ES2545683B1

ES2545683B1 - Nueva proteína Cry de Bacillus thuringiensis con actividad insecticida para combatir un hemíptero.

Info

Publication number: ES2545683B1
Application number: ES201430173A
Authority: ES
Inventors: Primitivo Caballero Murillo; Leopoldo PALMA DOVIS; Iñigo Ruíz De ESCUDERO FUENTEMILLA; Delia Muñoz Labiano; Jesús MURILLO MARTINEZ; Colin Berry
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Publica de Navarra
Current assignee: Universidad Publica de Navarra
Priority date: 2014-02-10
Filing date: 2014-02-10
Publication date: 2016-09-06
Anticipated expiration: 2034-02-10
Also published as: WO2015118207A1; ES2545683A1

Abstract

Nueva proteína Cry de Bacillus thuringiensis con actividad insecticida para combatir un hemíptero.#La invención se refiere a un nuevo gen que codifica una proteína Cry (o delta-endotoxina), a la propia proteína codificada por dicho gen, a los sistemas para la expresión de la misma (vectores y células hospedadoras), y a la utilización de dicho gen y/o dicha proteína para combatir plagas de hemípteros, con preferencia por el pulgón verde, Myzus persicae, tanto mediante el uso de una composición que contenga la nueva proteína y/o un sistema para su expresión, como mediante plantas transgénicas en las que se expresa el gen. Dichas composiciones y plantas transgénicas son de especial interés, pues la proteína nueva proteína Cry presenta una capacidad insecticida con Myzus persicae especialmente buena, en comparación con otras proteínas Cry conocidas, que presentaban una capacidad insecticida reducida contra áfidos y no se conocía ninguna activa con Myzus persicae.

Description

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DESCRIPCION

Nueva proteina Cry de Bacillus thuringiensis con actividad insecticida para combatir un hemiptero

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere al campo de los biopesticidas y de las plantas transgenicas capaces de expresarlos. Mas concretamente, la invencion se refiere a un nuevo gen que codifica una proteina Cry (o delta-endotoxina), a la propia proteina codificada por dicho gen, a los sistemas para la expresion de la misma (vectores y celulas hospedadoras), y a la utilizacion de dicho gen y/o dicha proteina para combatir plagas de Myzus persicae (Sulzer), el afido comunmente conocido como pulgon verde, tanto mediante el uso de una composicion que contenga la proteina como mediante plantas transgenicas en las que se expresa el gen.

Antecedentes de la invencion

Bacillus thuringiensis (Bt) es una bacteria Gram positiva, ubicua y esporulante que frecuentemente sintetiza diversas proteinas (Cry, Cyt y Vip) con actividad insecticida contra una amplia gama de insectos que causan plagas tales como lepidopteros (Dulmage, 1970; Estruch et al., 1996), coleopteros (Estruch and Yu, 1998; Krieg et al., 1983), dipteros (Federici et al., 2003; Goldberg, 1977) y hemipteros (Porcar et al., 2009; Sattar and Maiti, 2011). Bt produce proteinas insecticidas durante la esporulacion que aparecen como cristales paraesporales, cristales que estan compuestos predominantemente de una o mas proteinas Cry o Cyt. Las proteinas Cry se denominan asi porque son las proteinas de las inclusiones paraesporales (cristales, que dan lugar a la abreviatura Cry) de Bt que presentan un efecto toxico experimentalmente verificable frente a un organismo diana o que tienen una similitud de secuencia significativa con una proteina Cry conocida, mientras que las proteinas Cyt son las proteinas de las inclusiones paraesporales de Bt que exhiben actividad hemolitica (citolitica, que da lugar a la abreviatura Cyt) o que tienen una similitud de secuencia significativa con una proteina Cyt conocida.

Las proteinas Cry pertenecen a una clase de toxinas bacterianas conocidas como toxinas formadoras de poros. Las proteinas Cry de Bt en particular no exhiben actividad insecticida hasta que no han sido ingeridas y solubilizadas en el intestino del insecto, donde la forma ingerida (protoxina) es hidrolizada por proteasas para dar lugar a la

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molecula toxica activa (toxina). Junto con algunas proteinas Cyt, se engloban dentro del grupo de las delta-endotoxinas. Las proteinas Cry generalmente presentan cinco bloques de secuencia conservados, y tres dominios estructurales conservados: dominio I o dominio N, dominio II o dominio M y dominio III o dominio C, que reciben esa denominacion por las regiones donde aparecen en la proteina: zona del extremo amino (N), zona media (M) y zona del extremo carboxilo (C). Esos tres dominios estructurales son responsables de su actividad insecticida contra distintas especies de insectos, asi como tambien contra celulas cancerigenas de origen humano (parasporinas) (Ohba et al., 2009). De estos ultimos, se considera que los dominios M y C en particular estan implicados en el reconocimiento y union al receptor, y se consideran por ello determinantes de su especificidad como toxinas. El dominio III (dominio C) presenta a menudo una homologia estructural con proteinas que se unen a hidratos de carbono como el dominio de union a celulosa de la 1,4-p-glucanasa C, galactosa oxidasa, sialidasa, p-glucoronidasa, el dominio de union a hidratos de carbono de la xilanasa U y p-galactosidasa. La forma de protoxina de muchas proteinas Cry presenta una extension en el extremo carboxilo que hace que su longitud sea mayor que la de otras protoxinas de la familia, extension que se considera dispensable para la toxicidad pero que se cree que juega un papel en la formacion de los cuerpos de inclusion cristalinos dentro de la bacteria.

Los insecticidas basados en delta-endotoxinas han tenido un uso intensivo, que ha dado lugar incluso a la aparicion de resistencias en algunas especies.

Dentro del orden de los hemipteros (Hemiptera), la familia de los afididos o afidos (Aphididae), mas conocidos como pulgones, contiene gran numero de parasitos de plantas angiospermas, que originan algunas de las principales plagas que afectan a diferentes cultivos agricolas. El pulgon verde, Myzus persicae (Sulzer, 1776), es una de las principales plagas polifagas en muchas regiones del mundo (Harrington, 2007) incluida Espana (Diaz et al., 2006). Afecta tambien a un gran numero de cultivos agricolas de gran importancia economica (Harrington, 2007), entre los que se incluyen distintos frutales (como los de algunos citricos, el melocotonero y otros arboles del genero Prunus) y cultivos herbaceos como solanaceas, gramineas y cruciferas. En dichos cultivos no solo produce danos directos por alimentacion, sino tambien por ser un eficiente vector transmisor de varios virus fitopatogenos causantes de enfermedades vegetales muy perjudiciales (Nebreda et al., 2004). Es mas, recientemente se ha descrito que esta especie se ha hecho resistente a algunos de los insecticidas quimicos de

sintesis mas comunmente utilizados para su control en Europa (Slater et al., 2012).

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Actualmente, se conocen varias proteinas Cry de Bt con actividad insecticida contra afidos. Sin embargo, no han resultado especialmente toxicas contra estos insectos, ya que son necesarias elevadas dosis para matar entre el 50% y el 100% de los insectos tratados (Chougule and Bonning, 2012; Porcar et al., 2009). La Tabla 1 que se muestra a continuacion resume las toxicidades conocidas de proteinas Cry contra especies de afidos que causan plagas, de acuerdo con los datos de Chougule and Bonning (Chougule and Boning, 2012).

Tabla 1

Toxicidades conocidas de proteinas Cry contra afidos causantes de plagas

Toxina: Toxicidad Especificidad

Cry2, Cry3, Cry4: Reducida Pulgon de la patata (Macrosiphum euphorbiae)

Cry4Aa Cry11Aa Cry3A: LC50: 70 - 100 gg/ml 100% mortalidad a 500 gg/ml 60% mortalidad a 500 gg/ml Pulgon verde de la alfalfa (Acyrthosiphon pisum)

La solicitud de patente internacional WO2010099365 (perteneciente a la misma familia que la patente de EE.UU. US8318900B2), se refiere a secuencias nucleotidicas que codifican proteinas que presentan homologia con las delta-endotoxinas, a composiciones que comprenden dichas proteinas y a metodos para conferir resistencia contra plagas a bacterias, plantas, celulas vegetales, tejidos y semillas mediante la transformacion de dichos organismos con dichas secuencias nucleotidicas. La solicitud WO2010099365 divulga tanto secuencias naturales de genes identificados en distintas cepas de Bacillus thuringiensis (SEQ ID NOs:1 a 47 de dicha solicitud) como secuencias sinteticas preparadas a partir de las anteriores (SEQ ID Nos:97 a 196 de dicha solicitud WO2010099365), que dan lugar a proteinas que carecen del "dominio cristalino" C- terminal presente en la mayor parte de las delta-endotoxinas. En la solicitud WO2010099365 se cita Myzus persicae como una de las posibles plagas a combatir. Sin embargo, la solicitud no menciona ningun ensayo en el que se pruebe la eficiencia para combatir dicho afido de las composiciones y metodos divulgados en el documento WO2010099365, aunque si se definen unas pautas generales para posibles ensayos de afidos en el Ejemplo 20, sin mostrar preferencia por el uso de ninguna de las delta- endotoxinas divulgadas en el documento. El Ejemplo 19 de dicha solicitud describe un

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ensayo en el que se prueba la eficacia contra otro afido, Aphis glycines, de proteinas sinteticas derivadas de la proteina Axmi171 (un homologo lejano de la proteina Cry12Aa2, codificado por la secuencia insertada en la construccion descrita en la secuencia numero 204 de la solicitud WO2010099365 y de la patente US8318900B2, secuencia que codifica la secuencia de aminoacidos identificada con el numero 205); el maximo valor de mortalidad obtenido, 2 (es decir, 25-50% de los recipientes mostraban 100% de mortalidad) solo se consigue con un extracto concentrado de E. coli que expresa la forma de la proteina que carece del dominio N-terminal o con una forma de la proteina obtenida tras escindir con el factor Xa una proteina de fusion que incluia la proteina de union a la maltosa y resuspender en agua el precipitado formado, mientras que el resto de las variantes dieron lugar a 0-25% de los recipientes con 100% de mortalidad. Sin embargo, en el ejemplo anterior, el Ejemplo 18, se describen ensayos realizados tambien con derivados de dicha proteina Axmi171, concretamente con distintas concentraciones de la forma de la proteina obtenida tras escindir con el factor Xa una proteina de fusion que incluia la proteina de union a la maltosa y resuspender en agua el precipitado formado, pero donde se determina la actividad contra un hemiptero que no pertenece a la familia de los afidos sino a otra familia, la familia Miridae, concretamente Lygus hesperus, encontrando que una concentracion de 50 ppm (50 pg/ml) es suficiente para dar lugar a un 80% de mortalidad en dicho hemiptero.

La solicitud de patente internacional WO2009158470, perteneciente a la familia de la patente de EE.UU. US8461421B2 y del mismo solicitante que la anterior, describe tambien nuevos genes que codifican proteinas pesticidas de tipo delta-endotoxinas. Las proteinas y sus respectivos genes se utilizan para preparar formulaciones plaguicidas y para la produccion de plantas transgenicas resistentes a las plagas. Myzus persicae es mencionado como una de las posibles plagas a combatir mediante la invencion descrita en dicha solicitud de patente internacional, sin precisar la posible delta-endotoxina a utilizar o las condiciones concretas de aplicacion. En dicha solicitud, no se menciona tampoco ningun ejemplo en el que se demuestre la utilidad de dichas formulaciones o de dichas plantas transgenicas contra ningun afido, sino unicamente contra algunos lepidopteros, aunque si se definen unas pautas generales para posibles ensayos de afidos en el Ejemplo 8, de nuevo sin mostrar preferencia por el uso de ninguna de las delta-endotoxinas divulgadas en el documento para efectivamente llevarlos a cabo.

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Las solicitudes de patente de EE.UU. publicadas como US2012047607A1 y US201204760A1 (ambas con el mismo solicitante, Pionner Hi-Bred International Inc.) se refieren tambien a nuevos genes de Bacillus thuringiensis que codifican proteinas plaguicidas de la familia Cry, a composiciones derivadas de los mismos y a metodos e control de plagas que las emplean, incluida la generacion de plantas transgenicas que los expresan. Aunque se citan varios afidos como posibles plagas de interes, entre ellos Myzus persicae en particular, las solicitudes no incluyen ensayos en los que se demuestre la efectividad de las proteinas de dichas invenciones contra ningun afido. En la solicitud US2012047605A1, por ejemplo, solo se describen ensayos realizados con varios lepidopteros, alimentados con una dieta artificial que incluye la proteina Cry divulgada en dicha solicitud, obtenida por mutagenesis. En la solicitud US2012047607A1, por su parte, se describe un ensayo similar con un coleoptero, Diabrotica virgifera, (Ejemplo 1), que incluye tambien el calculo de la LC50 y de la EC50 (concentracion efectiva media) (Ejemplo 2).

La solicitud de patente internacional WO9516778 si se refiere especificamente a un metodo para combatir los danos que los afidos causan en plantas mediante una proteina toxica de Bacillus thuringiensis. Dicha solicitud de patente internacional menciona en los antecedentes de la invencion la falta de actividad contra los afidos de los insecticidas basados en Bacillus thuringiensis cuando se utilizan de forma independiente, no dando lugar tampoco a un aumento de la efectividad cuando se combinan con piretrinas. La misma falta de actividad se habia encontrado con diversas plantas transgenicas capaces de expresar proteinas insecticidas de Bacillus thuringiensis. La solicitud WO9516778 propone alimentar afidos con una dieta artificial que contiene proteinas Cry preparadas en una formulacion adecuada (solubilizada en un medio acuoso o en forma de suspension de solidos) por medio de un dispositivo alimentador, preparado a escala de laboratorio, donde los afidos estan separados de la dieta por una fina membrana de plastico. Como alternativa se propone la obtencion de plantas transgenicas en las que el promotor al que esta unido el gen de la proteina Cry se elige para que dicha proteina Cry se exprese en el tejido vascular de la planta, preferiblemente en el floema, pues eso asegura que los afidos ingieran la proteina al alimentarse de la planta. Dicha solicitud no muestra ningun ejemplo en el que se demuestre la efectividad de la estrategia de expresion de proteinas Cry en el floema de plantas transgenicas.

En cuanto a la alimentacion artificial, en la solicitud WO9516778 solo se describen ensayos con el pulgon de la patata, Macrosiphum euphorbiae (Thomas), que demuestran que son necesarias concentraciones elevadas de la proteina CryIIIA para observar un

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efecto (Ejemplo 1). En el Ejemplo 2, por su parte, intenta comparar la efectividad de las proteinas CryIA(c), CryIIA, CryIIIA, CryNIB2, CryNIB3, CryIVD y de una mezcla de proteinas Cry de tipo I (CryIA(a), CryIA(b), CrylC y CrylF), todas ellas en suspension acuosa; aunque la diferencia en las concentraciones anadidas en cada caso dificulta las comparaciones, el resultado demuestra que solo la proteina CryIA(c) no mostro actividad insecticida contra Macrosiphum euphorbiae, mientras que la proteina CryIIA (a 200 ng/pl) dio lugar a una rapida aparicion de la mortalidad, que era cercana al 100% tras dos dias de alimentacion, siendo menos eficaces las otras proteinas. En la seccion dedicada a la descripcion detallada de las realizaciones preferidas de la invencion de la solicitud WO9516778, se considera que las proteinas mas eficaces para combatir afidos, junto con la anterior, son las proteinas CryIIIA, CryIIIB y CryIVD. Esta valoracion, sin embargo, no ha sido realizada en ensayos con Myzus persicae. Las restantes proteinas ensayadas mostraron porcentajes variables de actividad insecticida, necesitandose de 4 a 5 dias para observar una mortalidad cercana al 100% en el caso de la mezcla de proteinas CryI (donde la concentracion total era proxima a 400 pg/pl, equivalente a 400 mg/ml)), en el caso de la proteina CryIIIA (a 400 ng/pl, equivalente a 400 pg/ml) y en el de la proteina CryIVD (a 350 ng/pl, equivalente a 350 pg/ml) y hasta 7 dias o mas en el caso de las proteinas CryIIIB2 (a 150 ng/pl, equivalente a 150 pg/ml) y CryIIIB3 (132 pg/pl, equivalente a 132 mg/ml).

De acuerdo con lo anterior, puede decirse que no se ha descrito hasta ahora ninguna proteina Cry que posea actividad insecticida contra Myzus persicae.

Dada la extension mundial de Myzus persicae y el gran numero de cultivos agricolas a los que afecta, seria interesante encontrar una proteina con actividad insecticida, por ejemplo del tipo de las endotoxinas, que mostrara una actividad insecticida significativa contra afidos y, en particular, como Myzus persicae. La presente invencion proporciona una solucion a dicho problema.

Breve descripcion de la invencion

La presente invencion se refiere, en un primer aspecto, a una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una delta-endotoxina, caracterizada por que la secuencia de nucleotidos que codifica una delta-endotoxina esta representada por SEQ ID NO:1 o presenta al menos un 90% de identidad con la misma. A la secuencia de nucleotidos que codifica una delta-endotoxina y que esta representada por SEQ ID NO:1 se aludira tambien en lo sucesivo como "el gen de la presente invencion", "el gen cry de la presente invencion" o "el nuevo gen cry". A la molecula de

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acido nucleico definida en este primer aspecto de la invencion se aludira como la molecula de acido nucleico de la presente invencion.

En aspectos adicionales de la invencion, la misma se refiere a un sistema de expresion de la molecula de acido nucleico anterior y/o de la secuencia codificante comprendida en la misma, y a los vectores de expresion que pueden formar parte de dicho sistema de expresion. Por tanto, la presente invencion se refiere tambien a un vector en el que esta inserta la molecula de acido nucleico de la presente invencion, vector que se considerara en adelante un vector de la presente invencion. Complementariamente, la invencion ademas se refiere a una celula hospedadora que comprende un vector de la invencion, es decir, una celula hospedadora de la presente invencion.

En un aspecto mas, la invencion se refiere a una planta transgenica que comprende una celula hospedadora de la presente invencion que es una celula de planta, asi como a una semilla transgenica que comprende una molecula de acido nucleico de la presente invencion.

Otro aspecto de la invencion es un polipeptido de la presente invencion, es decir, un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos caracterizada por que dicha secuencia de aminoacidos:

a) es la representada por SEQ ID NO:2;

b) es la secuencia de una delta-endotoxina que esta codificada por la secuencia representada por SEQ ID NO:1 o por una secuencia que presenta al menos un 90% de identidad con la misma, o

c) es la secuencia de una delta-endotoxina que presenta al menos un 80% de identidad con la secuencia representada por SEQ ID NO:2.

La secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO:2, asi como la secuencia que presenta al menos un 80% de identidad con la misma o la secuencia de una delta- endotoxina que esta codificada por la secuencia representada por SEQ ID NO:1 o por una secuencia que presenta al menos un 90% de identidad con la misma, se consideraran en adelante la delta-endotoxina de la presente invencion.

Es tambien un aspecto de la invencion una composicion que comprende un polipeptido de la presente invencion, un vector de la presente invencion y/o una celula hospedadora de la presente invencion. Dichas composiciones se consideraran las composiciones de la presente invencion.

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Tambien es un aspecto de la invencion el uso de una composicion de la presente invencion para combatir plagas de al menos un hemiptero, con preferencia por que el hemiptero sea un afido, y especial preferencia por el afido Myzus persicae.

Un aspecto mas de la invencion es un metodo para la produccion de un polipeptido de la presente invencion, que comprende:

a) obtener un organismo recombinante que exprese el polipeptido de la presente invencion;

b) cultivar dicho organismo recombinante;

c) inducir, de ser necesario, la expresion del polipeptido en dicho organismo recombinante;

d) purificar el polipeptido a partir del organismo recombinante.

Finalmente, tambien es un aspecto de la invencion un anticuerpo que se une especificamente a un polipeptido de la presente invencion, especialmente un anticuerpo que se une especificamente al fragmento de dicho polipeptido que constituye la delta- endotoxina de la presente invencion.

Breve Descripcion de las Figuras

Fig. 1: Alineamiento multiple de secuencias de proteinas Cry activas contra diferentes especies de afidos. Se incluye la proteina Cry de la presente invencion (CryBMI) y la proteina representada por la secuencia con numero de identificacion 205 en la patente US8318900B2 (Seq205-US8318900). Bajo cada secuencia aparecen rectangulos sombreados que indican, de haberlos, la situacion de los dominios N, M y C, caracteristicos de las delta-endotoxinas insecticidas, asi como la de otras regiones significativas (Gal: dominio de union a galactosa; CW: union a la pared celular; TMR: region transmembrana; SP: peptido senal) Notese la presencia de un rectangulo con la etiqueta "Ricina B" (que indica un dominio tipo ricina B) bajo el extremo derecho de la representacion correspondiente a la proteina CryBMI.

Fig. 2: Dendrograma representativo de la relacion filogenetica entre proteinas Cry activas contra afidos. Se incluye la proteina Cry de la presente invencion (CryBMI) y la proteina representada por la secuencia con numero de identificacion 205 en la patente US8318900B2 (Seq205-US8318900). La longitud de la barra horizontal situada bajo la linea de la proteina inferior, Cry1Aa, corresponde a una distancia taxonomica de 0,2,

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calculada en base al porcentaje de identidad de los alineamientos de las secuencias de aminoacidos, segun se indica en la propia figura.

Fig. 3: Esquema del vector recombinante de expresion pET-28b(+) utilizado para insertar el gen cryBMI y utilizado entonces para transformar celulas de Escherichia coli BL21(DE3) y expresar la proteina insecticida de la presente invencion bajo control del promotor del bacteriofago T7 (Promotor T7) inducible por IPTG. Se indica la posicion de insercion del gen cryBMI y el tamano del plasmido antes de la insercion de dicho gen (5369 pares de bases, abreviado como bp).

Fig. 4: Fotografia del gel de SDS-PAGE obtenido al someter a electroforesis una muestra de la proteina CryBMI expresada en Escherichia coli y purificada en columna de niquel. Se indica con una flecha y el tamano estimado (89 kDa) la banda correspondiente a la muestra (carril derecho, etiquetado como "Cry"); en el carril izquierdo, correspondiente al marcador, se indica el tamano de las dos bandas entre las que se localiza la banda de la muestra de CryBMI.

Fig. 5: Fotografia de los elementos utilizados en el bioensayo de actividad insecticida. De izquierda a derecha: vista posterior de un fragmento de las tiras de pelicula plastica para laboratorio Parafilm® "M"; vista lateral de una caja de ensayo; vista superior de una caja de ensayo, con 15 ninfas neonatas de Myzus persicae; vista superior de una caja cubierta con una capa de Parafilm® "M" con una gota de dieta + proteina CryBMI ("toxina" en la leyenda de la fotografia") depositada sobre la misma; vista superior de una caja con los mismos elementos que la anterior, en la que la gota de dieta + proteina CryBMI se ha cubierto con una segunda capa de Parafilm® "M". Junto a las cajas (en un nivel superior de la superficie de la fotografia) se muestra un extremo de la pipeta automatica utilizada para depositar las gotas de dieta + proteina CryBMI, en la que se ha encajado la punta utilizada para tomar y depositar las muestras.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se basa en la identificacion y aislamiento de un gen de de Bacillus thuringiensis (Bt), asi como en la identificacion, aislamiento, produccion y evaluacion insecticida de su producto, una nueva proteina Cry de Bt que es toxica contra el afido Myzus persicae o pulgon verde. Este nuevo gen y su producto, pueden ser utilizados para el desarrollo de nuevos biopesticidas y la construccion de plantas transgenicas resistentes al pulgon verde.

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En la presente solicitud se detallan la secuencia de nucleotidos del nuevo gen aislado (representada por SEQ ID NO:1) y la secuencia de aminoacidos de la proteina codificada por dicho gen (representada por SEQ ID NO:2). Tambien se aportan pruebas de la capacidad insecticida de dicha proteina, como el calculo del valor de la concentracion letal media (CL50), (que es la concentracion de toxina que produce la muerte en el 50% de los insectos que han sido tratados), que ha resultado ser una concentracion mas baja que las descritas para otras proteinas Cry aplicadas a otros hemipteros plaga, particularmente mas baja que las descritas hasta ahora para otros afidos.

La presente solicitud proporciona una descripcion detallada de la nueva proteina Cry y del gen que la codifica, que son significativamente diferentes, en secuencia y en algunas caracteristicas estructurales, de las secuencias correspondientes a otras proteinas Cry y, en particular, bastante diferentes de las proteinas Cry con actividad insecticida comprobada descritas hasta ahora.

El analisis estructural esquematizado en la Fig. 1 muestra que la proteina cuyo aislamiento y produccion se describe mas adelante en la presente solicitud (indicada en dicha Fig. 1 como CryBMI) es una proteina de 89 kDa que presenta la estructura caracteristica de las delta-endotoxinas, incluidos los dominios N, M y C que generalmente estan presentes en las proteinas Cry. En el dominio C en particular se observa una zona similar a un dominio de union a hidratos de carbono, concretamente un dominio de union a galactosa. Por ello, a la proteina cuyo aislamiento y produccion se divulga en la presente solicitud, junto con la identificacion y aislamiento de su secuencia codificante, se le denomina en la presente solicitud la proteina Cry de la presente invencion, la delta- endotoxina de la presente invencion o, simplemente, la proteina de la presente invencion.

El dendrograma representativo de la relacion filogenetica entre proteinas Cry activas contra afidos de la Fig. 2 muestra que la proteina Cry de la presente invencion no esta estrechamente relacionada con ninguna de dichas proteinas, indicando que se corresponde con una proteina no descrita hasta la fecha. A dicha proteina se le ha asignado provisionalmente la denominacion abreviada CryBMI en relacion al grupo de investigacion (Bioinsecticidas Microbianos).

Los analisis comparativos realizados, basados en las busquedas en bases de datos de otras secuencias de nucleotidos conocidas y su comparacion con respecto a SEQ ID NO:1, por una parte, y de secuencias de proteinas conocidas y su comparacion con respecto a SEQ ID NO:2, por otra parte, han permitido corroborar no solo que la nueva proteina Cry (o delta-endotoxina) de la presente invencion es nueva, como tambien lo es

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su secuencia codificante, por no coincidir sus secuencias con ninguna otra secuencia de aminoacidos o nucleotidos, respectivamente, previamente conocidas, sino tambien detectar diferencias con otras secuencias relacionadas.

Asi, por ejemplo, la comparacion de la secuencia de nucleotidos del gen de la presente invencion (SEQ ID NO:1) con otras secuencias de nucleotidos ha permitido constatar que no se encuentra ninguna secuencia de nucleotidos que presente un porcentaje de identidad que alcance el valor del 90%, o superior, con respecto a SEQ ID NO:1. El maximo porcentaje de identidad, 87%, corresponde a la secuencia de nucleotidos con el numero 38 en la familia de la solicitud de patente internacional WO 2010099365 y la patente de EE.UU. US8318900, a la que tambien pertenece la solicitud japonesa JP 2012519000-A, secuencia que codifica la proteina que responde a la secuencia 87 de dicha familia. Tambien aparecen entre la lista de secuencias con mayor porcentaje de homologia respecto a SEQ ID NO:1 (vease la Tabla 4 que se presenta mas adelante) otras secuencias de nucleotidos divulgadas en la misma familia de documentos de patente, como la secuencia 169 de WO2010099365 (secuencia 122 de JP 2012519000- A), con la que el gen de la presente invencion presenta una identidad del 70%. Aparece tambien en esa misma lista una secuencia divulgada en la familia de documentos de patente de la solicitud internacional WO 2009158470 y la patente de EE.UU. US8461421 (que incluye tambien a la solicitud de patente de Japon JP2011526150-A), la secuencia con el numero 24 de esta segunda familia de patentes, con la que SEQ ID NO:1 de la presente invencion presenta un 71% de identidad (considerando los nucleotidos 1 a 1345), que se eleva al 76% en el fragmento de 215 nucleotidos comprendido entre el nucleotido 1372 y el nucleotido 1586 de SEQ ID NO:1; el fragmento comprendido entre los nucleotidos 1346 y 1371, sin embargo, no aparece entre los de mayor identidad con la secuencia con el numero 24 de la familia de patentes de la solicitud internacional WO 2009158470 y la patente de EE.UU. US8461421.

Sin embargo, tal como se menciono previamente en la presente memoria, ninguno de los documentos citados muestra ensayos realizados en los que se demuestre actividad insecticida de alguna de las proteinas codificadas por dichas secuencias de nucleotidos, asumiendose que tal actividad existe por responder todas las proteinas a la estructura de las delta-endotoxinas. No hay tampoco en dichos documentos ninguna sugerencia de que alguna de esas proteinas codificadas por secuencias con un porcentaje de identidad considerable con el gen de la presente invencion pudiera ser especialmente adecuada para afidos. Es mas, la secuencia 169 de WO2010099365 pertenece al grupo de genes sinteticos descritos en dicha solicitud de patente que carecen del dominio "cristalino" del

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extremo carboxilo que esta presente en muchas delta-endotoxinas, y que se cree que esta implicado en la formacion de cuerpos cristalinos de inclusion dentro de Bt.

La situacion es similar en lo que se refiere a otras secuencias de nucleotidos que presentan tambien un porcentaje de identidad igual o superior al 70% con respecto a la secuencia del gen de la presente invencion, representada por SEQ ID NO:1. Asi, la CDS (secuencia codificante) con numero de acceso KC156704, que se dice que corresponde a una proteina plaguicida de Bacillus thuringiensis, cepa ARP242, presenta tambien un porcentaje de identidad del 87% con respecto a SEQ ID NO:1, pero no parece presentar entre la informacion disponible a partir de su numero de acceso la mencion de ninguna publicacion o documento de otro tipo en el que se demuestre su actividad plaguicida, no habiendo mencion ninguna de posible aplicacion a hemipteros, afidos en particular, o Myzus persicae en particular. Igual sucede con las CDS correspondientes a las cepas ARP256 (87% de identidad) o ARP277 (70% de identidad) de Bt. Finalmente, ademas de fragmentos de la secuenciacion del genoma completo de Bacillus subtilis, aparecen tambien porcentajes de identidad altos, pero que no llegan al 75% (74%) con fragmentos reducidos (152 nucleotidos) de secuencias codificantes (CDS) que, hipoteticamente, podrian codificar proteinas Cry a las que se les esta asignando una aplicacion no plaguicida, sino la de matar celulas cancerosas.

La comparacion realizada utilizando directamente la secuencia de la propia proteina de la presente invencion (SEQ ID NO:2) da lugar a que los porcentajes de identidad se reduzcan. Entre las secuencias extraidas de documentos de patentes (Tabla 3), el mayor porcentaje de identidad no llega al 80% (76,20%) y corresponde a la secuencia 87 de la familia de la patente US8318900 y la solicitud de patente internacional WO2010099365, que es precisamente la secuencia de aminoacidos codificada por la secuencia 38 de dichas solicitudes, es decir, la secuencia de nucleotidos con la que SEQ ID NO:1 presenta el mayor porcentaje de identidad. A continuacion, solo la secuencia 84 de la familia de la patente de EE.UU. US8461421 y la solicitud de patente internacional WO2009158470 presenta un porcentaje de identidad superior al 50% (57,91%). El resto de las secuencias extraidas de solicitudes de patente, pertenecientes todas ellas a esta ultima familia citada, presentan porcentajes de identidad inferiores al 40% con respecto a SEQ ID NO:2.

La comparacion con otras proteinas no redundantes no permite localizar proteinas con mayor grado de identidad con la secuencia de la delta-endotoxina de la presente invencion. Solo la proteina similar a Cry41Aa1 (numero de acceso en Genbank

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AEH76822.1) tiene un porcentaje de identidad cercano al 60%, 57,91%. Ademas de esta proteina, solo una secuencia, que corresponde a una proteina hipotetica (numero de acceso en Genbank EJR94916.1) presenta un porcentaje de identidad mayor al 50% con SEQ ID NO:2.

Asi, ni la busqueda comparativa por la secuencia del gen ni la busqueda por la secuencia de la proteina permite localizar secuencias que correspondan a proteinas Cry con actividad conocida contra hemipteros (especialmente contra afidos) y que presenten un porcentaje de identidad alto (al menos del 50%) con el gen y/o la proteina de la presente invencion. En particular, no aparece en ninguna de las Tablas 2, 3 o 4 la secuencia correspondiente a la proteina Cry o los derivados de la misma con los que se realizan ensayos de actividad insecticida en la familia de patentes de la solicitud internacional WO2010099365 y la patente de EE.UU. US8318900B2.

La delta-endotoxina de la presente invencion es bastante diferente de otras proteinas Cry activas contra afidos descritas hasta el momento. Tal como se muestra en la Tabla 5 que aparece mas adelante en la presente memoria, la proteina Cry con actividad conocida contra afidos que presenta mayor porcentaje de identidad con la proteina Cry de la presente invencion es la proteina Cry3Aa, con la que solo comparte un 26,3% de identidad. Con respecto a otras proteinas para las que se haya ensayado su posible actividad contra afidos (Cry2Aa, Cry4Aa, Cry11Aa e, incluso, la proteina representada por la secuencia con numero de identificacion 205 en la patente US8318900B2 y de la solicitud de patente internacional WO2010099365), la identidad no llega al 20%.

Y, sin embargo, sorprendentemente, los ensayos experimentales descritos mas adelante en Ejemplos de la presente solicitud demuestran que la nueva proteina Cry de la presente invencion es la primera proteina Cry de Bt con actividad insecticida significativa contra afidos en general y, en particular, la primera proteina Cry de Bt para la que se divulga que posea actividad insecticida contra el pulgon verde, Myzus persicae, por lo que, en consecuencia, es un objeto de la presente invencion, junto con el gen que la codifica, asi como el uso como insecticida de las composiciones que contienen el gen y/o la proteina, incluida la generacion de plantas transgenicas que expresen dicho gen.

Es mas, los resultados experimentales demuestran que esta proteina presenta una elevada actividad insecticida siendo su CL50 de tan solo 32,7 pg/ml. Este valor es mucho menor que los valores obtenidos con otras proteinas Cry previamente evaluadas en otras especies de afidos relacionadas con M. persicae (Tabla 1). Es tambien significativa la diferencia en orden de magnitud con las cantidades de otras proteinas Cry utilizadas en

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ensayos como los que se describen en la solicitud de patente internacional WO9516778 donde algunas proteinas analogas, como la mezcla de proteinas Cryl, llega a utilizarse a una concentracion proxima a 400 mg/ml, y donde otras proteinas, como CryIIIB2, utilizada a una concentracion casi un orden de magnitud superior (150 gg/ml), necesitan hasta 7 dias para dar lugar a una mortalidad cercana al 100% en ensayos dirigidos a afidos, en los que Myzus persicae no se menciona. Incluso extendiendo el ambito de comparacion a las actividades conocidas sobre otros hemipteros, el valor puede considerarse elevado, como puede comprobarse a partir del Ejemplo 18 de la solicitud WO2010099365 y de la patente US8318900B2, realizado con derivados no naturales de la proteina representada por la secuencia 205 de dichos documentos, donde la concentracion de 50 gg/ml da lugar a un 80% de mortalidad del hemiptero Lygus hesperus, de la familia Miridae, siendo necesario un extracto concentrado obtenido de E. coli para que uno de los derivados de la misma proteina de lugar al 100% de mortalidad en el 25-50% de los recipientes cuando el ensayo se realiza con un afido, Aphis glycines.

En general, como se comento previamente en la presente solicitud, los afidos no resultan muy susceptibles a las toxinas Cry de Bt (Chougule and Bonning, 2012). Este hecho, junto a la capacidad de los afidos para generar resistencias a los insecticidas quimicos de sintesis, incrementa la importancia del descubrimiento de nuevas proteinas mas toxicas para implementar metodos alternativos de control basados en toxinas Bt. La nueva proteina Cry de la presente invencion se presenta como tal alternativa, pudiendo ser adaptada al desarrollo de metodos de control basados en nuevos formulados bioinsecticidas y la construccion de plantas transgenicas resistentes al pulgon verde y otras especies de afidos susceptibles.

La secuencia codificante de esta nueva proteina puede utilizarse para transformar huespedes heterologos bacterianos o celulas vegetales mediante tecnicas bien conocidas y rutinarias en ingenieria genetica, bien para producir nuevas copias de la proteina o como paso intermedio para la generacion de plantas transgenicas que la expresen. Para ello, un paso previo suele ser su insercion en un "vector", una molecula de ADN que posibilita que se lleve a cabo el objetivo que se pretende conseguir, bien la expresion del gen (vectores de expresion) o bien la transferencia de moleculas o construcciones de ADN entre distintas celulas hospedadoras, como puede ser la transformacion de celulas de plantas, a menudo incluyendo la posterior obtencion de una planta transgenica (los llamados vectores de transformacion, que a menudo son tambien vectores de expresion, o incluyen lo que se llaman "casetes de expresion"). Tanto en uno como en otro casos, es frecuente que un paso previo sea la generacion de "casetes de expresion", en las que el

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gen a expresar esta operativamente unido a un promotor que permite su expresion en un sistema de interes y que a menudo contienen tambien alguna secuencia regulatoria adicional o de utilidad para la expresion, como una region no traducida de 3' o, especialmente cuando se desea la expresion en celulas eucarioticas, una secuencia senal o una secuencia lider que facilite el transporte del peptido que se esta formando, o una vez traducido, a un organulo celular determinado, tales como cloroplastos, reticulo endoplasmido, aparato de Golgi...; tambien es habitual que el "casete de expresion" se forme al insertar la secuencia codificante a expresar en el vector en un lugar preciso, de manera que quede unida a los elementos deseados.

La eleccion del promotor depende del sistema en el que se desee que se exprese el gen al que va a quedar operativamente unido. Asi, por ejemplo, cuando la proteina va a producirse, por ejemplo, en un microorganismo, tal como una bacteria, sera necesario elegir un promotor que permita la expresion en dicha bacteria. Una de las bacterias mas utilizadas para la expresion de proteinas es Escherichia coli, para la cual hay muchos promotores y vectores de expresion que los contienen bien conocidos por los expertos en la materia. En el caso de Escherichia coli, es habitual insertar los genes a expresar bajo el control de operon lac, como en el Ejemplo 2 de la presente invencion, lo cual permite controlar la expresion de la proteina, induciendola mediante la adicion de IPTG (isopropil- p-D-1-tiogalactopiranosido). Son muchos los vectores de expresion conocidos y disponibles comercialmente que permiten la expresion en E. coli, de los cuales son muy utilizados los plasmidos, pero tambien son habituales y conocidos algunos virus recombinantes preparados a partir de las formas naturales que infectan dicha bacteria, como el bacteriofago lambda. Los vectores de expresion tipo plasmido son faciles de localizar y de elegir a partir no solo de catalogos comerciales, sino de bases de datos dedicadas a este tipo de vectores como la de Addgene (http://
www.addgene.org), donde puede consultarse, por ejemplo, la estructura del plasmido pET-28b(+) utilizado en los ejemplos de la presente invencion.

Otros huespedes microbianos disponibles para la transformation con vectores de expresion, de especial interes en el presente caso, podrian ser la cepa Bt 4Q7 acristalofera (no productoras de otras endotoxinas) disponible en el Bacillus Genetic Stock Center, Bacillus megaterium (Mobitec, Germany), Pseudomona spp. o levaduras. En estos microorganismos, la proteina insecticida producida permanece encapsulada en el soma bacteriano de tal manera que el mismo microorganismo se convertiria en la materia activa del biopesticida, facilmente recuperable por centrifugacion. Esta microencapsulacion, protegeria ademas a la proteina de factores ambientales (ej. UV)

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alargando su vida util en el medioambiente. La opcion de recubrir dichas proteinas con sustancias (nanoparticulas) que protejan de manera similar a dicha toxina resulta tambien una alternativa atractiva.

Este nuevo gen cry, puede tambien optimizarse para su expresion en celulas vegetales en la construccion de plantas transgenicas resistentes al insecto, mediante la utilizacion de tecnicas ya descritas y bien conocidas de ingenieria genetica.

Los metodos de transformacion de plantas de la invencion implican la introduccion de una construccion nucleotidica, incluyendo en gen a transferir, en una planta. Por "introduccion" se entiende proporcionar a la planta la construccion de nucleotidos de tal manera que la construccion acceda al interior de una celula de la planta . Los metodos de la presente invencion no requieren que se utilice un metodo particular para la introduccion de una construccion de nucleotidos en una planta. Los metodos para introducir construcciones de nucleotidos en plantas son conocidos en la tecnica, incluyendo, pero sin limitarse a, metodos de transformacion estable, metodos de transformacion transitoria, y metodos mediados por virus.

Por "planta" se entiende plantas completas, organos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raices, etc ), semillas, celulas de plantas, propagulos, embriones y la progenie de los mismos. Las celulas de plantas (o celulas vegetales) pueden ser diferenciados o indiferenciados (por ejemplo, callos, las celulas en cultivo en suspension, protoplastos, celulas de las hojas, celulas de la raiz, celulas del floema, polen).

Los terminos "plantas transgenicas" o "plantas transformadas" o plantas celulas o tejidos "transformados de forma estable" se refieren a plantas que han incorporado o integrado secuencias de acidos nucleicos o fragmentos de ADN exogenos en una o mas celulas vegetales. Estas secuencias de acidos nucleicos incluyen las que son exogenos, o no estan presentes en la celula de la planta no transformada, asi como aquellas que pueden ser endogenas, o que estan presenten en la celula de la planta no transformada. Con el termino "heterologa" generalmente se hace referencia a las secuencias de acido nucleico que no son endogenas para la celula o parte del genoma nativo en el que estan presentes, y que se han anadido a la celula por infeccion, transfeccion, microinyeccion, electroporacion , microproyeccion, u otros similares.

Las plantas transgenicas de la presente invencion seran aquellas que expresen el gen de la presente invencion o una secuencia codificante de una delta-endotoxina que presente al menos un 90% de identidad con la secuencia del gen de la presente invencion (SEQ ID

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NO:1). La planta transgenica puede comprender ademas uno o mas genes adicionales para la resistencia a los insectos, y/o cualquier gen adicional que imparta un rasgo agronomico de interes.

La transformacion de celulas vegetales se puede lograr mediante diversas tecnicas bien conocidas por el experto en la materia. Normalmente, el gen que se quiere expresar (en este caso, el gen de la presente invencion, o secuencias codificantes que presenten al menos un 90% de identidad con el mismo), estara formando parte de una construccion (un casete de expresion, como se describio anteriormente) en la que el gen estara unido operativamente a un promotor que controlara su transcripcion, asi como a una zona no traducida de 3' que permitira la terminacion de la transcripcion y la poliadenilacion del transcrito. Entre las posibles regiones de terminacion pueden ser adecuadas, por ejemplo, las que estan presentes en el plasmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, tales como las regiones de terminacion de la octopina sintasa y la nopalina sintasa. Si se desea, puede incluirse tambien un peptido senal que facilite la transferencia del peptido que se esta formando al reticulo endoplasmico. Tambien puede ser interesante disenar el casete de expresion de la planta para que contenga al menos un intron, de tal manera que se requiera el procesamiento del intron del ARNm para su expresion.

Normalmente, este "casete de expresion en plantas" se inserta o esta inserto en un "vector de transformacion de plantas". Este vector de transformacion de plantas puede estar compuesto de uno o mas vectores de ADN necesarios para lograr la transformacion de la planta. Por ejemplo, es una practica comun en la tecnica utilizar vectores de transformacion de plantas que se componen de mas de un segmento de ADN contiguo. Estos vectores se denominan a menudo "vectores binarios". Los vectores binarios, asi como los vectores con plasmidos auxiliares, son los mas utilizados para la transformacion mediada por Agrobacterium, cuando el tamano y la complejidad de los segmentos de ADN necesarios para lograr la transformacion eficiente es bastante grande. Los vectores binarios contienen tipicamente un vector plasmidico que contiene las secuencias que actuan en cis necesarias para la transferencia de T-ADN (tal como el borde izquierdo y el borde derecho), un marcador de seleccion que esta disenado para ser capaz de expresarse en una celula vegetal, y un "gen de interes" (un gen disenado para ser capaz de expresarse en una celula de una planta de la cual se desea la generacion de plantas transgenicas que, en el presente caso, seria el gen de la presente invencion o una secuencia codificante que guarde al menos un 90% de identidad con el mismo). Tambien estan presentes en este vector plasmidico secuencias requeridas para la replicacion en bacterias. Las secuencias que actuan en cis estan dispuestas de tal manera que permitan

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la transferencia eficiente en celulas vegetales y la expresion en las mismas. Por ejemplo, el gen marcador de seleccion y el gen de la presente invencion se encuentran entre los bordes izquierdo y derecho. A menudo un segundo vector plasmidico contiene los factores que actuan en trans que median la transferencia del T-ADN de Agrobacterium a las celulas vegetales. Este plasmido contiene a menudo las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infeccion de las celulas vegetales por Agrobacterium, y la transferencia de ADN mediante escision de las secuencias de los bordes y la transferencia de ADN mediada por vir, como se entiende en la tecnica (Hellens and Mullineaux, 2000). Para la transformacion de plantas pueden utilizarse varios tipos de cepas de Agrobacterium (por ejemplo, LBA4404, GV3101, EHAlOl, EHA105, etc). El segundo vector plasmidico no es necesario para la transformacion de las plantas por otros metodos tales como microproyeccion, microinyeccion, electroporacion, polietilenglicol, etc.

En general, los metodos de transformacion de plantas involucran la transferencia de ADN heterologo a las celulas diana de la planta (por ejemplo, embriones inmaduros o maduros, cultivos en suspension, callo indiferenciado, protoplastos, etc), seguido por la aplicacion de un nivel umbral maximo para la seleccion apropiada (dependiendo del gen marcador seleccionable) para recuperar las celulas de plantas transformadas a partir de un grupo de una masa celular sin transformar. Los explantes se transfieren normalmente a un suministro fresco del mismo medio y se cultivan de forma rutinaria. Posteriormente, las celulas transformadas se diferencian en brotes despues de colocarlas en medio de regeneration suplementado con un nivel de umbral maximo de agente de seleccion. Los brotes son luego transferidos a un medio selectivo de enraizamiento para la recuperation de brotes con raices o plantulas enraizadas. La plantula transgenica crece entonces dando lugar a una planta madura y produce semillas fertiles. Los explantes se transfieren normalmente a un suministro fresco del mismo medio y se cultivan de forma rutinaria. Una description general de las tecnicas y metodos para generar plantas transgenicas se encuentran en publicaciones como la de Ayres y Park (Ayres and Park, 1994) y Bommineni y Jauhar (1997). Dado que el material transformado contiene muchas celulas, cualquier muestra de dicho material transformado contiene celulas transformadas y no transformadas. La capacidad de matar celulas no transformadas y permitir que las celulas transformadas proliferen da lugar a que sean convenientes los cultivos de plantas transformadas. A menudo, la capacidad de eliminar las celulas no transformadas es una limitation para la rapida recuperacion de las celulas de plantas transformadas y la generacion exitosa de plantas transgenicas.

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Los protocolos de transformacion asi como los protocolos para introducir secuencias de nucleotidos en plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o celula vegetal que se quiera transformar, es decir, monocotiledonea o dicotiledonea. Como se ha mencionado previamente, la generacion de plantas transgenicas puede ser realizada por diversos metodos, incluyendo, pero sin limitarse a, microinyeccion, electroporacion, transferencia directa de genes, introduccion de ADN heterologo por medio de Agrobacterium en celulas de plantas (transformacion mediada por Agrobacterium), bombardeo de celulas vegetales con ADN adherido a particulas, la aceleracion de particulas balisticas, transformacion mediante un haz de aerosol, la transformacion con Lec1, y diversos otros metodos no mediados por particulas.

Tras la integracion del ADN foraneo heterologo en celulas de la planta, se aplica entonces un nivel umbral maximo de seleccion apropiada en el medio para eliminar las celulas no transformadas y separar y hacer proliferar las celulas hipoteticamente transformadas que sobreviven a este tratamiento de seleccion transfiriendolas periodicamente a un medio fresco, mediante pases continuos y manteniendo las apropiadas condiciones de seleccion. Se han desarrollado numerosos marcadores para su uso con celulas vegetales, tales como la resistencia a cloranfenicol, al aminoglicosido G418, resistencia a higromicina, o similares.

Se pueden utilizar metodos moleculares y bioquimicos para confirmar la presencia del gen heterologo de interes integrado en el genoma de la planta transgenica, gen de interes que, en el caso de las plantas transgenicas de la presente invencion, es el gen de la presente invencion o una secuencia codificante con un porcentaje de identidad de al menos el 90% con el mismo.

Las celulas que han sido transformadas pueden ser cultivadas para dar lugar a plantas de forma convencional. Estas plantas pueden ser cultivadas a continuacion, y, o bien ser polinizadas con la misma cepa transformada o con cepas diferentes, y el hibrido resultante tiene expresion constitutiva de la caracteristica fenotipica deseada, en el presente caso, la expresion de la proteina Cry de la presente invencion. Dos o mas generaciones se pueden cultivar para asegurar que la expresion de la caracteristica fenotipica deseada se mantiene y se hereda de manera estable y luego cosechar las semillas para asegurar que se ha logrado la expresion de la caracteristica fenotipica deseada. De esta manera, la presente invencion proporciona semillas transformadas ( a las que tambien se hace referencia como "semillas transgenicas") que tiene una construccion nucleotidica de la presente invencion, (por ejemplo, un casete de expresion

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en el que el gen de la invencion esta ligado, de manera estable, a un promotor que permite su expresion en plantas y a una secuencia adecuada de terminacion, incorporado de manera estable en su genoma).

T ras la introduccion de ADN foraneo heterologo en celulas de plantas, la transformacion o integracion del gen heterologo en el genoma de la planta se puede confirmar por diversos metodos tales como el analisis de acidos nucleicos, proteinas y metabolitos asociados con el gen integrado. En este caso en particular, se puede realizar el analisis de la presencia del gen integrado, de la generacion de su ARNm o de la presencia de la proteina que se quiere expresar, la proteina de la presente invencion o una proteina que presenta un alto grado de identidad con la misma.

El analisis por PCR es un metodo rapido para detectar en celulas, tejidos o brotes transformados, la presencia del gen incorporado en una etapa anterior antes de trasplantarlo en el suelo, mediante metodos rutinarios para los expertos en la materia (vease, por ejemplo, Sambrook y Russell, 2001). La PCR se puede llevar a cabo utilizando los oligonucleotidos cebadores especificos que permitan amplificar el gen de interes desde el codon de inicio (ATG) hasta el codon de parada de la traduccion (TTA) (oligonucleotido cebador directo 5’-ATGAACCAAAATTATAACAACAATG-3’, (SEQ ID NO:3) oligonucleotido cebador inverso 5’ CAAATCAAAAATTCAAACTGAATAAGTTA3’ (SEQ ID NO:4)). Mediante amplificacion por PCR se podria ademas obtener el amplicon, purificarlo y marcarlo ya sea mediante metodos radioactivos (32P) o no radioactivos (digoxigenina) y utilizarlo como sonda especifica.

La transformacion de plantas puede ser confirmada por analisis mediante transferencia tipo Southern de ADN genomico (Sambrook y Russell, 2001). En general, el ADN total se extrae a partir del transformante, se digiere con enzimas de restriccion apropiadas, se fracciona en un gel de agarosa y se transfiere a una membrana de nitrocelulosa o de nylon. A continuacion, se realiza un ensayo con la membrana con el ADN transferido con, por ejemplo, un fragmento del ADN diana (un fragmento del gen de la presente invencion, en este caso, o una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad con el mismo) para confirmar la integracion del gen introducido en el genoma de la planta.

En el analisis de transferencia tipo Northern, se aisla ARN a partir de tejidos especificos del transformante, se fraccionan en un gel de agarosa-formaldehido, y se transfiere a un filtro de nylon de acuerdo con procedimientos estandar que se utilizan rutinariamente por los expertos en la tecnica (Sambrook y Russell, 2001). La expresion del ARN codificado por el gen de la presente invencion o por una secuencia codificante que tiene al menos

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un 90% de identidad con el mismo se prueba mediante la hibridacion del filtro con una sonda radioactiva derivada de la secuencia del gen de la endotoxina de la invencion, por metodos conocidos en la tecnica (Sambrook y Russell, 2001).

Tambien se puede confirmar la presencia de la proteina codificada por el gen de la delta- endotoxina de la presente invencion mediante transferencia tipo Western, ensayos bioquimicos o similares llevados a cabo en las plantas transgenicas por procedimientos estandar (Sambrook y Russell, 2001, supra), utilizando anticuerpos que se unen a uno o mas epitopos presentes en la proteina de la delta-endotoxina de la presente invencion. Para ello, pueden utilizarse, por ejemplo, anticuerpos dirigidos a otras proteinas Cry con las que la proteina Cry de la presente invencion comparta epitopos. Otra alternativa es la preparacion de anticuerpos especificos contra la nueva proteina Cry de la presente invencion y, de una manera similar, utilizar anticuerpos Anti-6xHis_Tag (Sigma-Aldrich) contra la cola de 6 histidinas fusionadas al extremo carboxilo de la proteina recombinante CyBMI y que estan codificadas en el vector pET-28b(+). La generation de anticuerpos frente a una proteina cualquiera es una tecnica habitual, conocida por cualquier experto en la tecnica, que puede considerarse rutinaria.

Se tiene preferencia por los anticuerpos monoclonales, que son anticuerpos homogeneos producidos por una celula hibrida producto de la fusion de un clon de linfocitos B descendiente de una sola y unica celula madre y una celula plasmatica tumoral, que garantiza su perpetuidad (Kohler & Milstein, 1975). Con esta fusion de dos celulas, una programada para producir un anticuerpo especifico pero que no se multiplica indefinidamente (linfocito) y otra inmortal con gran capacidad de crecimiento pero que no produce inmunoglobulina (celula de mieloma), se combina la information genetica necesaria para la sintesis del anticuerpo deseado y una capacidad de sintesis proteica, permitiendo su multiplication indefinida tanto in vitro como in vivo. Para la production de anticuerpos monoclonales frente a la proteina Cry de la presente invencion, los presentes autores de la presente invencion tienen preferencia por la metodologia descrita por Iglesias et al. (1997). Brevemente: se fusionan esplenocitos obtenidos de ratones BALB/c hembras, previamente inyectadas intraperitonealmente con la forma completa de la proteina Cry de la presente invencion, con celulas de mieloma murino X63-Ag8.653, en presencia de 50% de polietilenglicol (PEG) 4000 (Boehringer Mannheim, Barcelona, Espana). Los cultivos de hibridomas se pueden mantener segun lo descrito por Estevez et al. (1994). Posteriormente, se obtienen los anticuerpos monoclonales anti-Cry a partir del liquido ascitico de ratones inyectados, via intraperitoneal, con las celulas del hibridoma seleccionado (2x106 celulas/raton, por ejemplo). La purification parcial de los

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anticuerpos se puede realizar mediante precipitacion de la ascitis con sulfato amonico saturado (SAS). En cualquier caso, actualmente en Espana son muchas las companias biomedicas especializadas en la produccion de anticuerpos monoclonales a la carta, a las que se puede encargar su produccion.

En el presente caso, la presencia del transgen de la delta-endotoxina de la invencion se puede detectar tambien mediante pruebas de su actividad plaguicida en plantas fertiles. Las plantas que muestran actividad optima se seleccionan para su posterior reproduccion. Hay metodos disponibles en la tecnica para ensayar la actividad de plagas como, por ejemplo, mezclar la proteina y utilizarla en ensayos de alimentacion, como en los Ejemplos que se muestran mas adelante en la presente solicitud.

La utilizacion de cualquiera de las metodologias anteriormente descritas dan lugar a plantas transgenicas que expresan la delta-endotoxina de la presente invencion, por lo que dichas plantas transgenicas tendran actividad insecticida contra, al menos, un afido, preferiblemente Myzus persicae, de manera que el uso de dichas plantas transgenicas para combatir plagas de afidos y/o conferir a las plantas resistencia a los mismos, en particular de Myzus persicae, es tambien un objeto de la presente invencion. En principio, la manera en que se generan las celulas de plantas transgenicas no es critico para los fines de la presente invencion. Sin embargo, puesto que el objetivo principal de la presente invencion es combatir las plagas de hemipteros, preferiblemente afidos, de entre ellos Myzus persicae en particular, es una realizacion especialmente interesante de la presente invencion aquella en la que las plantas transformadas (transgenicas) selectivamente expresan la delta-endotoxina de la presente invencion en el tejido vascular de la planta, en particular en el tejido del floema, como se divulga en la solicitud WO95/16778, para facilitar la ingestion de la delta-endotoxina por parte de los afidos a combatir. Esto puede conseguirse eligiendo como promotor operativamente unido al gen de la presente invencion, o a una secuencia codificante con un porcentaje de identidad de al menos el 90% con el mismo, un promotor que facilite la expresion en dichos tejidos. Para ello, son promotores adecuados los mismos mencionados en dicha solicitud de patente internacional, tales como el promotor del virus del mosaico de la coliflor 4xB2+A CaMV35S.

La presente invencion se puede utilizar para la transformacion de cualquier tipo de planta. Las plantas por las que se tiene especial preferencia son aquellas que sufren danos causados por afidos, en particular por Myzus persicae, o en las que se ha comprobado que dicho pulgon facilita la transmision de virus. Asi, entre otras, se tiene preferencia por

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plantas transgenicas de melocotonero (Prunus persica), albaricoquero, ciruelo y otras plantas del genero Prunus, ctricos, crucferas, solanaceas, grammeas e, incluso, plantas ornamentales.

Alternativamente, las plantas pueden protegerse mediante la aplicacion de una composicion que contiene la delta-endotoxina de la invencion o un sistema capaz de expresarla. Tambien pueden utilizarse composiciones que comprenden la cepa de Bacillus que contiene en su genoma la secuencia de nucleotidos de la cual se ha aislado el gen de la presente invencion, Bacillus thuringiensis Bt H1.5, u otros microorganismos recombinantes en los que se exprese la delta-endotoxina de la invencion.

Los ingredientes activos (la delta-endotoxina de la presente invencion o un microorganismo que la exprese) de la presente invencion se aplican normalmente en forma de composiciones (las composiciones plaguicidas de la presente invencion) y pueden aplicarse al area de cultivo o planta a tratar, simultaneamente o de forma consecutiva, con otros compuestos. Estos compuestos pueden ser fertilizantes, herbicidas, crioprotectores, agentes tensioactivos, detergentes, jabones, aceites, plaguicidas latentes, polfmeros, o formulaciones de vehculos biodegradables que permiten la dosificacion a largo plazo en un area de destino despues de una sola aplicacion de la formulacion. Tambien pueden ser herbicidas selectivos, insecticidas qmmicos, virucidas, microbicidas, amibicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, molusquicidas o mezclas de varias de estas preparaciones, administradas, si se desea, junto con otros vehculos agncolamente aceptables, tensioactivos o adyuvantes de la aplicacion que se emplean habitualmente en la tecnica de la formulacion de plaguicidas. Los vehculos y adyuvantes adecuados pueden ser solidos o lfquidos y corresponderse con las sustancias empleadas normalmente en la tecnologfa de la formulacion, por ejemplo, sustancias minerales naturales, disolventes, dispersantes, agentes humectantes, aglutinantes o fertilizantes. Del mismo modo las formulaciones se pueden preparar en forma de "cebos comestibles" o formar "trampas" para plagas para permitir la alimentacion o la ingestion por una plaga diana de la formulacion plaguicida; un ejemplo de tales dispositivos puede encontrarse en la solicitud WO9516778.

Los metodos de aplicacion de una composicion de la presente invencion, que comprende al menos la delta-endotoxina de la presente invencion o un sistema de expresion de la misma, tal como celulas de Bacillus thuringiensis Bt H1.5 o de un microorganismo recombinante que comprende el gen de la invencion operativamente unido a un promotor que permite la expresion en dicho microorganismo, incluyen la aplicacion sobre las hojas,

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recubrimiento de semillas y aplicacion en el suelo. La composicion se puede formular en forma de polvo, granulo, aerosol, emulsion, coloide, solucion, o similares, y se puede preparar por medios convencionales tales como la desecacion, liofilizacion, homogeneizacion, extraccion, filtracion, centrifugacion, sedimentacion, o concentracion de un cultivo de celulas que comprenden el polipeptido correspondiente a la delta- endotoxina de la presente invencion.

Las formulaciones tambien pueden variar con respecto a las condiciones climaticas, las consideraciones ambientales, la frecuencia deseada de aplicacion y/o la severidad de la infestacion.

Las composiciones descritas pueden efectuarse mediante la formulacion de cualquier celula bacteriana de las anteriormente citadas, (que, en el caso de Bacillus thuringiensis, puede ser, por ejemplo, una suspension de esporas o de formas cristalinas), o la formulacion de la proteina de la presente invencion, previamente producida y aislada, con el vehiculo agricolamente aceptable deseado.

Un ejemplo de composicion que comprende la delta-endotoxina de la presente invencion puede encontrarse en el Ejemplo 3 de la presente solicitud, donde la proteina soluble se diluyo en una disolucion acuosa que contenia sacarosa, concretamente sacarosa al 20% p/v, que era la dieta artificial preparada para los afidos. Otros ejemplos de formulacion pueden encontrarse, por ejemplo, en la solicitud internacional WO9516778, donde las delta-endotoxinas estan en forma cristalina y se preparan en forma de suspension acuosa.

En general, las composiciones se pueden formular antes de la administracion en un medio apropiado, y se pueden preparar en la forma deseada por medios conocidos tales como liofilizacion, secado con congelacion posterior, o desecacion, o en un vehiculo acuoso, medio o diluyente adecuado, tal como solucion salina u otro tampon. Las composiciones formuladas pueden estar en la forma de un polvo o material granular, o una suspension en aceite (vegetal o mineral), o agua o emulsiones de aceite / agua, o como un polvo humectable, o en combinacion con cualquier otro vehiculo adecuado para aplicacion agricola. El termino "vehiculo agricolamente aceptable" cubre todos los adyuvantes, componentes inertes, dispersantes, tensioactivos, adhesivos, aglutinantes, etc, que se utilizan habitualmente en la tecnologia de formulacion de plaguicidas, que son bien conocidos para los expertos en formulacion plaguicida. Las formulaciones se pueden mezclar con uno o mas adyuvantes solidos o liquidos y prepararse por diversos medios, por ejemplo, mezcla hasta homogeneizacion, mezcla y/o molienda de la composicion

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plaguicida con adyuvantes adecuados usando tecnicas de formulacion convencionales. Formulaciones adecuadas y los metodos de aplicacion se describen, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. N° 6468523, incorporada a la presente solicitud por referencia.

Otra posible alternativa es que el gen de la presente invencion se clone para su expresion en la cepa Bt 4Q7, o en microorganismos como Bacillus megaterium, Pseudomonas spp., o levaduras, en los que la delta-endotoxina producida producida permanece encapsulada en el soma bacteriano, de tal manera que el mismo microorganismo se convertiria en la materia activa del biopesticida, facilmente recuperable por centrifugacion. Esta microencapsulacion, protegeria ademas a la proteina de factores ambientales (ej. UV) alargando su vida util en el medioambiente. La opcion de recubrir dichas proteinas con sustancias (nanoparticulas) que protejan de manera similar a la delta-endotoxina es tambien una posible alternativa.

La delta-endotoxina microencapsulada se puede utilizar en aplicaciones de pulverizacion, bien de forma independiente, o en rotaciones con insecticidas a base de Bt que exprese otras posibles delta-endotoxinas de interes.

Las plantas tambien pueden ser tratadas con una o mas composiciones quimicas, incluyendo uno o mas herbicidas, insecticidas, o funguicidas.

Por todo ello, la presente invencion se refiere a una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una delta-endotoxina, caracterizada por que la secuencia de nucleotidos que codifica una delta-endotoxina esta representada por SEQ ID NO:1 o presenta al menos un 90% de identidad con la misma. En posibles realizaciones, el porcentaje de identidad puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9%, porcentajes de identidad que se consideran que dan lugar a una delta-endotoxina suficientemente identica a la delta-endotoxina cuyo aislamiento y produccion se describe mas adelante en Ejemplos de la presente invencion. Logicamente, otra posible realizacion es aquella en la que la identidad es del 100%, realizacion que corresponded a la alternativa en la que la secuencia de nucleotidos que codifica una delta-endotoxina es exactamente la representada por SEQ ID NO:1, siendo asi una posible realizacion de este aspecto de la invencion que la secuencia de nucleotidos de la molecula de acido nucleico este representada exactamente por SEQ ID NO:1.

La determinacion del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede llevar a

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cabo con los recursos informaticos habituales, basados en algoritmos matematicos, como pueden ser los programas BLASTN y BLASTP utilizados en los Ejemplos posteriores de la presente solicitud, utilizando, por ejemplo, los parametros que aparecen por defecto, asi como con otras aplicaciones alternativas conocidas por los expertos en la materia, como Gapped Blast y PSI-Blast (Altschul et al., 1997), u otros.

Tal como se comenta mas adelante, la proteina Cry de la presente invencion presenta un dominio tipo ricina b, que no esta presente en otras proteinas Cry con actividad contra afidos. Por ello, se prefiere que se mantenga que la secuencia de nucleotidos que codifica una delta-endotoxina comprende un fragmento de secuencia que codifica un dominio tipo ricina b que presenta al menos un 90% de identidad con la secuencia codificante de los aminoacidos 652-799 de SEQ ID NO:2.

Son realizaciones preferidas de la presente invencion, compatibles con las anteriores, aquellas en las que la secuencia de nucleotidos que codifica una delta-endotoxina tiene actividad contra al menos una especie de insecto hemiptero. Se prefiere especialmente que presente actividad contra al menos una especie de afido y, muy especialmente, que tenga actividad contra el afido Myzus persicae.

Otro aspecto de la invencion lo constituyen las "construcciones" o "casetes de expresion" que posibilitan que el gen se exprese en un sistema de expresion u hospedador de interes, asi como los vectores que contienen dichas construcciones y, que facilitan la introduccion del gen en dichos sistemas y/o su expresion en los mismos.

Por ello, la invencion se refiere tambien a una molecula de acido nucleico aislada como cualquiera de las definidas anteriormente como parte de la presente invencion, en la que la secuencia de nucleotidos que codifica la delta-endotoxina de la invencion esta operativamente unida a un promotor. Segun donde se desee expresar el gen (la secuencia de nucleotidos que codifica la delta-endotoxina de la invencion), se tendra preferencia por distintos posibles promotores, que pueden ser promotores capaces de dirigir la expresion de la secuencia en una celula de planta, en una bacteria (preferiblemente seleccionada del grupo de Escherichia coli, Bacillus thuringiensis, Pseudomonas spp.) o en una levadura como Saccharomyces cerevisiae. Son posibles realizaciones de este aspecto de la invencion aquellas en las que la secuencia codificante de la delta- endotoxina esta operativamente unida a alguna secuencia de control adicional, tal como una region no traducida de 3'.

Otro aspecto de la invencion son los vectores que comprenden la secuencia codificante

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de la delta-endotoxina de la presente invencion, preferiblemente ligada a otros elementos de manera que formen las "construcciones" o "casetes de expresion" previamente definidos. Asi, otro aspecto de la invencion es un vector que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una delta-endotoxina, caracterizada por que la secuencia de nucleotidos que codifica una delta-endotoxina esta representada por SEQ ID NO:1 o presenta al menos un 90% de identidad con la misma, o una molecula de acido nucleico en la que este comprendida dicha secuencia de nucleotidos, es decir, un vector en el que esta inserta la molecula de acido nucleico que constituye el primer aspecto de la presente invencion. El vector se elige segun el sistema donde se desea la expresion o que se desea transformar con el. En una realizacion preferida, el vector es un plasmido, lo que permite obtener un numero elevado de copias en bacterias adecuadas transformadas con el y, en caso de que el promotor sea adecuado, permite tambien la expresion de la delta- endotoxina de la presente invencion en la bacteria, siendo posible la produccion y purificacion de la delta-endotoxina a partir de cultivos bacterianos. Tambien esta comprendida dentro del alcance de la invencion la realizacion en la que el plasmido es un plasmido que puede replicarse (y expresarse) en levaduras, como es el caso del llamado plasmido de 2 micras (2 g), de Saccharomyces cerivisiae. Una realizacion preferida es aquella en la que el plasmido permite la expresion de la delta-endotoxina de la presente invencion en una bacteria que se elige entre Escherichia coli, Pseudomonas spp, Bacillus megaterium o Bacillus thuringiensis; en este ultimo caso, se tiene especial preferencia por la cepa Bt 4Q7.

El vector puede ser tambien un vector de transformation de plantas, realizacion compatible, entre otras, con la alternativa de que el vector sea un plasmido. Se prefiere especialmente que dicho vector de transformacion este construido de la manera que la secuencia de nucleotidos que codifica la delta-endotoxina representada por SEQ ID NO:1 o la secuencia codificante que presenta al menos un 90% de identidad con la misma esta operativamente unida a un promotor capaz de dirigir la expresion de dicha secuencia de nucleotidos en una celula de planta, como puede ser el promotor del virus del mosaico de la coliflor (promotor de CaMV) o la variante 4xB2+A CaMV35S; dentro de esta realizacion, se prefiere particularmente que la secuencia codificante este tambien operativamente unida a otras secuencias de control o regulatorias que faciliten o posibiliten la expresion en plantas, como secuencias de termination o, incluso, secuencias lider, aunque la presencia de secuencias regulatorias es igualmente compatible con cualquier vector, incluidos los de expresion en bacterias. Con especialmente preferencia, la estructura del vector de transformacion debera ser tal que

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toda la construccion o "casete de expresion" (promotor, secuencia codificante y secuencias regulatorias o de control) pueda resultar transferido como tal conjunto estructural al genoma de la planta. Es tambien una realizacion preferida, compatible con todas las anteriores, aquella en la que la secuencia codificante de la delta-endotoxina de la presente invencion esta unida a la secuencia codificante de un segundo polipeptido, en fase con ella, y todo el conjunto bajo el control del mismo promotor, de manera que la expresion de la sucesion de secuencias codificantes de lugar a una proteina de fusion.

Otro aspecto mas de la invencion lo constituyen las celulas hospedadoras que comprendan al menos un vector de la presente invencion. Tal como se ha discutido previamente, entre los posibles hospedadores preferidos estan las celulas de bacterias, muy especialmente las del grupo de Escherichia coli, Pseudomonas spp., Bacillus megaterium o Bacillus thuringiensis, especie esta ultima en la que se tiene especial preferencia por la cepa Bt 4Q7. La celula puede ser tambien una celula de planta. Tambien es posible, entre otras realizaciones, que la celula sea una celula de levadura, particularmente de Saccharomyces cerivisiae.

Un aspecto mas de la presente invencion son las plantas transgenicas que comprenden celulas transformadas con vectores de la presente invencion. Por tanto, es un aspecto de la presente invencion una planta transgenica que comprende al menos una celula hospedadora que comprende al menos un vector de la presente invencion. Por planta, como ya se menciono anteriormente, puede entenderse una planta completa o cualquier parte de la misma, asi como las formas previas en su desarrollo que dan lugar a la planta complementamente desarollada, incluidas las plantulas y las semillas. Por su importancia, puede considerarse que un aspecto adicional de la invencion es una semilla que comprende una molecula de acido nucleico de la presente invencion, es decir, una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una delta-endotoxina, caracterizada por que la secuencia de nucleotidos que codifica una delta-endotoxina esta representada por SEQ ID NO:1 o presenta al menos un 90% de identidad con la misma. Tanto en el caso de las plantas como en el de las semillas, se prefieren las plantas que sufren danos causados por afidos (Myzus persicae en particular), o en las que se ha comprobado que dichos insectos facilitan la transmision de virus. Asi, entre otras, se tiene preferencia por plantas, partes de plantas o semillas de melocotonero (Prunus persica), albaricoquero (Prunus armeniaca), ciruelo (Prunus domestica), almendro (Prunus dulcis), otras especies del genero Prunus, citricos, patata, tomate y otras especies de la familia Solanaceae, tabaco, remolacha, remolacha azucarera, cana de azucar, girasol, apio, mostaza, pimiento, calabaza, alcachofa,

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esparrago, judias, brecol, coles de Bruselas, repollo, coliflor, col, col rizada, zanahoria, pepino, nabo, berenjena, lechuga, perejil, chirivia, guisante, alfalfa, pimiento, rabano, espinaca, berro, sandia, melon, maiz, sorgo, mijo, trigo, cebada, centeno, avena, arroz, soja, colza, cartamo, mani, batata, yuca, cafe, coco, pina, cacao, te, platano, aguacate, higo, guayaba, mango, papaya, olivo, algodon, coniferas, azalea, hortensia, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, claveles, flor de pascua, y crisantemos.

Es tambien un aspecto de la presente invencion cualquier polipeptido que comprenda la secuencia de la nueva delta-endotoxina de la presente invencion o secuencias con un alto grado de identidad con la misma que puedan considerarse delta-endotoxinas. Asi, la presente invencion se refiere tambien a un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos caracterizada por que dicha secuencia de aminoacidos:

a) es la representada por SEQ ID NO:2;

Cualquiera de las secuencias que responde a la definicion de a), b) o c) se considera una proteina (delta-endotoxina) de la presente invencion. Se prefiere especialmente que la proteina presente tres dominios estructurales que se correspondan con los dominios N, M y C de las proteinas Cry. Muy especialmente, se prefiere que la secuencia de aminoacidos de la delta-endotoxina comprenda un dominio tipo ricina b.

En el caso de la alternativa c), el porcentaje de identidad puede ser, entre otros, siendo el 100% la opcion a). Es una posible realizacion que el polipeptido se corresponda exactamente con el representado por SEQ ID NO:2.

En cualquiera de las opciones, se prefiere muy especialmente que el polipeptido tenga actividad insecticida contra al menos un hemiptero, preferiblemente al menos una especie de afido, teniendo especial preferencia por que tenga actividad insecticida contra el afido Myzus persicae.

En una posible realizacion, compatible con las anteriores, la secuencia de la delta- endotoxina de la presente invencion esta ligada a un segundo polipeptido, formando una proteina de fusion. Entre los posibles ejemplos de interes como segundo polipeptido

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puede citarse la proteina de union a la maltosa, como en el ejemplo 18 de la solicitud WO2010/099365. La delta-endotoxina de la presente invencion tambien puede estar unida a otras secuencias de aminoacidos de posible interes, como puede ser una secuencia lider en 5' o, por ejemplo, una cola de histidinas que facilite su posterior aislamiento.

Adicionalmente, es tambien un aspecto de la presente invencion una composicion que comprende un polipeptido de la presente invencion segun se ha definido en los parrafos previos, un vector de la presente invencion o una celula hospedadora de la presente invencion, composicion que se considera una composicion de la presente invencion. Preferiblemente, la composicion comprende tambien un excipiente y/o un vehiculo agronomicamente aceptable. La composicion puede estar en diversas formas, preferiblemente formas adecuadas para que la composicion pueda ser administrada como composiciones plaguicida, tales como polvo, granulado, emulsion, coloide, suspension o solucion. La suspension o solucion puede ser acuosa o puede ser que el vehiculo liquido sea, por ejemplo, un aceite o una emulsion.

Se prefiere que la composicion comprenda un polipeptido de la presente invencion o una celula hospedadora de la presente invencion. En este segundo caso, como se ha comentado previamente, se tiene preferencia por las celulas hospedadoras bacterianas o de levadura, particularmente de celulas de una especie que se selecciona entre Pseudomonas spp., Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis Bt 4Q7 o Saccharomyces cerivisae.

En la posible realizacion en la que la composicion comprende un polipeptido de la presente invencion, el mismo puede estar formando parte de una composicion solida, liquida o preparada para ser administrada en forma de aerosol. El polipeptido puede estar en forma cristalina, de forma que formara una suspension en el caso de que la composicion se prepare en un vehiculo acuoso, o puede estar solubilizado en un vehiculo liquido, que puede ser acuoso.

Las composiciones de la presente invencion, como se comento previamente, pueden contener otros distintos componentes adicionales, entre ellos, otros diversos plaguicidas o compuestos que incrementen su accion, incluidas las esporas de Bacillus thuringiensis, que pueden pertenecer a la cepa Bt 1.5H, a la cepa Bt 4Q7, a cualquier otra cepa natural, o a cepas recombinantes, incluidas cepas recombinantes que comprendan los vectores de la presente invencion.

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Puesto que uno de los principales objetivos de la presente invencion es combatir las plagas de pulgon Myzus persicae, un aspecto adicional de la presente invencion es el uso de las composiciones de la presente invencion para combatir plagas de hemipteros, especialmente afidos, y muy especialmente plagas del pulgon Myzus persicae.

Preferiblemente, el uso de la presente invencion es para combatir plagas que produzcan danos en plantas, cultivos de plantas, o a los productos de la cosecha de los mismos. Se prefiere especialmente que las plantas a tratar sean plantas que sufren danos por infestaciones de Myzus persicae o plantas en las que dicho pulgon puede actuar como transmisor de virus. Como ya se comento, estas plantas son principalmente el melocotonero y otros frutales del genero Prunus, asi como citricos, cruciferas, solanaceas e, incluso, coniferas y plantas ornamentales. Entre las especies a tratar se pueden citar melocotonero, albaricoquero, ciruelo, almendro, otras especies del genero Prunus, citricos, patata, tomate y otras especies de la familia Solanaceae, tabaco, remolacha, remolacha azucarera, cana de azucar, girasol, apio, mostaza, pimiento, calabaza, alcachofa, esparrago, judias, brecol, coles de Bruselas, repollo, coliflor, col, col rizada, zanahoria, pepino, nabo, berenjena, lechuga, perejil, chirivia, guisante, alfalfa, pimiento, rabano, espinaca, berro, sandia, melon, maiz, sorgo, mijo, trigo, cebada, centeno, avena, arroz, soja, colza, cartamo, mani, batata, yuca, cafe, coco, pina, cacao, te, platano, aguacate, higo, guayaba, mango, papaya, olivo, algodon, coniferas, azalea, hortensia, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, claveles, flor de pascua, y crisantemos. Se tiene especial preferencia por los frutales del genero Prunus, por una parte, y por el tabaco y la patata, por la especial importancia que tiene en esta ultima para la transmision de virus.

El uso comprende la administracion de las composiciones de la invencion por cualquier metodo conocido, como ya se comento previamente, apropiado segun la formulacion de la composicion, tal como pulverizacion, administracion en el agua de riego, deposito directo sobre organos de la planta o junto a la base de la misma...

Otro aspecto mas de la invencion es un metodo para la produccion de un polipeptido de la presente invencion. El metodo comprende las etapas de:

b) cultivar dicho organismo recombinante;

c) inducir, de ser necesario, la expresion del polipeptido en dicho organismo

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recombinante;

d) purificar el polipeptido a partir del organismo recombinante.

El organismo recombinante puede ser, por ejemplo, una planta transgenica de la presente invencion o una celula hospedadora de la presente invencion u otro microorganismo recombinante, preferiblemente una celula bacteriana o de levadura que o bien comprenda un vector de expresion de la presente invencion, o bien haya integrado en su genoma una molecula de acido nucleico de la presente invencion, especialmente si en dicha molecula de acido nucleico la secuencia de nucleotidos que codifica una delta- endotoxina estaba ya operativamente unida a un promotor que permite su expresion en dicho microorganismo recombinante. Un ejemplo de purificacion del polipeptido de la presente invencion, en este caso la delta-endotoxina de SEQ ID NO:2, se presenta en el Ejemplo 2 de la presente invencion, en el que se obtienen y cultivan celulas de Escherichia coli recombinante, transformadas con un plasmido que expresa dicha delta- endotoxina, induciendo la expresion de la delta-endotoxina con IPTG y procediendo a la purificacion a partir del cultivo, purificacion que puede llevarse a cabo por cualquier medio conocido, como puede ser cromatografia de afinidad como en el Ejemplo 2 citado. En el caso de que la produccion y purificacion se produjera a partir de plantas transgenicas, las formas del polipeptido de la presente invencion que comprenden proteinas de fusion o secuencias auxiliares de aminoacidos como colas de histidinas pueden ser de especial utilidad para el aislamiento del polipeptido de la presente invencion, pudiendo ser necesaria una etapa adicional en la que la secuencia auxiliar o el segundo polipeptido de la proteina de fusion se escinde, por ejemplo mediante el uso de una endoproteasa adecuada.

Finalmente, un aspecto adicional de la presente invencion es un anticuerpo que se une especificamente a un polipeptido de la presente invencion. Preferiblemente, el anticuerpo se une especificamente al fragmento del polipeptido que constituye la delta-endotoxina de la presente invencion, con especial preferencia por la realizacion en la que la secuencia de la delta-endotoxina es la representada por SEQ ID NO:2. En una realizacion preferida, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

La invencion se explicara ahora con mas detalle con ayuda de los Ejemplos y Figuras que aparecen a continuacion.

Ejemplos

- Ejemplo 1: identificacion y aislamiento del nuevo gen cry

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1.1. Identificacion y aislamiento del nuevo gen

El nuevo gen cry se identified en la cepa de Bacillus thuringiensis Bt H1.5, una cepa perteneciente a la coleccion Bt de la Universidad Publica de Navarra, Laboratorio de Bioinsecticidas Microbianos (Iriarte et al., 1998; Iriarte et al., 2000: articulos que describen como se realizo la toma de muestras y se construyo la coleccidn). La cepa Bt H1.5 en concreto fue aislada en la isla de El Hierro, Islas Canarias, Espana.

Esta cepa se cultivo en medio LB (Luria-Bertani) a 28 °C durante 16 horas a 200 rpm y su DNA total (genomico mas plasmidico) se purifico con el kit Wizard® DNA purification kit (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante para el aislamiento de DNA desde bacterias Gram positivas, lo cual implica el tratamiento previo de las celulas bacterinas con lisozima a una concentracion final de 10 mg/ml y una incubacion de 30 minutos a 37SC.

El DNA total fue utilizado para generar una libreria combinada ("pooled") segun las instrucciones de Illumina, Inc. para la preparacion de muestras con el sistema TruSeq™ (
http://supportres.illumina.com/documents/documentation/chemistry documentation/samp lepreps truseq/truseqsampleprep/truseq sample prep pooling guide 15042173 a.pdf), que fue secuenciado utilizando la tecnologia HiSeq™ 2000 Sequencing System (Illumina® Sequencing) en modo de lectura simple, con un tamano de lectura de 50 nucleotidos (GATC Biotech, Alemania).

Las secuencias obtenidas se analizaron utilizando Blast (Altschul et al., 1990) con bases de datos construidas con secuencias de toxinas Bt tales como Cry (cristalinas), Cyt (citoliticas), Vip1, Vip2 y Vip3 (proteinas insecticidas vegetativas), Sip (proteina insecticida secretables) ya descritas como asi tambien aquellas producidas por la bacteria Bacillus sphaericus tales como Mtx 1, Mtx2 y Mtx3 (toxinas mosquitocidas) y binarias Bina/BinB (Berry, 2012), que fueron obtenidas de bases de datos publicas tales como Genbank (Benson et al., 2005). Alternativamente, tambien se utilizo el servidor de anotacion automatizada RAST (Rapid Annotation using Subsystem Technology) (Aziz et al., 2008) el cual es un sistema totalmente automatizado para anotar genomas de bacterias y arcaeas completos o casi completos, proporcionando anotaciones del genoma de alta calidad de todo el arbol filogenetico (
http://rast.nmpdr.org). Ademas de identificar las regiones codificantes o CDSs, identifica los genes de ARNr (ARN ribosomal) y ARNt (ARN de transferencia), asigna funciones a los genes y utiliza esta informacion para reconstruir la red metabolica. Este servidor permite ademas la descarga de los resultados en distintos formatos (GenBank, Fasta, GFF, etc) y la navegacion en el genoma anotado

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facilitando de esta manera el analisis comparativo con otros genomas anotados.

El nuevo gen cry fue identificado mediante la utilization de Blast (Blastx) y el ORF (Open Reading Frame: marco abierto de lectura) o secuencia codificante delimitado manualmente desde el codon de inicio (ATG) hasta el codon de stop (TAA) y con respecto a la secuencia homologa de referencia con mayor cobertura y porcentaje de identidad. Tambien se tuvo en cuenta la secuencia tipica de union a ribosoma o secuencia de Shine-Dalgarno, la cual esta constituida por los siguientes nucleotidos 5’- AAGGAGG -3’, previa al codon de inicio ATG y separada por 7 nucleotidos en la secuencia 5’-TTTATGC-3’. Esta secuencia de union a ribosoma o secuencia de Shine- Dalgarno ya ha sido identificada en Bacillus anthracis, especie que esta estrechamente relacionada a Bacillus thuringiensis (Steichen et al., 2003). La prediction de codones de inicio, ATG en nuestro caso, en base a la presencia de secuencias Shine-Dalgarno ya conocidas; minimiza significativamente la probabilidad de cometer error en la prediccion de dicho codon (Starmer et al., 2006), especialmente, en genes como el de la presente invention, donde existen dos codones ATG proximos y separados por el nucleotido C (TTT AT G CATG).

Este ORF, cuya secuencia esta representada por SEQ ID NO:1, presentaba una longitud total de 2.397 bp (pares de bases), codifica una proteina de 799 aminoacidos, con un peso molecular aproximado de 89 kDa, secuencia de aminoacidos que esta representada por SEQ ID NO:2.

1.2. Analisis bioinformatico y comparativo de la secuencia de la proteina y de su secuencia codificante

La secuencia de aminoacidos de la nueva proteina presento una identidad en Blast (BlastP) maxima del 76,56% y el 76,20% al compararlas contra otras proteinas previamente descritas en las bases de datos publicas, tanto comparando con secuencias "nr" (secuencias de proteinas no redundantes), como comparando con secuencias "pat" (secuencias de proteinas patentadas), respectivamente. Puesto que las proteinas con las que presentaba mayor porcentaje de identidad eran todas ellas proteinas Cry o delta- endotoxinas, la proteina de la presente invencion es una proteina Cry nueva.

Las Tablas 2 y 3 muestran los resultados obtenidos al realizar el BlastP mediante los recursos de uso publico accesibles para tal fin en la pagina web del National Center for Biotechnology Information (NCBI) de EE.UU.

(
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE TYPE=BlastSearch&LI

NK LOC=blasthome), tanto seleccionando la base de datos de proteinas no redundantes (nr) (Tabla2), como seleccionando la base de datos de proteinas patentadas (pat) (Tabla 3). La Tabla 4, por su parte, muestra los resultados obtenidos con las herramientas analogas disponibles en la pagina web del EBI (European Bioinformatics Institute: 5 Instituto Europeo de Bioinformatica) para la consulta del ENA (European Nucleotide Archive: Archivo Europeo de Nucleotidos) (
http://www.ebi.ac.uk/ena/), realizando la consulta sobre la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO:1.

Lista de protemas no redundantes con mayor porcentaje de identidad con respecto a la delta-endotoxina de la presente invencion

Secuencia localizada S: Num. Acceso en Genbank % Identidad % Positivos Longitud de alineamiento Posiciones discrepantes Espacios abiertos Punto de inicio Qa Punto final Qb Punto inicio Sc Punto final Sd Valor e Valor de bits

Proteina pesticida: AGU13869 76,56 83,24 704 154 5 1 700 24 720 0.0 1055

Proteina pesticida: AGU13855 76,20 83,14 706 156 6 1 700 24 723 0.0 1049

Proteina similar a Cry41Aa1: AEH76822.1 57,91 70,92 815 313 15 1 799 1 801 0.0 879

Hipotetica Proteina: EJR94916.1 56,73 68,45 802 312 13 12 799 12 792 0.0 841

Hipotetica Proteina: EJR95828.1 42,08 55,20, 846 420 22 1 799 1 823 6.00E-179 546

Hipotetica Proteina: EJR29963.1 40,68 55,81, 826 447 20 1 799 1 810 4,00 E-165 510

Proteina Cry que mata celulas cancerosas: BAD35160.1 39,19 54,30 860 423 23 1 796 1 824 2.00E-152 478

Proteina Cry: BAD35166.1 39,64 53,94 825 457 21 1 799 1 810 2.00E-148 467

Proteina Cry que mata celulas cancerosas: EEM68667.1 39,24 53,36 864 435 24 1 799 26 864 4,00 E-146 462

Proteina cristalina CryE6S: BAB78603.1 37,94 54,74 738 401 20 1 713 1 706 2.00E-121 406

Proteina Cry que mata celulas cancerosas: BAD35163.1 48,56 65,35 381 176 8 1 365 1 377 2.00E-89 310

Cry32: BAD35163.1 39,60 54,34 346 180 12 471 796 492 828 1.00E-49 196

a Punto de inicio de la comparacion en la secuencia de busqueda (delta-endotoxina de la invencion) b Punto final de la comparacion en la secuencia de busqueda (delta-endotoxina de la invencion) c Punto de inicio de la comparacion en la secuencia localizada d Punto final de la comparacion en la secuencia localizada

ES 2 545 683 A1

Lista de proteinas de documentos de patente con mayor porcentaje de identidad con respecto a

la delta-endotoxina de la presente invencion

Secuencia localizada S: Num. Acceso en Genbank % Identidad % Positivos Longitud alinea- miento Posiciones discrepantes Espacios abiertos Punto inicio Qa Punto final Qb Punto inicio Sc Punto final Sd Valor e Valor de bits

Secuencia 87 de US8318900: AGA40054.1 76,20 83,14 706 156 6 1 700 24 723 0.0 1049

Secuencia 84 de US8461421: AGP18038.1 57,91 70,92 815 313 15 1 799 6 806 0.0 879

Secuencia 94 de US8461421: AGP18048.1 38,15 51,81 886 429 25 1 796 1 857 3,00 E-154 482

Secuencia 140 de US8461421: AGP18084.1 39,24 53,36 864 435 24 1 799 26 864 9.00E-148 462

Secuencia 70 de US8461421: AGP18024.1 39,82 55,72 673 334 20 12 650 12 647 6.00E-118 392

Secuencia 105 de US8461421: AGP18059.1 36,57 52,71 700 374 20 1 650 3 682 9.00E-118 378

Secuencia 92 de US8461421: AGP18046.1 33,38 47,04 710 365 20 42 656 50 746 3.00E-86 304

Secuencia 68 de US8461421: AGP18022.1 33,53 49,06 695 387 22 1 650 14 678 9.00E-84 296

Secuencia 82 de US8318900: AGA40049.1 33,88 47,11 726 346 28 12 656 12 684 9.00E-84 296

Secuencia 91 de US8461421: AGP18045.1 33,56 46,77 727 347 29 12 656 12 684 3.00E-80 285

CO

ES 2 545 683 A1

Lista de secuencias de nucleotidos con mayor porcentaje de identidad con respecto a la secuencia codificante de la delta-endotoxina de la presente invencion

Secuencia localizada S: Num. Acceso en EMBL-Bank % Identidad Longitud de alineamiento Punto de inicio Qa Punto final Qb Punto inicio Sc Punto final Sd Valor e Valor de bits

Gen de proteina plaguicida de Bacillus thuringiensis, cepa ARP242: cds: KC156704 87 1758 1 1758 70 1827 0 2063

Secuencia 38 de US8318900 / WO 2010099365 / JP 2012519000-A: GZ600762/ HH806253 HV951516 87 1757 1 1757 70 1829 0 2056

Gen de proteina plaguicida de Bacillus thuringiensis, cepa ARP256: cds: KC156690 87 1757 1 1757 1 1829 0 2056

Contigl .62 de secuenciacion del genoma completo de Bacillus cereus VDM022: AH FP01000062 73 1345 1 1345 6436 5086 9E-136 500

Supercontig1.5 de asociacion de fragmentos de secuenciacion del genoma completo de Bacillus cereus VDM022: JH791841 73 1345 1 1345 67926 66576 9E-136 500

Secuencia 170 de W02010099365 / Secuencia 123 de JP 2012519000-A: HH806385 HV951601 72 1585 1 1585 1 1585 1E-130 483

Secuencia 24 de W02009158470 / Secuencia 24 de US8461421 / Secuencia 24 de JP2011526150-A: HC309841 / HJ226143 HV549524 71 1345 1 1345 16 1360 2E-101 385

Gen de proteina similar a Cry41Aa1 de Bacillus thuringiensis, cepa Sbt029: cds: JF521582 71 1345 1 1345 16 1360 2E-101 385

Secuencia 169 de WO2010099365 / Secuencia 122 de JP 2012519000-A: HH806384 HV951600 70 1585 1 1585 1 1585 1E-87 483

Secuencia 24 de W02009158470 / Secuencia 24 de US8461421 / Secuencia 24 de JP2011526150-A: HC309841 / HJ226143 HV549524 76 215 1372 1586 1375 1592 4E-21 119

Gen de proteina similar a Cry41Aa1 de Bacillus thuringiensis, cepa Sbt029: cds: JF521582 76 215 1372 1586 1375 1592 4E-21 119

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Contigl .62 de secuenciacion del genoma completo de Bacillus cereus VDM022: AH FP01000062 75 221 1372 1592 5071 4848 6E-16 102

Supercontig1.5 de asociacion de fragmentos de secuenciacion del genoma completo de Bacillus cereus VDM022: JH791841 75 221 1372 1592 33561 66338 6E-16 102

Gen de protelna plaguicida de Bacillus thuringiensis, cepa ARP277: cds: KC156705 70 455 1497 1951 1545 2005 2E-70 73

Gen de hipotetica protelna: protelna Cry parasporina-3 que mata celulas cancerosas, mitad C-terminal, cds completa, cion: GC-I: AB116649 74 152 1874 2025 4903 5057 6E-4 62

Gen de hipotetica protelna: protelna Cry parasporina-3 que mata celulas cancerosas, mitad C-terminal, cds completa, cion: GC-I I: AB116650 74 152 1874 2025 5367 5521 6E-4 62

^ a Punto de inicio de la comparacion en la secuencia de busqueda (gen de la delta-endotoxina de la invencion) o

b Punto final de la comparacion en la secuencia de busqueda (gen de la delta-endotoxina de la invencion)

c Punto de inicio de la comparacion en la secuencia localizada d Punto final de la comparacion en la secuencia localizada

ES 2 545 683 A1

E software Geneious Pro v6.1.7 (Drummond et al., 2014) y su herramienta Geneious Alignment se utilizo para realizar el alineamiento multiple de la secuencia de la proteina CryBMI contra otras proteinas Cry conocidas, para las cuales se ha descrito que presentan actividad contra afidos, incluida la proteina representada por la secuencia con 5 numero de identificacion 205 en la patente US8318900B2 y en la solicitud internacional WO2010099365 (a la que se aludira de forma abreviada en lo sucesivo como Seq205- US8318900). Los resultados de dicho alineamiento se muestran en la Fig. 1. Este alineamiento se utilizo posteriormente para generar el dendrograma representativo de la relacion filogenetica entre las diversas proteinas Cry activas contra afidos que se 10 representa en la Fig. 2 con la herramienta Geneious Tree Builder y obtener una matriz de % de identidad de cada una de ellas (Tabla 5).

Tabla 5

Porcentaje de similitud entre proteinas Cry activas contra afidos, incluida la proteina Cry de la invencion (CryBM1)

: Cry2Aa Cry3Aa Cry4Aa Cry11Aa CryBM1 Seq205- US8318900

Cry2Aa: 100 15,5 13,4 15,7 14,2 13,9

Cry3Aa: 15,5 100 25,2 11,6 26,3 17,1

Cry4Aa: 13,4 25,2 100 9,1 16,5 11,8

Cry11Aa: 15,7 11,6 9,1 100 11,6 12,7

CryBM1: 14,2 26,3 16,5 11,6 100 15,0

Seq205- US8318900: 13,9 17,1 11,8 12,7 15,0 100

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Como puede verse en la Fig. 1, la nueva proteina Cry, al igual que las demas (excepto Cry2Aa, Cry11Aa y Seq205-US8318900), resulto ser una proteina Cry con tres dominios N, M y C, los dominios que se consideran responsable de la actividad insecticida contra distintas especies de insectos.

20 La nueva proteina Cry de la presente invencion (CryBM1), posee, sin embargo, una caracteristica singular representada por un fragmento de secuencia tipo dominio conservado de ricina (numero acceso InterPro IPR000772) constituido por 148

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aminoacidos localizado en el extremo carboxilo terminal entre las posiciones 652 a 799 y representada por la secuencia

TPTPEPVVDGIYQIVTALNNSSVAENGGPTTRGGPDQVKLSPFYNSTDQKWEFIYDSNE DVYTIRNLAGGFLTYFMLNPGYPVLAIRPQWATENQKWIVEPAGNGYYYLRSKSVPTEAA FAPNAADGSVVRMSAVDFSTNQKFKLNKL; mas concretamente, un dominio del tipo de la cadena B de la ricina natural, que es la cadena que tiene actividad como lectina (es decir, una proteina que se une a hidratos de carbono), pues se une a residuos terminales de galactosa presente en las superficies de las celulas. La ricina natural que se produce en las semillas de las plantas de ricino (Ricinus communis) es una proteina heterodimerica, compuesta por una cadena A y una cadena B, que resulta ser una lectina altamente toxica para una amplia variedad de organismos (Chougule and Bonning, 2012). Sin querer limitarse a ninguna teoria especifica, se propone que ese dominio de ricina podria ser el responsable de la elevada toxicidad de la proteina Cry de la presente invencion contra M. persicae que se demuestra en ejemplos posteriores de la presente invencion.

- Ejemplo 2: Clonacion del gen y produccion de la proteina recombinante

Una vez identificado el nuevo gen cry , fue amplificado mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) utilizando una Taq polimerasa a prueba de errores (PrimeSTAR HS DNA polymerase, Takara) con un cebador directo que permitia anadir una diana de restriccion NcoI (5’- CCATGGAT GAACCAAAATT AT AACAACAAT G-3’) (SEQ ID NO:5)

inmediatamente antes del codon de inicio (ATG) y un cebador reverso que permitia anadir una diana de restriccion SalI (5’-

GTCGACTAACTTATTCAGTTTGAATTTTTGATTTG -3’) (SEQ ID NO:6), detallados en cursiva en la secuencia. El cebador reverso ademas carecia el codon de parada (TAA) permitiendo la fusion de la proteina recombinante a la cola de 6 histidinas codificada en el vector. Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 25 pl con 5 pl de buffer de reaccion 5X, 10 mM de dNTPs, 6,3 pmol de cada cebador, 0,5 U de la DNA polimerasa a prueba de errores PrimeSTAR HS DNA polymerase (Takara) y 100 ng de DNA total. Cada reaccion de llevo a cabo en las siguientes condiciones: 4 min. de desnaturalizacion incial a 94°C, 35 ciclos de amplificacion (desnaturalizacion de 1 min. desnaturalizacion a 94°C, 1 min. de annealing (apareamiento) a 52°C y 2,5 min. de extension a 72°C) y con un paso de extension final a 72°C durante 10 min.

El fragmento amplificado fue ligado al vector pJET (Thermo Scientific) siguiendo las instrucciones provistas por el fabricante, separado del vector de clonado mediante

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digestion con las enzimas de restriccion NcoI y Sail y purificado del gel de agarosa con el kit Nucleospin Gel and PCR Cleanup (Macherey-Nagel). El fragmento purificado se subclono en el vector de expresion pET-28b(+) (Novagen) (ver Fig. 3) predigerido con las enzimas de restriccion restriccion Ncol y Sail y siguiendo tecnicas rutinarias de biologia molecular descritas por Sambrook y Russell (Sambrook and Russell, 2001). Este vector, posee un promotor fuerte para la RNA polimerasa viral del Fago T7 y un gen de resistencia a al antibiotico Kanamicina para facilitar su seleccion

Una vez obtenido el vector recombinante de expresion, representado en el Fig. 3, el mismo se utilizo para transformar celulas de Escherichia coli BL21(DE3) (Life Technologies), siguiendo tecnicas rutinarias de biologia molecular descritas por Sambrook y Russell (Sambrook and Russell, 2001). Estas celulas portan en su genoma el gen codificante de la RNA polimerasa viral del fago T7 inducible por IPTG (isopropil-p-D- 1-tiogalactopiranosido), la cual reconoce el promotor codificado en el vector de expresion pET-28b(+) (Novagen) y transcribe el gen clonado llevando a la produccion de la proteina codificada por tal gen.

La produccion de la proteina recombinante CryBM1 se llevo a cabo en las celulas de Escherichia coli obtenidas, induciendo su expresion con 1 mM (concentracion final) de IPTG a 37 °C y una 200 rpm de agitacion durante 16 hs.

La purificacion de la proteina recombinante portadora de una cola de 6 histidinas se llevo a cabo mediante cromatografia de afinidad en columnas de niquel con TED (tris- carboximetil-etilen-diamina) como ligando quelante, con el kit Protino Ni-Ted 1000 (Macherey-Nagel), siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentracion de la proteina soluble purificada fue determinada por el metodo de Bradford (Bradford, 1976). La nueva proteina Cry producida en E. coli se obtuvo en fase soluble a una concentracion aproximada de 1 mg/ml a partir de un litro de medio de cultivo. Al someter a electroforesis en gel SDS-PAGE una alicuota de la muestra purificada obtenida, se observo una banda a una altura correspondiente a un tamano de 89 kDa, equiparable al peso molecular teorico de la secuencia de la proteina recombinante y que se muestra en la Fig. 4.

- Ejemplo 3: Analisis de la actividad insecticida

El analisis de la actividad insecticida se llevo a cabo mediante una simplificacion de la

metodologia de bioensayos descrita por Sadeghi et al. (Sadeghi et al., 2009) utilizando

ninfas de M. persicae de primer estadio (N1) suministradas por el insectario del centro de

investigacion de los presentes inventores. Brevemente, la proteina soluble fue diluida en

dieta artificial para afidos la cual estaba constituida por sacarosa al 20% P/V en agua

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destilada esteril. Cada dilucion se incorporo entre dos laminas de Parafilm® "M" (Bemis Flexible Packaging, Nena, Wiscosin, EE.UU.) y cubriendo cajas circulares pequenas de 3 cm de diametro (1,5 cm de alto) sin tapa. Cada caja contenia 15 ninfas N1. De esta manera, las ninfas eran capaces de alimentarse a traves de la primer membrana de Parafilm® "M" y directamente sobre la mezcla de dieta artificial+toxina en los tratamientos o simplemente de la dieta artificial en el caso del control negativo. La Fig. 5 muestra fotografias de las cajas empleadas, cubiertas con Parafilm® "M" y con la gota de dieta artificial entre dos capas de dicho material.

Los bioensayos se llevaron a cabo en camara bajo las siguientes condiciones controladas: 25°C de temperatura, 70% de humedad relativa y bajo fotoperiodo de 16:8 horas de luz/oscuridad, respectivamente. La mortalidad producida se registro a las 72 horas.

En un principio, se realizaron ensayos preliminares en dos repeticiones y dos concentraciones de 100 y 1000 pg/ml de la proteina Cry de la presente invencion, CryBM1. Estos ensayos permitieron determinar las concentraciones aproximadas que producirian una mortalidad de entre el 5 al 95%. La concentracion letal media (CL50) se determino entonces a cuatro concentraciones de 20, 25, 32 y 40 pg/ml y a tres repeticiones por cada concentracion y el control negativo.

Los resultados obtenidos se muestran a continuacion en la Tabla 6:

Tabla 6

Porcentajes de mortalidad producidos por distintas concentraciones de CryBM1 al ser ingeridas por ninfas neonatas de Myzus persicae

Concentracion (gg/ml): Insectos tratados Insectos muertos % de mortalidad

0: 120 15 12,5

20: 126 20 15,9

25: 125 29 23,2

32: 119 65 54,6

40: 120 100 83,3

La CL50 fue estimada a partir de los datos anteriores, utilizando el programa estadistico Polo PC (LeOra-Software, 1987) basado en el analisis probit de Finney (1971). El valor

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obtenido y los detalles del analisis probit en los que se basa se muestran a continuacion en la Tabla 7.

Tabla 7

Concentracion letal media (CL50) estimada para la nueva proteina CryBMI contra ninfas

neonatas de Myzus persicae

: LC50 Regresion lineal Bondad de ajuste

Tratamiento: (pg/ml) Pendiente±EE* a*±EE* x2 g.l.*

Proteina Cry: 32,7 10,3±1,4 -10,6±2,1 0,55 2

*a: interseccion con la recta de regresion EE: error estandar g.l.: grados de libertad

La CL50 determinada fue de tan solo 32,7 pg/ml. Este valor puede considerarse la CL50 mas baja descrita hasta la fecha para una proteina Cry de Bt aplicada a una especie de hemiptero plaga.

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Slater, R., Paul, V.L., Andrews, M., Garbay, M., Camblin, P., 2012. Identifying the presence of neonicotinoidresistant peach-potato aphid (Myzus persicae) in the peach-growing regions of southern France and northern Spain. Pest Manag Sci 68, 634-638.

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Claims

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REIVINDICACIONES

1. Una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una delta-endotoxina, caracterizada por que la secuencia de nucleotidos que codifica una delta-endotoxina esta representada por SEQ ID NO:1 o presenta al menos un 90% de identidad con la misma.
2. Molecula de acido nucleico segun la reivindicacion 1, en la que la secuencia de nucleotidos que codifica una delta-endotoxina presenta al menos un porcentaje de identidad con la secuencia representada por SEQ ID NO:1 que se selecciona del grupo de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9%.
3. Molecula de acido nucleico segun la reivindicacion 1 o 2, en la que la secuencia de nucleotidos que codifica una delta-endotoxina que comprende un fragmento de secuencia que codifica un dominio tipo ricina b que presenta al menos un 90% de identidad con la secuencia codificante de los aminoacidos 652-799 de SEQ ID NO:2.
4. Molecula de acido nucleico segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una delta- endotoxina que tiene actividad contra al menos un insecto hemiptero.
5. Molecula de acido nucleico segun la reivindicacion 4, que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una delta-endotoxina que tiene actividad contra al menos una especie de afido.
6. Molecula de acido nucleico segun la reivindicacion 5, que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una delta-endotoxina que tiene actividad contra el afido Myzus persicae.
7. Molecula de acido nucleico segun la reivindicacion 1, cuya secuencia de nucleotidos esta representada por SEQ ID NO:1.
8. Molecula de acido nucleico segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la secuencia de nucleotidos que codifica una delta-endotoxina esta operativamente unida a un promotor.

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9. Molecula de acido nucleico segun la reivindicacion 8, en la que el promotor se selecciona del grupo de un promotor capaz de dirigir la expresion de dicha secuencia de nucleotidos en una celula de planta, en una bacteria que se selecciona del grupo de Escherichia coli, Bacillus thuringiensis, Pseudomonas spp., o en una celula de Saccharomyces cerevisiae.
10. Molecula de acido nucleico segun la reivindicacion 8 o 9, que adicionalmente esta operativamente unido a una secuencia de control adicional al promotor.
11. Un vector en el que esta inserta una molecula de acido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
12. Vector segun la reivindicacion 11, que es un plasmido.
13. Vector segun la reivindicacion 12, que es un vector de expresion que permite la expresion en una bacteria de la secuencia de nucleotidos que codifica una delta- endotoxina representada por SEQ ID NO:1 o de una secuencia codificante que presenta al menos un 90% de identidad con la misma.
14. Vector segun la reivindicacion 12, en el que la bacteria se selecciona del grupo de Escherichia coli, Pseudomonas spp., Bacillus megaterium o Bacillus thuringiensis.
15. Vector segun la reivindicacion 11 o 12, que es un vector de transformation de plantas.
16. Vector segun la reivindicacion 15, en el que la secuencia de nucleotidos que codifica la delta-endotoxina representada por SEQ ID NO:1 o la secuencia codificante que presenta al menos un 90% de identidad con la misma esta operativamente unida a un promotor capaz de dirigir la expresion de dicha secuencia de nucleotidos en una celula de planta.
17. Vector segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en que la secuencia codificante de la delta-endotoxina representada por SEQ ID NO:1 o la secuencia codificante que presenta al menos un 90% de identidad con la misma esta unida en fase de lectura a la secuencia codificante de un segundo polipeptido.

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18. Una celula hospedadora que comprende un vector segun una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17.
19. Celula hospedadora segun la reivindicacion 18, que es una celula de levadura.
20. Celula hospedadora segun la reivindicacion 18, que es una celula de bacteria.
21. Celula hospedadora segun la reivindicacion 20, que es una celula de una bacteria que se elige del grupo de Escherichia coli, Pseudomonas spp., Bacillus megaterium o Bacillus thuringiensis.
22. Celula hospedadora segun la reivindicacion 18, que es una celula de planta.
23. Una planta transgenica que comprende la celula hospedadora de la reivindicacion 22.
24. Una semilla transgenica que comprende una molecula de acido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
25. Planta transgenica segun la reivindicacion 23 o semilla transgenica segun la reivindicacion 24, que se selecciona del grupo de melocotonero, albaricoquero, ciruelo, almendro, otras especies del genero Prunus, citricos, patata, tomate y otras especies de la familia Solanaceae, tabaco, remolacha, remolacha azucarera, cana de azucar, girasol, apio, mostaza, pimiento, calabaza, alcachofa, esparrago, judias, brecol, coles de Bruselas, repollo, coliflor, col, col rizada, zanahoria, pepino, nabo, berenjena, lechuga, perejil, chirivia, guisante, alfalfa, pimiento, rabano, espinaca, berro, sandia, melon, maiz, sorgo, mijo, trigo, cebada, centeno, avena, arroz, soja, colza, cartamo, mani, batata, yuca, cafe, coco, pina, cacao, te, platano, aguacate, higo, guayaba, mango, papaya, olivo, algodon, coniferas, azalea, hortensia, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, claveles, flor de pascua, y crisantemos.
26. Un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos caracterizada por que dicha secuencia de aminoacidos:

a) es la representada por SEQ ID NO:2;

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b) es la secuencia de una delta-endotoxina que esta codificada por la secuencia representada por SEQ ID NO:1 o por una secuencia que presenta al menos un 90% de identidad con la misma, o

c) es la secuencia de una delta-endotoxina que presenta al menos un 80% de identidad con la secuencia representada por SEQ ID NO:2.
27. Polipeptido segun la reivindicacion 26, en el que la secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO:2 o la delta-endotoxina definida en los apartados b) o c) de la reivindicacion 26 presenta tres dominios estructurales que se corresponden con los dominios N, M y C de las proteinas Cry.
28. Polipeptido segun la reivindicacion 26 o 27, que comprende una secuencia de aminoacidos que es la secuencia de una delta-endotoxina que presenta al menos un 80% de identidad con la secuencia representada por SEQ ID NO:2, en el que el porcentaje de identidad se selecciona del grupo de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9%.
29. Polipeptido segun la reivindicacion 26, cuya secuencia esta representada por SEQ ID NO:2.
30. Polipeptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, que presenta actividad insecticida contra al menos un hemiptero.
31. Polipeptido segun la reivindicacion 30, que presenta actividad insecticida contra al menos un afido.
32. Polipeptido segun la reivindicacion 31, que presenta actividad insecticida contra Myzus persicae.
33. Polipeptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 32, en el que la secuencia de aminoacidos representada por SEQ ID NO:2 o que corresponde a una delta-endotoxina codificada por una secuencia que presenta al menos un 90% de identidad con SEQ ID NO:1 o que corresponde a una delta-endotoxina que presenta al menos un 80% de identidad con la secuencia representada por SEQ ID NO:2, esta ligada a un segundo polipeptido, formando una proteina de fusion.

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34. Una composicion que comprende un polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 33, un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17 y/o una celula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22.
35. Composicion segun la reivindicacion 34, que adicionalmente comprende un excipiente agronomicamente aceptable y/o un vehiculo agronomicamente aceptable.
36. Composicion segun la reivindicacion 34 o 35, que comprende una celula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21.
37. Composicion segun la reivindicacion 36, en la que las celulas hospedadoras se seleccionan entre las celulas de las especies Pseudomonas spp., Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis Bt 4Q7 o Saccharomyces cerivisae.
38. Composicion segun la reivindicacion 34 o 35, que comprende un polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 33, en forma cristalina o solubilizada en un vehiculo liquido.
39. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 38, que esta en forma de polvo, granulado, emulsion, coloide, suspension o solucion.
40. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 39, que comprende un compuesto plaguicida adicional, un compuesto que incremente la accion plaguicida o esporas de Bacillus thuringiensis.
41. Uso de una composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 40 para combatir plagas de al menos un hemiptero.
42. Uso segun la reivindicacion 41, en el que el hemiptero es un afido.
43. Uso segun la reivindicacion 42, en el que el afido es Myzus persicae.
44. Uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 41 a 43, en el que la plaga a combatir afecta a una planta, un cultivo de plantas, o a los productos de la cosecha de los mismos.

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45. Uso segun la reivindicacion 44, en el que la planta se selecciona del grupo de melocotonero, albaricoquero, ciruelo, almendro, otras especies del genero Prunus, citricos, patata, tomate y otras especies de la familia Solanaceae, tabaco, remolacha, remolacha azucarera, cana de azucar, girasol, apio, mostaza, pimiento, calabaza, alcachofa, esparrago, judias, brecol, coles de Bruselas, repollo, coliflor, col, col rizada, zanahoria, pepino, nabo, berenjena, lechuga, perejil, chirivia, guisante, alfalfa, pimiento, rabano, espinaca, berro, sandia, melon, maiz, sorgo, mijo, trigo, cebada, centeno, avena, arroz, soja, colza, cartamo, mani, batata, yuca, cafe, coco, pina, cacao, te, platano, aguacate, higo, guayaba, mango, papaya, olivo, algodon, coniferas, azalea, hortensia, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, claveles, flor de pascua, y crisantemos.
46. Un metodo para la produccion de un polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 33, que comprende:

a) obtener un organismo recombinante que exprese el polipeptido de la presente invencion;

b) cultivar dicho organismo recombinante;

c) inducir, de ser necesario, la expresion del polipeptido en dicho organismo recombinante;

d) purificar el polipeptido a partir del organismo recombinante.
47. Metodo segun la reivindicacion 46, en el que el organismo recombinante es una planta transgenica.
48. Metodo segun la reivindicacion 46, en el que el organismo recombinante es una celula hospedadora de la presente invencion, una bacteria recombinante o una levadura recombinante
49. Un anticuerpo que se une especificamente a un polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 33.
50. Anticuerpo segun la reivindicacion 49, que se une especificamente al fragmento del polipeptido cuya secuencia:

a) es la representada por SEQ ID NO:2;

b) es la secuencia de una delta-endotoxina que esta codificada por la secuencia representada por SEQ ID NO:1 o por una secuencia que presenta al menos un 90% de identidad con la misma, o

5 c) es la secuencia de una delta-endotoxina que presenta al menos un 80% de

identidad con la secuencia representada por SEQ ID NO:2.
51. Anticuerpo segun la reivindicacion 50, que se une especificamente a la secuencia representada por SEQ ID NO:2.

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52. Anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 49 a 51, que es un anticuerpo monoclonal.