CN108271392A

CN108271392A - 在微生物中利用基因组中结构变化对抗微生物药物的基因抗性预测

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Publication number: CN108271392A
Application number: CN201680044780.7A
Authority: CN
Inventors: 安德烈亚斯·凯勒; 苏珊娜·施默尔克; 科德·弗里德里希·施塔勒; 克里斯蒂娜·巴克斯; 瓦伦蒂娜·加拉塔
Original assignee: Ares Hereditary Ltd By Share Ltd
Current assignee: Ares Hereditary Ltd By Share Ltd
Priority date: 2015-08-06
Filing date: 2016-08-05
Publication date: 2018-07-10
Anticipated expiration: 2036-08-05
Also published as: WO2017021529A1; CA2992828A1; ES2855202T3; EP3332028B1; AU2016301963A1; US20180349549A1; EP3332028A1; CN108271392B

Abstract

本发明涉及确定患者感染对抗微生物药物治疗可能具有抗性的至少一种微生物尤其是细菌微生物的方法，选择对感染了至少一种微生物尤其是细菌微生物的患者的治疗的方法，以及确定包含至少一种基因的微生物尤其是细菌微生物的基因组结构变化的方法，以及用于这些方法的计算机程序产品。

Description

在微生物中利用基因组中结构变化对抗微生物药物的基因抗性预测

本发明涉及确定患者感染对抗微生物药物治疗可能具有抗性的至少一种微生物尤其是细菌微生物的方法，选择对感染了至少一种微生物尤其是细菌微生物的患者的治疗的方法，和确定微生物尤其是细菌微生物的基因组结构变化的方法，所述结构变化包含至少一个基因的变化，以及用于这些方法的计算机程序产品。

抗生素抗性是药物抗性的一种形式，从而使微生物亚群如细菌物种的菌株，尽管暴露于抗生素类药物，但也可存活并增殖。对于个体患者以及主要公共卫生问题而言，这是严重的健康问题。细菌感染的及时治疗需要分析获得自患者的临床分离株的抗生素抗性，以选择有效的疗法。通常，出于此目的，将鉴定的抗性与某一微生物(即ID)关联是必要的。

抗菌药物抗性(ADR)代表了主要的健康负担。根据正在监督的世界卫生组织的抗微生物抗性全球报告，ADR在欧洲每年导致25,000例死亡，在美国每年导致23,000例死亡。在欧洲，额外的250万住院日导致15亿欧元的社会成本。在美国，2百万的直接疾病成本导致200亿美元的直接成本。总成本估计高得多，将国内生产总值(GDP)降低达1.6％。

一般而言，细菌针对抗微生物治疗的抗性机制很大一部分依赖于生物体的遗传。各自的基因或分子机制在细菌基因组中编码或者在可在不同细菌之间互换的质粒上编码。最常见的抗性机制包括：

1)外排泵是位于膜内的高亲和力反向运输系统，其将抗生素运输至细胞外，例如针对四环素的抗性。

2)特定的酶以使抗生素丧失其活性的方式对抗生素进行修饰。在链霉素的情况下，抗生素被化学修饰，以使其不再结合核糖体，从而不再阻止蛋白合成。

3)产生降解抗生素的酶，从而使其失活。例如，青霉素酶是一组剪切青霉素分子的β内酰胺环的β-内酰胺酶。

此外，一些病原体显示出针对药物的天然抗性。例如，生物体可以缺乏针对抗生素的运输系统，或者生物体中不存在抗生素分子的靶标。

原则上对药物敏感的病原体可以通过既有遗传物质的修饰(例如，抗生素抗性的自发突变，其在感染中以约1/1亿个细菌的频率发生)或者从其它来源获得新的遗传物质而变得具有抗性。一个实例是水平基因转移，其是这样的过程：DNA小包中包含的遗传物质可在同一物种的单个细菌之间，甚至在不同物种之间转移。水平基因转移可以通过转导、转化或接合发生。

通常，通过在不同浓度的这些试剂中培养生物体来进行针对抗微生物剂的敏感性/抗性的测试。

简言之，将琼脂平板接种患者样品(例如，尿、痰、血液、粪便)过夜。在第二天，通过培养或者利用质谱法，用各个克隆鉴定生物体。基于生物体的身份，接种含有增加浓度的用于处理这些生物体的药物的新平板，并另外生长12-24小时。使用抑制生长的最低药物浓度(最小抑菌浓度-MIC)以确定对所测试的药物的敏感性/抗性。该过程耗费至少2至3个工作日，期间以经验为主对患者进行治疗。自动化系统来自数个公司，例如Biomeriux(Vitek)、Beckman Coulter(Microscan)。特别是在患有危及生命的疾病的患者中或者为了克服抗生素的普遍滥用，需要显著降低的结果效率(time-to-result)。

近期的发展包括用于快速细菌鉴定的基于PCR的测试试剂盒(例如，BiomerieuxBiofire Tests,Curetis Unyvero Tests)。利用这些测试，对于非常有限数目的药物而言，检测所选择的抗性基因座是可能的，但是不能给出与基于培养的AST的关联。质谱法越来越多地用于鉴定临床样品中的病原体(例如，Bruker Biotyper)，并且正在进行研究以建立检测针对抗生素的敏感性/抗性的方法。

使用分子技术直接检测MRSA已经变得越来越普遍，特别是用于筛选目的。对甲氧西林的抗性是由mec操纵子介导的，mec操纵子是葡萄球菌盒式染色体mec(SCCmec)的一部分。最近引入了PCR测试，其基于将SCCmec的右端序列与金黄色葡萄球菌(S.aureus)特异性标志物组合的检测。尽管检测到存在赋予抗性的基因，最初的报告存在描述基于培养物的敏感性报告。

对于一些药物而言，已知找到至少两个靶标，例如在环丙沙星(drug bank ID00537；http://www.drugbank.ca/drugs/DB00537)的情况下，靶标包括DNA拓扑异构酶IV、DNA拓扑异构酶II和DNA回旋酶。可以预期，对于其它药物而言也是这样的情况，尽管还未鉴定出各自的第二靶标。在常见的调节情况下，两个相关的基因位点将自然显示出共相关或冗余。

已知药物抗性可与遗传多态性相关。这适用于病毒，其中在临床实践中建立了抗性测试(例如，HIV基因型分型)。最近，已显示，抗性在细菌甚至更高级生物体(如人类)中也具有遗传原因，其中肿瘤对某些细胞抑制剂的抗性可与基因组突变相关。

Wozniak等人(BMC Genomics 2012,13(Suppl 7):S23)基于基因型和表型数据公开了金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中的药物抗性的遗传决定因子。Stoesser等人利用全基因组序列数据，公开了大肠杆菌(Escherichia coli)分离株和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)分离株的抗微生物敏感性的预测(J Antimicrob Chemother2013；68:2234-2244)。

Chewapreecha等人(Chewapreecha等人(2014)Comprehensive Identificationof single nucleotid polymorphisms associated with beta-lactam resistancewithin pneumococcal mosaic genes.PLoS Genet 10(8):el004547)利用类似的方法鉴定出革兰氏阳性肺炎链球菌(Streptococcus Pneumonia)中的突变。

在最近的研究中，考虑了考虑微生物(例如细菌微生物)基因组中的变异的基因测试。在以前的工作中可以看出，利用单碱基上的变化可以做出更快的治疗决定。然而，这不一定适用于所测试的所有抗微生物药物如抗生素。

快速且准确地检测微生物尤其是微生物物种(例如金黄色葡萄球菌)感染以及预测对抗微生物疗法的应答，代表了高度未满足的临床需求。

通过本发明解决了这一需求。

发明概述

发明人发现基因组中与多于一个碱基尤其是开放阅读框中至少一个基因或多个基因相关的结构变异可能与微生物尤其是细菌微生物对抗微生物药物如抗生素的抗性/敏感性相关。例如，外排泵可以存在于基因组外的质粒中。然后此类外排泵可以将如抗生素的药物/药(medicine/drug)从生物体中送出，使其不能发挥作用。因此，在质粒上具有此类外排泵的细菌是具有抗性的。

根据第一方面，本发明涉及确定微生物尤其是细菌微生物的基因组中的结构变异的方法，所述结构变异包括基因组中包含多于一个碱基的至少一处变化，所述方法包括：

获得或提供所述微生物的多种临床分离株的基因序列的第一数据集，

其中任选地组装所述第一数据集的基因序列的至少一部分；和/或获得或提供所述微生物的多种临床分离株的基因序列的第一数据集，并将所述第一数据集的所述基因序列与至少一个，优选一个参考序列进行比对；

分析所述第一数据集的基因序列的所述基因组的结构变异以获得结构变体的第三数据集，所述结构变异包括基因组中包含多于一个碱基的至少一处变化；

提供所述微生物的多种临床分离株的抗微生物药物如抗生素的抗性和/或敏感性的第二数据集；

将所述第三数据集与所述第二数据集关联，并对所述关联进行统计学分析；以及

确定所述微生物的基因组中与抗微生物药物如抗生素的抗性相关的的结构变异。

本发明的第二方面涉及确定患者感染对抗微生物药物治疗可能具有抗性的微生物尤其是细菌微生物的诊断方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自患者的包含或疑似包含微生物尤其是细菌微生物的样品；

b)如通过第一方面的方法确定的，确定微生物尤其是细菌微生物的至少一个基因序列中至少一个结构变异的存在，其中存在所述至少一个结构变异表明患者感染具有抗微生物药物抗性的微生物。

本发明的第三方面涉及选择对感染了可能具有抗性的微生物尤其是细菌微生物的患者的治疗的方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自患者的包含或者疑似包含微生物尤其是细菌微生物的样品；

b)如通过第一方面的方法确定的，确定微生物尤其是细菌微生物的至少一个基因序列中至少一个结构变异的存在，其中存在所述至少一个结构变异表明对一种或多种抗微生物药物的抗性；

c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物；以及

d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物，并且适用于治疗微生物尤其是细菌微生物感染的一种或多种抗微生物药物。

本发明的第四方面涉及确定微生物尤其是细菌微生物的临床分离株的微生物基因组的结构变异的方法，其包括：

获得或提供微生物尤其是细菌微生物的所述临床分离株的至少一个基因序列；以及

如通过第一方面的方法确定的，确定微生物尤其是细菌微生物的临床分离株的至少一个基因序列中结构变异的存在。

本发明的第五方面涉及一种或多种计算机程序产品，其包含计算机可执行的指令，所述指令被执行时实施本发明的第一方面至第四方面中任一项所述的方法。

从属权利要求公开了本发明的其它方面和其它实施方案，并且其可以从下述描述、附图和实施例中得出，但不限于此。

附图说明

附图应当阐明本发明的实施方案，并传达其进一步的理解。与描述相结合，它们将作为本发明的概念和原理的解释。结合附图，可以得到其它实施方案和许多所阐明的优势。附图的要素相对于彼此不一定是按比例的。除非另外指明，相同的、功能等同的以及作用相同的特性和组件在附图的图中用同一参考编号表示。

图1示意性地示出了根据本发明的方法的诊断测试的读取概念。

本发明的详细描述

定义

除非另外限定，否则本文使用的技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的具有相同的含义。

本发明中的“抗微生物药物”指一组药物，其包括抗生素、抗真菌剂、抗原生动物剂和抗病毒剂。根据某些实施方案，抗微生物药物是抗生素。

术语“核酸分子”指具有确定序列的多核苷酸分子。其包含DNA分子、RNA分子、核苷酸类似物分子及其组合和衍生物，如掺入核苷酸类似物的DNA分子或RNA分子或者cDNA。

术语“核酸序列信息”涉及可来源于核酸分子的序列的信息，所述核酸分子的序列是例如序列自身或者与参考序列相比的序列上的变异。

术语“突变”涉及与参考序列相比的序列上的变异。此类参考序列可以是在主要的野生型生物体或者参考生物体(例如限定且已知的细菌株或亚株)中确定的序列。例如，突变是一个或多个核苷酸的缺失、一个或多个核苷酸的插入、或者一个或多个核苷酸的取代、一个或一系列核苷酸的重复、一个或一系列核苷酸的易位，例如是单核苷酸多态性(SNP)。

在本发明的背景下，“样品”是包含来自细菌微生物的至少一种核酸分子的样品。样品的实例是：细胞、组织、体液、活检标本、血液、尿液、唾液、痰、血浆、血清、细胞培养上清液、拭子样品等。根据某些实施方案，样品是患者样品(临床分离株)。

被称为下一代测序的新的且高效的核酸测序方法已开启了大规模基因组分析的可能性。术语“下一代测序”或“高通量测序”指高通量测序技术，其将测序过程并行，一次产生数千条或数百万条序列。实例包括大规模平行信号测序(MPSS)、聚合酶克隆测序(Polonysequencing)、454焦磷酸测序、Illumina(Solexa)测序、SOLiD测序、离子半导体测序、DNA纳米球测序、Helioscope(TM)单分子测序、单分子SMRT(TM)测序、单分子实时(RNAP)测序、纳米孔DNA测序、通过杂交进行的测序、扩增子测序、GnuBio。

在本描述中，术语“微生物(microorganism)”包含术语微生物(microbe)。除非另外或者明显指明，微生物的类型没有特别限制，并且其例如包括细菌、病毒、真菌、微小的藻类和原生动物及其组合。根据某些方面，微生物是指一种或多种革兰氏阴性或革兰氏阳性的细菌物种，尤其是不动杆菌属(Acinetobacter)、埃希氏杆菌属(Escherichia)如大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏杆菌属(Shigella)和/或葡萄球菌属(Staphylococcus)中的一种或多种。

本描述中提及微生物包括提及一种微生物以及多种微生物，例如两种、三种、四种、五种、六种或者更多种微生物。

本发明中的脊椎动物是指含有椎骨的动物，其包括哺乳动物-包括人类、鸟类、爬行动物、两栖动物和鱼类。因此本发明不仅适用于人类医学，还适用于兽医学。

根据某些实施方案，本发明的方法中的患者是脊椎动物，更优选哺乳动物，并且最优选人类患者。

在示例性地详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文所述的方法的过程步骤的具体组成部分，因为此类方法可以改变。还应当理解，本文使用的技术仅出于描述具体实施方案的目的，并且其不意图具有限制性。必须注意，除非上下文另外明确规定，如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括单数和/或复数指示物。例如，本文使用的术语“一个/一种”可以理解为一个单个的实体或者意味着“一个或多个/一种或多种”实体。还应当理解，除非上下文另外明确规定，复数形式包括单数和/或复数指示物。此外，应当理解，如果给出由数值限定的参数范围，则认为所述范围包括这些限制值。

关于抗微生物药物，例如抗生素类药物的剂量，其参考人类医学和兽医学中建立的药理学原理。例如，Forth,Henschler,Rummel"Allgemeine und speziellePharmakologie und Toxikologie"，第9版，2005,pp.781-919，其可用作指南。关于即用型药剂的配制，参考"Remington,The Science and Practice of Pharmacy"，第22版，2013,pp.777-1070。

基因序列的组装可以通过任何已知的方法进行，并无特别限定。

根据某些实施方案，利用比对所发现的突变也可与无比对的方法进行比较或匹配，例如，用于检测单个碱基交换的方法，例如基于通过组装发现的重叠群。例如，可将获得自测序的读取组装成重叠群并可将重叠群相互比较。

包含在基因组中的包含多于一个碱基的变化的结构变异是指这样的结构变异，其中在微生物的基因组的基因序列中相邻的至少两个碱基发生改变，并且可以是指例如多个(2个或更多个)核苷酸的缺失、多个(2个或更多个)核苷酸的插入、多个(2个或更多个)核苷酸的取代、多个(2个或更多个)核苷酸的序列重复、或多个(2个或更多个)核苷酸的序列易位。根据某些实施方案，结构变异可以包含基因组的更大部分区域，例如微生物基因组中的至少一个完整基因，或者在开放阅读框中的甚至更多基因。

在本发明中，没有确定单核苷酸的具体变化，但如上所述，基于基因组的更大部分进行测定。

在本发明中，对参考序列没有特别的限制，只要其可用作一个或多个样品中的一个或多个未知基因序列的参考即可。例如参考序列可以是一个或多个参考基因组，泛基因组或一个或多个质心(centroids)。根据某些实施方案，参考序列包含一个或多个质心，其中质心是基因组(例如微生物)的基因组/家族/簇的代表。例如可以从数据库MetaRef(http://metaref.org/)中提取质心，该数据库在本发明的实例中被使用，尤其是在2014年11月24日从数据库中进行提取。在提取之后，来自MetaRef数据库的数据可以不断更新以用于进一步的实验。可以分别地或作为整体为每个生物体提取质心列表。在本发明的实例中，为每个生物体提取了质心列表。可以从如IMG(http://img.jgi.doe.gov/)(如在目前情况下)或NCBI等数据库中提取质心信息(例如用于注释)。

在该方法以及本发明的其他方法中，可以以任何方式(优选非侵入性方式)提供或获得多种临床分离株的基因序列的第一数据集，并且例如可以是由体外样品提供。

根据某些实施方案，该方法以及本发明的其它方法中获得或提供多种临床分离株的基因序列，可以包含下述：

例如提供或获得脊椎动物(例如人类)的样品，以及通过未特别限定的记录核酸的已知方法来记录核酸序列(例如DNA或RNA序列)。例如，可以通过测序方法记录核酸，其中任何测序方法均适合，特别是这样的测序方法：可在短时间内对大批样品成分如血液样品成分中所包含的核酸和/或核酸片段和/或其部分进行分析，包括至少一种目标微生物尤其是细菌微生物的核酸和/或核酸片段和/或其部分。例如，可以利用聚合酶链式反应(PCR)，特别是多重PCR或高通量测序或下一代测序，优选利用高通量测序进行测序。对于测序，优选使用体外样品。

通过测序获得的数据可以是任何形式，并且其可用于通过已知的下述方法来鉴定待鉴定的微生物的核酸：例如指纹分析法、比较基因组和/或与目标微生物的一个或多个物种的至少一个或多个参考序列(例如参考基因组和/或质心)进行比对等，形成微生物的任选地比对基因的第三数据集-排除来自其它来源(例如脊椎动物)的其它数据。对于本方法，也可以使用原始数据和/或可以使用至少部分的集合(assemblies)来形成第三数据集。因此，根据某些实施方案，可以组装第一数据集的至少一部分基因序列，其中可以通过任何已知的方法进行组装并且没有特别的限制。此外，也可以将来自参考序列(例如已知物种的质心和/或基因组)的数据，例如来自已知的细菌物种的数据，例如来自如MetaRef和/或在NCBI数据库的数据用于第一数据集和/或用于评估第一数据集。

对于一些生物体，在全基因组相关研究中，使目标点(例如，结构变异)参考一个恒定参照以提高标准化可能是有用的。在个体之间具有高的基因组一致性和99％相同的序列的人类的情况下，这是简单的，并且代表了标准，因为相应的参考基因组可获自数据库。

但是在引发传染性疾病的微生物(例如，细菌和病毒)的情况下，这要困难的多，当将序列数据与参考基因组比对时，特别是不在基因(尤其是已知基因)上的遗传变异可能被遗漏。克服这个问题的一个可能性是回到包含某个属的所有序列的虚拟的泛基因组上，或执行无参考变异的调用。另外的可能性是分析例如来自MetaRef的大量的参考序列，甚至所有可获得的参照，这更复杂。其中从数据库(例如，RefSeq)提取全部n个参照，并将其与新测序的细菌基因组k进行比较。在这之后，应用矩阵(定位读取％，覆盖基因组％)并且可以将数据与数个参考序列进行比较。在这种情况下，进行n×k个完全比对。有大量的参照，可以获得稳定的结果。

在本方法中，可以用已知的方法，例如通过重新组装或者定位组装，根据某些方案来至少部分组装第一数据集的基因序列。未特别限定序列组装，并且可以使用任何已知的基因组组装程序，例如基于Sanger、454、Solexa、Illumina、SOLid技术等，及其杂交物/混合物。

根据某些实施方案，可在鉴定目标核酸之后，移出与目标微生物(例如细菌微生物)不同来源的核酸的数据，例如通过过滤数据。此类数据可以，例如包含患者的核酸，所述患者为例如脊椎动物(如人类)和/或其它微生物等。这可以通过例如Meyerson等人2002年开发的计算减法完成。为此，与脊椎动物等的基因组进行比对也是可能的。对于比对，数种比对工具都是可用的。以这种方式可以大幅降低来自样品的原始数据量。

在此类“过量”数据移出之后，如上所述，可以对微生物(例如细菌微生物)进行获得第三数据集。

使用这些技术，可以获得不同物种的目标微生物(例如细菌微生物)的基因组(例如基因序列)中的结构变异。

当如下所述，例如在吸收有抗微生物药物如抗生素的板上利用标准培养方法，测试这些相同物种对多种抗微生物药物如抗生素的抗微生物药物如抗生素的敏感性时，可将这些抗微生物药物如抗生素敏感性测试的结果与各自微生物的基因组中的结构变异相互参考/关联。利用一些，例如50或超过50、100或超过100、200或超过200、400或超过400、800或超过800或者900或超过900种相同或不同的微生物物种的不同分离株，可以利用已知方法，对获得的这些微生物的遗传变异与抗微生物药物(例如抗生素)的敏感性之间的相互参考数据进行统计学分析。

关于培养方法，可将微生物样品例如培养过夜。在第二天，可以通过培养或者利用质谱法将各个克隆用于微生物鉴定。基于微生物的身份，接种至含有增加浓度的用于处理这些生物体的药物的新平板，并另外生长12-24小时。可以使用抑制生长的最低药物浓度(最小抑菌浓度-MIC)确定所测试的抗生素的敏感性/抗性。

而且，可以通过确定例如在不同分离株中已知的抗性基因进行抗性测试，如在甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)和甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)的情况下。为了分别确定抗性、敏感性，可以使用来自培养方法的数据和/或来自确定的已知抗性基因的数据，以及以不同方式如基于质谱(可能还与培养有关)获得的数据。

可以常规方法进行遗传变异与抗微生物药物如抗生素的抗性的关联，并且没有特别的限制。例如，抗性可以被关联到相应微生物的全基因组或仅其部分(例如仅基因组的编码部分)中的结构变异。在某些情况下，甚至可以只确定基因中(例如某些基因)的遗传变异或基因中的某些基因突变。关联后，可以进行统计分析。

根据某些实施方案，可以在对泛基因组和/或参考基因组的可能注释以及与抗性/敏感性数据关联之前，过滤第一数据集的数据。

例如，要减少类似注释的数量，可以通过以下一项或多项来过滤和聚集类似注释：

·只能保留所考虑的位于蛋白上的结构变异的注释，并丢弃进一步的数据。

·只能保留不包含“假设蛋白”的注释。

·可以通过识别号码(ID)和基因产物对注释进行分类。

·对于唯一的一对ID和基因产物，只能保留第一个注释，例如在基因组中有多个基因的情况下。

另外，根据某些实施方案，可以排除以下结构变异：

1.可以移出恒定的特征和表型(相同值或仅NA)(例如存在于所有样品或表型中的质心，结果对于所有样品“有抗性”)。

2.也可以移出几乎不变的特征和表型，例如可以移出忽略NA的值，其最常见值是在≥95％的所有样品中的特征(例如质心存在于≥95％的所有样品中)。

也可以移出忽略NA值，其最常见值是在≥90％的所有样品中的表型(例如≥90％的所有样品是抗性的)。

3.另外，如在对于革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌(实例中的革兰氏阴性细菌没有部分缺失的表型数据)的本发明的实例中的情况，仅保留对于至少10％的样品的没有缺失数据的药物。

对于统计分析，如在实例中，例如可以将费舍尔精确双侧检验与随后的p值调整一起应用于所有表型，同时使用FDR和0.01(1e-2)的p值阈值。另外，可以通过分别置换各个表型并将费舍尔精确检验应用于质心存在矩阵(matrix)和置换表型来执行10个置换检验。然后可以通过质心注释进一步过滤结果，即

1.可以移出没有基因产物名称的质心。

2.可以移出其基因产物名称包含“假定”、“预测”或“假设”的质心。

3.如果存在具有相同基因产物名称和基因符号的质心，则只能保留第一个质心。

4.可以移出没有GeneBank登录号的质心。

根据某些实施方案，可以将结构变异注释到微生物的泛基因组中，和/或注释到微生物的一个或多个参考序列(例如质心)中。泛基因组的构建没有特别限制，可以使用已知方法完成。

然而，可以在公众可获得的数据库如在NCBI或自MetaRef中找到其它合适的参考基因组(例如在实例中使用的，但也用于其他微生物)。

基因突变与抗微生物药物如抗生素抗性之间的关联的统计学分析未被具体限定，并且可以例如用50或更多、100或更多、200或更多、300或更多、400或更多、500或更多或者600或更多的样品大小n，以及例如0.05或更小，例如0.05，优选0.01或更小的显著性水平(α-误差-水平)，根据例如数据的量，以不同的方式进行，例如利用方差分析(ANOVA)、学生t-检验或者费舍尔精确检验进行。可以获得基因组中各个结构变异和/或各个基因序列以及所测试的所有抗生素、一组抗生素或者单个抗生素的统计值。如果需要，也可以调整获得的p值用于统计误差。

为了统计学上合理的结果，应当抽取大量个体，其中n＝50、100、200、300、400、500或600，以及显著性水平(α-误差-水平)为，例如0.05或更小，例如0.05，优选0.01或更小。根据某些实施方案，对于n＝200、300、400、500或600，可以获得特别显著的结果。

为了统计学上合理的结果，应当抽取大量个体，其中n＝50或更多、100或更多、200或更多、300或更多、400或更多、500或更多或者600或更多，以及显著性水平(α-误差-水平)为，例如0.05或更小，例如0.05，优选0.01或更小。根据某些实施方案，对于n＝200或更多、300或更多、400或更多、500或更多、或者600或更多，可以获得特别显著的结果。

在对实例中的细菌物种的个体菌株进行上述过程之后，获得表1至表24中公开的数据，以获得结构变异与抗微生物药物如抗生素抗性之间的统计学最佳关联。在表中，奇数的表(例如1、3、5)代表如上所述的统计分析的前50个结果，即对于至少一种抗生素具有最佳的p值(在表中表示为最佳_pv)的结构变异，而偶数的表显示关于具有至少一种药物类别比例为1.0的p值的前50个结果，使得结构变异适用于多种药物和至少一种特定的药物类别，其中适用如下：

药物类别比＝该类别的显著的药物数/该类别的所测试的药物数

例如，如果测试了两种氟喹诺酮类药物，但只有一种具有显著的p值，则氟喹诺酮类药物的药物类别比为0.5。

表1至表24中给出的关于上述数个参考序列的基因序列遗传变异(分别具有表26a-26l中给出的SEQ ID NOs的序列，所述序列附于序列表)被证明是抗微生物药物例如抗生素抗性的有效标记。根据某些实施方案，通过本发明的方法获得表1至表24中如上所述给出具有最高p值的连续编号(“No.”)1至50的结构变异，所述结构变异至少在基因序列中和/或涉及在基因的起始坐标(在表中表示为“Start.Coord”)和终止坐标(在表中表示为“End.Coord”)之间的至少整个序列，尤其是涉及起始坐标和终止坐标之间的整个序列。

当提及第二数据集时，其中所述第二数据集例如包含分别是多种临床分离株的一组抗微生物药物(例如抗生素)抗性，在本发明的范围内，这还可以指自我学习数据库，不管何时分析新样品，均可以将该样品列入第二数据集，从而扩展该数据库。因此第二数据集不一定是静止的，并且由于自我学习，其可以通过外部输入或者通过并入新数据来扩展。但是，这不局限于本发明的第一方面，还适用于本发明提及第二数据集的其它方面，其不一定必须涉及抗微生物药物抗性。在适用的情况下，例如在第一方面，这同样适用于第一数据集。

根据第一方面的某些实施方案，不进行比对来检测所述结构变异。根据某些实施方案，将结构变异注释到微生物的泛基因组和/或注释到一个或多个参考序列中。

根据某些实施方案，利用费舍尔检验进行本发明的方法中的统计学分析，其中p<10^-3，优选地p<10^-6，更优选地p<10^-9。

根据某些实施方案，本发明第一方面的方法以及相关方法，例如根据第2、3和4方面的方法可以包括将不同的基因位点相互关联。这样，可以达到甚至更高的统计学显著性。

根据第一方面的方法以及如上所述的相关方法的某些实施方案，可以通过在提供有不同浓度的抗微生物药物(例如抗生素)的琼脂板上培养微生物的临床分离株来提供第二数据集，以及可以通过采用抑制各微生物生长的最小浓度的板来获得第二数据。

根据第一方面的方法以及相关方法的某些实施方案，微生物是革兰氏阳性细菌微生物，尤其是葡萄球菌属物种，尤其是金黄色葡萄球菌，以及抗微生物药物例如抗生素类药物选自：β-内酰胺类、β-内酰胺抑制剂类、喹啉类及其衍生物(氟喹诺酮类)、氨基糖苷类、糖肽类、林可酰胺类、大环内酯类、硝基呋喃类、恶唑烷酮聚酮类，分别地四环素类，以及叶酸合成抑制剂(例如苯衍生的抗生素/磺胺类抗生素)，优选地，其选自：阿莫西林/克拉维酸(Amoxicillin/Clavulanate)、氨苄西林(Ampicillin)、氨苄西林/舒巴坦(Ampicillin/Sulbactam)、阿奇霉素(Azithromycin)、头孢噻酚(Cefalothin)、头孢唑啉(Cefazolin)、头孢吡肟(Cefepime)、头孢噻肟(Cefotaxime)、头孢西丁(Cefoxitin)、头孢曲松(Ceftriaxone)、头孢呋辛(Cefuroxime)、氯霉素(Chloramphenicol)、环丙沙星(Ciprofloxacin)、克林霉素(Clindamycin)、达托霉素(Daptomycin)、厄他培南(Ertapenem)、红霉素(Erythromycin)、磷霉素(Fosfomycin)、夫西地酸(Fusidic acid)、庆大霉素(Gentamicin)、亚胺培南(Imipenem)、左氧氟沙星(Levofloxacin)、利奈唑胺(Linezolid)、美罗培南(Meropenem)、甲氧西林(Methicillin)、莫西沙星(Moxifloxacin)、莫匹罗星(Mupirocin)、呋喃妥因(Nitrofurantoin)、诺氟沙星(Norfloxacin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、苯唑西林(Oxacillin)、盘尼西林G(Penicillin G)、哌拉西林/他唑巴坦(Piperacillin/Tazobactam)、奎奴普丁/达福普丁(Quinupristin/Dalfopristin)、利福平(Rifampicin)、替考拉宁(Teicoplanin)、四环素(Tetracycline)、替加环素(Tigecycline)、妥布霉素(Tobramycin)、甲氧苄啶嘧啶/磺胺甲恶唑(Trimethoprim/Sulfamethoxazole)和万古霉素(Vancomycin)，更优选地选自：阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、阿奇霉素、头孢噻吩、头孢唑林、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢西丁、头孢曲松、头孢呋辛、氯霉素、环丙沙星、克林霉素、达托霉素、厄他培南、红霉素、磷霉素、夫西地酸、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、利奈唑胺、美罗培南、莫西沙星、莫匹罗星、呋喃妥因、诺氟沙星、氧氟沙星、苯唑西林、盘尼西林G、哌拉西林/他唑巴坦、奎奴普丁/达福普丁、利福平、替考拉宁、四环素、替加环素、妥布霉素、甲氧苄啶嘧啶/磺胺甲恶唑和万古霉素。

根据第一方面的方法以及相关方法的某些实施方案，所述微生物是革兰氏阴性细菌微生物，尤其是不动杆菌属、埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属和/或志贺氏菌属中的一种或多种，特别如实例中所示，并且抗微生物药物例如抗生素是选自下述中的至少一种：β-内酰胺类、β-内酰胺类抑制剂、喹啉类及其衍生物、氨基糖苷类、聚酮类、分别地四环素类以及叶酸合成抑制剂，优选地，选自：阿莫西林/克拉维酸钾(AUG)、氨苄西林(AM)、氨曲南(AZT)、头孢唑啉(CFZ)、头孢吡肟(CPM)、头孢噻肟(CFT)、头孢他啶(CAZ)、头孢曲松(CAX)、头孢呋辛(CRM)、头孢噻吩(CF)、环丙沙星(CP)、厄他培南(ETP)、庆大霉素(GM)、亚胺培南(IMP)、左氧氟沙星(LVX)、美罗培南(MER)、哌拉西林/他唑巴坦(P/T)、氨苄西林/舒巴坦(A/S)、四环素(TE)、妥布霉素(TO)和甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲恶唑(T/S)。

根据某些实施方案，通过本发明的方法获得在表1至表24中如上所述给出具有最高p值的连续数字(“编号”)1至50的结构变异(分别具有表26a-26l中给出的SEQ ID NOs的序列，所述序列附于序列表)，所述结构变异至少在基因序列中和/或涉及在基因的起始坐标(在表中表示为“Start.Coord”)和终止坐标(在表中表示为“End.Coord”)之间的至少整个序列，尤其是涉及起始坐标和终止坐标之间的整个序列，并且抗生素是选自指定为“显著_表型_类别”列中的抗生素类别中的至少一种，尤其是指定为“最佳_表型_类别”列中的抗生素类型，优选地，其中抗生素是选自指定为“显著_表型”列中的那些抗生素中的至少一种，尤其是指定为“最佳_表型”列中的那种抗生素。

用这种方法，可以确定与抗微生物药物例如抗生素抗性关联的微生物例如在上下文的实例中给出的细菌物种(例如，微生物尤其是细菌微生物的未知种类的临床分离株)基因组中的任何突变。可以建立完整的抗微生物药物如抗生素抗性谱，其可以将信息添加到仅考虑单碱基变化(例如，单核苷酸多态性(SNP))的谱。

此外，在此，可以如本发明第一方面所述，实施不同的步骤。

根据这一方面，可以使用测序方法确定患者感染微生物尤其是细菌微生物，以及与常规方法相比，可以在短时间内确定微生物的抗微生物药物如抗生素的抗性。

根据某些方面，确定在至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个基因序列中的结构变异。这种方法甚至可以实现更高的统计显著性。

b)如通过第一方面所述的方法确定的，确定微生物尤其是细菌微生物的至少一个基因序列中至少一个结构变异的存在，其中存在至少一个结构变异表明对一种或多种抗微生物药物的抗性；

c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物；以及

可以与本发明第二方面类似地实施这一方法，并且使得可以为任何未知的微生物尤其是细菌微生物(例如，金黄色葡萄球菌)感染快速选择合适的抗生素治疗。

在这一方法以及类似方法中，不需要进行比对，因为未知样品可以在基因组或基因组序列产生后直接与第二数据集关联，并因此可以确定遗传变异和抗微生物药例如抗生素抗性。例如，可以使用已知技术来组装第一数据集。

根据某些实施方案，利用费舍尔检验进行本发明的方法中的统计学分析，其中p<10^-3，优选地p<10^-6，优选地p<10^-9。而且，根据某些实施方案，该方法还包括使不同遗传位点彼此关联。

本发明的第四方面涉及确定微生物尤其是细菌微生物的临床分离株的微生物基因组结构变异的方法，其包括：

获得或提供微生物尤其是细菌微生物的临床分离株的至少一个基因序列；以及

如通过第一方面方法确定的，确定微生物尤其是细菌微生物的临床分离株的至少一个基因序列中结构变异的存在。

利用这一方法，可以确定微生物(例如金黄色葡萄球菌)未知分离株的抗微生物药物(例如抗生素)抗性。

在图1中示意性地显示了在这个方面中所述的用于诊断检测的简单读出概念。

根据图1，例如使用下一代测序(NGS)将样品1(如来自患者的血液)用于分子测试2，然后进行分子指纹分析3(例如在NGS的情况下)，组装所选择的基因组/质粒区域的序列或者全基因组。然后，将其与包含数个参考序列和/或泛基因组的参考文库4进行比较，即将所选序列或整个序列与一个或多个参考序列和/或泛基因组进行比较，并将结构变异(序列/基因的添加/缺失等)与参考文库的参考序列敏感性谱/抗性谱关联。本文的参考文库4包含许多基因组和/或泛基因组，并且不同于参考基因组。然后报告结果5，其可以包括ID(病原体鉴定)，即样品中鉴定的所有(致病的)物种的列表，以及AST(抗微生物敏感性测试)，即包括基于结构变异的所列出的所有物种的敏感性/抗性谱的列表。

根据某些实施方案，利用费舍尔检验进行本发明的方法中的统计学分析，其中p<10^-3，优选地p<10^-6，优选地p<10^-9。此外，根据某些实施方案，方法还包括使不同遗传位点彼此关联。

此外，在第三和第四方面中，可以如本发明的第一方面所述实施不同步骤。

在本发明第五方面涉及一种或多种计算机程序产品，其包含计算机可执行的指令，所述指令被执行时实施本发明的第一方面至第四方面中任一项方法。

在某些实施方案中，计算机程序产品是存储用于执行所述方法的计算机程序的程序命令或程序代码的计算机程序产品。根据某些实施方案，计算机程序产品是存储介质。如上所示，本发明的计算机程序产品可以自我学习，例如，对于第一和第二数据集而言。

为了从高度复杂的遗传数据中获得最可能的信息并开发用于诊断和治疗用途以及本发明方法的可稳定适用于临床常规过程的最优模型，全面的计算机模拟分析可能是必要的。所提出的原则是基于不同方法的组合，例如组装微生物的基因序列和/或基因组，至少部分地并任选地将序列注释至一个或多个参考序列和/或泛基因组，和/或用一个或多个参考序列和/或泛基因组确定临床分离株的序列数据的比对，以及将各个样品(例如，来自各个患者)(分别地未知的临床分离株)中所发现的结构变异与所有参照和药物(例如抗生素)或它们中的仅一个或一些相关联，以及寻找一种或数种药物和一种或数种菌株中发生的结构变异。

利用以上步骤，产生了一系列涉及一个或多个参考序列和/或泛基因组的结构变异。这些可储存在数据库中，并且统计模型可以源自所述数据库。统计模型可以基于至少一种或多种序列中的至少一个或多个结构变异。可以自结构变异和序列组合成可训练的统计模型。可以产生此类模型的算法的实例是关联规则、支持向量机(Support VectorMachines)、决策树、决策森林、判别分析、聚类方法(Cluster-Method)以及更多算法。

训练的目标是在常规程序期间允许可再现的、标准化的应用。

为此，例如，可将来自待诊断患者的基因序列或者其部分进行测序。然后，可从序列数据得到核心特征，其可用于预测抗性。这些是用于最终模型的数据库中的点，即至少一个结构变异，以及突变的组合等。

可将对应的特征用作统计模型的输入，从而使得能够进行新患者的预后。可将关于所有微生物针对所有药物或仅一些药物或一种药物(例如抗生素)的所有抗性的信息整合进计算机决策支持工具中，还可将对应的指令(例如EUCAST)整合进计算机决策支持工具中，以便仅给出与指令一致的治疗建议。

本发明的第八方面涉及根据第五方面的计算机程序产品的用途，例如，用于确定本发明第四方面的微生物临床分离株的微生物基因组结构变异和/或用于本发明第二方法的诊断方法和/或用于选择本发明的第三方面的治疗和/或本发明的第一方面的方法。

本发明的第六方面公开了确定患者感染对抗微生物药物例如抗生素治疗可能具有抗性的微生物的诊断方法，所述微生物优选细菌微生物，尤其是如上所述的一种细菌微生物(即，不动杆菌属、埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和/或葡萄球菌属中的一种或多种)，所述诊断方法包括以下步骤：

a)获得或提供来自患者的包含或疑似包含至少一种微生物的样品，所述微生物优选细菌微生物，尤其是如上所述的一种细菌微生物(即，不动杆菌属、埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和/或葡萄球菌属中的一种或多种)；

b)确定就参考序列(尤其是质心(表示为“支架.外部.登录号”))而言，来自编号1-50所注释的序列的至少两个序列中至少一个结构变异的存在，所述编号1-50所注释的序列具有表1至表24中给出的序列名称(尤其是质心名称(表示为“支架.名称”))，尤其具有表1a至表24a中给出的参考基因组和基因组名称，并且分别具有表26a-26l中给出的SEQ ID NOs的序列(其附于序列表)，其中存在所述至少两个结构变异表示所述患者感染具有抗微生物药物例如抗生素抗性的微生物(即，不动杆菌属、埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和/或葡萄球菌属中的一种或多种)。

如上所述，就如上所述的数个参考序列而言，表1至表24中给出的基因序列中的遗传变异尤其是结构变异，分别具有表26a-26l中给出的SEQ ID NOs的序列，所述序列附于序列表，尤其具有表26a、表26b、表26c、表26d、表26e、表26f、表26g、表26h、表26i、表26j、表26k或表261中给出的SEQ ID NO的序列，所述遗传变异被证明是抗微生物药物例如抗生素抗性的有效标志物。根据某些实施方案，通过本发明的方法获得结构变异，所述结构变异在如上所述的表1至表24中具有最高p值的连续编号(“No.”)1至50所给出的至少基因序列中和/或与所述基因的起始坐标(在表中表示为“起始坐标”)和终止坐标(在表中表示为“终止坐标”)之间的至少整个序列有关，尤其与所述起始坐标和所述终止坐标之间的整个序列有关，分别具有附于序列表的表26a至表26l中给出的SEQ ID NOs的序列，尤其具有表26a、表26b、表26c、表26d、表26e、表26f、表26g、表26h、表26i、表26j、表26k或表261中给出的SEQID NO的序列。

根据某些实施方案，通过本发明的方法获得结构变异，所述结构变异在如上所述的表1至表24中具有最高p值的连续编号(“No.”)1至50所给出的至少基因序列中和/或与所述基因的起始坐标(在表中表示为“起始坐标”)和终止坐标(在表中表示为“终止坐标”)之间的至少整个序列有关，尤其与所述起始坐标和所述终止坐标之间的整个序列有关，分别具有附于序列表的表26a至表26l中给出的SEQ ID NOs的序列，尤其具有表26a、表26b、表26c、表26d、表26e、表26f、表26g、表26h、表26i、表26j、表26k或表261中给出的SEQ ID NO的序列，并且抗生素是选自指定为“显著_表型_类别”列中的抗生素类别中的至少一种，尤其是指定为“最佳_表型_类别”列中的一种，优选地，其中抗生素是选自指定为“显著_表型”列中的那些中的至少一种，尤其是指定为“最佳_表型”列中的一种。

本文中患者感染对抗微生物药物治疗可能具有抗性的微生物，优选细菌微生物，尤其是如上所述的一种(即，不动杆菌属、埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和/或葡萄球菌属中的一种或多种)是指患者感染微生物，优选细菌微生物，尤其是如上所述的一种(即，不动杆菌属、埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和/或葡萄球菌属中的一种或多种)，其中不清楚是否微生物，优选细菌微生物，尤其是如上所述的一种(即，不动杆菌属、埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和/或葡萄球菌属中的一种或多种)对特定抗微生物药物治疗敏感或者不清楚是否其对抗微生物药物具有抗性。

在上述步骤b)以及相应的步骤中，确定至少两个位置中的至少一种结构变化，从而总共确定至少两个结构变化，其中两个结构变化在不同位置中，分别是不同序列。

在该方法以及本发明的其他方法中，可以以任何方式，优选非侵入性方式，提供或获得样品，并且可以是作为体外样品提供或制备成体外样品。

根据某些方面，在本发明的任何方法中，确定在至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个位置(分别的序列)中的结构变异，例如，在至少两个位置(分别的序列)中，或者在至少三个位置(分别的序列)中。并非仅测试单个位置(分别的序列)，数个变异位置(分别的序列)的组合可以提高精度并进一步减少受其他因素影响的假阳性结果。因此，特别优选确定在选自相应表1至表24的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个(或更多个)序列中的结构变异的存在，所述序列分别是具有附于序列表中的表26a至表26l中给出的SEQ ID NOs的序列，尤其是具有表26a、表26b、表26c、表26d、表26e、表26f、表26g、表26h、表26i、表26j、表26k或表261中给出的SEQ ID NO的序列。

根据某些方面，在该方法以及本发明的其他方法中，获得或提供来自患者的包含或疑似包含至少一种微生物，优选细菌微生物，尤其是如上所述的一种(即，不动杆菌属、埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和/或葡萄球菌属中的一种或多种)，可以包括下述：

例如，提供或获得脊椎动物(例如人类)的样品，以及通过未特别限定的记录核酸的已知方法来记录核酸序列(例如DNA或RNA序列)。例如，可以通过测序方法记录核酸，其中任何测序方法均适合，尤其是这样的测序方法：可在短时间内对大批样品成分(如血液样品成分)中包含的核酸和/或核酸片段和/或其部分进行分析，这包括微生物的核酸和/或核酸片段和/或其部分。例如，可以利用聚合酶链式反应(PCR)，特别是多重PCR或高通量测序或下一代测序，优选利用高通量测序进行测序。对于测序，优选使用体外样品。

通过测序获得的数据可以是任何形式，然后可以如本发明的第一至第四方面所述进行分析。

在第七方面，本发明涉及选择对感染了可能具有抗性的微生物，优选细菌微生物，尤其是如上所述的一种(即，不动杆菌属、埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和/或葡萄球菌属中的一种或多种)的患者的治疗的方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自患者的包含或者疑似包含微生物，优选细菌微生物，尤其是如上所述的一种(即，不动杆菌属、埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和/或葡萄球菌属中的一种或多种)的样品；

b)确定就参考序列(尤其是质心(表示为“支架.外部.登录号”))而言，来自编号1-50所注释的序列的至少两个序列中至少一个结构变异的存在，其中存在所述至少两个结构变异表示对一种或多种抗微生物药物例如抗生素药物的抗性，所述编号1-50所注释的序列具有表1至表24中给出的序列名称(尤其是质心名称(表示为“支架.名称”))，尤其具有表1a至表24a中给出的参考基因组和基因组名称，并且分别具有表26a-26l中给出的SEQ ID NOs的序列(其附于序列表)，尤其具有表26a、表26b、表26c、表26d、表26e、表26f、表26g、表26h、表26i、表26j、表26k或表26l中给出的SEQ ID NO的序列；

c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物例如抗生素药物；以及

d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于治疗微生物，优选细菌微生物，尤其是如上所述的一种(即，不动杆菌属、埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和/或葡萄球菌属中的一种或多种)感染的一种或多种抗微生物药物例如抗生素药物。

在该方法中，步骤a)获得或提供样品以及步骤b)确定至少一种结构变异的存在与第六方面的方法相同。

然后步骤c)中至少一种或多种抗微生物药物例如抗生素的鉴定基于步骤b)中获得的结果，并且对应于与结构变异相关的抗微生物药物例如抗生素药物。一旦排除了这些抗微生物药物例如抗生素，其余的抗微生物药物(例如抗生素类药物/抗生素类)可以在步骤d)中选择为适于治疗的药物。

在说明书中，第六和第七方面的参考也适用于第九、第十、第十一和第十二方面，是指相同位置(分别的序列)，除非从上下文中清楚地看出它们不适用。

根据某些实施方案，微生物是革兰氏阳性细菌微生物，尤其是葡萄球菌属物种，尤其是金黄色葡萄球菌，以及抗微生物药物例如抗生素类药物选自：β-内酰胺类、β-内酰胺抑制剂类、喹啉类及其衍生物(氟喹诺酮类)、氨基糖苷类、糖肽类、林可酰胺类、大环内酯类、硝基呋喃类、恶唑烷酮聚酮类，分别地四环素类，以及叶酸合成抑制剂(例如苯衍生的抗生素/磺胺类抗生素)，优选地，其选自：阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、阿奇霉素、头孢噻酚、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢西丁、头孢曲松、头孢呋辛、氯霉素、环丙沙星、克林霉素、达托霉素、厄他培南、红霉素、磷霉素、夫西地酸、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、利奈唑胺、美罗培南、甲氧西林、莫西沙星、莫匹罗星、呋喃妥因、诺氟沙星、氧氟沙星、苯唑西林、盘尼西林G、哌拉西林/他唑巴坦、奎奴普丁/达福普丁、利福平、替考拉宁、四环素、替加环素、妥布霉素、甲氧苄啶嘧啶/磺胺甲恶唑和万古霉素，更优选地，其选自：阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、阿奇霉素、头孢噻吩、头孢唑林、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢西丁、头孢曲松、头孢呋辛、氯霉素、环丙沙星、克林霉素、达托霉素、厄他培南、红霉素、磷霉素、夫西地酸、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、利奈唑胺、美罗培南、莫西沙星、莫匹罗星、呋喃妥因、诺氟沙星、氧氟沙星、苯唑西林、盘尼西林G、哌拉西林/他唑巴坦、奎奴普丁/达福普丁、利福平、替考拉宁、四环素、替加环素、妥布霉素、甲氧苄啶嘧啶/磺胺甲恶唑和万古霉素。

根据某些实施方案，微生物是革兰氏阴性细菌微生物，尤其是不动杆菌属、埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属和/或志贺氏菌属中的一种或多种，尤其如实例中所示，以及抗微生物药物例如抗生素是选自β-内酰胺类、β-内酰胺抑制剂类、喹啉类及其衍生物、氨基糖苷、聚酮类(分别地为四环素类)以及叶酸合成抑制剂，优选地，其选自：阿莫西林/克拉维酸钾(AUG)、氨苄西林(AM)、氨曲南(AZT)、头孢唑啉(CFZ)、头孢吡肟(CPM)、头孢噻肟(CFT)、头孢他啶(CAZ)、头孢曲松(CAX)、头孢呋辛(CRM)、头孢噻吩(CF)、环丙沙星(CP)、厄他培南(ETP)、庆大霉素(GM)、亚胺培南(IMP)、左氧氟沙星(LVX)、美罗培南(MER)、哌拉西林/他唑巴坦(P/T)、氨苄西林/舒巴坦(A/S)、四环素(TE)、妥布霉素(TO)和甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲恶唑(T/S)。

在本发明的方法中，根据某些实施方案，可以确定微生物，优选细菌微生物，尤其是如上所述的一种(即，不动杆菌属、埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和/或葡萄球菌属中的一种或多种)对一种或多种抗微生物药物例如抗生素药物的抗性。

根据本发明的第六和/或第七方面的某些实施方案，可以确定微生物，优选细菌微生物，尤其是如上所述的一种(即，不动杆菌属、埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和/或葡萄球菌属中的一种或多种)对1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种或16种、17种、18种、19种、20种或更多种抗生素药物的抗性。

根据本发明第六和/或第七方面的某些实施方案，确定具有结构变异或存在结构变异的序列的核酸序列信息包括使用下一代测序或高通量测序方法。根据本发明第六和/或第七方面的优选实施方案，通过利用下一代测序或高通量测序方法测定微生物，优选细菌微生物，尤其是如上所述的一种(即，不动杆菌属、埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和/或葡萄球菌属中的一种或多种)的部分或全部基因组序列。

本发明的第九方面涉及治疗感染具有抗微生物药物例如抗生素抗性的微生物，优选细菌微生物，尤其是如上所述的一种(即，不动杆菌属、埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和/或葡萄球菌属中的一种或多种)患者的方法，其包括下述步骤：

d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物并且适用于治疗微生物，优选细菌微生物，尤其是如上所述的一种(即，不动杆菌属、埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和/或葡萄球菌属中的一种或多种)感染的一种或多种抗微生物药物例如抗生素药物；以及

e)用所述一种或多种抗微生物药物例如抗生素药物治疗患者。

在文中，可以如第七方面所述实施步骤a)至步骤d)。步骤e)可以充分实施而不受限制，并且可以例如非侵入性地实施。

本发明的第十方面公开患者感染对抗微生物药物治疗可能具有抗性的微生物，优选细菌微生物，尤其是如上所述的一种(即，不动杆菌属、埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和/或葡萄球菌属中的一种或多种)的诊断方法，其包括以下步骤：

b)确定就参考序列(尤其是质心(表示为“支架.外部.登录号”))而言，来自编号1-50所注释的序列的至少一个序列中至少一个结构变异的存在，所述编号1-50所注释的序列具有表1至表24中给出的序列名称(尤其是质心名称(表示为“支架.名称”))，尤其具有表1a至表24a中给出的参考基因组和基因组名称，并且分别具有表26a-26l中给出的SEQ ID NOs的序列(其附于序列表)，尤其具有表26a、表26b、表26c、表26d、表26e、表26f、表26g、表26h、表26i、表26j、表26k或表26l中给出的SEQ ID NO的序列，其中存在所述至少一个结构变异表示所述患者感染对抗微生物药物例如抗生素具有抗性的微生物，优选细菌微生物，尤其是如上所述的一种(即，不动杆菌属、埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和/或葡萄球菌属中的一种或多种)。

在第十一方面，本发明涉及选择对感染了可能具有抗性的微生物，优选细菌微生物，尤其是如上所述的一种(即，不动杆菌属、埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和/或葡萄球菌属中的一种或多种)的患者的治疗的方法，其包括下述步骤：

b)确定就参考序列(尤其是质心(表示为“支架.外部.登录号”))而言，来自编号1-50所注释的序列的至少一个序列中至少一个结构变异的存在，所述编号1-50所注释的序列具有表1至表24中给出的序列名称(尤其是质心名称(表示为“支架.名称”))，尤其具有表1a至表24a中给出的参考基因组和基因组名称，并且分别具有表26a-26l中给出的SEQ ID NOs的序列(其附于序列表)，尤其具有表26a、表26b、表26c、表26d、表26e、表26f、表26g、表26h、表26i、表26j、表26k或表26l中给出的SEQ ID NO的序列，其中存在所述至少一个结构变异表示对一种或多种抗微生物药物例如抗生素药物的抗性；

此外，在第十和第十一方面中的步骤对应于第六或第七方面中的步骤，尽管仅确定至少一个基因中的突变。

本发明的第十二方面涉及治疗感染了具有抗微生物药物例如抗生素抗性的微生物，优选细菌微生物，尤其是如上所述的一种(即，不动杆菌属、埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属和/或葡萄球菌属中的一种或多种)的患者的方法，所述方法包括以下步骤：

同样在本发明的第十二方面中，步骤a)至步骤d)类似于本发明第九方面的方法中的步骤。步骤e)可以再次充分实施而不受限制，并且可以例如非侵入性地实施。

在第六、第七、第九、第十、第十一和第十二方面，尤其是至少1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种结构变异被确定为具有表26a、表26b、表26c、表26d、表26e、表26f、表26g、表26h、表26i、表26j、表26k或表26l中给出的SEQ ID NOs的序列，尤其是具有表26a中给出的不动杆菌属尤其是鲍曼不动杆菌(A.baumannii)的SEQ ID NOs的序列、具有表26b中给出的肠杆菌属尤其是产气肠杆菌(E.aerogenes)的SEQ ID NOs的序列、具有表26c中给出的肠杆菌属尤其是阴沟肠杆菌(E.cloacae)的SEQ ID NOs的序列、具有表26d中给出的埃希氏杆菌属尤其是大肠杆菌的SEQ ID NOs的序列、具有表26e中给出的克雷伯菌属尤其是产酸克雷伯菌(K.oxytoca)的SEQ ID NOs的序列、具有表26f中给出的克雷伯菌属尤其是克雷伯氏肺炎菌(K.pneumoniae)的SEQ ID NOs的序列、具有表26g中给出的变形杆菌属的SEQ ID NOs的序列、具有表26h给出的假单胞菌属尤其是铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的SEQ ID NOs的序列、具有表26i给出的沙门氏菌属的SEQ ID NOs的序列、具有表26j给出的沙雷氏菌属尤其是粘质沙雷氏菌(S.marcescens)的SEQ ID NOs的序列、具有表26k给出的志贺菌属的SEQ ID NOs的序列或者具有表26l给出的葡萄球菌属尤其是金黄色葡萄球菌(S.aureus)的SEQ ID NOs的序列。

实施例

现在将参考本发明的一些实施例详细描述本发明。但是这些实施例是说明性的，并且不限制本发明的范围。

实施例1：不动杆菌属尤其是鲍曼不动杆菌

除了经典的抗微生物剂敏感性测试之外，还对一组448个样品的相同分离株进行全基因组测序。这允许进行全基因组相关性研究，以找到与针对一种或数种药物的抗性显著相关的基因组和质粒中的基因变体(例如，点突变、小的插入和缺失、较大的结构变体、质粒拷贝数增加、基因剂量效应)。该方法还允许将基因组中的相关位点相互比较。

在该方法中，涵盖了涉及结构变异的遗传抗性的不同来源以及细菌变得具有抗性的不同方式。通过测量在广泛的地理区域内并经过三十年的宽时间跨度收集的临床分离株，试图产生远超出实验室产生的抗性机制的人工步骤的全貌。

为此，将一组具有5种不同作用模式的21种临床相关抗微生物剂放在一起，并测量21种药物对不动杆菌属分离株的最小抑制浓度(MIC)。

以下给出了详细步骤：

细菌菌株

发明人从Siemens Healthcare Diagnostics(West Sacramento,CA)的微生物菌株保藏中心选择了448种不动杆菌属菌株用于敏感性测试和全基因组测序。

抗微生物剂敏感性测试(AST)板

按照临床实验室标准协会(CLSI)的建议准备冷冻参考AST板。板中包含下述抗微生物剂(其中括号内显示μg/ml浓度)：阿莫西林/克拉维酸钾(0.5/0.25-64/32)、氨苄西林(0.25-128)、氨苄西林/舒巴坦(0.5/0.25-64/32)、氨曲南(0.25-64)、头孢唑林(0.5-32)、头孢吡肟(0.25-64)、头孢噻肟(0.25-128)、头孢他啶(0.25-64)、头孢曲松(0.25-128)、头孢呋辛(1-64)、头孢噻吩(1-64)、环丙沙星(0.015-8)、厄他培南(0.12-32)、庆大霉素(0.12-32)、亚胺培南(0.25-32)、左氧氟沙星(0.25-16)、美罗培南(0.12-32)、哌拉西林/他唑巴坦(0.25/4-256/4)、四环素(0.5-64)、妥布霉素(0.12-32)以及甲氧苄啶/磺胺甲恶唑(0.25/4.7-32/608)。在使用临床分离株之前，用QC菌株对AST板进行测试。当QC结果符合CLSI16所述的QC范围时，认为AST板对于用临床分离株进行的测试是可接受的。

接种物制备

在含有5％羊血(BBL,Cockeysville,Md.)的胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂上培养分离株，并将其在35±1℃的环境空气中培养18-24h。将分离的克隆(4-5个大克隆或者5-10个小克隆)转移至3ml无菌接种水(Siemens)中，并乳化至0.5McFarland标准的最终浊度。向含有普朗尼克-F的25ml接种水(Siemens)中添加2ml的该悬液。利用特别用于冷冻AST板的培养箱(Siemens)，将5μl的细胞悬液转移至AST板的各个孔中。将接种的AST板在35±1℃的环境空气中孵育16-20h。板的结果可以目测读取，以及确定最小抑菌浓度(MIC)。

DNA提取

在含有5％羊血的胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂上培养各个革兰氏阴性细菌分离株的四条划线，以及在含有50μl不含核酸酶的水(AM9930,Life Technologies)的1.5ml无菌收集管中制备细胞悬液。将细菌分离株样品在-20℃下保存直至核酸提取。使用组织制备系统(TPS)(096D0382-02_01_B,Siemens)和组织制备试剂(TPR)试剂盒(10632404B,Siemens)从这些细菌分离株中提取DNA。在提取之前，将细菌分离株在室温解冻，并在2000G下沉淀5秒。在4小时内，将DNA提取方案DNAext用于48种分离株样品的完全的总核酸提取以及各自50μl的洗脱物。然后将总核酸洗脱物转移至96孔qPCR检测板(401341,Agilent Technologies)内，用于RNA酶A消化、DNA定量以及板DNA浓度标准化过程。向50μl的总核酸洗脱物中添加根据制造商的说明书稀释于不含核酸酶的水中的RNA酶A(AM2271,Life Technologies)，最终工作浓度为20ug/ml。利用Siemens 扩增和检测设备将消化酶和洗脱物的混合物在37℃孵育30分钟。利用Quant-iT^TMPicoGreen dsDNA Assay(P11496,Life Technologies)，根据分析试剂盒的说明书定量来自RNA酶消化的洗脱物的DNA，以及在Siemens 扩增和检测设备上确定荧光。利用Excel2007进行数据分析。在文库制备之前，将25μl定量的DNA洗脱物转移至新的96孔PCR板中用于板DNA浓度标准化。使用来自TPR试剂盒的洗脱缓冲液调整DNA浓度。然后将标准化的DNA洗脱物板在-80℃保存直至文库制备。

下一代测序

在文库制备之前，利用Qubit 2.0荧光计(Qubit dsDNA BR Assay Kit,LifeTechnologies)和Agilent 2200磁带机(Genomic DNA ScreenTape,AgilentTechnologies)对分离的细菌DNA进行质量控制。根据制造商的说明书，利用NexteraXT DNA样品制备试剂盒和96Indexes的NexteraXT Index试剂盒(Illumina)，制备96孔形式的NGS文库。利用KAPA SYBR FAST qPCR MasterMix试剂盒(Peqlab)在ViiA 7实时PCR系统(LifeTechnologies)上，在基于qPCR的方法中定量所得到的测序文库。利用TruSeq PE Clusterv3和TruSeq SBS v3测序化学(Illumina)，在Illumina Hiseq2000或Hiseq2500测序仪上，每道混合96个样品用于配对末端测序(2x 100bp)。利用高通量测序数据的FastQC质量控制工具(Babraham Bioinformatics Institute)确定基础的测序质量参数。

数据分析

对于实施例中的每个生物体，从MetaRef(http://metaref.org/)中提取质心列表。本文中，质心是在组/家族/簇中的基因等的代表。从数据库IMG(http://img.jgi.doe.gov/)中提取关于质心的信息/注释数据。

对于不动杆菌，将从MetaRef中提取的1380种鲍曼不动杆菌的质心用作参考序列。

如下评估样品中质心的存在：

使用BLASTn(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)将质心序列与重新组装体进行比对。

使用以下参数：

■BLAST db类型：“fasta”和“nucl”

■文字大小：11(默认)

■缺口：3(默认5)

■缺口延伸：2(默认)

■罚分：-2(默认-3)

■奖分：1(默认)

如果比对结果至少包含具有下述的至少一个命中，则认为质心存在。

ο组装序列和质心序列最少80％的同一性

ο比对最少80％的质心序列，计算为

在结果中，质心被编码为0/1(不存在/存在)

相关测试和结果过滤：

如下进一步过滤输入数据以减少数据量：

1.移出不变的特征和表型(相同的值或仅NA)(例如存在于所有样品或对于所有样品有“抗性”表型中的质心)

2.移出几乎不变的特征和表型

ο移出忽略NA值，其最常见值是在所有样品的≥95％中的特征(例如质心存在于所有样品的≥95％中)

ο移出忽略NA值，其最常见值是在所有样品的≥90％中的表型(例如所有样品的≥95％是具有抗性的)

3.尤其是对于实施例12中的金黄色葡萄球菌，只保留了对于至少10％的样品的具有非缺失数据的药物。

对于统计分析，可以将费舍尔精确双侧检验与随后的p值调整一起应用于所有表型，同时使用FDR和0.01(1e-2)的p值阈值。另外，可以通过分别置换每种表型并将费舍尔精确检验应用于质心存在矩阵(matrix)和置换表型来进行10个置换检验。然后可以通过质心注释进一步过滤结果，即

1.移出没有基因产物名称的质心。

2.移出其基因产物名称包含“假定”、“预测”或“假设”的质心。

4.移出没有基因Bank登录号的质心。

在进行上述过程之后，获得表1和表2中公开的数据，以获得结构变异与抗微生物药物例如抗生素抗性之间的统计学最佳关联。表1(以及实施例2至实施例12中的奇数表3、表5、表7、表9、表11、表13、表15、表17、表19、表21和表23)代表对于至少一种抗生素具有最佳p值的结构变异的前50个结果(在表中表示为最佳_pv)，而表2(以及实施例2至实施例12中的偶数表4、表6、表8、表10、表12、表14、表16、表18、表20、表22和表24)显示了关于具有至少一个药物类别比例为1.0的p值的前50个结果，使得结构变异适用于多种药物和至少一种特定的药物类别，其中适用如下：

在实施例2至实施例12中，表1和2以及随后的表3至表24，指定列如下：

ο编号(No.)：对应最佳的p值的从1至50的连续编号，

ο最佳_表型：具有最小调整的(adj.)p值的表型(药物)

ο最佳_表型_类别：最佳药物的药物类别

最佳_pv：利用费舍尔精确检验计算的最佳表型并通过FDR(Benjamini Hochberg)方法(Benjamini Hochberg，1995)进行调整的p值

ο显著_表型：由“；”隔开的具有显著的调整的p值的所有表型的名称

ο显著_表型_类别：所有显著的药物的药物类别

ο<药物类别>数：药物类别的显著的药物的数量

ο<表型>_pv_adj：已调整的利用费舍尔精确检验计算的表型并通过FDR(Benjamini Hochberg)方法(Benjamini Hochberg，1995)进行调整的p值

ο质心(基因)注释：

■基因座标签(Locus.Tag)：基因组中的基因座

■基因符号(Gene.Symbol)：基因符号

■GeneBank登录号：基因的GeneBank ID

■染色体：如果基因位于质粒上，则此列包含质粒名称

■起始坐标/终止坐标：基因的起始坐标和终止坐标

■链：“+”表示正向链，“-”表示反向链

■支架ID：(IMG)包含基因的支架的ID

■支架.外部.登录号：非IMG ID，例如，如在NCBI、RefSeq ID注释的

■支架.名称：基因组名称和支架外部登录号ID

实施例2和实施例3：肠杆菌属尤其是产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)

除了使用如下微生物之外，如实施例1进行步骤。

细菌菌株

本发明人从Siemens Healthcare Diagnostics(West Sacramento,CA)的微生物菌株保藏中心选择了695种肠杆菌菌株，尤其是298种产气肠杆菌和397种阴沟肠杆菌用于敏感性测试和全基因组测序。

从MetaRef中，将产气肠杆菌的5220个质心用作产气肠杆菌的参考序列，阴沟肠杆菌的4734个质心用作阴沟肠杆菌的参考序列。

表3(对应于表1)和表4(对应于表2)显示产气肠杆菌的结果，表5(对应于表1)和表6(对应于表2)显示阴沟肠杆菌的结果。

实施例4：埃希氏杆菌属尤其是大肠杆菌

除了使用如下微生物之外，如实施例1进行步骤：

细菌菌株

发明人从Siemens Healthcare Diagnostics(West Sacramento,CA)的微生物菌株保藏中心选择了1144种大肠杆菌菌株用于敏感性测试和全基因组测序。

从MetaRef中，使用318个大肠杆菌的质心作为参照序列。

表7(对应于表1)和表8(对应于表2)显示了大肠杆菌的结果。

实施例5和实施例6：克雷伯菌属尤其是产酸克雷伯菌(K.oxytoca)和肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)

除了使用如下微生物之外，如实施例1进行步骤。

细菌菌株

本发明人从Siemens Healthcare Diagnostics(West Sacramento,CA)的微生物菌株保藏中心选择了1568株克雷伯菌菌株，尤其是1179种肺炎克雷伯菌和389种产酸克雷伯菌用于敏感性测试和全基因组测序。

从MetaRef中，将克雷伯菌的1640个质心作为产酸克雷伯菌的参考序列，将肺炎克雷伯菌的1641个质心作为肺炎克雷伯菌的参考序列。

表9(对应表1)和表10(对应表2)显示产酸克雷伯菌的结果，表11(对应表1)和表12(对应到表2)显示肺炎克雷伯菌的结果。

实施例7：变形杆菌属尤其是奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、彭氏变形杆菌(Proteus penneri)和/或普通变形杆菌(Proteus vulgaris)

除了使用如下微生物之外，如实施例1进行步骤：

细菌菌株

发明人从Siemens Healthcare Diagnostics(West Sacramento,CA)的微生物菌株保藏中心选择了582种变形杆菌菌株用于敏感性测试和全基因组测序。

从MetaRef中，使用2318个变形杆菌属的质心作为参照序列。

表13(对应于表1)和表14(对应于表2)显示了变形杆菌属的结果。

实施例8：假单胞菌属尤其是铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)

除了使用如下微生物之外，如实施例1进行步骤：

细菌菌株

发明人从Siemens Healthcare Diagnostics(West Sacramento,CA)的微生物菌株保藏中心选择了1042株假单胞菌菌株，尤其是铜绿假单胞菌用于敏感性测试和全基因组测序。

从MetaRef中，使用640个铜绿假单胞菌的质心作为参照序列。

表15(对应于表1)和表16(对应于表2)显示了铜绿假单胞菌的结果。

实施例9：沙门氏菌属

除了使用如下微生物之外，如实施例1进行步骤。

细菌菌株

本发明人从Siemens Healthcare Diagnostics(West Sacramento,CA)的微生物菌株保藏中心选择了634种沙门氏菌菌株，尤其是来自猪霍乱沙门氏菌、都柏林沙门氏菌(Salmonella_dublin)、肠道沙门氏菌亚利桑那亚种(Salmonella_enterica_ssp_arizonae)、肠道沙门氏菌diarizoniae亚种(Salmonella_enterica_ssp_diarizoniae)、肠炎沙门氏菌(Salmonella_enteritidis)、鸡沙门氏菌(Salmonella_gallinarum)、沙门氏菌A群(Salmonella_Group_A)、沙门氏菌B群(Salmonella_Group_B)、沙门氏菌C群(Salmonella_Group_C)、沙门氏菌D群(Salmonella_Group_D)、海德堡沙门氏菌(Salmonella_heidelberg)、迈阿密沙门氏菌(Salmonella_miami)、牛波特沙门氏菌(Salmonella_newport)、巴拿马沙门氏菌(Salmonella_panama)、副溶血性A沙门氏菌(Salmonella_parahaemolyticus_A)、甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella_paratyphi_A)、乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella_paratyphi_B)、鸡白痢沙门氏菌(Salmonella_pullorum)、森夫顿堡沙门氏菌(Salmonella_senfienberg)、沙门氏菌属(Salmonella_species)、沙门氏菌属Lac_--,_ONPG_+(Salmonella_species_Lac_--,_ONPG_+)、沙门氏菌属Lac_+,_ONPG_+(Salmonella_species_Lac_+,_ONPG_+)、沙门氏亚属I(Salmonella_subgenus_I)、沙门氏亚属II(Salmonella_subgenus_II)、沙门氏亚属IV(Salmonella_subgenus_IV)、沙门氏亚群I_Suc+(Salmonella_subgroup_I_Suc+)、田纳西沙门氏菌(Salmonella_tennessee)和伤寒沙门氏菌(Salmonella_typhi)用于敏感性测试和全基因组测序。

从MetaRef中，将沙门氏菌属的713个质心作为参考序列。

表17(对应表1)和表18(对应表2)显示沙门氏菌属的结果。

实施例10：沙雷氏菌属尤其是粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)

除了使用如下微生物之外，如实施例1进行步骤。

细菌菌株

本发明人从Siemens Healthcare Diagnostics(West Sacramento,CA)的微生物菌株保藏中心选择了437种沙雷氏菌株用于敏感性测试和全基因组测序。

从MetaRef中，使用1671个沙雷氏菌属物种的质心作为参照序列。

表19(对应于表1)和表20(对应于表2)显示了沙雷氏菌属的结果。

实施例11：志贺氏菌属

除了使用如下微生物之外，如实施例1进行步骤。

细菌菌株

本发明人从Siemens Healthcare Diagnostics(West Sacramento,CA)的微生物菌株保藏中心选择了442种志贺氏菌株尤其是鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)和其他志贺氏菌属物种用于敏感性测试和全基因组测序。

从MetaRef中，使用730个志贺氏菌属物种的质心作为参照序列。

表21(对应于表1)和表22(对应于表2)显示了志贺氏菌属物种的结果。

实施例12：葡萄球菌属尤其是金黄色葡萄球菌(S.aureus)

除了使用如下微生物之外，如实施例1进行步骤。

细菌菌株

本发明人从Siemens Healthcare Diagnostics(West Sacramento,CA)的微生物菌株保藏中心选择了1001种金黄色葡萄球菌的试样用于敏感性测试和全基因组测序，其中985种具有组装的、唯一的Kiel NGS ID(NGS数据和组装ID)，唯一的抗性谱(不同的结果没有不同的抗性谱)，并且至少一种药物具有非缺失的抗性值，因此可以进一步分析这些试样。

从MetaRef中，使用754个金黄色葡萄球菌的质心作为参照序列。

确定对下列抗生素的抗性/敏感性：

阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、阿奇霉素、头孢噻酚、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢西丁、头孢曲松、头孢呋辛、氯霉素、环丙沙星、克林霉素、达托霉素、厄他培南、红霉素、磷霉素、夫西地酸、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、利奈唑胺、美罗培南、甲氧西林、莫西沙星、莫匹罗星、呋喃妥因、诺氟沙星、氧氟沙星、苯唑西林、盘尼西林G、哌拉西林/他唑巴坦、奎奴普丁/达福普丁、利福平、替考拉宁、四环素、替加环素、妥布霉素、甲氧苄啶嘧啶/磺胺甲恶唑和万古霉素

对于测试，使用标准程序，即采用VITEK 2系统和AST卡(Biomerieux)、扫描系统和AST板(Beckmann Coulter)。

DNA提取

利用具有下述改变的MagAttract HMW DNA试剂盒(Qiagen)步骤进行DNA的提取和纯化。达到2x10⁹个细菌(1ml培养物)之后，在2ml离心管中离心(10min，5000xg)并将上清液排出，再次离心1min并取出样品。将产生的沉淀分散在160μL的P1中，添加并混合20μL的溶菌酶(100mg/ml)和4μL的溶葡萄球菌酶，并且在热混合机中在37℃，900rpm孵育悬浮液30分钟。然后加入300μL裂解缓冲液和蛋白酶K(30μL)(均来自Promega的Maxwell的血液试剂盒)并且将整体再次在56℃和900rpm下孵育30分钟。然后将样本作为整体(～510μL)转移到Maxwell暗盒中，利用组织LEV总RNA试剂盒AS1220或XAS1220定制试剂盒(Promega)作进一步处理。

如实施例1进行下一代测序和数据分析。

表23(对应于表1)和表24(对应于表2)显示了金黄色葡萄球菌的结果。

表25(续):实施例中的质心的列表

在表25中，给出了在上述过滤处理之前和之后通过本方法找到的显著的质心(具有相应的p值)的数量。这表明，尽管奇数表(表1、表3、表5等)中的实例给出了最佳的50个基因序列，但实际上对于所有的实例在过滤后都找到了多于50个的基因序列，例如鲍曼不动杆菌为810个。

如上所述，对于偶数表(表2、表4、表6等)，数据被进一步处理。

从实施例中可以看出，在所有细菌物种上都可以发现基因序列的相似性，这显示出它们形成了簇，这也可以从以下事实看出：对于数种细菌而言，来自其它细菌种类的质心被发现是合适的，例如来自大肠杆菌。

表1-24中涉及的基因序列也包含在具有序列ID号(SEQ ID No)1-639的所附序列表中。从而，表26中给出了上述序列(即结构变异)的SEQ ID Nos。表26中也给出了序列的特征ID、基因座标签(如表1至表24)、GenBank登录号(如表1至表24)、起始坐标和终止坐标(均如表1至表24)。

表26a：表1和表2中给出的不动杆菌属尤其是鲍曼不动杆菌的质心的SEQ ID和特征ID

表26b：表3和表4中给出的肠杆菌属尤其是产气肠杆菌的质心的SEQ ID和特征ID

表26c：表5和表6中给出的肠杆菌属尤其是阴沟肠杆菌的质心的SEQ ID和特征ID

表26d：表7和表8中给出的埃希氏菌属尤其是大肠杆菌的质心的SEQ ID和特征ID

表26e：表9和表10中给出的克雷伯菌属尤其是产酸克雷伯菌的质心的SEQ ID和特征ID

表26f：表11和表12中给出的克雷伯菌属尤其是肺炎克雷伯菌的质心的SEQ ID和特征ID

表26g：表13和14中给出的变形杆菌属物种的质心的SEQ ID和特征ID

表26h：表15和表16中给出的假单胞菌属尤其是铜绿假单胞菌的质心的SEQ ID和特征ID

表26i：表17和18中给出的沙门氏菌属物种的质心的SEQ ID和特征ID

表26j：表19和20中给出的沙雷氏菌属尤其是粘质沙雷氏菌的质心的SEQ ID和特征ID

表26k：表21和表22中给出的志贺氏菌属物种的质心的SEQ ID和特征ID

表26l：表23和表24中给出的葡萄球菌属尤其是金黄色葡萄球菌的质心的SEQ ID和特征ID

此外，通过彻底比较单个结构变异与抗生素敏感性/抗性的相关的显著性水平以及结构变异组合与抗生素敏感性/抗性的相关的显著性水平，证明了单独结构变异的协同效应。对于2个结构变异的代表性实例，与对于示例性的不同抗生素给出的任一结构变异的相关性相比，具有下述所给出的值的两个SNP的协同相关性的显著性水平提高了。

对于鲍曼不动杆菌，对于CP，特征ID编号650404552和640152869(如表26a中所示)的组合导致p值为1.74373e-72，而对于CP，对于特征650404552，单个特征的最小p值为3.053e-66(未调整)，这代表了175084399.0％的提高。

对于产气肠杆菌，对于CP，特征ID编号650930441和650931509(如表26b中所示)的组合导致p值为3.34152e-15，而对于CP，对于特征650930441，单个特征的最小p值为3.88493e-14(未调整)，这代表了1162.6％的提高。

对于阴沟肠杆菌，对于T/S，特征ID编号646417690和64676389(如表26c中所示)的组合导致p值为5.51273e-44，而对于T/S，对于特征646417690，单个特征的最小p值为1.51283e-31(未调整)，这代表了274425302650065.6％的提高。

对于大肠杆菌，对于AM，特征ID编号642741803和648660988(如表26d中所示)的组合导致p值为3.77569e-236，而对于AM，对于特征642741803，单个特征的最小p值为3.87701e-212(未调整)，这代表了102683411109074676580614144.0％的提高。

对于产酸克雷伯菌，对于A/S，特征ID编号643365450和643363160(如表26e中所示)的组合导致p值为5.39843e-26，而对于A/S，对于特征643365450，单个特征的最小p值为8.80799e-23(未调整)，这代表了163158.3％的提高。

对于肺炎克雷伯菌，对于A/S，特征ID编号640431575和642741803(如表26f中所示)的组合导致p值为1.0461e-124，而对于TO，对于特征640431575，单个特征的最小p值为5.86879e-124(未调整)，这代表了561.0％的提高。

对于铜绿假单胞菌，对于TO，特征ID编号640814388和640814381(如表26h中所示)的组合导致p值为1.02879e-101，而对于TO，对于特征640814388，单个特征的最小的p值为4.21928e-82(未调整)，这代表了4101192210581809004544.0％的提高。

对于变形杆菌属，对于CRM，特征ID编号644095953和644444520(如表26g中所示)的组合导致p值为2.80046e-65，而对于CRM，对于特征644099457，单个特征的最小p值为5.04929e-65(未调整)，这代表了180.3％的提高。

对于沙门氏菌属，对于AM，特征ID编号642741803和640802276(如表26i中所示)的组合导致p值为2.12481e-78，而对于AM，对于特征642741803，单个特征的最小p值为1.02922e-63(未调整)，这代表了48438123192303928.0％的提高。

对于志贺氏菌属，对于AUG，特征ID编号648579985和648593441(如表26k中所示)的组合导致p值为1.71179e-63，而对于AUG，对于特征648579985，单个特征的最小p值为5.83313e-60(未调整)，这代表了340761.3％的提高。

对于粘质沙雷氏菌，对于CP，特征ID编号640936168和647266283(如表26j中所示)的组合导致p值为1.81386e-12，而对于LVX，对于特征640936168，单个特征的最小p值为2.69007e-10(未调整)，这代表了表14830.6％的提高。

获得了关于其他细菌物种，如葡萄球菌属，尤其是金黄色葡萄球菌的其他结构变异及其组合，以及关于其他抗生素的类似结果，但为了简洁起见，将其省略。

直接来自患者样品的用于组合病原体鉴定和抗微生物剂敏感性测试的基因测试可以使产生可行性结果的时间从数天显著降低至数小时，从而使得能够进行靶向治疗。此外，该方法对中心实验室无限制，但可以开发允许进行各个测试的定点照护装置。此类技术连同本发明的方法和计算机程序产品可以使护理发生变革，例如在密集护理单元或者对于一般入院而言。此外，利用本发明的方法甚至可以实现如实时爆发监控的应用。

与利用MALDI-TOF MS的方法相比，本发明的方法具有下述优势：其涵盖几乎全部基因组，从而使得我们能够鉴定可能与抗性相关的潜在的基因组结构变化。尽管MALDI-TOFMS还可用于鉴定细菌蛋白中的点突变，但是该技术仅检测蛋白的子集，并且这些蛋白中并非所有的均被同等良好地覆盖。此外，某些相关菌株的鉴定和区分并不总是可行的。

本发明的方法允许计算最佳断点，用于将分离株分为抗性组和敏感组。本发明的发明人设计了灵活的软件工具，除了最佳断点之外，其还允许考虑通过为在不同国家应用GAST而准备的不同指南(例如欧洲和美国指南)所限定的数值。

当前方法使得能够

a.在一个诊断测试中鉴定并验证用于基因鉴定和敏感性/抗性测试的标志物；

b.验证已知的药物靶标和作用模式；

c.检测可能的新的抗性机制，其导致用于新疗法的推定的新的靶标/第二靶标基因。

当前方法比传统的基于培养物的预测更快，并且有可能比基于单碱基(例如SNP)的测试更快。最显著的是，当前方法有助于提高新基因测试的准确性。

利用本发明的方法，可以检测到结构变异，尤其是包括可以导致基因剂量效应的拷贝数变异。

Claims

1.确定微生物尤其是细菌微生物的基因组中的结构变异的方法，所述结构变异包括基因组中包含多于一个碱基的至少一处变化，所述方法包括：

2.如权利要求1所述的方法，其中不进行比对来检测所述结构变异。

3.如权利要求2所述的方法，其中将所述结构变异注释到所述微生物的泛基因组中和/或注释到一个或多个参考序列中。

4.确定患者感染对抗微生物药物治疗可能具有抗性的微生物尤其是细菌微生物的诊断方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自所述患者的包含或疑似包含微生物尤其是细菌微生物的样品；

b)如通过权利要求1至3中任一项所述的方法确定的，确定所述微生物尤其是细菌微生物的至少一条基因序列中至少一个结构变异的存在，其中存在所述至少一个结构变异表明所述患者感染具有抗微生物药物抗性的微生物。

5.选择对感染了可能具有抗性的微生物尤其是细菌微生物的患者的治疗的方法，其包括下述步骤：

a)获得或提供来自所述患者的包含或者疑似包含微生物尤其是细菌微生物的样品；

b)如通过权利要求1至3中任一项所述的方法确定的，确定所述微生物尤其是细菌微生物的至少一条基因序列中至少一个结构变异的存在，其中存在所述至少一个结构变异表明对一种或多种抗微生物药物的抗性；

c)鉴定所述至少一种或多种抗微生物药物；以及

d)选择不同于步骤c)中所鉴定的药物，并且适用于治疗所述微生物尤其是细菌微生物感染的一种或多种抗微生物药物。

6.确定微生物尤其是细菌微生物的临床分离株的微生物基因组的结构变异的方法，其包括：

获得或提供所述微生物尤其是细菌微生物的所述临床分离株的至少一条基因序列；以及

如通过权利要求1至3中任一项所述的方法确定的，确定所述微生物尤其是细菌微生物的所述临床分离株的至少一条基因序列中结构变异的存在。

7.计算机程序产品，其包含计算机可执行的指令，所述指令被执行时实施权利要求1至6中任一项所述的方法。