feoB、misL、dxr、hemF、rnfG、yhjB、UMN798_1163、UMN798_0394、alkA、nhaA和/或lspA；和/或
其中所述抗微生物药物，例如抗生素类药物选自聚酮类抗生素，优选四环素类抗生素，并且确定下述基因中突变的存在：recN、hemH、UMN798_3428、metE、yijD、UMN798_4831、UMN798_1939、copS、UMN798_0628、UMN798_4878、leuB、recF、emrA、glyQ、dcp、thiH、UMN798_1612、UMN798_2909、UMN798_1680、UMN798_4073、yjbC、nadB、UMN798_3160、hutU、envC、UMN798_3889、UMN798_1629、bcfB、UMN798_1331、trg、uvrC、polB、hpcD、UMN798_1628、UMN798_1701、glgS、plsB、yjcC、feoB、misL、dxr、hemF、rnfG、yhjB、UMN798_1163、UMN798_0394、alkA、nhaA和/或lspA。
5.如前述权利要求中的一项或多项所述的方法，其中所述抗微生物药物，例如抗生素类药物选自阿莫西林/克拉维酸钾(AUG)、氨苄西林(AM)、氨曲南(AZT)、头孢唑林(CFZ)、头孢吡肟(CPM)、头孢噻肟(CFT)、头孢他啶(CAZ)、头孢曲松(CAX)、头孢呋辛(CRM)、头孢噻吩(CF)、环丙沙星(CP)、厄他培南(ETP)、庆大霉素(GM)、亚胺培南(IMP)、左氧氟沙星(LVX)、美罗培南(MER)、哌拉西林/他唑巴坦(P/T)、氨苄西林/舒巴坦(A/S)、四环素(TE)、妥布霉素(TO)以及甲氧苄啶/磺胺甲恶唑(T/S)。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述抗生素类药物是CFZ，并且检测就NCBI中注释的参考基因组NC_017046而言，至少一种下述核苷酸位点中的突变：4779417、2983118、1548464、1574737、3772654、1313897；和/或
其中所述抗生素类药物是GM，并且检测就NCBI中注释的参考基因组NC_017046而言，至少一种下述核苷酸位点中的突变：2840330、25574、3536122、115342、1148509、3379140、4478134、3686566、1487086、3799879、1163470、2208848、46695、56998、3335426；和/或
其中所述抗生素类药物是CF，并且检测就NCBI中注释的参考基因组NC_017046而言，至少一种下述核苷酸位点中的突变：2833888、546961、3334479、4191057、4366486、4724403、1895588、1139812、637461、4779417、131219、4062015、2983118、3861998、1548464、4397111、1574737、1650934、4436188、3075942、855087、3582301、3772654、1590194、1313897、1673475、1994028、1589819、1672517、3976726、3582354、1673444；和/或
其中所述抗生素类药物是TE，并且检测就NCBI中注释的参考基因组NC_017046而言，至少一种下述核苷酸位点中的突变：2833888、546961、3334479、4191057、4366486、4724403、1895588、1139812、637461、4779417、131219、4062015、2983118、3861998、1548464、4397111、1574737、2840330、1650934、3966175、4436188、2780306、3075942、855087、3582301、3772654、1590194、25574、1313897、1673475、1994028、115342、1148509、1589819、1672517、3379140、4478134、4523874、3686566、3976726、258966、2558379、1487086、3799879、1163470、409259、2208848、46695、56998、3582354、3335426、1673444；和/或
其中所述抗生素类药物是A/S，并且检测就NCBI中注释的参考基因组NC_017046而言，至少一种下述核苷酸位点中的突变：2833888、546961、3334479、4191057、4366486、4724403、1895588、1139812、637461、4779417、131219、4062015、2983118、3861998、1548464、4397111、1574737、2840330、1650934、3966175、4436188、2780306、3075942、855087、3582301、3772654、1590194、25574、3536122、1313897、1673475、1994028、115342、1148509、1589819、1672517、3379140、4478134、4523874、3686566、3976726、258966、2558379、1487086、3799879、1163470、409259、2208848、46695、56998、3582354、3335426、1673444；和/或
其中所述抗生素类药物是CRM，并且检测就NCBI中注释的参考基因组NC_017046而言，至少一种下述核苷酸位点中的突变：2833888、546961、3334479、4191057、4366486、4724403、1895588、1139812、637461、4779417、131219、4062015、2983118、3861998、1548464、4397111、1574737、2840330、1650934、3966175、4436188、2780306、3075942、855087、3582301、3772654、1590194、25574、3536122、1313897、1673475、1994028、115342、1148509、1589819、1672517、3379140、4478134、4523874、3686566、3976726、258966、2558379、1487086、3799879、1163470、409259、2208848、46695、56998、3582354、3335426、1673444；和/或
其中所述抗生素类药物是P/T，并且检测就NCBI中注释的参考基因组NC_017046而言，至少一种下述核苷酸位点中的突变：2833888、546961、3334479、4191057、4366486、4724403、1895588、1139812、637461、4779417、131219、4062015、2983118、3861998、1548464、4397111、1574737、2840330、1650934、3966175、4436188、2780306、3075942、855087、3582301、3772654、1590194、25574、3536122、1313897、1673475、1994028、115342、1148509、1589819、1672517、3379140、4478134、4523874、3686566、3976726、258966、2558379、1487086、3799879、1163470、409259、2208848、46695、56998、3582354、3335426、1673444；和/或
其中所述抗生素类药物是TO，并且检测就NCBI中注释的参考基因组NC_017046而言，至少一种下述核苷酸位点中的突变：2833888、546961、3334479、4191057、4366486、4724403、1895588、1139812、637461、4779417、131219、4062015、2983118、3861998、1548464、4397111、1574737、2840330、1650934、3966175、4436188、2780306、3075942、855087、3582301、3772654、1590194、25574、3536122、1313897、1673475、1994028、115342、1148509、1589819、1672517、3379140、4478134、4523874、3686566、3976726、258966、2558379、1487086、3799879、1163470、409259、2208848、46695、56998、3582354、3335426、1673444；和/或
其中所述抗生素类药物是AM，并且检测就NCBI中注释的参考基因组NC_017046而言，至少一种下述核苷酸位点中的突变：2833888、546961、3334479、4191057、4366486、4724403、1895588、1139812、637461、4779417、131219、4062015、2983118、3861998、1548464、4397111、1574737、2840330、1650934、3966175、4436188、2780306、3075942、855087、3772654、25574、3536122、1313897、1994028、115342、1148509、3379140、4478134、4523874、3686566、3976726、258966、2558379、1487086、3799879、1163470、409259、2208848、46695、56998、3335426；和/或
其中所述抗生素类药物是AUG，并且检测就NCBI中注释的参考基因组NC_017046而言，至少一种下述核苷酸位点中的突变：2833888、546961、3334479、4191057、4366486、4724403、1895588、1139812、637461、4779417、131219、4062015、2983118、3861998、1548464、4397111、1574737、2840330、1650934、3966175、4436188、2780306、3075942、855087、3582301、3772654、1590194、25574、3536122、1313897、1673475、1994028、115342、1148509、1589819、1672517、3379140、4478134、4523874、3686566、3976726、258966、2558379、1487086、3799879、1163470、409259、2208848、46695、56998、3582354、3335426、1673444。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中确定属于沙门氏菌属物种的细菌微生物对1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16、17、18、19、20或21种抗生素类药物的抗性。
8.如前述权利要求中的一项或多项所述的方法，其中确定核酸序列信息或者突变的存在包括确定至少两种基因的部分序列或全部序列。
9.如前述权利要求中的一项或多项所述的方法，其中确定核酸序列信息或者突变的存在包括确定沙门氏菌属物种基因组的部分或全部序列，其中所述基因组的部分或全部序列包括所述至少两种基因的至少部分序列。
10.如前述权利要求中的一项或多项所述的方法，其中确定核酸序列信息或者突变的存在包括利用下一代测序或高通量测序方法，优选地，其中通过利用下一代测序或高通量测序方法确定沙门氏菌属物种的细菌生物体的部分或全部基因组序列。
11.确定沙门氏菌属物种的细菌微生物对抗微生物药物如抗生素的抗性谱的方法，其包括：
获得或者提供沙门氏菌属物种多种临床分离株的基因序列的第一数据集；
提供所述沙门氏菌属物种多种临床分离株的抗微生物药物抗性如抗生素抗性的第二数据集；
将所述第一数据集的基因序列与沙门氏菌属至少一个，优选一个参考基因组进行比对，和/或至少部分组装所述第一数据集的基因序列；
分析所述第一数据集的基因序列的基因变体，以获得基因变体的第三数据集；
将所述第三数据集与所述第二数据集关联，并对所述关联进行统计学分析；以及
确定沙门氏菌属的基因组中与抗微生物药物抗性如抗生素抗性相关的基因位点。
12.确定患者感染对抗微生物药物治疗可能具有抗性的沙门氏菌属物种的诊断方法，其包括下述步骤：
a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含属于沙门氏菌属物种的细菌微生物的样品；
b)如通过权利要求11所述的方法确定的，确定所述属于沙门氏菌属物种的细菌微生物的至少一种基因中至少一个突变的存在，其中存在所述至少一个突变表明所述患者感染具有抗微生物药物抗性的沙门氏菌属菌株。
13.选择对感染了可能具有抗性的沙门氏菌属菌株的患者的治疗的方法，其包括下述步骤：
a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含属于沙门氏菌属物种的细菌微生物的样品；
b)如通过权利要求11所述的方法确定的，确定所述属于沙门氏菌属物种的细菌微生物的至少一种基因中至少一个突变的存在，其中存在所述至少一个突变表明对一种或多种抗微生物药物的抗性：
c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物；以及
d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物，并且适用于治疗沙门氏菌属感染的一种或多种抗微生物药物。
14.获得沙门氏菌属物种的细菌微生物对抗微生物药物如抗生素的抗性谱的方法，其包括：
获得或提供沙门氏菌属物种临床分离株的基因序列的第一数据集；
提供沙门氏菌属物种多种临床分离株的抗微生物药物抗性如抗生素抗性的第二数据集；
将所述第一数据集的基因序列与沙门氏菌属至少一个，优选一个参考基因组进行比对，和/或至少部分组装所述第一数据集的基因序列；
分析所述第一数据集的基因序列的基因变体，以获得所述第一数据集的基因变体的第三数据集；
将所述第三数据集与所述第二数据集关联，并对所述关联进行统计学分析；以及
确定所述第一数据集的沙门氏菌属基因组中与抗微生物药物抗性如抗生素抗性相关的基因位点。
15.计算机程序产品，其包含计算机可执行的指令，所述指令被执行时实施权利要求11至14中任一项所述的方法。
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