KR20030028498A

KR20030028498A - 객담에서 ｒｎａ를 추출하는 방법

Info

Publication number: KR20030028498A
Application number: KR1020030002611A
Authority: KR
Inventors: 전창호; 박종욱
Original assignee: 주식회사 아이씨엔지
Priority date: 2003-01-15
Filing date: 2003-01-15
Publication date: 2003-04-08
Also published as: KR20040010822A

Abstract

본 발명은 점액성이 많은 객담에서 RNA를 간편하게 추출하기 위한 방법 및 이에 사용되는 시약에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명에 따른 객담 추출 방법은 객담 시료에 구아니디늄 티오시아네이트 버퍼를 첨가하는 단계; 상기 시료에 핵산결합비드를 첨가하는 단계; 및 상기 핵산결합비드에 PGI 시약을 첨가하는 단계를 포함하고 있다. 본 방법은 기존의 시약을 새롭게 조합하여 객담에서 RNA를 추출하는 데 최적의 조건을 찾아내어 시약을 개발하였다.

Description

객담에서 ＲＮＡ를 추출하는 방법{A METHOD FOR EXTRACTING RNA FROM A SPUTUM}

점액질의 객담에서 RNA를 분리하기 위한 통상적 방법은 객담에 보존제를 주입하여 객담을 액화시키고, 세포를 용해한 후, 이 때 녹아나온 RNA를 실리카겔로 흡착시켜 RNA를 수거하여 용출시킨 다음 RNA를 추출하는 단계로 이루어졌다.

객담에는 다량의 정상세포, 각종 세균, 염증세포, 단백질, 점액질 및 다당류 등 많은 성분들이 혼재하여 있으므로 손상없이 RNA를 수거하기가 용이하지 않다. 특히 객담에는 세균들이 많아서 세포가 조금만 손상 받아도 쉽게 RNA가 파괴된다. 따라서 종래의 객담에서의 역전사 중합효소 연쇄반응법은 임상적으로 활용하기가어려웠고, 특히 객담에 소량으로 존재하지만 임상적 의미가 지대한, 종양세포들의 암유전자를 검출하기 위해서는 RNA를 손상시키지 않고 분리할 수 있는 방법을 개발하는 것이 필수적인 선결 과제였다.

종래의 객담 처리법은 디티오트레이톨(Dithiothreitol: 이하 DTT) 혹은 N-아세틸-L-시스테인(N-acetyl-L-cysteine: NALC)을 사용하여 객담을 완전히 액화시킨 다음, 원심분리하여 세포를 집적하고, 집적된 세포를 용해하여 RNA를 분리하는 단계를 거쳤다. 그러나, 이러한 종래의 방법에 따르면, 객담이 완전히 액화되기 위해서는 15분 내지 1시간 정도의 시간이 소요되며, 일부 객담에서는 액화가 일어나지 않기도 하였다. 그나마 액화되어서 세포들을 집적할 수 있게 되어도 각종 세균, 다당류, 다양한 효소, 단백질 등이 함께 혼재되어 있어 RNA가 쉽게 손상을 받았다. 그 결과 특정 RNA를 분리하기 위해서는 많은 양의 세포가 필요하였고, 이는 곧 검출율의 감소로 이어져 객담을 이용한 유전자 진단법은 실효화되지 못하였다.

본 발명은 상기한 방법의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명은 기존의 시약을 조합하여 간편하고 신속하면서 개량된 특이도 및 민감도를 갖는 객담처리 및 RNA 분리방법 및 이에 사용되는 키트에 관한 것이다. 특히 객담에 소량으로 존재하지만 임상적 의미가 지대한, 종양세포들의 암유전자를 검출하기 위해서는 RNA를 손상시키지 않고 분리할 수 있는 방법을 개발하는 것이 필수적인 선결 과제였다. 본 연구자는 최초로 객담에 혼재되어 있는 소량의 RNA를 분리할 수 있는 방법을 개발하였다.

도 1은 객담에서 RNA를 분리하는 과정을 도식적으로 나타낸다.

<도면 부호에 대한 간단한 설명>

(1) 아침객담 채취(2) GT 버퍼첨가(3) GT 버퍼와 객담 혼합

(4) NA 비드 첨가 (5) NA 비드와 객담 혼합(6) 상층액 제거

(7) 비드 세척 (8) 비드에 PGI 시약 첨가

(9) 70℃에서 10분간 혼합하여 결합된 핵산 유리

(10) 유리된 핵산을 새 시험관에 옮김

(11) 클로르포름 시약을 주입하여 혼합후 원심하여 상층에 있는 RNA 층 수거

(12) 이소프로필알코올 첨가하여 RNA 침전

(13) 상층액을제거하고 76% 에탄올 가하여 세척

(14) 원심하여 에탄올 제거하고 증류수 가하여 RNA 용해.

도 2는 기존의 디티오트레이톨 방법과 본 발명의 방법에 의하여 각각 제조된 RNA 샘플에서 MAGE의 발현을 검출함으로써 특정 RNA 분리율을 증명하는 사진이다(객담은 1, 4, 16, 64 SNU 484 세포를 함유. MAGE 유전자는 RT-네스티드 PCR에 의하여 증폭됨.).

<도면 부호에 대한 간단한 설명>

(A) 디티오트레이톨 방법(B) 본 발명에 의한 방법.

*: 크기 마커

도 3은 기존의 디티오트레이톨 방법과 본 발명의 방법에 의하여 각각 제조된 RNA 샘플에서 GAPD의 발현을 검출함으로써 RNA 추출 효율을 증명하는 사진이다(객담은 1, 4, 16, 64 SNU 484 세포를 함유. GAPD 유전자는 RT-PCR에 의하여 증폭됨.).

<도면 부호에 대한 간단한 설명>

(A) 디티오트레이톨 방법(B) 본 발명에 의한 방법.

*: 크기 마커

본 발명의 제1 목적은 간편하고 신속하게 객담을 처리하여 RNA를 안정화하는 방법의 제공에 있다.

본 발명의 제2 목적은 안정화된 객담에서 효율적으로 RNA를 분리하는 방법을 제공한다.

즉, 본 발명은 객담의 액화, 세포용해 및 RNA 보존을 동시에 실시함으로서 신속하게 객담을 처리하여, 객담에 있는 미량의 RNA를 안정화시켜 임상적으로 용이하게 사용할 수 있도록 하며, 안정화된 객담에서 효율적으로 RNA를 추출하는 방법을 개발하는 데 있다. 따라서, 신속한 객담 처리법을 개발하여 소량의 RNA를 안정적으로 수거하는 데 있다.

본 발명의 RNA 분리 방법은 (a) 채취한 객담 시료에 구아니디늄 티오시아네이트(GT) 버퍼를 첨가하는 단계; (b) 상기 시료에 핵산결합(NA) 비드를 첨가하는 단계; 및 (c) 상기 NA 비드에 페놀 구아니딘 티오시아네이트(PGI) 시약을 첨가하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 GT 버퍼, 핵산결합비드, PGI 시약을 포함하는 객담에서 RNA를 분리하는 키트에 관한 것이다.

본 방법에 따른 RNA 분리 방법은 객담처리시간이 기존의 30분 내지 1시간에 비하여 약 5분으로 단축되었으며, 본 방법은 기존의 방법에 비하여 16배 정도 민감하게 특정 RNA를 분리할 수 있었다. 또한, 본 방법은 기존의 방법에 비하여 16배 내지 64배 정도 효율적으로 RNA를 분리할 수 있다.

본 발명에 따른 객담에서 RNA를 간편하고 신속하게 분리하는 방법을 아래와 같이 구체적으로 설명한다.

1. 환자로부터 객담을 채취한 후 즉시 GT 버퍼를 넣고 진동교반(vortex)시켜 완전히 액화시킨다. 이때 액화될 때까지 추가로 GT 버퍼를 주입하여 혼합해야 하며, GT 버퍼를 넣은 후 검사시까지 -20 ℃ 또는 - 70 ℃에 보관 함으로서 약 6개월간 안정하게 유지될 수 있다. 이 과정은 객담에 있는 점액성분을 중화하고 세포를 용해하여 녹아나온 RNA를 안정화시키는 가장 중요한 부분이다. 이로써 신속한 검체처리와 RNA 보존이 이루어진다.

2. 미리 균질화시킨 핵산결합비드(NA Bead)를 액화된 객담에 주입하고 진동교반시켜 잘 혼합한다. 이 단계는 액화된 객담에서 RNA를 분리하는 최적의 방법으로서, 로슈사에서는 혈액에서 RNA를 추출하기 위하여 NA 비드를 사용하고 있으나, 객담은 세포수 및 구성성분 등이 혈액과는 다르기 때문에 종래 프로토콜에 의하여 이상적이며 경제적인 RNA 추출 조건을 결정하기가 매우 어렵다. 본 발명자는 여러번의 실험을 통하여 주입하는 NA 비드 양을 GT 버퍼 1㎖당 NA 비드 30㎕로 결정하였다.

3. 핵산결합비드와 혼합된 객담을 30분간 실온에서 롤러혼합기(roller mixer)에서 항온처리한다. 이때 핵산완충액(NA-buffer)에 차가운 에탄올을 첨가하여 핵산세척버퍼(Nucleic acid washing buffer)를 제조하여 둔다(20 test 용).

4. 액화 객담을 2000 rpm으로 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 비드를 부유시킨 후, 1.5㎖시험관에 옮긴다. 50㎖시험관에 핵산세척버퍼를 0.5㎖ 첨가하여 남은 비드를 깨끗이 수거한 뒤 1.5㎖ 시험관으로 옮긴다.

5. NA 비드 세척 과정

(1) NA 비드를 수거한 시험관을 자석분리대(magnetic separator)에 꽂아 NA 비드를 자석에 붙인 후 상층을 제거한다.

(2) 핵산세척버퍼를 시험관에 1㎖ 넣고 피펫으로 조심스럽게 섞어 비드를 세척한 후, 마이크로튜브를 자석분리대에 꽂아서 NA 비드를 붙이고 이 상태에서 버퍼를 피펫으로 제거해낸다(3회 반복). 마지막 3번째 세척에서는 일단 버퍼를 제거하고 잠시 기다렸다가 남아있는 버퍼를 완전히 제거한다.

6. 핵산 용출 과정

(1) 상기 튜브에 PGI 시약 800㎕첨가하여 핵산결합비드를 재부유시킨다.

이 단계는 PGI(Trizol) 시약을 비드에 첨가하여 사용한 것으로 NA-비드법과 Trizol법을 결합시킨 것이다. 객담에는 점액질뿐 아니라 다당류가 많이 혼재하여 구아디닌-티오시아네이트법으로 추출한 RNA에서 RT-PCR이 억제되는 경우가 발생한다. 따라서, GT 버퍼로 추출한 RNA를 세척한 다음, 한번더 Trizol 용액으로 처리하여 남아있는 단백질, 다당류 등을 제거하여 PCR 과정에 억제작용이 발생하지 않도록 하는 과정이다.

(2) 이 시험관을 70℃ 쉐이커(에펜도르프 쉐이커)에 넣어 10분간 교반시킨다(교반속도 1400rpm). 만일 70℃ 쉐이커(에펜도르프 쉐이커)가 없는 경우 시험관을 70℃ 건조 욕조에 넣어 가온 하면서 3분마다 1번씩 2회 진동교반(vortex)한다.

(3) 시험관을 자석분리대에 놓고 NA 비드를 자석에 붙인 다음, 녹아 나온 핵산을 새 시험관에 옮긴다. 이때 NA 비드가 딸려나오지 않도록 조심한다.

(4) 샘플을 실온에서 식힌 후 클로르포름 0.2㎖을 첨가하여 마개를 잘 닫고 15초간 손으로 격렬하게 교반한 다음 15분간 4℃ 12,000rpm 으로 원심분리시킨다.

원심분리결과 적색 페놀-클로로 저층, 중간층, 무색 수성 상층으로 분리되며, 무색 상층에 RNA가 존재한다. 일반적으로 상층액은 주입한 Trizol양의 60%에 해당하며, 그렇지 못한 경우 5 내지 10분간 더 원심분리한다.

7. RNA 침전

(1) 원심분리후 상층액을 새로운 시험관에 옮긴다. 유기층은 20-70℃에서 보관하여 DNA 또는 단백질 추출에 사용할 수 있다.

(2) 동량의 이소프로필알코올을 주입한 뒤 실온에서 10분간 방치하고 10분간 4℃, 12,000rpm으로 원심분리시킨다. 이 때, RNA 침전물이 원심분리 전에 겔과 같은 펠렛처럼 보일 수 있다.

8. RNA 세척

상층액을 제거하고 75% 에탄올 1㎖을 가하여 역위혼합(invert mix)한 후 4℃, 12,000rpm에서 5분간 원심분리시킨다.

9. RNA 재용해

(1) 원심분리한 상기 샘플은 상층액을 제거하고 RNA 펠렛을 5분 내지 10분 동안 에어드라이시킨다(진공건조시키지 말 것). 이때 완전히 건조되지 않게 주의한다.

(2) RNase가 없는 증류수(RNA-free water)을 25ul 가하여 피펫으로 조심스럽게 혼합한 다음 70℃에서 10분간 방치 후 즉시 얼음에 방치한다.

(3) 시험관을 부드럽게 5회 두드린 후(tapping) RNA 11.0㎕를 취하여 역전사반응을 실시한다. 나머지는 70 ℃ 냉동고에 보관한다(재검용).

본 발명에 사용하는 시약에 대한 구체적인 설명은 다음과 같다:

1. 구아니디늄 티오시아네이트 버퍼(Guanidinium thiocyanate buffer: GT 버퍼)

상기 GT 버퍼는 구아니디늄 티오시아네이트, 0.1 M TrisCl(pH 7.5), 1% 베타 머캅토에탄올, 5 mM 디티오트레이톨로 구성되어 있으며, 세포를 용해하고, 객담을 액화하며, RNA를 보존하는 작용을 한다. Roche molecular biochemicals(독일, 만하임에 소재)사에서는 GT buffer에 Triton-X 100 등을 주입하여 혈액/골수의 RNA/DNA 안정제를 개발하여 시판하고 있다. 연구자들이 이 시약을 사용하여 객담에 적용해 본 결과 GT buffer처럼 양호한 RNA 분리율을 나타내었다. 가격적인 면에서도 제조하는 것과 차이가 없어 완제품으로 제조된 로슈사의 시약을 사용해도 무방할 것이다. 본 발명에서는 GT 버퍼를 객담에 사용하여 이를 액화시키고, RNA 용출 및 안정화 하는 기능을 수행하고 있으며, 이는 본 발명자의 아이디어와 경험에 의하여 개발되었다.

2. 핵산결합비드(NA bead)

NA 비드는 캡슐화된 산화철을 보유한 폴리스티렌으로 구성되어 있으며, 그 표면에 COOH가 부착되어 있다. NA 비드의 표면에 있는 COOH는 녹아 나온 RNA와 결합하고, 내부의 금속성분은 결합된 RNA를 모으기 위하여 자석에 부착시키는 역할을 함으로써, DNA, RNA 및 아미노산과 결합한다. 이러한 기능에 의하여 객담에서 RNA를 분리하는 목적에 적합하게 사용되고 있다.

3. 핵산세척버퍼(Nucleic acid washing buffer)

핵산세척버퍼는 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl(pH7.5)의 버퍼를 만든후 4배 volume의 차가운 에탄올을 첨가하여 최종 농도가 20 mM NaCl, 2 mM HCl(pH7.5)로 되게 제조된다. 핵산세척버퍼는 불순물이 잘 분리되도록 물질들의 비특이적 결합을 제거하는 속성이 있으며, 이를 이용하여 NA 비드에 비특이적으로 결합한 이물질을 씻어내는데 사용한다.

4. 페놀-구아니딘 티오시아네이트(Phenol-guanidine thiocyanate: PGI)

페놀-구아니딘 티오시아네이트(PGI)는 상품명으로 트리졸(Trizol)이라 한다(Gibco BRL, Life technologies, 미국에 소재). 이 시약은 세포를 용해하고 RNA 분해효소를 억제하는 기능이 있어서, RNA, DNA, 단백질 등을 한단계로 분리할 수 있으며, RNA를 안정화시키는 작용을 한다. 본 발명에서는 상기 작용 외에 NA 비드에 결합되어 있는 핵산을 비드에서 분리하여 용액으로 녹아나오게 한다.

5. 클로르포름(Chlorform)

이는 단백질과 결합하여 침전물을 만드는데, 추출된 RNA를 DNA와 단백질로부터 분리하는데 사용한다.

7. 이소프로필 알코올

이는 추출된 RNA를 침전시켜 용액에 녹아있는 RNA를 집적하는 작용을 한다.

8. Rnase 없는 75% 에탄올(Rnase free 75% ethanol)

이는 침전된 RNA중 불순물을 세척하는데 사용된다.

9. 디에틸피로카보네이트-증류수(Diethylpyrocarbonate-DW)

이는 추출된 RNA를 녹이는데 사용된다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다.

[실시예 1] 객담에서 RNA분리를 위한 객담처리 시간 비교

방법: 병원에 입원한 환자들 중 미생물배양이 의뢰된 객담을 사용하였다. 미생물 배양이 실시되고 남은 객담을 20개 수거하여 점도가 육안으로 비슷한 객담으로 각각 10개씩 분류하였다. 각 10개의 객담을 대상으로 기존의 0.3% 디티오트레이톨-0.02 M EDTA(pH 7.0)와 시판되고 있는 GT-버퍼인 혈액안정화제를 사용하여 액화 및 RNA 보존에 소요되는 시간을 측정하였다.

1. 첫번째 시험관에는 DTT-EDTA 용액을 동량 가하고 두번째 시험관에는 GT-버퍼를 동량 가하여 각각 혼합하였다.

2-1) 기존방법: 첫번째 시험관을 진동교반기(vortexer)로 혼합하여 액화시켰다. 만일 완전히 액화되지 않으면 DTT-EDTA 용액을 추가하여 완전히 액화시켰다.

2-2) 2,000 RPM에서 10분간 원심한 다음, 상층액을 버리고 바닥에 모인 세포층만 남겼다.

2-3) 세포층을 PBS(phosphate buffered saline)를 3㎖ 가하여 부유시킨 다음 동일 RPM에서 5분간 원심하여 세포층을 집적하였다.

2-4) 상층액은 모두 제거하고 다시 PBS 3㎖를 가하여 부유시킨 다음 같은 조건에서 원심하여 세포층을 집적하였다.

2-5) 상층액을 제거한 다음 Trizol 1㎖을 가하여 부유시켰다. 이로써 RNA 분리를 위한 과정이 종료되며, 소요시간을 측정하였다.

3-1) 본 발명에 따른 방법: 두번째 시험관을 진동교반기로 혼합하여 액화시켰다. 만약 완전히 액화되지 않으면 GT-버퍼 용액을 추가하여 완전히 액화시켰다.

3-2) 객담이 액화되면 두번째 시험관에서 RNA를 추출할 수 있으므로 시험이 종료된 것이며, 지금까지 소요된 시간을 측정하였다.

4. 두가지 방법을 각각 10회 반복하여 RNA 분리를 위한 검체처리 과정에서 소요되는 시간을 측정하였다.

결과:

1. 본 방법은 객담에 GT-버퍼를 객담의 2-3배 정도 주입하여 혼합함으로써 5분 이내에 객담의 액화 및 RNA안정화를 이룩할 수 있었다.

2. 기존의 방법은 세포층 분리에서 RNA 안정화까지 30분 내지 1시간 정도 소요되었다. 일부 점도가 높은 객담에서는 완전히 액화하기 어려웠다.

[실시예 2] 기존의 DTT법과 신규방법을 이용하여 특정 RNA 추출율 비교.

객담에 MAGE양성인 484세포를 개수별로 주입하여 RNA추출한 다음 RT-PCR로 검출

실시예 1의 방법으로 처리한 객담을 대상으로 기존방법과 본 발명의 방법에따른 RNA 추출 효율을 비교하고자 하였다. 객담 5㎖에 MAGE 양성인 SNU 484 세포를 각각 5개, 20개, 80개 및 320개를 각각 주입하여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA를 대상으로 MAGE RT-PCR을 시행하였다. 이 실험을 10회 실시하여 주입한 세포수에 따라 MAGE(melanoma antigen gene) 유전자가 검출되는 정도를 비교하여 특정 RNA 추출 효과를 검증하였다.

기존방법(DTT법)

1. RNA 분획화

(1) Trizol을 주입한 객담세포층을 실온에서 5분간 방치한다.

(2) Trizol 1㎖에 클로르포름 0.2㎖을 첨가하여 마개를 잘 닫고 15초간 손으로 격렬하게 교반한 후 12,000g 4℃에서 15분간 원심분리시켰다.

(3) 적색 페놀-클로로 저층, 중간층, 무색 수성 상층으로 분리되었다.

(4) 상층액은 주입한 Trizol 양의 60%에 해당한다.

2. RNA 침전

(1) 상층액을 새로운 시험관에 옮기고 유기층을 보관하여 DNA 또는 단백질 추출에 사용한다.

(2) 동량의 이소프로필 알코올(/1㎖ Trizol)을 주입하고 실온에서 10분간 방치한후, 12,000g 4℃에서 10분간 원심분리시켰다(시간엄수).

3. RNA 세척

상층액을 제거하고 75% 에탄올 1㎖을 가하여 진동교반으로 혼합한 다음 7,500 g 4℃에서 5분간 원심분리시켰다.

4. RNA 재용해

(1) 상층액을 제거하고 RNA 펠렛을 5 내지 10분 동안 에어드라이시켰다.

(2) RNAase가 제거된 물을 25㎕ 가하여 피펫으로 혼합한 다음 55-60℃에서 10분간 방치하였다.

신규 방법

1. NA 비드를 잘 혼합한 뒤 150㎕를 액화된 객담에 주입하고 진동교반으로 혼합하였다. 만일, GT 버퍼를 추가하였으면 이에 비례(150㎕/5㎖)하여 NA 비드도 추가한다.

2. 30분간 실온에서 롤러 혼합기로 항온처리하였다.

3. 액화 객담을 2000 rpm으로 5분간 원심분리시킨후 상층액은 버리고 비드를 부유시킨 후 1.5㎖시험관으로 옮겼다. 50㎖시험관에 NA 비드 세척 완충액을 0.5㎖첨가하여 남은 비드를 깨끗이 수거한뒤 1.5㎖ 시험관으로 옮겼다.

4. NA 비드 세척 과정

(1) NA 비드를 수거한 시험관을 자석분리대에 꽂아 NA 비드를 자석에 붙인후 상층을 제거하였다.

(2) NA 비드 세척 완충액을 시험관에 1㎖ 넣고 피펫으로 섞어 비드를 세척한 후, 마이크로튜브를 자석분리대에 꽂아서 NA 비드를 붙이고 이 상태에서 버퍼를 피펫을 제거해냈다(3회 반복). 3번째 세척에서는 일단 버퍼를 제거하고 잠시 기다렸다가 남아있는 버퍼를 완전히 제거하였다.

5. 핵산 용출 단계

(1) 시험관에 PGI 시약 800㎕ 첨가하여 NA 비드를 재부유시켰다.

(2) 시험관을 70 ℃ 쉐이커(에펜도르프 쉐이커)에 넣어 10분간 1400 rpm으로 교반시켰다.

(3) 시험간을 자석분리대에 놓고 NA 비드를 자석에 붙인 다음, 녹아 나온 핵산을 새 시험관에 옮겼다. 이때 NA 비드가 딸려나오지 않게 조심하였다.

(4) 샘플을 실온에서 식힌후 클로르포름 0.2㎖을 첨가하여 마개를 잘 닫고 15초간 손으로 격렬하게 교반시킨후, 12,000 rpm 4℃에서 15분간 원심분리시켰다.

6. RNA 침전, RNA 세척, RNA 재용해는 기존의 방법과 동일하게 진행시켰다.

RT-TCR 및 네스티드 PCR: 공통

1. RNA 2차 구조를 제거하기 위하여 RNA 용액 11.0㎕을 70℃에 10분간 두고 얼음에 방치하였다.

2. 총 RNA 2㎕(2㎍)을 주입하여 역전사 중합효소반응을 다음의 조건으로 시행하였다.

5X RT 버퍼(Promega, USA) 4㎕

10 mM dNTP 혼합물 1㎕

MMLV (200 U/㎕) 0.5㎕

Rnase 저해제 (40 U/㎕) 0.5㎕

올리고 dT 프라이머 (100 pmol) 1㎕

증류수 11㎕

RNA 2㎕

3. 광유를 한 방울 넣은 후 시험관을 PCR 기계(Perkin Elmer, Cetus 2400)dp 넣어 RT 반응을 실시하였다(조건: 25℃ 10분, 42℃ 60분 1싸이클).

4. 다음과 같이 PCR-1 혼합물을 제조하였다.

10X PCR 버퍼 3㎕

25 mM MgCl₂2.4㎕

100 mM dNTP 0.3㎕

10 pmol 프라이머 C1 0.1㎕

10 pmol 프라이머 C2 0.1㎕

PCR 효소 1U 0.1 ul

증류수 22.0㎕

5. RT 반응 산물(4번 과정)을 2㎕ 취하여 PCR-1 혼합물이 들어있는 시험관에 첨가하였다.

6. 광유를 한 방울 넣은 후 PCR 기계에 넣어 PCR을 실시하였다(PE 2400 기준, 900 bp가 합성되므로 시간은 각 PCR 장비에 맞게 조정한다).

94℃ 10분 1싸이클: Gold Taq(PE)를 위하여 예비항온처리함

94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 1분 30싸이클

72℃ 3분 1 싸이클

7. 다음과 같이 PCR-2 혼합물을 제조하였다.

10X PCR 버퍼 3㎕

25 mM MgCl₂2.4㎕

100 mM dNTP 0.3㎕

10 pmol 프라이머 C3 0.1㎕

10 pmol 프라이머 C4 0.1㎕

PCR 효소 1U 0.1㎕

증류수 22.0㎕

8. PCR-2 혼합물에 1차 PCR 산물 2㎕를 첨가하였다.

9. PCR 기계에 넣어 네스티드 PCR을 실시하였다(MAGE 내부 490 bp가 증폭).

94℃ 10분 1싸이클: Gold Taq(PE)를 위하여 예비항온처리함

94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 45초 30싸이클

72℃ 3분 1 싸이클

10. PCR이 끝난 시험관을 전기영동실로 옮기고 에티듐 브로마이드가 함유된 1% 아가로스겔에서 전기영동하여 결과를 관찰하였다.

결과: 표 2에서 요약한 바와 같이 본원 발명에 따른 방법은 기존의 방법보다 SNU 484 세포에 존재하고 있는 MAGE 유전자 검출율이 16배 정도 민감하였다.

공통 MAGE RT-PCR에 사용되는 프라이머 서열

프라이머	유형	용도	서열	크기(bp)
C1	센스	RT-PCR	CTGAAGGAGAAGATCTGCC	828-924
C2	안티센스	RT-PCR	CTCCAGGTAGTTTTCCTGCAC
C3	센스	네스티드 PCR	CTGAAGGAGAAGATCTGCCWGTG	469-493
C4	안티센스	네스티드 PCR	CCAGCATTTCTGCCTTTGTGA

RNA 추출방법에 따른 객담에서 MAGE 양성 SNU484 세포의 검출율

방법	검출율(%)
	1*	4	16	64	총
디티오트레이톨(N=10)	20	60	60	80	55
신규방법(N=10)	60	80	100	100	85∫
* SNU 484 세포의 갯수/㎖ 객담∫P <0.01 디티오트레이톨과 신규 방법간

[실시예 3] 총 RNA 분리 효율 비교

GAPD PCR을 실시하여 GAPD 밴드의 세기 측정

RNA 분리 효율을 관찰하기에 가장 좋은 방법은 RNA 추출후 분광계수기를 이용하여 RNA 순도와 농도를 측정하는 것이다. 그러나 객담은 그 특성상 동일한 세포수를 가진 객담을 제조하기가 불가능하다. 따라서 본 연구자들은 실시예 2와 같이 제조된 객담에서 각각의 방법에 따라 RNA를 추출한 다음 GAPD(glyceraldehydes phosphate dehydrogenase) 유전자를 증폭하여 RNA 분리 효율을 간접적으로 측정하고자 하였다.

1. 아래와 같이 GAPD PCR 시약을 제조한다.

10X PCR 버퍼 3㎕

25 mM MgCl₂2.4㎕

100 mM dNTP 0.3㎕

10 pmol 센스 프라이머 0.1㎕

10 pmol 안티센스 프라이머 0.1㎕

PCR 효소 1U 0.1㎕

증류수 22.0㎕

GAPD RT-PCR에 사용된 프라이머 서열

프라이머	유형	용도	서열	크기(bp)
C1	센스	RT-PCR	GTCAACGGATTTGGTCTGTATT	560
C2	안티센스	RT-PCT	AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT

2. 실시예 2에서 합성된 cDNA 2㎕를 주입하여 다음의 조건으로 GAPD 유전자를 증폭하였다(PE 2400 기준, 900 bp가 합성되므로 시간은 각 PCR 장비에 맞게 조정한다).

94℃ 10분 1싸이클: Gold Taq(PE)를 위하여 예비항온 처리함

94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 1분 30싸이클

72℃ 3분 1 싸이클

3. PCR이 끝난 시험관을 전기영동실로 옮기고 GAPDH PCR 산물을 에티듐 브로마이드가 함유된 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 결과를 관찰하였다.

결과:

GAPD PCR 결과를 도 3에 나타내었다. 기존의 방법보다 본원 발명에 따른 방법에서 증폭되는 GAPD 유전자의 양이 훨씬 많아짐을 알 수 있다. 특히 SNU 484 세포수가 증가함에 따라 본원 발명에 따른 방법에서는 밴드가 진하게 나타남을 관찰할 수 있었으나 종래 방법으로는 이를 관찰하기 어려웠다. 따라서, 본원 발명에 따른 방법에 의한 RNA 분리효율의 우수성을 입증할 수 있다.

본 발명은 점액성이 커서 세포를 별도로 분리하기 매우 어려운 객담에서 이를 액화시켜 RNA 분리를 분리하는 방법에 관한 것으로서, 객담에 소량으로 존재하는 RNA를 손상받지 않게 분리할 수 있는 방법을 제공한다.

본 방법은 종래의 방법에 비하여 객담처리시간이 매우 단축되었으며, RNA 분리 민감도와 효율이 현저히 높아졌음을 알 수 있다.

Claims

객담 시료에서 RNA를 추출하는 방법에 있어서,

(a) 객담시료에 구아니디늄 티오시아네이트 버퍼를 첨가하는 단계;

(b) 상기 시료에 핵산결합비드를 첨가하는 단계; 및

(c) 상기 핵산결합비드에 페놀-구아니딘 티오시아네이트 시약을 첨가하는 단계;

를 포함하는 객담에서 RNA를 추출하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 핵산결합비드의 양이 구아니디늄 티오시아네이트 버퍼 1㎖ 당 약 30㎕인 것을 특징으로 하는 객담에서 RNA를 추출하는 방법.
구아니디늄 티오시아네이트 버퍼, 핵산결합비드 및 페놀-구아니딘 티오시아네이트를 구성요소로 포함하는 객담시료에서 RNA를 추출하는 키트