CN210572338U

CN210572338U - 试剂盒

Info

Publication number: CN210572338U
Application number: CN201921438801.0U
Authority: CN
Inventors: 何军光; 徐京; 楼亿圆; 翁嘉慧; 吕洪坤; 张晓丽; 佘慧玲
Original assignee: Zhejiang Xinan Chemical Industrial Group Co Ltd
Current assignee: Yuan Longping High Tech Agriculture Co ltd
Priority date: 2019-08-30
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2020-05-19
Anticipated expiration: 2029-08-30

Abstract

本实用新型涉及生物检测领域，特别涉及一种试剂盒。本实用新型公开了一种新的AM79 EPSPS蛋白的定量检测试剂盒，通过原核表达获得重组AM79 EPSPS蛋白，将重组蛋白免疫小鼠，并通过筛选得到特异性的单克隆抗体，最终开发出定量检测AM79 EPSPS蛋白含量的酶联免疫定量检测试剂盒。该ELISA试剂盒，可定量检测AM79 EPSPS的蛋白。利用生产试剂盒，对实际样本进行检测。

Description

试剂盒

技术领域

本实用新型涉及生物检测领域，特别涉及试剂盒。

背景技术

利用宏基因组学方法从受草甘膦污染的土壤中分离得到的抗除草剂的 EPSP合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphatesynthase,EPSPS)是生物体内芳香族氨基酸——色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生物合成过程中的关键性酶；草甘磷是通过抑制EPSP合成酶的活性而阻断芳香族氨基酸的合成最终导致受试植物死亡。但是某些细菌的EPSP合成酶的活性不被草甘膦所抑制，所以细菌EPSPS基因的表达可以使植物免受除草剂的伤害。将除草剂抗性基因 EPSPS转入大豆，旨在培育具抗草甘膦优良特性的转基因大豆，提高大豆生产中的田间除草效果，降低生产成本。

利用宏基因组学方法从受草甘膦污染的土壤中分离得到的抗除草剂的 EPSPS基因，构建了植物组成型表达载体pSOY19，由35S启动子驱动，可以为转基因植物提供草甘膦抗性。pSOY19质粒中只含有1种能在植物细胞中表达的基因：细菌EPSPS，位于CaMV 35S启动子的控制下。抗除草剂基因表达质粒为9557bp。插入序列EPSPS基因全长1321bp，编码一个含有440个氨基酸的多肽。通过农杆菌介导法，已将EPSPS外源基因转化大豆华春3号和Jack品种并获得转EPSPS基因的抗除草剂转基因大豆材料。

此前，对AM79 EPSPS检测多用常规的RT-PCR检测方法，操作繁杂、耗时长、成本较高、不能定量检测，只能定性判断，且不能高通量检测。

实用新型内容

有鉴于此，本实用新型提供了杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体在检测 AM79EPSPS蛋白中的应用，以及转基因蛋白AM79 EPSPS双抗体夹心ELISA 定量检测试剂盒，该试剂盒特异性好、灵敏度高、稳定性好，能够快速、简便、高效的定量检测转基因蛋白AM79EPSPS，成本低、适合高通量检测。

为了实现上述实用新型目的，本实用新型提供以下技术方案：

本实用新型提供了一种试剂盒，一种试剂盒，其特征在于，包括盒体(2)、盒盖(1)、以及所述盒体(2)与所述盒盖(1)之间的夹层(6)，还包括设置于所述盒体(2)的试剂孔(4)和试剂瓶(5)；所述试剂孔(4)下凹，与所述试剂瓶(5)的瓶底紧密配合；

所述夹层(6)设置有下凹板位，所述下凹板位分别与抗体预包被酶标板 (7)和操作说明书(8)紧密配合；

所述抗体预包被酶标板的抗体为鼠抗AM79 EPSPS单克隆抗体；所述鼠抗AM79EPSPS单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO：C201937的杂交瘤细胞制得；

所述试剂瓶至少有1个；所述试剂瓶分别装有待测物标准品、样品稀释液、显色剂、洗涤液、反应终止液、酶标抗体中的一种或多种。

在本实用新型的一些具体实施方案中，所述鼠抗AM79 EPSPS单克隆抗体的包被浓度为1.8～2.2μg/mL。

在本实用新型的一些具体实施方案中，所述酶标抗体为酶标记的兔抗 AM79EPSPS多克隆抗体；所述酶标记抗体的浓度为2μg/mL。

在本实用新型的一些具体实施方案中，所述酶标抗体的酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶或β-半乳糖苷酶。

在本实用新型的一些具体实施方案中，所述样品稀释液为0.01mM、pH 值为7.4的PBS缓冲液。

在本实用新型的一些具体实施方案中，所述洗涤液的溶剂是0.01mM、pH 值为7.4的PBS缓冲液，溶质为吐温-20，吐温-20在洗涤液中的体积百分浓度为0.2％。

在本实用新型的一些具体实施方案中，所述终止液为2M的硫酸水溶液。

在本实用新型的一些具体实施方案中，所述显色剂包括辣根过氧化物酶催化底物A液和B液；所述辣根过氧化物酶催化底物A液为体积浓度为3％的H₂O₂水溶液；所述辣根过氧化物酶催化底物B液制备方法如下：将1mL 浓度为10mg/mL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液加入到100mL浓度为0.1 mol/L、pH为6.0的磷酸缓冲液中配成。

在本实用新型的一些具体实施方案中，本实用新型提供的转基因蛋白 AM79EPSPS双抗体夹心ELISA定量检测试剂盒，包括预包被酶标板和酶标记抗体，所述预包被酶标板是采用所述抗转基因蛋白AM79 EPSPS蛋白单克隆抗体包被的酶标板，所述酶标记抗体是辣根过氧化物酶标记的抗转基因蛋白AM79 EPSPS蛋白多克隆抗体；所述抗转基因蛋白AM79 EPSPSN蛋白多克隆抗体通过用转基因蛋白AM79 EPSPSN蛋白免疫兔子，获取兔子血清后纯化获得。

在本实用新型的一些具体实施方案中，本实用新型提供的定量检测腹泻样品中AM79 EPSPS的方法，该方法包括：

(1)从待测样本中提取蛋白，获得蛋白提取液；

(2)用本实用新型提供的试剂盒对AM79 EPSPS蛋白的标准品进行检测，获得浓度-吸光度标准曲线；所述检测包括加样、第一孵育、第一洗涤、加酶、第二孵育、第二洗涤、显色、终止和读数；所述读数为读取吸光度；

(3)用本实用新型提供的试剂盒对所述蛋白提取液进行检测，获得吸光度；所述检测包括加样、第一孵育、第一洗涤、加酶、第二孵育、第二洗涤、显色、终止和读数；所述读数为读取吸光度；

(4)根据获得的AM79 EPSPS蛋白标准品的浓度-吸光度标准曲线，获得待测样本中的AM79 EPSPS蛋白浓度。

本实用新型公开了一种基于AM79 EPSPS蛋白的定量检测试剂盒，通过原核表达获得重组AM79 EPSPS蛋白，将重组蛋白免疫小鼠，并通过筛选得到特异性的单克隆抗体，最终开发出定量检测AM79 EPSPS蛋白含量的酶联免疫定量检测试剂盒。其包括：将AM79 EPSPS基因经过优化重组构建入大肠杆菌原核表达系统，通过表达纯化得到重组AM79 EPSPS蛋白；用该蛋白免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠，再用免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，通过筛选获得特异性单克隆抗体细胞株，通过制备腹水的方式，经过纯化获得特异性单克隆抗体；用HRP偶联抗体，用双抗体夹心的ELISA方法，筛选配对抗体；建立双抗体夹心的ELISA方法，通过优化得到ELISA试剂盒体系，可定量检测AM79 EPSPS的蛋白。利用生产试剂盒，对实际样本进行检测。

生物保藏说明

杂交瘤细胞株F0，于2019年03月05日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为CCTCC NO：C201937。

附图说明

为了更清楚地说明本实用新型实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示试剂盒结构图；其中，1-盒盖；2-盒体；3-固定底座；4-试剂孔； 5-试剂瓶；6-夹层；7-抗体预包被酶标板；8-操作说明书；

图2示AM79 EPSPS蛋白的原核表达及纯化结果的SDS-PAGE电泳图；其中泳道MK为marker，泳道LS是进样液，泳道FT是流穿液，泳道 40/80/200/500分别为咪唑浓度为40、80、200和500mM的洗脱液；

图3示使用本实用新型提供的试剂盒检测AM79 EPSPS的标准曲线；其中，横坐标为重组AM79 EPSPS蛋白的浓度，纵坐标为OD值。

具体实施方式

本实用新型公开了一种试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本实用新型。本实用新型的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本实用新型内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本实用新型技术。

本实用新型采用以下技术方案：

本实用新型提供了一种试剂盒，包括盒体、盒盖、放置于盒内的抗体预包被酶标板、试剂瓶；所述盒体设置有下凹的抗体预包被酶标板位和下凹的瓶位，所述盒盖设置有上凸的抗体预包被酶标板位和上凸的瓶位；

所述盒盖的上凸的抗体预包被酶标板位、所述盒体的下凹的抗体预包被酶标板位分别与所述抗体预包被酶标板紧密配合；

所述盒盖的上凸的瓶位、所述盒体的下凹的瓶位与所述试剂瓶紧密配合；

在本实用新型的一些具体实施方案中，所述抗转基因蛋白AM79 EPSPS 单克隆抗体的包被浓度为2μg/mL，所述酶标记抗体的浓度为2μg/mL。

在本实用新型的一些具体实施方案中，所述试剂盒还包括标准品冻干粉、样品稀释液、显色剂、终止液或洗涤液中的一种或多种。

在本实用新型的一些具体实施方案中，所述标准品冻干粉为AM79 EPSPS重组蛋白；

所述样品稀释液为0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液；

所述洗涤液的溶剂是0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液，溶质为吐温 -20，吐温-20在洗涤液中的体积百分浓度为0.2％；

终止液：2M的硫酸水溶液；

显色剂包括辣根过氧化物酶催化底物A液和B液；所述辣根过氧化物酶催化底物A液是体积浓度为3％的H₂O₂水溶液；所述辣根过氧化物酶催化底物B液制备方法如下：将1mL浓度为10mg/mL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液加入到100mL浓度为0.1mol/L、pH为6.0的磷酸缓冲液中配成。

在本实用新型的一些具体实施方案中，本实用新型提供的定量检测待测样本中AM79 EPSPS的试剂盒，其包括如下组分：

(1)抗体预包被酶标板；

(2)样品稀释液，其为磷酸盐缓冲液；

(3)洗涤液，其为含Tween-20的磷酸盐缓冲液；

(4)反应终止液，其为H₂SO₄溶液；

(5)酶标抗体，为辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗AM79 EPSPS多克隆抗体；

(6)显色剂，为TMB显色剂；

(7)AM79 EPSPS标准品。

组分(1)中，所述抗体预包被酶标板的制备过程如下：

步骤1：将特异性鼠抗AM79 EPSPS单克隆抗体(本实用新型提供的保藏编号为CCTCC NO：C201937的杂交瘤细胞株F0制得的单克隆抗体)稀释到一定浓度，加至96孔酶标板，每孔100μL，37℃反应3h；

步骤2：将板孔溶液甩干，加入洗涤液，浸泡5min，将板孔溶液甩干，在吸水纸上拍干；

步骤3：将封闭液加至96孔酶标板，每孔150μL，37℃反应2h；

步骤4：将板孔溶液甩干，在吸水纸上拍干，用冷冻干燥机抽干；

步骤5：真空封装。

优选地，所述抗体预包被酶标板的制备过程中，所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液；进一步优选地，所述碳酸盐缓冲液为Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，其浓度为0.1M，pH值为9.6；

优选地，所述鼠抗AM79 EPSPS单克隆抗体的包被浓度为1.8～ 2.2μg/ml、优选1.9～2.1μg/ml、更优选2μg/ml；

优选地，所述封闭液为含BSA的碳酸盐缓冲液；

组分(5)中，所述酶标抗体为HRP标记的兔抗AM79 EPSPS多克隆抗体。

优选地，所述抗AM79 EPSPS的单克隆抗体的浓度为1.8～2.2μg/ml、优选1.9～2.1μg/ml、更优选2μg/ml；

优选地，加入HRP标记的抗AM79 EPSPS蛋白的多克隆抗体后的孵育温度为22～26℃、优选25℃，孵育时间为40～50分钟、优选45分钟。

所用鼠抗AM79 EPSPS为通过用AM79 EPSPS重组蛋白免疫BALB/c小鼠，然后通过细胞融合、克隆化筛选制备得到单克隆抗体细胞株，然后制备小鼠腹水，经过纯化得到。

组分(7)中所述AM79 EPSPS标准品为AM79 EPSPS基因经过优化后构建入大肠杆菌表达体系，重组表达纯化得到。

组分(4)中，所述硫酸为1.8～2.2M、优选1.9～2.1M、更优选2M的硫酸。

本实用新型还提供了AM79 EPSPS蛋白的检测方法，取所述的单克隆抗体或所述的抗体组合与待测样本混合，孵育，检测。

第一方面，本实用新型提供了一种定量检测腹泻样品中AM79 EPSPS的方法，该方法包括：

(1)从待检样品中提取蛋白，得到蛋白提取液；

(2)用AM79 EPSPS定量检测试剂盒对蛋白提取液进行检测，其主要过程包括加样、孵育、洗涤、加酶、孵育、洗涤、显色、终止和读数。

(3)通过用AM79 EPSPS蛋白标准品制作的浓度-吸光度标准曲线，计算待检样品中的AM79 EPSPS蛋白浓度。

第二方面，本实用新型提供了一种定量检测临床样品中AM79 EPSPS的试剂盒，其包括如下组分：

(1)抗体预包被酶标板

(2)样品稀释液，其为磷酸盐缓冲液；

(3)洗涤液，其为含Tween-20的磷酸盐缓冲液；

(4)反应终止液，其为H₂SO₄溶液；

(6)显色剂，为TMB显色剂

(7)AM79 EPSPS标准品。

组分(1)中，所述抗体预包被酶标板的制备过程如下：

(1)将特异性鼠抗AM79 EPSPS单克隆抗体稀释到一定浓度，加至96 孔酶标板，每孔100μL，37℃反应3h；

(2)将板孔溶液甩干，加入洗涤液，浸泡5min，将板孔溶液甩干，在吸水纸上拍干；

(3)将封闭液加至96孔酶标板，每孔150μL，37℃反应2h；

(4)将板孔溶液甩干，在吸水纸上拍干，用冷冻干燥机抽干；

(5)用真空包装机包装于铝箔袋中。

优选的，所述抗体预包被酶标板的制备过程中，所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液；进一步优选地，所述碳酸盐缓冲液为Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，其浓度为0.1M，pH值为9.6；

优选地，所述封闭液为含BSA的碳酸盐缓冲液；

组分(5)中，所述酶标抗体为HRP标记的兔抗AM79 EPSPS多克隆抗体；

本实用新型提供的转基因蛋白AM79 EPSPS的定量检测方法准确、可靠，与已有技术相比操作时间短，成本低。

本实用新型的有益效果:

(1)、特异性强:本实用新型试剂盒与AM79 EPSPS重组蛋白和实际样本中的转基因AM79 EPSPS蛋白有较强的反应性，其他转基因蛋白无交叉反应。

(2)、灵敏度高:本实用新型试剂盒最低可检测25ppb含量的AM79 EPSPS。

(3)、定量分析：本实用新型试剂盒可以对样品中AM79 EPSPS蛋白含量进行定量。

(4)、重复性：本实用新型试剂盒的批内和批间重复性较好。

(5)、快速：本实用新型试剂盒操作简便、快速。

因此，本实用新型试剂盒为AM79 EPSPS的高通量检测以及相关基础研究提供技术手段，对转基因的研发和检测具有重要意义。

本实用新型提供的试剂盒中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本实用新型：

实施例1、制备重组AM79 EPSPS蛋白

1.序列合成

将已经公开的AM79 EPSPS的基因序列按照大肠杆菌的密码子偏好情况进行优化，得到优化后的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。将优化后的基因送基因公司合成，然后将该片段克隆至原核表达载体pET-30a(+)的Nde I和Xho I酶切位点之间，得到 pET-30a-AM79 EPSPS阳性质粒。

SEQ ID No：1

ATGTCTCATTCTACCAGTCGTAGCCCGTGGAGCAAAGCCACCGAAT ATCATGAAGCACTGGTGACCCCGACCAGTAATAAAATTAATGGCG AAATTTTTGTTCCGGGTAGCAAATCTTATACCAATCGTGCACTGAT TATTGCTGCTCTGGCCGAAGGTACATCAACCCTGAAAGGCATTCTG AAAAGCGATGATAGCTATTGGTGCATTGATGCTCTGCGCCGTCTGG GCATTAAAATTGAAGTTGCTGAAGAAACCGTTACCATTCATGGTTG CGGCGGTAAATGGCCGGTGCAGTCAGCAGAACTGTTTATTGGCGC GGCTGGTACAATTGCTCGTTTTCTGCCGGGTGCACTGGCTGTGGCACAGCAGGGCGAATGGATTGTTGATGGCGTGCCGCAGCTGCGTGAA CGCCCGCTGAAACCGCTGGTTGATGCACTGACCCAGCTGGGTGGC CGCATTGAATATCTGACCGAACATCCGGGTCTGCCGCTGCGTGTGA AAGGTGCGGGTCTGTCTGGTCAGCATGTTCGCGTTCCGGGCAATGT TTCATCACAGTTTCTGAGTGGTCTGCTGATTGCGAGCCCGTATGCC TCTGAAGCTGTTAGTATTGAAGTTATTAATGGCCTGGTGCAGCCGT CTTATATTGCCATTACCATTCAGCTGATGCGTGAATTTGGTGCCAA AGTTGAACATAATGAAGATTATAGTCTGTTTAAAGTTTATCCGACC GGCTATCAGGGCCGTGATACCATTCTGGAAGCGGATGCCAGTACC GCCTGTTATTTTCTGAGCCTGGCCGCCCTGACCGGTGGCACCATTC AGGTGAAAAATGTTGGTTATCATAGCTATCAGCCGGATGCGCGCTT TATTGATGTTCTGGAACAGATGGGTTGCGAAGTGATTAAAAATGA ATCTTTTCTGGAAGTGACCGGCCCGACCCGTCTGAAAGGTGGCTTT GAAGTGGATATGAAACCGATGAGCGATCAGGCACTGACCATTGGT GCTCTGGCACCGTTTGCTGATGCACCGATTCGTGTGACCAATGTTG CCCATATTCGCGCACATGAAAGCGATCGCATTGCCGTTATTTGTAG CAGCCTGCAGCAGATGGGCGTTCAGGTGGAAGAACGTGAAGATGG CTTTACCATTTATCCGGGCCAGCCGGTTGGCACCACCCTGAATCCG CATGATGATCATCGCAATGCAATGGTTTTTGGTCTGCTGGGCGTTA AAGTTCCGCATATTCGCATTGTTGATCCGGGTTGCGTGTCTAAAAC CTGTCCGGCTTATTTTGAAGAACTGCAGAAATTTGGCATTCATGTGGAATATAAT

SEQ ID No：2

MSHSTSRSPWSKATEYHEALVTPTSNKINGEIFVPGSKSYTNRALIIAA LAEGTSTLKGILKSDDSYWCIDALRRLGIKIEVAEETVTIHGCGGKWP VQSAELFIGAAGTIARFLPGALAVAQQGEWIVDGVPQLRERPLKPLVD ALTQLGGRIEYLTEHPGLPLRVKGAGLSGQHVRVPGNVSSQFLSGLLI ASPYASEAVSIEVINGLVQPSYIAITIQLMREFGAKVEHNEDYSLFKVY PTGYQGRDTILEADASTACYFLSLAALTGGTIQVKNVGYHSYQPDAR FIDVLEQMGCEVIKNESFLEVTGPTRLKGGFEVDMKPMSDQALTIGAL APFADAPIRVTNVAHIRAHESDRIAVICSSLQQMGVQVEEREDGFTIYP GQPVGTTLNPHDDHRNAMVFGLLGVKVPHIRIVDPGCVSKTCPAYFEELQKFGIHVEYN

2.AM79 EPSPS蛋白表达、纯化

(1)转化：pET-30a-AM79 EPSPS阳性质粒转化原核表达宿主菌 BL21(DE3)，涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基(卡那霉素浓度 100μg/mL)，在37℃培养12-16h。挑取单菌落于含有卡那霉素的LB液体培养基(卡那霉素浓度50μg/mL)中培养12-16h，通过测序鉴定，得到阳性重组菌pET-30a-AM79 EPSPS/BL21，保存其甘油菌于-80℃。

(2)菌种活化：37℃过夜培养活化pET-30a-AM79 EPSPS/BL21的甘油菌。

(3)诱导表达：按照接种量为0.5％将pET-30a-AM79 EPSPS/BL21 转接至300mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.4-0.6，加入终浓度为1mM的IPTG，37℃诱导表达3h。将发酵液在8000rpm、4℃条件下离心5min，收集诱导表达后菌体。

(4)菌体裂解：在诱导表达后菌体中加入100mL破碎液(PBS缓冲液)进行超声波裂解。超声波裂解条件：冰浴、功率60％、超声2s、间隔2s，裂解时间为15min。将菌体裂解液在12000rpm、4℃条件下离心15min，分别收集裂解液上清和沉淀，经SDS-PAGE电泳检测，发现蛋白主要以包涵体形式表达。

(5)包涵体纯化：增溶液：溶剂为pH8.0、20mM的Tris-HCl缓冲液，溶质及其浓度如下：50mMNaCl、20mM咪唑、8M尿素、0.2mMDTT 和2％(质量百分浓度)Triton。采用增溶液悬浮诱导表达后pET-30a-AM79 EPSPS/BL21的裂解液沉淀，在冰浴条件下放置2h，然后10000rpm、4℃离心 15min，收集上清。利用组氨酸标签蛋白亲和纯化填料纯化重组蛋白，收集流穿液、洗脱液，采用SDS-PAGE电泳检测蛋白纯化效果。结果如图1所示，重组转基因AM79EPSPS蛋白(分子量约48kD)主要被含200mM咪唑的流动相洗脱下来，纯度85％，蛋白浓度0.5mg/mL。300mL培养基发酵后，最终得到5mg重组转基因AM79 EPSPS蛋白。

实施例2、鼠抗AM79 EPSPS单克隆抗体的制备

1、免疫原制备：将实施例1制备的重组蛋白(0.5mg/mL)分别与等体积佐剂混合乳化均匀，成油包水状态，制成重组蛋白疫苗，以备免疫小鼠。第一次免疫所用佐剂为弗氏完全佐剂和YOΜLONG佐剂，第二次及之后的免疫作用佐剂为弗氏不完全佐剂和YOΜLONG佐剂。

2、免疫策略：取4只Balb/c小鼠(编号分别为：FL021-1、FL021-2、 FL021-3、FL021-4)用重组转基因AM79 EPSPS蛋白疫苗进行皮下免疫，每只小鼠皮下免疫3次，每次每只小鼠免疫0.1mg免疫原，每次免疫间隔4周，三免后一周断尾取血，分离血清，采用间接ELISA方法检测其抗体效价，具体方法如下：

1)用0.1mol/L、pH＝9.6的碳酸盐缓冲液稀释转基因AM79 EPSPS蛋白 (实施例1制备)至1ug/ml，加入96孔酶标板，每孔100μL，37℃反应3h或者4℃静置过夜。

2)甩去板孔中液体，加入250μL洗涤缓冲液，静置30s，甩去板中液体，重复3次。

3)加入检测样本，每孔100μL，同时加入阳性对照(步骤(2)中所取阳性小鼠血清)、阴性对照(免疫前小鼠血清)和空白对照(不加小鼠血清)37℃反应45min，

4)重复步骤2)；

5)加入HRP标记的羊抗鼠酶标二抗(北京博奥森生物技术有限公司)，每孔100μL，37℃反应45min。

6)重复步骤2)；

7)加入显色剂，每孔100μL，室温避光反应15min。

8)加入终止液，每孔100μL，使用酶标仪在450nm波长处读取OD值。

结果如表1。

表1各小鼠血清的抗体效价

小鼠编号	效价
		FL021-1	1:243000
FL021-2	>1:243000
		FL021-3	>1:243000
FL021-4	>1:243000

3、细胞融合：三免后两周，取血清抗体效价最高的小鼠对其腹腔注射 0.1mL重组蛋白溶液(0.5mg/mL)进行加强免疫，三天后进行细胞融合。将该小鼠断颈处死，用70％乙醇溶液浸泡30min消毒，在超净台剪开腹腔，取出脾脏，磨碎，过80目筛网，得到脾细胞，加入SP2/0骨髓瘤细胞，在PEG4000 的作用下进行细胞融合。

4、融合筛选：将融合好的细胞铺进96孔板，用HAT培养液(购自 sigma)进行培养，三天后换液，改用HT培养液(购自sigma)培养。10天后，取细胞培养上清采用间接ELISA方法检测抗体效价(方法同上)，取阳性孔以备进行亚克隆。

5、亚克隆与建株：使用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，10天后检测，将阳性克隆继续采用有限稀释法进行亚克隆，直到得到的亚克隆都为阳性。最终获得9株能够分泌抗AM79 EPSPS蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，依次编号为1#、2#……9#，各杂交瘤细胞株与其产生的抗AM79 EPSPS蛋白单克隆抗体编号相同。

6、扩大培养：将各杂交瘤细胞株分别扩大培养，并进行冻存。

7、抗体制备与纯化

制备、纯化上述9株杂交瘤细胞株产生的抗AM79 EPSPS蛋白单克隆抗体，具体方法如下：

a)腹水制备：在小鼠腹腔注射矿物油，一周后将杂交瘤细胞株以PBS缓冲液稀释后注射入小鼠腹腔，每只小鼠注射的杂交瘤细胞数约为5×10⁵个，10 天后收集腹水。

b)单克隆抗体纯化：将腹水在4000rpm、室温条件下离心15min，取上清。在4℃、搅拌条件下向腹水上清中逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至体系中硫酸铵饱和度达到50％，继续搅拌30min，然后在13000rpm、4℃条件下离心30min，弃上清，取沉淀溶于PBS缓冲液(0.01M、pH7.4)，在4℃、搅拌条件下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至体系中硫酸铵饱和度为33％，继续搅拌 30min，在13000rpm、4℃条件下离心30min，弃上清，取沉淀溶于PBS缓冲液(0.01M、pH7.4)，4℃透析过夜，得到单克隆抗体粗蛋白，测定抗体含量， -20℃冻存备用。将单克隆抗体粗蛋白采用Protein G预装柱(GE公司)进行纯化，新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5ml、浓度为0.4M的PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续采用10ml、0.4M的PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；采用5ml、0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.7)洗脱结合位点上的抗体，在洗脱液中加入pH 8.0、1M的Tris-HCl中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。

8、抗体特性分析

分析本实施例标题7获得的9个单克隆抗体的特性。

a)效价测定

用间接ELISA法(同上)检测各单克隆抗体的效价，以0.5作为截断值。上述9个单克隆抗体中，有5个单克隆抗体效价>1：1024×10³，3个单克隆抗体效价介于1：512×10³和1：1024×10³之间，1个单克隆抗体效价低于1：64×10³。

其中3#单抗效价>1：1024×10³。

b)亚型测定

根据亚型检测试剂盒说明书测定抗体亚型，其中6株抗体亚型为IgG1，2 株抗体亚型为IgG2a，1株为IgM。

其中3#单抗亚型为IgG1。

实施例3、制备酶标记多克隆抗体与抗体配对筛选

1.制备酶标记的抗转基因蛋白AM79 EPSPSN蛋白的多克隆抗体

(1)制备抗转基因蛋白AM79 EPSPSN蛋白的多克隆抗体将实施例1制备的重组AM79EPSPSN蛋白按照常规方法免疫兔子，当兔血清抗体效价(实施例2中方法检测)达到1：243000以上，采集兔血清；兔多克隆抗纯化：将兔血清在4000rpm、室温条件下离心15min，取上清。在4℃、搅拌条件下向腹水上清中逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至体系中硫酸铵饱和度达到50％，继续搅拌30min，然后在13000rpm、4℃条件下离心30 min，弃上清，取沉淀溶于PBS缓冲液(0.01M、pH7.4)，在4℃、搅拌条件下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至体系中硫酸铵饱和度为33％，继续搅拌30 min，在13000rpm、4℃条件下离心30min，弃上清，取沉淀溶于PBS缓冲液 (0.01M、pH7.4)，4℃透析过夜，得到单克隆抗体粗蛋白，测定抗体含量， -20℃冻存备用。将兔多克隆抗体抗体粗蛋白采用Protein A预装柱(GE公司) 进行纯化，新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5ml、浓度为0.4M的PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续采用10ml、0.4M的PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；采用5ml、0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 3.0)洗脱结合位点上的抗体，在洗脱液中加入pH 8.0、1M的Tris-HCl中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。

(2)酶标多克隆抗体的制备

取纯化后的抗转基因蛋白AM79 EPSPSN蛋白的多克隆抗体，与辣根过氧化物酶(HRP)耦连，得到酶标记抗体。具体方法如下：

(1)取5mg HRP溶于纯水，加入0.2ml、0.1M的NaIO₄溶液，室温反应30分钟；

(2)将5mg纯化后的抗转基因蛋白AM79 EPSPSN蛋白的多克隆抗体用偶联缓冲液(pH9.5、10mM的碳酸盐缓冲液)透析过夜；

(3)将步骤(1)所得溶液加入步骤(2)透析后所得抗体溶液中，室温反应2小时；

(4)加入硼氢化钠封闭反应位点；

(5)磷酸盐缓冲液透析过夜，得到酶标多克隆抗体，加入等量甘油保存于-20℃。

2.抗体配对筛选

采用实施例3制备的各单克隆抗体分别包被酶标板，然后以重组AM79 EPSPS蛋白(1ppm)作为夹心抗原，以本实施例制备的酶标多克隆抗体作为检测抗体，进行双抗夹心ELISA检测，以进行抗体配对筛选。阴性对照中以缓冲液替代夹心抗原。检测结果以OD₄₅₀值表示。

部分配对筛选结果如表2。

表2抗体配对筛选

从表2中的配对筛选数据可以看到，其中有8个抗体阳性样本6#的OD₄₅₀值>2.5*阴性样本OD₄₅₀值，可判定为可检出阳性样本。其中抗AM79 EPSPS N蛋白单克隆3#(缩写为单克隆抗体3#)对阳性样本的OD₄₅₀值很高，且阴性样本OD₄₅₀值较低，检测效果最好，因此，选取单克隆抗体3#作为开发ELISA试剂盒的抗体。单克隆抗体3#是由杂交瘤细胞株3#制备产生，其亚型为IgG1，纯化后的单克隆抗体3#效价>1:1024×10³。

实施例4转基因蛋白AM79 EPSPS双抗体夹心ELISA定量检测试剂盒的组装

选择抗AM79 EPSPS蛋白单克隆抗体3#制备试剂盒，检测不同的ELISA 条件：包被抗体浓度、检测抗体使用浓度、反应时间等，最终确定试剂盒中成分及检测方法。

1.试剂盒组成

试剂盒组成：包括预包被酶标板、标准品冻干粉、酶标记抗体工作液、样品稀释液、显色剂、终止液、洗涤液。

(1)试剂的配制

包被缓冲液(0.1M、pH值为9.6的CB缓冲液)：3.2克碳酸钠，5.86克碳酸氢钠，用纯水定容至1L。

样品稀释液(0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液)：8克氯化钠，3.35 克十二水合磷酸氢二钠，0.2克氯化钾，0.2克磷酸二氢钾，用纯水定容至 1L。

洗涤液：溶剂是0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液，溶质为吐温-20，吐温-20在洗涤液中的体积百分浓度为0.2％。

封闭液：溶剂是0.1M、pH值为9.6的CB缓冲液，溶质为BSA(牛血清白蛋白)，BSA在封闭液中的质量百分浓度为1％。

终止液：2M的硫酸水溶液。

显色剂：包括辣根过氧化物酶催化底物A液和B液。辣根过氧化物酶催化底物A液：体积浓度为3％的H₂O₂水溶液。辣根过氧化物酶催化底物B 液：将1mL浓度为10mg/mL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶液加入到 100mL浓度为0.1mol/L、pH为6.0的磷酸缓冲液中配成；浓度为0.1mol/L、 pH为6.0的磷酸缓冲液的配制方法为：0.1mol/L磷酸二氢钠水溶液87.7mL 和0.1mol/L磷酸氢二钠水溶液12.3mL混合即成。

(2)预包被酶标板的制备

预包被酶标板的制备方法，包括如下步骤：

1)包被：采用包被缓冲液将纯化后的、由杂交瘤细胞株AM79 EPSPS分泌的抗AM79EPSPS N蛋白单克隆抗体(制备方法见实施例2)稀释至2 μg/mL，得到包被工作液。将包被工作液按每孔100μL加入酶标板中，4℃静置12-18h。

2)封闭：将酶标板以洗板机吸干-洗涤二次，将板条在洁净的吸水纸上拍干；然后将封闭液按每孔150μL加入酶标板中，37℃烘焙3小时。洗涤过程中采用洗涤液。

3)抽干密封：弃去烘焙后的酶标板中的封闭液，拍干，放入真空冷冻干燥机中抽干3小时，真空热封。

(3)AM79 EPSPS标准品冻干粉

将实施例1中方法制备得到的重组AM79 EPSPS蛋白(纯化后的)，用样品稀释液稀释到2μg/ml。在3mL棕色玻璃瓶中加入100μL、2μg/ml的重组AM79 EPSPS蛋白，采用真空冷冻干燥机抽干，得到AM79 EPSPS标准品冻干粉。

(4)酶标记抗体工作液的配制

采用实施例4中方法制备酶标记多克隆抗体，采用0.01mM、pH值为7.4 的PBS缓冲液稀释至2μg/mL，得到酶标记抗体工作液，2～8℃避光保存。

实施例5 AM79 EPSPS双抗体夹心ELISA定量检测试剂盒的使用与验证 1.试剂盒的具体使用方法：

(1)从待检样本中提取蛋白：取0.1g样本，放入1ml样品提取液进行提取，4000rpm离心5分钟，取上清，得蛋白提取液；

(2)将试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温(20-25℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

(3)加标准品/样本：在预包被酶标板的每孔中加入100μL样品稀释液 (空白对照)或标准品(AM79 EPSPS标准品冻干粉用样品稀释液溶解)或样本蛋白提取液，轻轻振荡混匀，25℃避光环境中反应45min。

(4)洗板：将孔内液体甩干，用洗涤液250μL/孔充分洗涤4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头戳破)。

(5)加酶标记抗体工作液：加入酶标记抗体工作液100μL/孔，轻轻振荡混匀，25℃避光环境中反应45min，取出重复洗板步骤(4)。

(6)显色：将辣根过氧化物酶催化底物A液和B液等体积混合，每孔加入100μL，置于25℃避光环境中反应15min。

(7)测定：加入终止液100μL/孔，轻轻振荡混匀，在酶标仪中检测450nm 处每孔的OD值，即得到OD₄₅₀值。

按照上述方法，制作浓度-吸光度标准曲线，标准品中重组AM79 EPSPS 蛋白浓度范围为200、100、50、25μg/kg，检测结果如表3所示。标准曲线如图3所示。

表3标准品检测结果(OD₄₅₀值)

标品(μg/kg)	OD<sub>450</sub>值
		200	2.208
100	1.262
		50	0.831
25	0.464
		0	0.116

(3)通过用AM79 EPSPS标准品制作的浓度-吸光度标准曲线，计算待检样品中的AM79 EPSPS蛋白浓度。

2.特异性

用AM79试剂盒检测其他几种常见转基因成分，测试试剂盒的特异性。

表4

转基因名称	标准品ppb	OD
			AM79	100	1.1256
空白对照	0	0.1638
			Cry1AbAc	10000	0.2017
Cry1C	10000	0.1872
			Cry1F	10000	0.1985
CP4 EPSPS	10000	0.2004
			G10EPSPS	10000	0.2063
PAT/bar	10000	0.2217

AM79试剂盒未能检测出6种常见的转基因成分，表明本实用新型提供的试剂盒的特异性好。

3.灵敏度

标准品梯度稀释，按照实施例5试剂盒的使用方法操作，检测本实用新型提供的试剂盒所能达到的灵敏度。

表5

标品(μg/kg)	OD<sub>450</sub>值
		400	3.6533
200	2.1155
		100	1.2363
50	0.7057
		25	0.4317
12.5	0.3075
		6	0.1863
0	0.1516

以标品0的OD值的2.5倍作为灵敏度判断标准，线性范围的最大OD 值控制在2.5以下，因此试剂盒检测标准品灵敏度达25μg/kg，检测线性 25～200ppb。

4.重复性

每个线性点重复6个孔，测试试剂盒的重复性。

表6

试剂盒每个线性点的检测值CV<5％，符合要求。

实施例6利用AM79 EPSPS双抗体夹心ELISA定量检测试剂盒对实际样品进行检测

1、样品处理

以非转基因玉米(阴性样本)和转am79 epsps转基因玉米(编号为 AM113-1、AM113-2、AM113-3)叶片为检测样品，利用水培法获得玉米幼苗后，剪下叶片，称取样品0.2g，加入样品提取液2mL，充分研磨震荡提取，离心，取上清用于AM79 EPSPS蛋白的检测；样本处理的稀释倍数为10倍。

2、操作步骤μL

各孔分别加入100μL样本提取液/阳性对照/阴性对照，25℃反应45min；

洗板，加入100μL多抗工作液，25℃避光反应30min；

洗板，加入100μL酶标工作液，25℃避光反应30min；

洗板，加入100μL显色剂，25℃避光反应15min；

加入100μL终止液，酶标仪450读数。

3、样本检测结果

表7

4、结论

提供的非转基因玉米阴性样本未检出，其他转基因玉米样品检测均为阳性，结果符合预期。

以上所述仅是本实用新型的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本实用新型的保护范围。

Claims

1.一种试剂盒，其特征在于，包括盒体(2)、盒盖(1)、以及所述盒体(2)与所述盒盖(1)之间的夹层(6)，还包括设置于所述盒体(2)的试剂孔(4)和试剂瓶(5)；所述试剂孔(4)下凹，与所述试剂瓶(5)的瓶底紧密配合；

所述夹层(6)设置有下凹板位，所述下凹板位分别与抗体预包被酶标板(7)和操作说明书(8)紧密配合；

所述抗体预包被酶标板的抗体为鼠抗AM79 EPSPS单克隆抗体；所述鼠抗AM79 EPSPS单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO：C201937的杂交瘤细胞制得；

所述试剂瓶(5)至少有1个；所述试剂瓶分别装有待测物标准品、样品稀释液、显色剂、洗涤液、反应终止液、酶标抗体中的一种或多种。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述鼠抗AM79 EPSPS单克隆抗体的包被浓度为1.8～2.2μg/mL。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体为酶标记的兔抗AM79 EPSPS多克隆抗体；所述酶标记抗体的浓度为2μg/mL。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体的酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶或β-半乳糖苷酶。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液的溶剂是0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液，溶质为吐温-20，吐温-20在洗涤液中的体积百分浓度为0.2％。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述终止液为2M的硫酸水溶液。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述显色剂包括辣根过氧化物酶催化底物A液和B液；所述辣根过氧化物酶催化底物A液为体积浓度为3％的H₂O₂水溶液；所述辣根过氧化物酶催化底物B液制备方法如下：将1mL浓度为10mg/mL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液加入到100mL浓度为0.1mol/L、pH为6.0的磷酸缓冲液中配成。