CN110431234A - Bp005毒素基因及其使用方法 - Google Patents

Abstract

提供了赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子杀有害生物活性的组合物和方法。提供了包含毒素多肽的编码序列的组合物。编码序列可在用于在植物和细菌中转化和表达的DNA构建体或表达盒中使用。组合物还包含转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。特别地，提供了分离的毒素核酸分子。另外，涵盖了对应于多核苷酸的氨基酸序列，以及特异性结合这些氨基酸序列的抗体。具体地，本发明提供分离的核酸分子，这些分离的核酸分子包含：编码任一SEQ ID NO:1‑40、42、43、45‑48、50、51、52、54、56、58‑64、66或67所示的氨基酸序列的核苷酸序列，或任一SEQ ID NO:69‑106所示的核苷酸序列，以及其变体和片段。

Description

BP005毒素基因及其使用方法

相关申请的交叉引用

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对以电子方式提交的序列表的引用

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技术领域

本发明涉及分子生物学领域。提供的是编码杀有害生物蛋白质的新基因。这些蛋白质和编码它们的核酸序列在制备杀有害生物配制品和在生产转基因的抵抗有害生物的植物中有用。

背景技术

有害昆虫是世界商业重要农作物受损的主要原因。目前旨在减少作物损失的策略主要依靠化学杀有害生物剂。转基因作物的开发和培养使全世界的农业发生了革命。2014年，全球昆虫保护作物培养面积估计为78.8百万公顷。第一代抗虫转基因植物基于来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)的杀昆虫蛋白。正在开发的第二代抗虫植物包括Bt蛋白和非Bt蛋白，其具有新颖的作用模式和针对昆虫有害生物的不同活性谱。此外，自从引入表达这些毒素的转基因作物以来，通常对杀昆虫Bt蛋白具有抗性的刺穿/吸吮昆虫已成为主要有害生物。表达Bt杀昆虫蛋白的作物对经济上重要的鞘翅目和鳞翅目有害生物提供了极好的控制，但在控制半翅目有害生物方面无效。

因为昆虫可导致破坏且通过控制昆虫有害生物所带来的产量提高，所以不断需要发现新形式的杀有害生物毒素。

发明概述

提供了赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子杀有害生物活性的组合物和方法。组合物包括编码杀有害生物和杀昆虫多肽的序列的核酸分子、包含那些核酸分子的载体，和包含所述载体的宿主细胞。组合物还包括杀有害生物的多肽序列和针对那些多肽的抗体。核苷酸序列可以用于在生物体(包括微生物和植物)中用以转化和表达的DNA构建体或表达盒中。所述核苷酸或氨基酸序列可以是已设计为在生物体中表达的合成序列，该生物体包括但不限于微生物或植物。组合物还包含含有本发明的核苷酸序列的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。

具体地，提供编码杀有害生物蛋白质的分离的、重组的和嵌合的核酸分子。另外，包括与所述杀有害生物蛋白质相对应的氨基酸序列。具体地，本发明提供分离的、重组的或嵌合的核酸分子，其包含：编码SEQ ID NO:1-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66、或67中任一项显示的氨基酸序列的核苷酸序列，或SEQ ID NO:69-106中所示的核苷酸序列，以及其生物学活性变体或片段。还涵盖与本发明的核苷酸序列互补，或与本发明的序列或其互补体杂交的核苷酸序列。还提供包含以下的载体、宿主细胞、植物和种子：本发明的核苷酸序列，或编码本发明氨基酸序列的核苷酸序列，以及其生物学活性变体或其片段。

提供用于产生本发明的多肽，和使用那些多肽来控制或杀伤鳞翅目、半翅目、鞘翅目、线虫或双翅目有害生物的方法。还包括用于在样品中检测本发明的核酸和多肽的方法和试剂盒。

本发明的组合物和方法可用于具有增强有害生物抗性或耐受性的生物体的生产中。这些生物体和组合物包括用于理想的农业用途的生物体。本发明的组合物还可用于生成具有杀有害生物活性的改变或改进的蛋白质，或用于在产品或生物体中检测杀有害生物蛋白或核酸的存在。

具体实施方式

本发明描绘了用于调节生物体，尤其是植物或植物细胞中的有害生物抗性或耐受性的组合物和方法。“抗性”是指有害生物(例如，昆虫)在吸收本发明的多肽或与本发明的多肽接触后被杀死。“耐受性”是指有害生物的运动、摄食、繁殖、或其它功能方面的损害或降低。这些方法涉及用编码本发明的杀有害生物蛋白质的核苷酸序列转化生物。特别地，本发明的核苷酸序列可用于制备具有杀有害生物活性的植物和微生物。由此，提供经转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织和种子。组合物为芽孢杆菌或其他种属的杀有害生物核酸和蛋白质。所述序列可用于构建表达载体以随后转化到感兴趣的生物中，作为探针用于分离其他同源(或部分同源)基因，以及用于通过本领域中已知的方法，诸如结构域交换(domain swapping)或DNA改组(DNA shuffling)，来生成改变的杀有害生物蛋白。所述蛋白质可用于控制或杀伤鳞翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目和线虫有害生物群体，以及用于产生具有杀有害生物活性的组合物。

“杀有害生物毒素”或“杀有害生物蛋白”意指具有针对一种或多种有害生物，包括但不限于，鳞翅目、双翅目、半翅目和鞘翅目，或者线虫(Nematoda)门的成员的毒素活性的毒素，或者与这类蛋白具有同源性的蛋白质。已经从包括例如芽孢杆菌菌种、双酶梭菌(Clostridium bifermentans)和Paenibacillus popilliae在内的生物体分离出杀有害生物蛋白。杀有害生物蛋白质包括本披露的全长核苷酸序列推导的氨基酸序列，以及比全长序列短的氨基酸序列，这是由于可替换的下游起始位点的使用，或者由于加工产生具有杀有害生物活性的一个较短的蛋白质。加工可能发生在蛋白质被表达的生物体内，或在吸收蛋白质后的有害生物内。

因此，本文种提供了赋予杀有害生物活性的新颖的分离的、重组的或嵌合的核苷酸序列。还提供所述杀有害生物蛋白的氨基酸序列。从该基因翻译得到的蛋白质允许细胞去控制或杀伤摄取它的有害生物。

分离的核酸分子及其变体和片段

本发明的一个方面涉及分离的、重组的或嵌合的核酸分子，这些核酸分子包含编码杀有害生物蛋白质和多肽或其生物学活性部分的核酸序列，以及涉及以下核酸分子，这些核酸分子足以用作杂交探针来鉴定编码具有序列同源性区域的蛋白质的核酸分子。本文也包括了在本文其它地方定义的严格条件下能与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。本文所用术语“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如，重组DNA、cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。该核酸分子可以是单链的，或是双链的，但优选地是双链的DNA。术语“重组”包括已相对于天然多核苷酸或多肽操纵的多核苷酸或多肽，以使得该多核苷酸或多肽不同于(例如，在化学组成或结构方面)自然界中存在的多核苷酸或多肽。在另一个实施方案中，“重组”多核苷酸不含有该多核苷酸所来源的生物体基因组DNA中天然存在的内部序列(即内含子)。此多核苷酸的典型实例是所谓的互补DNA(cDNA)。

分离的、重组的或嵌合的核酸(或DNA)在此用于表示不再处于其天然环境中的核酸(或DNA)，例如在体外或在重组细菌或植物宿主细胞中。在一些实施方案中，分离的、重组的或嵌合的核酸是不含有天然侧接生物体基因组DNA中核酸(即位于该核酸5′端和3′端的序列)的序列(优选地蛋白编码序列)，该生物体为该核酸来源。就本发明而言，当“分离的”用于表述核酸分子时，不包括分离的染色体。例如，在多个实施方案中，分离的bp005核酸分子可包含小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，该核苷酸序列天然侧接细胞基因组DNA中的核酸分子，该细胞为该核酸来源。在多个实施方案中，基本上无细胞材料的BP005蛋白包括具有小于约30％、20％、10％或5％(干重)的非BP005蛋白(在此又称之为“污染蛋白”)的蛋白制剂。在一些实施方案中，本发明的重组核酸包含相对于SEQ IDNO:69-106或其变体或片段中任一项的一个或多个核苷酸取代。

本发明编码蛋白质的核苷酸序列包含SEQ ID NO:69-106中任一项所示的序列及其变体、片段和互补体。“互补体”是指与一个给定的核苷酸序列充分互补的核苷酸序列以至于它可以与该给定的核苷酸序列杂交，从而形成稳定的双链。杀有害生物蛋白质的相应的氨基酸序列是由SEQ ID NO:1-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66、或67中任一项所示的这些核苷酸序列编码。

本发明还包括核酸分子，这些核酸分子是编码杀有害生物蛋白质的核苷酸序列的片段。“片段”是指编码杀有害生物蛋白质的核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码杀有害生物蛋白质的具有生物活性的部分，或者它可以是用作使用下述方法的杂交探针或PCR引物的片段。作为编码杀有害生物蛋白质的核苷酸序列的片段的核酸分子，根据所期望的用途可包括至少大约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1350、1400个连续核苷酸，或高达存在于本文披露的编码杀有害生物蛋白质的全长核苷酸序列中的核苷酸数目。“连续的”核苷酸是指彼此紧邻的核苷酸残基。本发明的核苷酸序列片段编码蛋白片段，该蛋白片段保留杀有害生物蛋白质的生物学活性，并且因此保留杀有害生物活性。因此，这里也包括披露的多肽的生物活性片段。“保留活性”是指片段将具有杀有害生物蛋白质的杀有害生物活性的至少大约30％、至少大约50％、至少大约70％、80％、90％、95％或或更高。在一个实施方案中，杀有害生物活性是杀鞘翅目活性。在另一个实施方案中，杀有害生物活性是杀鳞翅目活性。在另一个实施方案中，杀有害生物活性是杀线虫活性。在另一个实施方案中，杀有害生物活性是杀双翅目活性。在另一个实施方案中，杀有害生物活性是杀半翅目活性。用于测定杀有害生物活性的方法是本技术领域中所熟知的。参见，例如，Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.[经济昆虫杂志]83:2480-2485；Andrews等人(1988)Biochem.J.[生物化学杂志]252:199-206；Marrone等人(1985)J.of Economic Entomology[经济昆虫杂志]78:290-293；和美国专利号5,743,477，其通过引用完整并入本文。

编码杀有害生物蛋白质的核苷酸序列的片段编码本发明蛋白质的生物活性部分，该片段编码至少约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450个连续的氨基酸，或达到本发明全长杀有害生物蛋白质中存在的所有氨基酸的数量。在一些实施方案中，片段是蛋白质水解切割性片段。例如，蛋白质水解切割性片段可以具有相对于SEQID NO:1-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66、或67中任一项的至少大约100个氨基酸、至少大约120、大约130、大约140、大约150、大约160个氨基酸的N端或C端截短。在一些实施方案中，本文包含的片段是C-端结晶化区域去除的结果，例如，通过蛋白质水解或通过在编码序列中终止密码子的插入。

在多个实施方案中，本发明的核酸包含SEQ ID NO:69-106中任一种的简并核酸，其中所述简并核苷酸序列与SEQ ID NO:1-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66、或67中任一项编码相同的氨基酸序列。

本发明优选的杀有害生物蛋白质是由与SEQ ID NO:69-106中任一项的核苷酸序列足够同一的核苷酸序列编码，或者杀有害生物蛋白质是与SEQ ID NO:1-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66、或67中任一项所示的氨基酸序列足够同一的。“足够相同”是指氨基酸或核苷酸序列，使用标准参数利用本文描述的对齐程序，相比参考序列具有至少大约60％或65％序列同一性、大约70％或75％序列同一性、大约80％或85％序列同一性、大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高的序列同一性。在本技术领域的普通技术人员都会认识到，这些值通过考虑密码子的简并性、氨基酸相似性，阅读框定位等，可以适当调整以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。

为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分数，对这些序列进行了比对，以达到最佳比较效果。两个核酸的同一性百分数是这些序列共有相同位置的数目的函数(即，同一性百分数＝相同位置的数目/位置总数(例如，重叠位置)x 100)。在一个实施方案中，两个序列具有相同长度。在另一个实施方案中，同一性百分数跨整个参考序列(例如，本文披露的SEQ ID NO:1-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66、67、或69-106中任一个的序列)来计算。使用与以下所述类似的技术，无论允许或不允许缺口，可以确定两个序列之间的同一性百分数。在计算同一性百分数时，典型地对精确匹配进行计算。一个缺口(即一个比对中的一个位置，其中一个残基在一个序列中存在但是在另一个序列中不存在)被视为具有不相同残基的一个位置。

两个序列之间的同一性百分数的确定可以使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的一个非限制性的实例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]87:2264中的算法，如在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-5877中修订的。这样一种算法被并入BLASTN和BLASTX程序，该程序是在Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403中所述的。可以用BLASTN程序(分值＝100，字长＝12)进行BLAST核苷酸检索，以获得与本发明的杀有害生物性类似核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序(分值＝50，字长＝3)进行BLAST蛋白质检索，以获得与本发明的杀有害生物蛋白质同源的氨基酸序列。为了获得缺口比较对齐的目的，可以利用Gapped BLAST(在BLAST2.0中)，如描述于Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389中。作为替代方案，可用PSI-Blast进行迭代检索以检测分子间的远源关系。参见Altschul等人(1997)同上。当利用BLAST、Gapped BLAST以及PSI-Blast程序时，可使用相应程序(例如，BLASTX和BLASTN)的默认参数。对齐也可以通过检查手动进行。

用于比较序列的数学算法的另一非限制性实例是ClustalW算法(Higgins等人(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680)。ClustalW比较序列并比对氨基酸或DNA序列的整体，并且因此可以提供关于完整氨基酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法已被用于几种商业上可获得的DNA/氨基酸分析软件包中，例如载体NTI程序组(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)的ALIGNX模块。在使用ClustalW比对氨基酸序列后，可以评估氨基酸同一性百分数。可用于分析ClustalW比对的软件程序的非限制性实例是GENEDOC^TM。GENEDOC^TM(Karl Nicholas)允许评价多个蛋白质之间氨基酸(或DNA)的相似性和同一性。用于比较序列的数学算法的另一个非限制性的实例是Myers和Miller(1988)CABIOS[生物科学]4:11-17)的算法。这样的算法被结合到ALIGN程序(2.0版)中，它是GCG威斯康辛遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)，版本10(可购自美国加利福尼亚州圣地亚哥市9685斯克兰顿路(Scranton Rd.)的阿赛乐德公司(Accelrys,Inc.))的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分为12和缺口罚分为4。

除非另行说明，GAP版本10使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48(3):443-453的算法的GAP版本，将使用下列参数来确定序列同一性和相似性：核苷酸序列的同一性％和相似性％使用GAP权重＝50，长度权重＝3，以及nwsgapdna.cmp打分矩阵；氨基酸序列的同一性权重和相似性％使用GAP权重＝8，长度权重＝2，以及BLOSUM62打分程序。也可采用等效程序。“等效程序”是指任何序列比对程序，当与GAP版本10产生的相应比对相比时，其对任何两个相关序列的对比产生相同的核苷酸残基匹配和相同的百分序列同一性。

本发明也包含多种核酸分子。编码核苷酸序列的杀有害生物蛋白质的“变体”包括本文披露的编码杀有害生物蛋白质但因为遗传密码的简并性而保守性不同的那些序列，和如上述讨论的足够同一的那些。通过使用众所周知的分子生物学技术，例如聚合酶链式反应(PCR)和如下文概述的杂交技术，可以识别天然存在的等位基因变体。不同的核苷酸序列还包括通过合成衍生的核苷酸序列，这些通过合成衍生的核苷酸序列如通过使用定点诱变产生，但是仍编码如下文讨论的本发明披露的杀有害生物蛋白质。本发明所包括的不同蛋白质具有生物活性，即其继续拥有天然蛋白质所需的生物活性，即，杀有害生物活性。“保留活性”是指变体将具有天然蛋白质杀有害生物活性的至少大约30％、至少大约50％、至少大约70％或至少大约80％。用于测定杀有害生物活性的方法是本技术领域中所熟知的。参见，例如，Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.[经济昆虫杂志]83:2480-2485；Andrews等人(1988)Biochem.J.[生物化学杂志]252:199-206；Marrone等人(1985)J.of EconomicEntomology[经济昆虫杂志]78:290-293；和美国专利号5,743,477，其通过引用完整并入本文。

本技术领域的技术人员将进一步理解可以通过本发明的核苷酸序列的突变而引入变化，以此导致编码的杀有害生物蛋白质的氨基酸序列的变化，而不改变蛋白质的生物活性。因此，分离的核酸分子的变体可以通过将一个或多个核苷酸取代、添加、缺失引入到本文披露的相应的核苷酸序列中来产生，以至于一个或多个氨基酸取代、添加或缺失被引入到编码的蛋白质。通过标准技术，例如定点诱变和PCR-介导的诱变，可以引入突变。这些核苷酸序列变体也包括在本发明中。

例如，保守的氨基酸取代可以在一个或多个预测的不重要氨基酸残基上进行。“非必需的”氨基酸残基是可以从杀有害生物蛋白质的野生型序列改变，而没有改变生物活性，其中“必需的”氨基酸残基是生物活性必需的。“保守的氨基酸取代”是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代。具有相似的侧链的氨基酸残基的家族已在本技术领域中定义。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

氨基酸取代可以在保留功能的非保守区域进行。在一般情况下，不会对保守氨基酸残基，或驻留在保守基序的氨基酸残基进行这样的取代，其中这些残基对于蛋白质活性是重要的。保守的并且可能是蛋白质活性必不可少的残基的实例包括，例如，在对本发明的序列相似或相关的毒素的比对中包含的所有蛋白质之间相同的残基(例如，在同源蛋白质的比对中同一的残基)。保守的但可以允许保守的氨基酸取代并仍然保留活性的残基的实例包括，例如，与本发明的序列相似或相关的毒素的比对中包含的所有蛋白质之间仅具有保守性取代的残基(例如，在比对的同源性蛋白质中包含的所有蛋白质之间仅具有保守性取代的残基)。然而，本技术领域的技术人员能理解功能性变异在保守性氨基酸残基中可以有轻微的保守或非保守的改变。

备选地，通过沿着全部或部分的编码序列随机引入突变，例如通过饱和诱变，可以产生变体核苷酸序列，并且在得到的突变体中，可以筛选能够赋予杀有害生物活性的突变体以鉴别保留活性的突变体。诱变之后，可以重组表达编码的蛋白质并且可以通过标准的试验技术测定该蛋白质的活性。

使用诸如PCR、杂交等的方法可以鉴定出相应的杀有害生物序列，此类序列与本发明的序列具有实质的同一性(例如，对跨整个参考序列至少约70％、至少约75％、80％、85％、90％、95％或更高的序列同一性)，或具有或赋予杀有害生物活性。参见，例如，Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.[分子克隆：实验室手册](Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约州冷泉港)，以及Innis等人(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications[PCR方案：方法和应用的指南](Academic Press[学术出版社]，纽约)。

在杂交方法中，可以使用杀有害生物的核苷酸序列的全部或部分来筛选cDNA或基因组文库。用于构建这些cDNA和基因组文库的方法是本领域普遍已知的，且披露于Sambrook和Russell,2001,同上中。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，且可以标有可检测的基团(例如³²P)或其他任何可检测的标记，例如其他的放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。可以通过基于本文披露的已知杀有害生物蛋白质编码核苷酸序列，对合成寡核苷酸标记来制造用于杂交的探针。另外，可以使用基于在核苷酸序列或编码的氨基酸序列中保守的核苷酸或氨基酸残基设计的简并引物。探针典型地包括核苷酸序列区域，该核苷酸序列区域在严格条件下与本发明编码杀有害生物蛋白质的核苷酸序列的至少大约12、至少大约25、至少大约50、75、100、125、150、175、或200个连续核苷酸或其片段或变体杂交。杂交探针的制备的方法是本技术领域普遍已知的，并且披露于Sambrook和Russell,2001,同上中，其通过引用并入本文作为参考。

例如，本文所披露的完整杀有害生物序列，或其一个或多个部分，可以被用作能够特异地与相应杀有害生物蛋白质类似序列和信使RNA杂交的探针。为了实现在多种条件下的特异性杂交，这些探针包含唯一的、且优选至少约10个核苷酸长或至少约20个核苷酸长的序列。这些探针可以用于通过PCR扩增来自选定生物体或样品的对应杀有害生物序列。该技术可以用于从目的生物体分离附加的编码序列，或者作为确定生物体中是否存在编码序列的诊断性试验。杂交技术包括板化DNA文库的杂交筛选(空斑或集落；参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册](第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约州冷泉港)。

因此，本发明包括用于杂交的探针，以及能够与本发明的核苷酸序列的所有或部分进行杂交的核苷酸序列(例如，至少大约10、25、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、或达到本文披露的核苷酸序列的全长)。可以在严格条件下进行这些序列的杂交。“严格条件”或“严格杂交条件”意指这样的条件，在该条件下探针将会与其靶序列杂交，其可检测程度高于与其它序列杂交的可检测程度(例如，至少高于背景两倍)。严格条件是序列依赖的并且在不同情况下将是不同的。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴别出与探针100％互补的靶序列(同源探测)。作为替代方案，可调整严格条件以允许序列中的一些错配，从而检测出更低的相似度(异源探测)。通常，探针长度小于大约1000个核苷酸，优选长度小于500个核苷酸。

典型地，严格条件将是以下条件，其中盐浓度在pH为7.0到8.3时为低于约1.5M Na离子，通常为大约0.01到1.0M钠离子浓度(或其他盐)并且短探针(例如，10到50个核苷酸)的温度为至少约30℃且长探针(例如，大于50个核苷酸)的温度为至少约60℃。也可以通过添加去稳定剂如甲酰胺实现严格性条件。示例性低严格条件包括用30％-35％甲酰胺的缓冲溶液、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)于37℃杂交，以及在IX至2X SSC(20XSSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中于50℃至55℃冲洗；示例性中等严格条件包括在40％-45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中于37℃杂交，以及在0.5X至1X SSC中于55至60℃冲洗；示例性高严格条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中于37℃杂交，以及在0.1X SSC中于60℃至65℃冲洗。任选地，冲洗缓冲液可以包含大约0.1％至大约1％SDS。通常杂交持续时间小于约24小时，通常约4至约12小时。

特异性典型地是指杂交后冲洗的功能，关键因素是最终冲洗溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交，T_m可以从梅尼克斯和沃尔(1984)分析生物化学138:267-284(Meinkoth and Wahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284)的等式大致估算：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；式中，M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中的鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分率，％甲酰胺是甲酰胺在杂交溶液中的百分率，并且L是碱基对中的杂交的长度。T_m是温度(在确定的离子强度和pH下)，在此温度下，50％的互补靶序列与完全相配的探针杂交。每错配1％，T_m降低约1℃；因而，可调整T_m、杂交和/或冲洗条件至与预期同一性的序列杂交。例如，如果获得同一性＞90％的序列，T_m可以降低10℃。通常，严格条件被选择为比在确定的离子强度和pH下的特异序列及其互补序列的热力学熔点(T_m)低大约5℃。然而，高度严格条件可以在比热力学熔点(T_m)低1℃、2℃、3℃或4℃下采用杂交和/或洗涤；中等严格条件可以在比热力学熔点(T_m)低6、7、8、9或10℃下采用杂交和/或洗涤；低严格条件可以在比热力学熔点(T_m)低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃下采用杂交和/或洗涤。使用等式、杂交、洗涤组合物以及预期的T_m，普通专业技术人员将会理解，杂交和/或洗涤液条件严格性的变化属本质性描述。如果预期的错配度导致T_m低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选是增加SSC浓度以便可以使用更高温度。关于核酸杂交的详细指导可见于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes[生物化学和分子生物学实验室技术：与核酸探针杂交],第一部分,第二章(Elsevier[爱思唯尔出版公司]，纽约)；以及Ausubel等人,编辑.(1995)Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学现代方法],第二章(Greene Publishing[格林出版协会]和Wiley-Interscience[威利国际科学出版公司]，纽约)。参见Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual[分子克隆：实验室手册](第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约州冷泉港)。

分离的蛋白质及其变体和片段

杀有害生物蛋白质也包括在本发明中。“杀有害生物蛋白质”是指具有SEQ ID NO:1-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66、或67中任一项所示的氨基酸序列的蛋白质。还提供其片段、生物活性部分和变体，并且它们可以用于实践本发明的方法。“分离的蛋白”或“重组蛋白”是用于指这样的蛋白，该蛋白不再在它的自然环境中，例如在体外或在一个重组细菌或植物宿主细胞中。在一些实施方案中，重组蛋白是SEQ ID NO:1-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66、或67中任一项的变体，其中该变体相对于SEQ ID NO:1-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66、或67中任一项包含至少一个氨基酸取代、缺失或插入。

“片段”或“生物活性部分”包括多肽片段，这些多肽片段包含与SEQ ID NO:1-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66、或67中任一项所示的氨基酸序列具有足够同一性的氨基酸序列，并且表现出杀有害生物活性。杀有害生物蛋白的生物活性部分可以是多肽，其长度为例如10、25、50、100、150、200、250或更多个氨基酸。这样的生物活性部分可以通过重组技术制备并用于杀有害生物活性的评估。用于测定杀有害生物活性的方法是本技术领域中所熟知的。参见，例如，Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.[经济昆虫杂志]83:2480-2485；Andrews等人(1988)Biochem.J.[生物化学杂志]252:199-206；Marrone等人(1985)J.of Economic Entomology[经济昆虫杂志]78:290-293；和美国专利号5,743,477，其通过引用完整并入本文。如本文使用的，片段包括SEQ ID NO:1-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66、或67中任一项的至少8个连续的氨基酸。但是本发明包括其它的片段，例如蛋白质中大于约10、20、30、50、100、150、200、250或更多的氨基酸长度的任何片段。

“变体”是指具有与SEQ ID NO:1-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66、或67中任一项的氨基酸序列有至少约60％、65％、约70％、75％、约80％、85％、约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的蛋白质或多肽。变体也包括与SEQ ID NO:69-106中任一项的核酸分子或其互补链在严格条件下杂交的核酸分子编码的多肽。变体包括由于诱变在氨基酸序列上不同的多肽。本发明所包括的变体蛋白质具有生物活性，即其继续拥有天然蛋白质预期的生物活性，即，保留杀有害生物活性。在一些实施方案中，变体相对于天然蛋白质具有改善的活性。用于测定杀有害生物活性的方法是本技术领域中所熟知的。参见，例如，Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.[经济昆虫杂志]83:2480-2485；Andrews等人(1988)Biochem.J.[生物化学杂志]252:199-206；Marrone等人(1985)J.of Economic Entomology[经济昆虫杂志]78:290-293；和美国专利号5,743,477，其通过引用完整并入本文。

细菌基因，例如本发明的基因，通常在开放阅读框的起始点附近拥有多个蛋氨酸起始密码子。通常，在一个或多个这些起始密码子处的翻译起始将引起功能蛋白质的产生。这些起始密码子可以包括ATG密码子。然而，细菌例如芽孢杆菌(Bacillus sp.)也识别GTG作为起始密码子，并且在GTG密码子处起始翻译的蛋白质在第一氨基酸包括蛋氨酸。在很少的情况下，在细菌系统中的翻译可以在TTG密码子起始，尽管在这个情况下TTG编码蛋氨酸。此外，通常不确定这些密码子中的哪个先天地在细菌中被天然地利用。因此可以理解使用一个替代的蛋氨酸密码子也可以导致杀有害生物蛋白质的产生。这些杀有害生物蛋白质被包括在本发明中，并且可能在本发明的方法中被利用。应该理解的是，当在植物中表达时，有必要改变备用起始密码子为ATG以正确翻译。

在本发明的多个实施方案中，杀有害生物蛋白质包括从本文披露的全长核苷酸序列推断的氨基酸序列，以及由于备选的下游起始位点的使用短于全长序列的氨基酸序列。因此，本发明的核苷酸序列和/或包含本发明的核苷酸序列的载体、宿主细胞和植物(以及制备和使用本发明的核苷酸序列的方法)可以包含编码对应于SEQ ID NO:1-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66、或67中任一项的氨基酸序列的核苷酸序列。

本发明也包括本发明的多肽或其变体或片段的抗体。用于产生抗体的方法是本领域已熟知的(参见，例如，哈洛(Harlow)和拉内(Lane)(1988)抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，纽约冷泉港(Cold Spring Harbor,NY)；美国专利号4,196,265)。

因此，本发明的一个方面涉及特异性地结合一个或多个本发明的蛋白质或肽分子及其同系物、融合物或片段的抗体、单链抗原结合分子、或其它的蛋白质。在一个特别优选的实施方案中，所述抗体特异性结合具有SEQ ID NO:1-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66、或67中任一项所示的氨基酸序列的蛋白质或其片段。在另一个实施方案中，所述抗体特异性结合包含选自SEQ ID NO:1-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66、或67中任一项所示氨基酸序列的氨基酸序列的融合蛋白或其片段。在多个实施方案中，特异性结合本发明的蛋白质或包含本发明蛋白质的融合蛋白的抗体是非天然存在的抗体。

本发明的抗体可以用于定量或定性地检测本发明的蛋白质或肽分子，或用于检测蛋白质的翻译后修饰。如在此使用的，如果结合是不被非相关分子的存在竞争性地抑制，则认为抗体或肽“特异性地结合”本发明的蛋白质或肽分子。

本发明的抗体可以包含在试剂盒中，该试剂盒可用于检测本发明的蛋白质或肽分子。本发明还包含检测本发明的蛋白质或肽分子(特别是由SEQ ID NO:1-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66、或67中任一项所示氨基酸序列编码的蛋白质，包括能够特异性结合本发明抗体的其变体或片段)的方法，包括使样品与本发明的抗体接触，并测定该样品是否含有本发明的蛋白质或肽分子。利用抗体来检测感兴趣的蛋白质或肽的方法是本领域已知的。

改变的或改善的变体

应当认识到杀有害生物蛋白质的DNA序列可以通过各种方法来改变，并且这些改变可导致以下DNA序列编码蛋白，这些蛋白具有与由本发明的杀有害生物蛋白质编码的氨基酸序列不同的氨基酸序列。这种蛋白质可以以多种方式改变，包括SEQ ID NO:1-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66、或67中任一项的一个或多个氨基酸的氨基酸取代、缺失、截短、和插入，包括多达约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约100、约105、约110、约115、约120、约125、约130、约135、约140、约145、约150、约155、或更多的氨基酸取代、缺失或插入。这样操作的方法是本技术领域中所公知的。例如，杀有害生物蛋白质的氨基酸序列变体可以通过DNA中的突变制备。这可能是通过几种突变形式中的一种和/或在直接的进化中完成。在一些方面，在氨基酸序列中编码的改变将不会本质上影响蛋白质的功能。这样的变体将拥有预期的杀有害生物活性。然而，应了解杀有害生物蛋白质授予杀有害生物活性的能力可以被在本发明的组合物上使用这样的技术所改善。例如，可以在DNA的复制过程中表现出高比例的碱基错误插入的宿主细胞中表达杀有害生物蛋白质，如XL-1Red(Stratagene公司，加利福利亚州拉霍亚)。在这样的菌株中繁殖后，可以分离DNA(例如通过制备质粒DNA、或在载体中通过PCR和克隆扩增产生的PCR片段)，在非突变菌株中培养杀有害生物蛋白质突变体，以及鉴别具有杀有害生物活性的突变基因，例如通过进行一个实验以测试杀有害生物活性。通常，该蛋白质被混合并用于饲喂试验或者该毒素直接暴露于昆虫。参见，例如Marrone等人(1985)J.of Economic Entomology[经济昆虫杂志]78:290-293和Cira等人(2017)J Pest Sci[有害生物科学杂志]90:1257-1268。这样的试验可包括使一种或多种有害生物接触植物并确定该植物的存活和/或导致有害生物死亡的能力。导致毒性增加的突变的实例被描述在Schnepf等人(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.[微生物分子生物学评论]62:775-806。

备选地，也可能对许多蛋白质的氨基或羧基端的蛋白质序列进行改变而本质上不影响活性。这可以包括通过现代分子生物学方法引入插入、缺失或改变，该现代生物学方法是例如PCR，包括PCR扩增，该PCR扩增凭借在PCR扩增中利用的寡核苷酸中包含氨基酸编码序列来改变或延伸蛋白质编码序列。或者，添加的蛋白质序列可以包括整个蛋白质的编码序列，例如在本技术领域中通常用来产生蛋白融合的那些。这样的融合蛋白质通常被用来(1)增加感兴趣的蛋白质的表达(2)引入结合结构域、酶活性、或抗原表位以促进蛋白质纯化、蛋白质检测或其它本技术领域已知的实验用途(3)靶标分泌或蛋白质翻译至亚细胞细胞器，例如革兰氏阴性菌的细胞周质间隙、或真核生物的内质网，后者通常导致蛋白质的糖基化。

本发明变体核苷酸和氨基酸序列也包括从突变和重组基因程序例如DNA改组衍生的序列。通过这样的程序，一个或多个不同的杀有害生物蛋白质编码区域可以被用来产生拥有预期特性的新的杀有害生物蛋白质。以这种方式，从包含具有基本的序列同一性并可以在体外或体内同源重组的序列区域的相关序列多核苷酸群产生重组多核苷酸文库。例如，使用该方法，编码感兴趣的结构域的序列基序可以在本发明的杀有害生物基因和其它已知的杀有害生物基因之间改组，以获得编码具有改善的感兴趣特性的蛋白质的新基因，例如增加杀昆虫活性。用于这样的DNA改组的策略是本技术领域已知的。参见，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]91:10747-10751；Stemmer(1994)Nature[自然]370:389-391；Crameri等人(1997)Nature Biotech.[自然生物技术]15:436-438；Moore等人(1997)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]272:336-347；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]94:4504-4509；Crameri等人(1998)Nature[自然]391:288-291；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。

结构域交换或改组是产生改变的杀有害生物蛋白质的另一种机制。结构域可以在杀有害生物蛋白质之间进行交换，导致杂合或嵌合毒素具有改进的杀有害生物活性或目标光谱。用于产生重组蛋白并测试它们的杀有害生物活性的方法在本技术领域已熟知(参见，例如，Naimov等人(2001)Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物]67:5328-5330；deMaagd等人(1996)Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物]62:1537-1543；Ge等人(1991)J.Mol.Chem.[分子生物学杂志]266:17954-17958；Schnepf等人(1990)J.Biol.Chem.[分子生物学杂志]265:20923-20930；Rang等人91999)Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物]65:2918-2925)。

在又一个实施方案中，可以使用以下一种或多种来获得变体核苷酸和/或氨基酸序列：易错PCR、寡核苷酸指导的诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归整体诱变、指数整体诱变、位点特异性诱变、基因重新装配、基因位点饱和诱变、置换诱变、合成连接重新装配(SLR)、重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、含尿嘧啶的模板诱变、缺口二重诱变、点错配修复诱变、修复缺陷宿主菌株诱变、化学诱变、放射引起的诱变、缺失诱变、限制选择诱变、限制纯化诱变、人工基因合成、整体诱变、嵌合核酸多聚体生成等。

载体

本发明的杀有害生物序列可以在表达盒中提供以在感兴趣的宿主细胞，例如植物细胞或微生物中表达。“植物表达盒”意指能够引起来自植物细胞中的开放阅读框的蛋白质表达的DNA构建体。典型地这些包括启动子和编码序列。这些构建体通常还含有3'端非翻译区。这些构建体可以含有“信号序列”或“前导序列”，以促进肽向某些细胞内结构的共翻译或翻译后转运，这些结构为例如叶绿体(或其它质体)、内质网或高尔基体。

“信号序列”是指已知的或可能导致穿过细胞膜的共翻译或翻译后肽转运的序列。在真核细胞中，其典型地涉及向高尔基体中的分泌，有些会导致糖基化。细菌的杀昆虫毒素通常是合成的毒素，其实在目标有害生物的肠内水解蛋白激活(Chang(1987)MethodsEnzymol.[酶学方法]153:507-516)。在本发明一些实施方案中，信号序列是位于天然的序列中，或可能是从本发明的序列衍生而来。“前导序列”是指在翻译时产生足以触发肽链向亚细胞细胞器共翻译转运的氨基酸序列的序列。因而，其包括通过进入内质网、液泡通道、包括叶绿体、线粒体等质体而靶向转运和/或糖基化的前导序列。如此，本文中进一步提供包含本发明的氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列有效地连接于异源前导序列或信号序列。

“植物转化载体”是指对于有效转化植物细胞必需的DNA分子。这样的分子可以包括一个或多个植物表达盒，且可以组织成一个以上“载体”DNA分子。例如，二元载体是使用2个非连续DNA载体编码转化植物细胞的所有必需的顺式和反式作用功能的植物转化载体(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in Plant Science[植物科学发展趋势],5:446-451)。“载体”是指设计成在不同的宿主细胞之间进行转移的核酸构建体。“表达载体”是指能在外来细胞中结合、整合和表达异源DNA序列或片段的载体。该盒将包括有效地连接至本发明的序列的5’和/或3’调节序列。“有效地连接”是指启动子和第二序列之间的功能连接，其中启动子序列启动并介导与第二序列相对应的DNA序列的转录。通常，有效地连接意味着连接的核酸序列是毗邻的，且在需要连接两个蛋白编码区时这些连接的核酸序列是毗邻的并处在同一阅读框中，但并非总是如此。在一些实施方案中，核苷酸序列有效地连接至能够指导所述核苷酸序列在宿主细胞(例如，微生物宿主细胞或植物宿主细胞)中表达的异源启动子。此外，盒可以含有至少一个额外的基因以被共转化入生物体。作为替代方案，可以在多个表达盒上提供所述额外的基因。

在多个实施方案中，本发明的核苷酸序列有效地连接至能够指导所述核苷酸序列在细胞(例如，植物细胞或微生物)中表达的异源启动子。“启动子”是指作用是引导下游编码序列转录的核酸序列。这些元件，连同其他转录和翻译调控核酸序列(也称“控制序列”)，都是表达感兴趣的DNA序列所必需的。

这样的表达盒提供有多个限制位点，用于插入在调控区的转录调控作用下的杀有害生物序列。

该表达盒将包括在植物中以5'-3'方向转录的转录和翻译起始区(即，启动子)、本发明的DNA序列、以及翻译和转录终止区(即终止区)的功能。启动子可以是对于本发明的植物宿主和/或DNA序列天然的或类似的、或外来的或异源的。此外，启动子可以是天然的序列或者备选地合成的序列。当启动子是对于植物宿主“天然”或“同源”的，它是指启动子在被导入所述启动子的天然植物中发现。当启动子是对于本发明的DNA序列“外来的”或“异源的”，它是指启动子对于本发明的有效连接的DNA序列不是天然的或不是天然存在的启动子。该启动子可以是诱导型或组成型的。它可以是天然存在的，可以由多个天然存在的启动子的部分组成，或者可以是部分合成或完全合成的。用于设计启动子的指导是通过启动子结构的研究来提供的，诸如Harley和Reynolds(1987)Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:2343-2361。而且，可以优化启动子相对于转录起始的位置。参见，例如，Roberts等人(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],76:760-764。用于植物中的许多适合的启动子是本领域已熟知的。

例如，用于植物中的合适的组成型启动子包括：来自植物病毒的启动子，诸如花生褪绿条纹病花椰菜花叶病毒(peanut chlorotic streak caulimovirus)(PClSV)启动子(美国专利号5,850,019)；来自花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)(CaMV)的35S启动子(Odell等人(1985)Nature[自然]313:810-812)；35S启动子，描述于Kay等人(1987)Science[科学]236:1299-1302；小球藻病毒甲基转移酶基因的启动子(美国专利号5,563,328)和来自玄参花叶病毒(FMV)的全长转录物启动子(美国专利号5,378,619)；来自此类基因的启动子，如稻肌动蛋白(McElroy等人(1990)Plant Cell[植物细胞]2:163-171和美国专利5,641,876)；泛素(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]12:619-632和Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]18:675-689)以及Grefen等人(2010)Plant J[植物杂志],64:355-365；pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]81:581-588)；MAS(Velten等人(1984)EMBO J.[欧洲分子生物学学会会刊]3:2723-2730和美国专利5,510,474)；玉蜀黍H3组蛋白(Lepetit等人(1992)Mol.Gen.Genet.[分子基因与遗传学杂志]231:276-285和Atanassova等人(1992)Plant J.[植物杂志]2(3):291-300)；欧洲油菜(Brassica napus)ALS3(PCT申请WO 97/41228)；植物核酮糖-双羧化酶/加氧酶(RuBisCO)小亚基基因；圆环病毒(AU 689 311)或木薯叶脉花叶病毒(CsVMV，US 7,053,205)；来自大豆的启动子(Pbdc6或Pbdc7，描述于WO/2014/150449，或泛素3启动子，描述于美国专利号7393948和美国专利号8395021)；和多种农杆菌(Agrobacterium)基因启动子(参见美国专利号4,771,002；5,102,796；5,182,200；和5,428,147)。

用于植物中的合适的诱导型启动子包括:来自ACE1系统的响应铜的启动子(Mett等人(1993)PNAS[美国国家科学院院刊]90:4567-4571)；玉蜀黍In2基因的响应苯磺酰胺除草剂安全剂的启动子(Hershey等人(1991)Mol.Gen.Genetics[分子基因与遗传学杂志]227:229-237和Gatz等人(1994)Mol.Gen.Genetics[分子基因与遗传学杂志]243:32-38)；以及来自Tn10的Tet抑制子的启动子(Gatz等人(1991)Mol.Gen.Genet.[分子基因与遗传学杂志]227:229-237)。用于植物中的另一种诱导型启动子是响应于植物通常并不响应的诱导剂的一种启动子。该类型的一种示例性的诱导型启动子是来自类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性受到糖皮质类固醇激素的诱导(Schena等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]88:10421)或嵌合转录激活物XVE的最近应用(其用于由雌二醇激活的基于雌激素受体的可诱导植物表达系统(Zuo等人(2000)Plant J.[植物杂志],24:265-273)。用于植物中的其他诱导型启动子描述于EP 332104、PCT WO 93/21334和PCT WO 97/06269中，这些专利通过引用以其整体并入本文作为参考。还可以使用由其他启动子和部分或总体合成的启动子的部分组成的启动子。参见，例如，描述用于植物中的此类启动子的Ni等人(1995)Plant J.[植物杂志]7:661-676和PCT WO 95/14098。

在本发明的一个实施方案中，可将特异于植物的特定区域或组织的启动子序列，用于表达本发明的杀有害生物蛋白，如特异于种子的启动子(Datla,R.等人,1997,Biotechnology Ann.Rev.[生物技术年度回顾]3,269-296)，尤其是napin启动子(EP 255378 A1)、菜豆素(phaseolin)启动子、麦谷蛋白启动子、helianthinin启动子(WO 92/17580)、白蛋白启动子(WO 98/45460)、油质蛋白(oleosin启动子)(WO 98/45461)、SAT1启动子或SAT3启动子(PCT/US 98/06978)。

还可以使用有利地选自以下各项的诱导型启动子：苯丙氨酸解氨酶(PAL)、HMG-CoA还原酶(HMG)、几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶抑制剂(PI)、PR1家族基因、胭脂碱合酶(nos)和vspB启动子(US 5 670 349，表3)、HMG2启动子(US 5 670 349)、苹果β-半乳糖苷酶(ABG1)启动子以及苹果氨基环丙烷羧酸合酶(ACC合酶)启动子(WO 98/45445)。多个启动子可以用于本发明的构建体中，包括依次使用。

启动子可以包括或者被修饰来包括一个或多个增强子元件。在一些实施方案中，启动子可以包括多个增强子元件。含有增强子元件的启动子提供了与不包含它们的启动子相比更高水平的转录。用于植物中的合适的增强子元件包括PClSV增强子元件(美国专利号5,850,019)、CaMV 35S增强子元件(美国专利号5,106,739和5,164,316)和FMV增强子元件(Maiti等人(1997)Transgenic Res.[转基因研究]6:143-156)；申请WO 87/07644中描述的烟草花叶病毒(TMV)的或例如Carrington&Freed 1990,J.Virol.[病毒学杂志]64:1590-1597描述的烟草蚀纹病毒(TEV)的翻译激活子，或内含子如玉蜀黍的adh1内含子或稻肌动蛋白的内含子1。还参见PCT WO 96/23898、WO 2012/021794、WO 2012/021797、WO 2011/084370、以及WO 2011/028914。

这些构建体通常可以含有5'和3'端非翻译区。这些构建体可以含有“信号序列”或“前导序列”，以促进感兴趣的肽向某些细胞内结构共翻译或翻译后转运，或促使其分泌，这些细胞内结构诸如叶绿体(或其他质体)、内质网或高尔基体。例如，构建体可以被工程化为含有促进肽向内质网的转移的信号肽。“信号序列”是指已知的或可能导致穿过细胞膜的共翻译或翻译后肽转运的序列。在真核细胞中，其一般参与向高尔基体中的分泌，有些会导致糖基化。“前导序列”是指在翻译时产生足以触发肽链向亚细胞器共翻译转运的氨基酸序列的任何序列。因而，其包括通过进入内质网、液泡通道、包括叶绿体、线粒体等质体而靶向转运和/或糖基化的前导序列。还可以优选地加工植物表达盒，使之含有内含子，从而其表达需要内含子的mRNA加工。

“3'非翻译区”是指位于编码序列下游的多核苷酸。多腺苷酸化信号序列以及编码能够影响将多腺苷酸片段添加到mRNA前体3'端的调控信号的其他序列都是3'非翻译区。“5'非翻译区”是指位于编码序列上游的多核苷酸。

其他上游或下游的非翻译元件包括增强子。增强子是作用来增加启动子区的表达的多核苷酸。增强子是本领域中公知的，且包括但不限于SV40增强子区和35S增强子元件。

终止区域可以对转录起始区是天然的，可以对有效连接的目的DNA序列是天然的，可以对植物宿主是天然的，或者可能从另一来源衍生而来(即，对于启动子、目的DNA序列、植物宿主、或其任意组合是外来的或异源的)。合适的终止区可以从根癌农杆菌的Ti-质粒得到，例如章鱼碱合酶终止区和胭脂碱合酶终止区。也参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.[分子基因与遗传学杂志]262:141-144；Proudfoot(1991)Cell[细胞]64:671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.[基因开发]5:141-149；MMogen等人(1990)PlantCell[植物细胞]2:1261-1272；Munroe等人(1990)Gene[基因]91:151-158；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17:7891-7903；以及Joshi等人(1987)NucleicAcid Res.[核酸研究]15:9627-9639。

根据需要，可优化一种或多种基因以增加在转化宿主细胞中的表达(合成的DNA序列)。也就是说，可以使用宿主细胞偏好的密码子合成基因以改进表达，或者可以根据宿主偏好的密码子使用频率用密码子合成基因。合成DNA序列的开放阅读框在细胞中的表达能够产生本发明的多肽。合成的DNA序列可以适用于简单地去除不需要的限制性内切核酸酶位点、辅助DNA克隆策略、改变或去除任何潜在的密码子偏爱、改变或提高GC含量、去除或改变交替的阅读框、并且/或者改变或去除可能存在于天然DNA序列中的内含子/外显子间接识别位点、聚腺苷酸化位点、核糖体结合序列、不需要的启动子元件等。通常，基因的GC含量将增加。参见，例如，Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.[植物生理学]92:1-11来讨论宿主偏好的密码子使用。用于合成植物优选基因的方法是本技术领域已知的。参见，例如，美国专利号5,380,831与5,436,391，美国专利申请号20090137409，以及Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17:477-498，通过引用在此结合。

还可能的是合成的DNA序列可以用于将其他改进引入到DNA序列中，诸如引入内含子序列、创建表达为与细胞器靶向序列的蛋白质融合物的DNA序列，诸如叶绿体转运肽、质外体/空泡靶向肽、或在内质网中引起所得肽截留的肽序列。因此，在一个实施方案中，将杀有害生物蛋白质靶向定位在叶绿体中进行表达。以此方式，当杀有害生物蛋白质不是直接插入到叶绿体中时，表达盒将另外含有编码转运肽的核酸以引导杀有害生物蛋白质至叶绿体。这些转运肽是本领域已知的。参见，例如，Von Heijne等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.[植物分子生物学导报]9:104-126；Clark等人(1989)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]264:17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.[植物生理学]84:965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.[生物化学和生物物理研究通讯]196:1414-1421；以及Shah等人(1986)Science[科学]233:478-481。

可以优化靶向定位至叶绿体的杀有害生物基因，以在叶绿体中表达，以说明在植物核和该细胞器之间的密码子使用差异。以此方式，可以使用叶绿体偏好的密码子合成目的核酸。参见例如，美国专利号5,380,831，其通过引用并入本文作为参考。

植物转化

本发明的方法涉及将核苷酸构建体引入植物。“引入”是指将核苷酸构建体提供给植物，其方式为使得构建体能够到达植物细胞的内部。本发明的方法不要求使用某个具体方法将核苷酸构建体引入植物，只要求核苷酸构建体能够到达植物的至少一个细胞的内部。本领域已知的用于将核苷酸构建体引入到植物中的方法包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法以及病毒介导法。

“植物”指整个植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、无性繁殖体、胚及其后代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。

“转基因植物”或“转化植物”或“稳定转化的”植物或细胞或组织是指已经将外源核酸序列或DNA片段结合到或整合到植物细胞中的植物。这些核酸序列包括那些外源的或者未转化的植物细胞中不存在的序列，以及那些或许是内源的或者未转化的植物细胞中或许已经存在的序列。“异源”通常是指如下核酸序列，其对于所在细胞或天然基因组的一部分不是内源的，且已经通过感染、转染、显微注射、电穿孔、显微投射(microprojection)等添加到细胞中。

本发明中的转基因植物表达了本文所披露的一个或多个新型毒素序列。在一些实施方案中，本发明的蛋白质或核苷酸序列有利地在植物中与编码赋予此类植物有用的农艺学特性的蛋白质或RNA的其他基因组合。在编码对转化植物赋予有用的农艺学特性的蛋白质或RNA的基因中，可以提及的是编码赋予对一种或多种除草剂的耐受性的蛋白质、以及赋予对某些昆虫的耐受性的其他蛋白质、赋予对某些疾病的耐受性的那些蛋白质的DNA序列，编码提供线虫或昆虫控制的RNA的DNA等。此类基因特别描述于公开的PCT专利申请WO 91/02071和WO 95/06128以及美国专利7,923,602和美国专利公开号20100166723中，这些专利各自通过引用以其整体并入本文作为参考。

在编码赋予转化植物细胞和植物对某些除草剂的耐受性的蛋白质的DNA序列中，可以提及的是WO 2009/152359中描述的赋予对草丁膦(glufosinate)除草剂的耐受性的bar或PAT基因或天蓝色链霉菌基因、编码赋予对以EPSPS为靶标的除草剂(诸如草甘膦及其盐)的耐受性的适合EPSPS的基因(US 4,535,060、US 4,769,061、US 5,094,945、US 4,940,835、US 5,188,642、US 4,971,908、US 5,145,783、US 5,310,667、US 5,312,910、US 5,627,061、US 5,633,435)、编码草甘膦-n-乙酰转移酶的基因(例如，US 8,222,489、US 8,088,972、US 8,044,261、US 8,021,857、US 8,008,547、US 7,999,152、US 7,998,703、US7,863,503、US 7,714,188、US 7,709,702、US 7,666,644、US 7,666,643、US 7,531,339、US7,527,955、以及US 7,405,074)、编码草甘膦氧化还原酶的基因(例如，US 5,463,175)、或编码HPPD抑制剂耐受蛋白的基因(例如，WO 2004/055191，WO 199638567，US 6791014，WO2011/068567，WO 2011/076345，WO 2011/085221，WO 2011/094205，WO 2011/068567，WO2011/094199，WO 2011/094205，WO 2011/145015，WO 2012/056401，和WO 2014/043435中描述的HPPD抑制剂耐受基因)。

在编码赋予对以EPSPS为靶标的除草剂的耐受性的适合EPSPS的DNA序列中，将更具体地提及的是编码植物EPSPS、具体地是玉蜀黍EPSPS、具体地是包含两个突变(具体地是在氨基酸位置102处的突变和在氨基酸位置106处的突变)并且描述于专利申请US 6566587(在下文中称为双突变体玉蜀黍EPSPS或2mEPSPS)的玉蜀黍EPSPS(WO 2004/074443)的基因、或者编码从农杆菌属中分离的EPSPS并且通过美国专利5,633,435的序列ID No.2和序列ID No.3描述的基因(也称为CP4)。

在编码赋予对以EPSPS为靶标的除草剂的耐受性的适合EPSPS的DNA序列中，将更具体地提及的是编码来自球形节杆菌的EPSPS GRG23而且编码突变体GRG23 ACE1、GRG23ACE2或GRG23 ACE3，具体地是如WO2008/100353中所述的GRG23突变体或变体，诸如WO2008/100353中的SEQ ID No.29的GRG23(ace3)R173K的基因。

在编码EPSPS并且更具体地说编码以上基因的DNA序列的情况下，编码这些酶的序列有利地前置有编码转运肽、特别地前置有美国专利5,510,471或5,633,448中的“优化的转运肽”的序列。

可以与本发明的核酸序列组合的示例性除草剂耐受性性状进一步包括至少一种ALS(乙酰乳酸合酶)抑制剂(WO 2007/024782)；突变的拟南芥ALS/AHAS基因(美国专利6,855,533)；编码通过代谢赋予对2,4-D(2,4-二氯苯氧基乙酸)的耐受性的2,4-D-单加氧酶的基因(美国专利6,153,401)；以及编码通过代谢赋予对麦草畏(3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)的耐受性的麦草畏单加氧酶的基因(US 2008/0119361和US 2008/0120739)。

在多个实施方案中，本发明的核酸与一种或多种除草剂耐受性基因叠加，这些耐受性基因包括一种或多种HPPD抑制剂除草剂耐受性基因、和/或对草甘膦和/或草丁膦耐受的一种或多种基因。

在编码涉及耐昆虫特性的蛋白质的DNA序列中，将更具体地提及的是文献中广泛描述的并且本领域技术人员已熟知的Bt蛋白质。还将提及的是从细菌诸如光杆状菌属中提取的蛋白质(WO 97/17432&WO 98/08932)。

在编码赋予新耐昆虫特性的感兴趣蛋白质的此类DNA序列中，将更具体地提及的是文献中广泛描述的并且本领域技术人员已熟知的Bt Cry或VIP蛋白质。这些蛋白质包括Cry1F蛋白或源自Cry1F蛋白的杂合体(例如，US 6,326,169；US 6,281,016；US 6,218,188中所述的杂合Cry1A-Cry1F蛋白或其毒性片段)、Cry1A型蛋白或其毒性片段、优选地Cry1Ac蛋白或源自Cry1Ac蛋白的杂合体(例如，US 5,880,275中所述的杂合Cry1Ab-Cry1Ac蛋白)或如EP 451878中所述的Cry1Ab或Bt2蛋白或其杀昆虫片段、如WO 2002/057664中所述的Cry2Ae、Cry2Af或Cry2Ag蛋白或其毒性片段、WO 2007/140256中所述的Cry1A.105蛋白(SEQID No.7)或其毒性片段、NCBI登录号ABG20428的VIP3Aa19蛋白、NCBI登录号ABG20429的VIP3Aa20蛋白(在WO 2007/142840中的SEQ ID No.2)、在COT202或COT203棉花事件中产生的VIP3A(分别见WO 2005/054479和WO 2005/054480)、如WO 2001/47952中所述的Cry蛋白、如Estruch等人(1996),Proc Natl Acad Sci U S A.[美国国家科学院院刊]28；93(11):5389-94和US 6,291,156中所述的VIP3Aa蛋白或其毒性片段；来自致病杆菌属(如WO 98/50427中所述的)、沙雷氏菌属(具体地是来自嗜虫沙雷氏菌(S.entomophila))或光杆状菌属物种菌株的杀昆虫蛋白，诸如来自光杆状菌属的如WO 98/08932中所述的Tc-蛋白(例如，Waterfield等人,2001,Appl Environ Microbiol[应用与环境微生物学].67(11):5017-24；Ffrench-Constant和Bowen,2000,Cell Mol Life Sci.[细胞与分子生命科学]；57(5):828-33)。在此还包括一些(1-10，优选地1-5个)氨基酸不同于任一以上序列的这些蛋白质中任一种的任何变体或突变体，这些序列具体地是其毒性片段的序列、或融合至转运肽诸如质体转运肽、或另一种蛋白质或肽的序列。

在多个实施方案中，本发明的核酸可以在植物中与赋予所希望的性状的一种或多种基因组合，这些性状诸如除草剂耐受性、昆虫耐受性、耐旱性、线虫控制、水利用效率、氮利用效率、提高的营养价值、抗病性、提高的光合作用、提高的纤维品质、胁迫耐受性、提高的再生、以及类似性状。

可与本发明的基因在同一物种的植物中组合的特别有用的转基因事件(例如通过杂交或通过将含有另一转基因事件的植物用本发明的嵌合基因再转化)，包括事件531/PV-GHBK04(棉花，昆虫控制，描述于WO 2002/040677)，事件1143-14A(棉花，昆虫控制，未保藏，描述于WO 2006/128569)；事件1143-51B(棉花，昆虫控制，未保藏，描述于WO 2006/128570)；事件1445(棉花，除草剂耐受，未保藏，描述于US-A 2002-120964或WO 2002/034946；事件17053(稻，除草剂耐受，保藏为PTA-9843，描述于WO 2010/117737)；事件17314(稻，除草剂耐受，保藏为PTA-9844，描述于WO2010/117735)；事件281-24-236(棉花，昆虫控制-除草剂耐受，保藏为PTA-6233，描述于WO 2005/103266或US-A 2005-216969)；事件3006-210-23(棉花，昆虫控制-除草剂耐受，保藏为PTA-6233，描述于US-A 2007-143876或WO 2005/103266)；事件3272(玉米，质量性状，保藏为PTA-9972，描述于WO 2006/098952或US-A 2006-230473)；事件33391(小麦，除草剂耐受，保藏为PTA-2347，描述于WO 2002/027004)，事件40416(玉米，昆虫控制-除草剂耐受，保藏为ATCC PTA-11508，描述于WO 11/075593)；事件43A47(玉米，昆虫控制-除草剂耐受，保藏为ATCC PTA-11509，描述于WO2011/075595)；事件5307(玉米，昆虫控制，保藏为ATCC PTA-9561，描述于WO 2010/077816)；事件ASR-368(剪股颖(bent grass)，除草剂耐受，保藏为ATCC PTA-4816，描述于US-A 2006-162007或WO 2004/053062)；事件B16(玉米，除草剂耐受，未保藏，描述于US-A2003-126634)；事件BPS-CV127-9(大豆，除草剂耐受，保藏为NCIMB号41603，描述于WO2010/080829)；事件BLR1(油籽油菜，雄性不育恢复，保藏为NCIMB 41193，描述于WO 2005/074671)，事件CE43-67B(棉花，昆虫控制，保藏为DSM ACC2724，描述于US-A 2009-217423或WO 2006/128573)；事件CE44-69D(棉花，昆虫控制，未保藏，描述于US-A 2010-0024077)；事件CE44-69D(棉花，昆虫控制，未保藏，描述于WO 2006/128571)；事件CE46-02A(棉花，昆虫控制，未保藏，描述于WO 2006/128572)；事件COT102(棉花，昆虫控制，未保藏，描述于US-A2006-130175或WO 2004/039986)；事件COT202(棉花，昆虫控制，未保藏，描述于US-A 2007-067868或WO 2005/054479)；事件COT203(棉花，昆虫控制，未保藏，描述于WO 2005/054480)；)；事件DAS21606-3/1606(大豆，除草剂耐受，保藏为PTA-11028，描述于WO 2012/033794)，事件DAS40278(玉米，除草剂耐受，保藏为ATCC PTA-10244，描述于WO2011/022469)；事件DAS-44406-6/pDAB8264.44.06.1(大豆，除草剂耐受，保藏为PTA-11336，描述于WO 2012/075426)，事件DAS-14536-7/pDAB8291.45.36.2(大豆，除草剂耐受，保藏为PTA-11335，描述于WO 2012/075429)，事件DAS-59122-7(玉米，昆虫控制-除草剂耐受，保藏为ATCC PTA 11384，描述于US-A 2006-070139)；事件DAS-59132(玉米，昆虫控制-除草剂耐受，未保藏，描述于WO 2009/100188)；事件DAS68416(大豆，除草剂耐受，保藏为ATCC PTA-10442，描述于WO 2011/066384或WO 2011/066360)；事件DP-098140-6(玉米，除草剂耐受，保藏为ATCC PTA-8296，描述于US-A 2009-137395或WO 08/112019)；事件DP-305423-1(大豆，质量性状，未保藏，描述于US-A 2008-312082或WO 2008/054747)；事件DP-32138-1(玉米，杂交系统，保藏为ATCC PTA-9158，描述于US-A 2009-0210970或WO 2009/103049)；事件DP-356043-5(大豆，除草剂耐受，保藏为ATCC PTA-8287，描述于US-A 2010-0184079或WO2008/002872)；事件EE-1(茄子(brinjal)，昆虫控制，未保藏，描述于WO 07/091277)；事件FI117(玉米，除草剂耐受，保藏为ATCC 209031，描述于US-A 2006-059581或WO 98/044140)；事件FG72(大豆，除草剂耐受，保藏为PTA-11041，描述于WO 2011/063413)，事件GA21(玉米，除草剂耐受，保藏为ATCC 209033，描述于US-A 2005-086719或WO 98/044140)；事件GG25(玉米，除草剂耐受，保藏为ATCC 209032，描述于US-A 2005-188434或WO 98/044140)；事件GHB119(棉花，昆虫控制-除草剂耐受，保藏为ATCC PTA-8398，描述于WO2008/151780)；事件GHB614(棉花，除草剂耐受，保藏为ATCC PTA-6878，描述于US-A 2010-050282或WO 2007/017186)；事件GJ11(玉米，除草剂耐受，保藏为ATCC 209030，描述于US-A2005-188434或WO 98/044140)；事件GM RZ13(糖用甜菜，病毒抗性，保藏为NCIMB-41601，描述于WO 2010/076212)；事件H7-1(糖用甜菜，除草剂耐受，保藏为NCIMB 41158或NCIMB41159，描述于US-A 2004-172669或WO 2004/074492)；事件JOPLIN1(小麦，疾病耐受，未保藏，描述于US-A 2008-064032)；事件LL27(大豆，除草剂耐受，保藏为NCIMB41658，描述于WO2006/108674或US-A 2008-320616)；事件LL55(大豆，除草剂耐受，保藏为NCIMB 41660，描述于WO 2006/108675或US-A 2008-196127)；事件LLcotton25(棉花，除草剂耐受，保藏为ATCC PTA-3343，描述于WO 2003/013224或US-A 2003-097687)；事件LLRICE06(稻，除草剂耐受，保藏为ATCC 203353，描述于US 6,468,747或WO 2000/026345)；事件LLRice62(稻，除草剂耐受，保藏为ATCC 203352，描述于WO 2000/026345)，事件LLRICE601(稻，除草剂耐受，保藏为ATCC PTA-2600，描述于US-A 2008-2289060或WO 2000/026356)；事件LY038(玉米，质量性状，保藏为ATCC PTA-5623，描述于US-A 2007-028322或WO 2005/061720)；事件MIR162(玉米，昆虫控制，保藏为PTA-8166，描述于US-A 2009-300784或WO 2007/142840)；事件MIR604(玉米，昆虫控制，未保藏，描述于US-A 2008-167456或WO 2005/103301)；事件MON15985(棉花，昆虫控制，保藏为ATCC PTA-2516，描述于US-A 2004-250317或WO 2002/100163)；事件MON810(玉米，昆虫控制，未保藏，描述于US-A 2002-102582)；事件MON863(玉米，昆虫控制，保藏为ATCC PTA-2605，描述于WO 2004/011601或US-A 2006-095986)；事件MON87427(玉米，授粉控制，保藏为ATCC PTA-7899，描述于WO 2011/062904)；事件MON87460(玉米，应激耐受，保藏为ATCC PTA-8910，描述于WO 2009/111263或US-A 2011-0138504)；事件MON87701(大豆，昆虫控制，保藏为ATCC PTA-8194，描述于US-A 2009-130071或WO2009/064652)；事件MON87705(大豆，质量性状-除草剂耐受，保藏为ATCC PTA-9241，描述于US-A 2010-0080887或WO 2010/037016)；事件MON87708(大豆，除草剂耐受，保藏为ATCCPTA-9670，描述于WO 2011/034704)；事件MON87712(大豆，田野，保藏为PTA-10296，描述于WO 2012/051199)，事件MON87754(大豆，质量性状，保藏为ATCC PTA-9385，描述于WO 2010/024976)；事件MON87769(大豆，质量性状，保藏为ATCC PTA-8911，描述于US-A 2011-0067141或WO 2009/102873)；事件MON88017(玉米，昆虫控制-除草剂耐受，保藏为ATCCPTA-5582，描述于US-A 2008-028482或WO 2005/059103)；事件MON88913(棉花，除草剂耐受，保藏为ATCC PTA-4854，描述于WO 2004/072235或US-A 2006-059590)；事件MON88302(油籽油菜，除草剂耐受，保藏为PTA-10955，描述于WO 2011/153186)，事件MON88701(棉花，除草剂耐受，保藏为PTA-11754，描述于WO 2012/134808)，事件MON89034(玉米，昆虫控制，保藏为ATCC PTA-7455，描述于WO 07/140256或US-A 2008-260932)；事件MON89788(大豆，除草剂耐受，保藏为ATCC PTA-6708，描述于US-A 2006-282915或WO 2006/130436)；事件MS11(油籽油菜，授粉控制-除草剂耐受，保藏为ATCC PTA-850或PTA-2485，描述于WO 2001/031042)；事件MS8(油籽油菜，授粉控制-除草剂耐受，保藏为ATCC PTA-730，描述于WO2001/041558或US-A 2003-188347)；事件NK603(玉米，除草剂耐受，保藏为ATCC PTA-2478，描述于US-A 2007-292854)；事件PE-7(稻，昆虫控制，未保藏，描述于WO 2008/114282)；事件RF3(油籽油菜，授粉控制-除草剂耐受，保藏为ATCC PTA-730，描述于WO 2001/041558或US-A 2003-188347)；事件RT73(油籽油菜，除草剂耐受，未保藏，描述于WO 2002/036831或US-A 2008-070260)；事件SYHT0H2/SYN-000H2-5(大豆，除草剂耐受，保藏为PTA-11226，描述于WO 2012/082548)，事件T227-1(糖用甜菜，除草剂耐受，未保藏，描述于WO 2002/44407或US-A 2009-265817)；事件T25(玉米，除草剂耐受，未保藏，描述于US-A 2001-029014或WO2001/051654)；事件T304-40(棉花，昆虫控制-除草剂耐受，保藏为ATCC PTA-8171，描述于US-A 2010-077501或WO 2008/122406)；事件T342-142(棉花，昆虫控制，未保藏，描述于WO2006/128568)；事件TC1507(玉米，昆虫控制-除草剂耐受，未保藏，描述于US-A 2005-039226或WO 2004/099447)；事件VIP1034(玉米，昆虫控制-除草剂耐受，保藏为ATCC PTA-3925.，描述于WO 2003/052073)，事件32316(玉米，昆虫控制-除草剂耐受，保藏为PTA-11507，描述于WO 2011/084632)，事件4114(玉米，昆虫控制-除草剂耐受，保藏为PTA-11506，描述于WO 2011/084621)，事件EE-GM3/FG72(大豆，除草剂耐受，ATCC登录号PTA-11041)任选地叠加于事件EE-GM1/LL27或事件EE-GM2/LL55(WO 2011/063413A2)，事件DAS-68416-4(大豆，除草剂耐受，ATCC登录号PTA-10442，WO 2011/066360A1)，事件DAS-68416-4(大豆，除草剂耐受，ATCC登录号PTA-10442，WO 2011/066384A1)，事件DP-040416-8(玉米，昆虫控制，ATCC登录号PTA-11508，WO 2011/075593 A1)，事件DP-043A47-3(玉米，昆虫控制，ATCC登录号PTA-11509，WO 2011/075595 A1)，事件DP-004114-3(玉米，昆虫控制，ATCC登录号PTA-11506，WO 2011/084621 A1)，事件DP-032316-8(玉米，昆虫控制，ATCC登录号PTA-11507，WO 2011/084632 A1)，事件MON-88302-9(油籽油菜，除草剂耐受，ATCC登录号PTA-10955，WO 2011/153186 A1)，事件DAS-21606-3(大豆，除草剂耐受，ATCC登录号PTA-11028，WO 2012/033794 A2)，事件MON-87712-4(大豆，质量性状，ATCC登录号PTA-10296，WO2012/051199 A2)，事件DAS-44406-6(大豆，叠加的除草剂耐受，ATCC登录号PTA-11336，WO2012/075426 A1)，事件DAS-14536-7(大豆，叠加的除草剂耐受，ATCC登录号PTA-11335，WO2012/075429 A1)，事件SYN-000H2-5(大豆，除草剂耐受，ATCC登录号PTA-11226，WO 2012/082548 A2)，事件DP-061061-7(油籽油菜，除草剂耐受，保藏号未获得，WO 2012071039A1)，事件DP-073496-4(油籽油菜，除草剂耐受，保藏号未获得，US 2012131692)，事件8264.44.06.1(大豆，叠加的除草剂耐受，登录号PTA-11336，WO 2012075426 A2)，事件8291.45.36.2(大豆，叠加的除草剂耐受，登录号PTA-11335，WO 2012075429 A2)，事件SYHT0H2(大豆，ATCC登录号PTA-11226，WO 2012/082548 A2)，事件MON88701(棉花，ATCC登录号PTA-11754，WO 2012/134808 A1)，事件KK179-2(苜蓿，ATCC登录号PTA-11833，WO2013/003558 A1)，事件pDAB8264.42.32.1(大豆，叠加的除草剂耐受，ATCC登录号PTA-11993，WO 2013/010094 A1)，事件MZDT09Y(玉米，ATCC登录号PTA-13025，WO 2013/012775A1)。

植物细胞的转化可以通过本领域内已知的几种技术之一实现。本发明的杀有害生物基因可以被修饰，以获得或增强在植物细胞中的表达。典型地，表达这样的蛋白的构建体会含有启动子以驱动基因转录，并含有3’非翻译区以使转录终止和多腺苷酸化。这些构建体的组织是本领域中公知的。在某些情况下，设计基因可以是有用的，使得分泌由此产生的肽，或以其他方式将其靶向定位在植物细胞内。例如，基因可利用工程方法加工使其含有信号肽，以促进肽向内质网的转移。还可以优选地加工植物表达盒，使之含有内含子，从而其表达需要内含子的mRNA加工。

“植物表达盒”典型地将被插入到“植物转化载体”。此植物转化载体可以包括实现植物转化所需要的一种或多种DNA载体。例如，本领域的通常作法是使用包括一个以上的连续DNA片段的植物转化载体。这些载体在本领域通常称为“二元载体”。二元载体以及带有辅助质粒的载体最常用于农杆菌介导的转化，其中实现高效转化所需的DNA片段的大小和复杂度都是非常大的，且将功能分离到分离的DNA分子上是有利的。二元载体典型地含有质粒载体、可选择标记和“感兴趣的基因”；其中质粒载体含有T-DNA转移(例如左边界和右边界)所需的顺式作用序列；可选择标记设计成能在植物细胞中表达；“感兴趣的基因”指该基因设计成能在植物细胞中表达，以期产生转基因植物。此质粒载体上还存在细菌复制所需要的序列。顺式作用序列以适宜方式排列，使其能向植物细胞内有效转移并在细胞中表达。例如，可选择的标记基因和杀有害生物基因位于左右边界之间。通常，第二质粒载体含有反式作用因子，这些反式作用因子介导从农杆菌到植物细胞的T-DNA转移。此质粒通常含有毒力作用(Vir基因)，使植物细胞被农杆菌属感染，并且通过在边界序列切割来转移DNA以及Vir介导的DNA转移，这一点是在本领域了解的(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in PlantScience[植物科学趋势],5:446-451)。几种类型的农杆菌菌株(例如LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等等)可以用于植物转化。第二质粒载体并非必要通过其他方法转化植物，例如显微投射、显微注射、电穿孔、聚乙二醇等等。

一般来说，植物转化方法涉及将异源DNA转移进入靶植物细胞(例如不成熟的或成熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体，等等)，接着是应用适当的选择(取决于可选择的标记基因)的最大阈值水平以从一组未转化的细胞团块回收转化的植物细胞。典型地，将外植体转移到新鲜供应的相同培养基中，并常规培养。随后，在放置于补充有最大阈值水平的选择剂的再生培养基上之后，使转化细胞分化成嫩苗。然后将嫩苗转移到选择性生根培养基中，用于回收生根的嫩苗或小植株。转基因植株然后成长为成熟的植物并产生可育种子(例如Hiei等人(1994)The Plant Journal[植物杂志]6:271-282；Ishida等人(1996)Nature Biotechnology[自然生物技术]14:745-750)。典型地，将外植体转移到新供应的相同培养基中，并常规培养。用于产生转基因植物的技术与方法的一般说明可参见Ayres和Park(1994)Critical Reviews in Plant Science[植物科学评论性综述]13:219-239以及Bommineni和Jauhar(1997)Maydica[玉米]42:107-120。由于被转化材料含有许多细胞；在任何一块目的愈伤组织或组织或细胞群中同时存在转化细胞和未转化细胞。杀死未转化细胞并允许转化细胞增殖的能力产生转化植物培养物。通常，去除未转化细胞的能力是转化植物细胞的快速回收和转基因植物成功生成的一个限制。

转化方法和将核苷酸序列引入植物的方法可以不同，这取决于靶向转化的植物或植物细胞的类型，即随单子叶植物或双子叶植物而变化。可通过几种方法中的一种方法来生成转基因植物，这些方法包括但不限于显微注射、电穿孔、直接基因转移、通过农杆菌将异源DNA引入植物细胞(农杆菌介导的转化)、用粘附于颗粒的异源外源DNA轰击植物细胞、弹道的颗粒加速、气溶胶束转化(美国公布申请号20010026941、美国专利号4,945,050、国际公布号WO 91/00915、美国公布申请号2002015066)、Lec1转化以及转化DNA的多种其他非颗粒直接介导的方法。

转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见，例如，Svab等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]87:8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:913-917；Svab和Maliga(1993)EMBOJ.[欧洲分子生物学组织杂志]12:601-606。该方法依赖于基因枪递送含有选择标记的DNA，且通过同源重组将DNA靶向定位到质体基因组中。另外，通过对核编码的和质体定位RNA聚合酶的组织偏爱型表达，实现沉默的质体携带的转基因的反式激活，可以完成质体转化。这样的系统已经被报道于McBride等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]91:7301-7305。

异源的外来DNA整合到植物细胞中后，然后在培养基中选择时应用最大阈值水平，以杀死未转化细胞，并通过定期地转移到新鲜培养基中，分离和繁殖能在该选择处理中存活的推定已转化的细胞。通过连续传代和用合适选择挑战，可以鉴别和繁殖经质粒载体转化的细胞。然后，可以用分子和生物化学方法来确认异源的感兴趣的基因是否整合到转基因植物的基因组中。

可根据常规方法将已经转化的细胞培养成植物。参见，例如，McCormick等人(1986)Plant Cell Reports[植物细胞报告]5:81-84。之后这些植物可以生长，并且用相同的转化品系或不同的品系对它授粉，并且所得的杂种具有鉴定的所需表型特征组成型表达。可以培养两代或多代，以确保理想表型特征的表达得到稳定维持和遗传，然后收获种子，以确保已经实现了理想表型特征的表达。以此方式，本发明提供了具有稳定地结合到在其基因组中的本发明核苷酸构建体(例如本发明的表达盒)的转化种子(也称作“转基因种子”)。

植物转化的评估

将异源的外来DNA引入植物细胞后，通过不同的方法，例如分析核酸或蛋白质以及与整合的基因有关的代谢物，可以确认异源基因在植物基因组中的转化或整合。

PCR分析是在移植到土壤中之前的早期阶段，筛选转化的细胞、组织或芽是否存在所掺入的基因的快速方法(Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual.[分子克隆：实验室手册]Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约州冷泉港)。使用对感兴趣的基因或农杆菌载体背景等具有特异性的寡核苷酸引物进行PCR。

可以通过基因组DNA的Southern印迹分析确认植物转化(Sambrook和Russell,2001,同上)。一般而言，从转化体中提取总DNA，用合适的限制酶消化，在琼脂糖凝胶上分级分离，并转移到硝酸纤维素或尼龙膜上。然后根据标准技术(Sambrook和Russell,2001,同上)，用例如放射标记的³²P靶DNA片段探测膜或“印迹”，以确认所引入的基因在植物基因组中的整合。

做Northern印迹分析时，按照本领域常规使用的标准程序(Sambrook和Russell,2001,同上)，将RNA从转化体的特定组织中分离，在甲醛琼脂糖凝胶中分级分离，印迹到尼龙滤膜上。然后使用本技术领域已知的方法(Sambrook和Russell,2001,同上)，通过使所述滤膜与源自于杀有害生物基因的放射性探针杂交，检测杀有害生物基因编码的RNA的表达。

可对转基因植物进行蛋白质印迹、生物化学检验等，使用结合到存在于杀有害生物蛋白质的一个或多个表位上的抗体通过标准程序(Sambrook和Russell,2001,同上)以确认杀有害生物基因编码的蛋白质的存在。

植物中的杀有害生物活性

本发明的另一个方面，可以产生表达具有杀有害生物活性的杀有害生物蛋白质的转基因植物。上述通过实例的方式描述的方法可以被用来产生转基因植物，但该产生转基因植物细胞的方式对本发明不是决定性的。本技术领域已知的或描述的方法例如农杆菌介导的转化、基因枪转化、和非颗粒介导的方法可以根据实验者的判断力来使用。表达杀有害生物蛋白质的植物可以通过本技术领域中描述的通用方法来分离，例如通过愈伤组织转化、转化愈伤组织的选择、以及从这样的转基因愈伤组织再生可育的植物。在这样的过程中，可以使用任何基因作为可选择的标记，只要它在植物中的表达赋予鉴别和选择转化细胞的能力。

已经开发了很多标记用于植物细胞，例如抵抗氯霉素、氨基糖苷G418、潮霉素等等。编码涉及叶绿体代谢物的产物的其它基因也可以被用作可选择的标记。例如，对植物除草剂例如草甘膦、溴苯腈或咪唑啉酮提供抗性的基因可以发现特定用途。这样的基因已经被报道(Stalker等人(1985)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]263:6310-6314(溴苯腈抗性腈水解酶基因)；以及Sathasivan等人(1990)Nucl.Acids Res.[核酸研究]18:2188(AHAS咪唑啉酮抗性基因)。另外，本文披露的基因可用作评估细菌或植物细胞转化的标记。用于在植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚或其子代中检测转基因的存在的方法在本技术领域中是熟知的。在一个实施方案中，转基因的存在是通过测试杀有害生物活性来检测。

表达杀有害生物蛋白质的可育植物可以用于杀有害生物活性测试，并且选择显示出最佳活性的植物用于进一步育种。方法是本技术领域可获得的以测定有害生物活性。通常，该蛋白质被混合并用于饲喂试验。参见，例如Marrone等人(1985)J.of EconomicEntomology[经济昆虫杂志]78:290-293。

本发明可以用于任何植物种的转化，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。感兴趣的植物的实例包括但不限于玉米(玉蜀黍)、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油籽油菜、芸苔属、苜蓿、黑麦、粟类、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑桔树、可可、茶叶、香蕉、油桃、无花果、番石榴、芒果、橄榄、木瓜、腰果、澳洲坚果、杏、燕麦、蔬菜、观赏植物以及针叶树。

蔬菜包括但不限于番茄、莴苣、青豆、利马豆、豌豆以及甜瓜属的成员(诸如黄瓜、哈密瓜以及香瓜)。观赏植物包括但不限于杜鹃花、锈球花、芙蓉、玫瑰、郁金香、黄水仙、矮牵牛、康乃馨、一品红以及菊花。优选地，本发明的植物是作物植物(例如，玉蜀黍、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科的植物、胡椒、土豆、棉花、稻谷、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油籽油菜等等)。

在杀有害生物控制方面的用途

用于采用包括本发明的核苷酸序列或其变体的菌株在有害生物控制或工程化其他生物作为杀有害生物剂的一般方法是本技术领域已知的。参见例如，美国专利号5,039,523和EP 0480762A2。

含有本发明的核酸序列或其变体的芽孢杆菌菌株、或遗传学上被改变成包含本发明的杀有害生物基因和蛋白质的微生物可用于保护农作物和产品防御有害生物。在本发明的一方面，当细胞应用于一种或多种目标有害生物的环境时，生产毒素(杀有害生物剂)的生物体的完整的即未裂解的细胞使用延长细胞中生产的毒素的活性的试剂处理。

备选地，杀有害生物剂是通过将杀有害生物基因引入到细胞宿主来产生。杀有害生物基因的表达直接或间接地导致杀有害生物剂在细胞内生产和保持。在本发明的一个方面，当细胞应用于一种或多种目标有害生物的环境时，然后在延长在细胞中生产的毒素的活性的条件下处理这些细胞。产生的产物保留了毒素的毒性。这些天然封装的杀有害生物剂然后可依照常规技术配制用于具有目标有害生物的环境，例如，土壤、水和植物的叶子。参见，例如EPA0192319，并在此引用作为参考。备选地，可配制表达本发明的基因的细胞以至于允许应用生成的物质作为杀有害生物剂。

本发明的活性成分通常是以组合物的形式应用，并且可以同时或相继地与其他化合物应用于要处理的作物区或植物。这些化合物可以是肥料、除草剂、冷冻保护剂、表面活性剂、洗涤剂、杀虫皂、休眠油、聚合物、和/或定时释放或生物可降解的载体配制品，其允许单一应用该配制品后一个靶标区域的长期给药。它们还可以是选择性除草剂、化学杀虫剂、杀病毒剂、杀微生物剂、杀变形虫剂、杀有害生物剂、杀真菌剂、杀菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、或几种这些制剂的混合物，如果需要的话，进一步与农业上可接受的载体、表面活性剂或应用促进佐剂习惯一起应用于本制剂技术领域中。合适的载体和佐剂可以是固体或液体，并对应在配制技术中通常所用的物质，例如天然的或再生的矿物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂、粘合剂或肥料。同样地，这些配制品可以制备成可食用的“诱饵”或塑造成有害生物“陷阱”，以允许该杀有害生物配制品被靶标有害生物摄食或消化。

应用本发明的活性成分或包含本发明的细菌菌株产生的至少一种杀有害生物蛋白质的本发明的农艺化学组合物的方法包括叶应用、种子包衣和土壤应用。应用的数量和应用比例取决于被对应有害生物侵染的强度。

该组合物可以配制成粉剂、尘剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体、溶液、或诸如此类，并且可以通过常规方法如脱水、冷冻干燥、均质化、提取、过滤、离心、沉降、或浓缩包含该多肽的细胞培养物来制备。在包含至少一种这样的杀有害生物多肽的所有这些组合物中，多肽可以以约1％的至约99％浓度(重量)存在。

鳞翅目、半翅目、双翅目或鞘翅目有害生物可以通过本发明的方法在给定的区域杀死或减少其数量，或者可以预防性地应用于环境区域以防止易感有害生物的侵染。优选是有害生物摄取或接触杀有害生物有效量的多肽。“杀有害生物有效量”是指能够对至少一种有害生物致死，或显著地减少有害生物生长、摄食、或正常的生理发育的杀有害生物剂的量。例如，杀有害生物剂可导致卵孵化减少、在昆虫发育的任何阶段的死亡率降低、蜕皮减少和/或有害生物对靶生物的摄食减少(例如，植物或植物细胞的摄食部位数目减少和/或对植物或植物细胞的损害减少)。此量将根据这些因子改变，例如，待控制的特定的目标有害生物、特定的环境、位置、植物、作物、或待处理的农业现场、环境条件、以及杀有害生物有效的多肽组合物的方法、比率、浓度、稳定性、和应用的数量。这些配制品还可以相对于气候条件、环境考虑和/或应用的频率和/或有害生物侵染的严重性而变化。

所述的杀有害生物剂组合物可通过配制细菌细胞、晶体和/或孢子悬液，或具有预期的农业上可接收的载体的分离蛋白质组分而制成。这些组合物可以在施用前以适当方法如冻干、冷冻干燥、脱水、或在水性载体、介质或适合的稀释剂如生理盐水或其他缓冲液中配制。配制的组合物可以是以粉尘或颗粒材料的形式，或在油(植物或矿物)中的悬浮液的形式，或水或油/水乳剂的形式，或作为可湿性粉剂的形式，或与合适农业应用的任何其他载体材料组合的形式。合适的农业载体可以是固体或液体，并且在本技术领域中是熟知的。术语“农业上可接受的载体”涵盖了那些通常在杀有害生物剂配制技术中所用的所有的佐剂、惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂等；这些是在杀虫剂制剂领域的技术人员熟知的。这些配制品可与一种或多种固体或液体佐剂混合并通过各种方法，例如使用常规制剂技术和合适的佐剂通过均匀混合、搅拌和/或研磨杀有害生物组合物以制备。合适的配制品和应用方法被描述在美国专利号6,468,523中，通过引用在此结合。

“有害生物”包括但不限于昆虫、真菌、细菌、线虫、螨虫、蜱等等。昆虫有害生物包括选自以下目的昆虫：鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、总翅类、革翅目、等翅目、虱属、蚤目、毛翅目等，特别地是鞘翅目、鳞翅类，以及双翅目。

鞘翅目包括肉食亚目(Adephaga)和多食亚目(Polyphaga)。肉食亚目包括超家族步甲总科(Caraboidea)和豉甲总科(Gyrinoidea)，而多食亚目包括超家族水龟甲总科(Hydrophiloidea)、隐翅甲总科(Staphylinoidea)、花萤总科(Cantharoidea)、郭公甲总科(Cleroidea)、叩头甲总科(Elateroidea)、花甲总科(Dascilloidea)、泥甲总科(Dryopoidea)、丸甲总科(Byrrhoidea)、扁甲总科(cucujoidea)、芫菁科(Meloidea)、花蚤总科(Mordelloidea)、拟步甲总科(Tenebrionoidea)、长蠹总科(Bostrichoidea)、金龟甲总科(Scarabaeoidea)、天牛总科(Cerambycoidea)、叶甲总科(Chrysomeloidea)、和象甲总科(Curculionoidea)。超家族步甲总科包括家族虎甲科(Cicindelidae)、步甲科(Carabidae)、和龙虱科(Dytiscidae)。超家族豉甲总科包括家族豉甲科(Gyrinidae)。超家族水龟甲总科包括家族水龟科(Hydrophilidae)。超家族隐翅甲总科包括家族埋葬虫科(Silphidae)和隐翅虫科(Staphylinidae)。超家族花萤总科包括家族花萤科(Cantharidae)和萤火虫科(Lampyridae)。超家族郭公甲总科包括家族郭公虫科(Cleridae)和皮蠹科(Dermestidae)。超家族叩头甲总科包括家族叩头虫科(Elateridae)和吉丁虫科(Buprestidae)。扁甲总科超家族包括家族瓢虫科(Coccinellidae)。超家族芫菁科包括家族芫菁科。超家族拟步甲总科包括家族拟步甲科(Tenebrionidae)。超家族金龟甲总科包括家族黑艳虫科(Passalidae)和金龟子科(Scarabaeidae)。超家族天牛总科包括家族天牛科(Cerambycidae)。超家族叶甲总科包括家族叶甲科(Chrysomelidae)。超家族象甲总科包括家族象甲科(Curculionidae)和小蠹科(Scolytidae)。

双翅目包括长角亚目(Nematocera)、短角亚目(Brachycera)、和环裂亚目(Cyclorrhapha)。长角亚目包括家族大蚊科(Tipulidae)、毛蠓科(Psychodidae)、蚊科(Culicidae)、蠓科(Ceratopogonidae)、摇蚊科(Chironomidae)、蚋科(Simuliidae)、毛蚊科(Bibionidae)、和瘿蚊科(Cecidomyiidae)。短角亚目包括家族水虻科(Stratiomyidae)、虻科(Tabanidae)、剑虻科(Therevidae)、食虫虻科(Asilidae)、拟食虫虻科(Mydidae)、蜂虻科(Bombyliidae)、和长足虻科(Dolichopodidae)。环裂亚目包括分组无缝组(Aschiza)和无缝组(Aschiza)。分组无缝组包括家族蚤蝇科(Phoridae)、食蚜蝇科(Syrphidae)、和眼蝇科(ConopidaeConopidae)。分组无缝组包括分类无翅瓣类(Acalyptratae)和有瓣类(Calyptratae)。分类无翅瓣类包括家族斑蝇科(Otitidae)、实蝇科(Tephritidae)、潜蝇科(Agromyzidae)、和果蝇科(Drosophilidae)。分类有瓣类包括家族虱蝇科(Hippoboscidae)、狂蝇科(Oestridae)、寄蝇科(Tachinidae)、花蝇科(Anthomyiidae)、蝇科(Muscidae)、丽蝇科(Calliphoridae)、和麻蝇科(Sarcophagidae)。

鳞翅目包括家族凤蝶科(Papilionidae)、粉蝶科(Pieridae)、灰蝶科(Lycaenidae)、蛱蝶科(Nymphalidae)、斑蝶科(Danaidae)、眼蝶科(Satyridae)、弄蝶科(Hesperiidae)、天蛾科(Sphingidae)、天蚕蛾科(Saturniidae)、尺蛾科(Geometridae)、灯蛾科(Arctiidae)、夜蛾科(Noctuidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、透翅蛾科(Sesiidae)、和谷蛾科(Tineidae)。

线虫包括寄生线虫，例如根癌、囊肿，以及病变线虫，其包括异皮虫，根结线虫，以及球异皮线虫；特别地，囊线虫的成员，包括但不限于胞囊线虫(大豆胞囊线虫)；甜菜异皮线虫(甜菜胞囊线虫)；禾谷异皮线虫(禾谷胞囊线虫)；以及马铃薯金线虫和马铃薯白线虫(马铃薯胞囊线虫)。根腐线虫包括短体线虫属物种(Pratylenchus spp.)。

半翅目有害生物(其中包括被命名为半翅目(Hemiptera)、同翅目(Homoptera)或异翅目(Heteroptera)的物种)，包括但不限于，草盲蝽，如西部牧草盲蝽(豆荚盲蝽)、牧草盲蝽(美洲牧草盲蝽)、和绿盲蝽(Lygus elisus)；蚜虫，如桃蚜(Myzus persicae)、棉蚜(Aphis gossypii)、樱桃蚜或黑樱桃蚜虫(Myzus cerasi)、大豆蚜(Aphis glycinesMatsumura)；褐稻飞虱(褐稻虱)、和稻黑尾叶蝉(黑尾叶蝉属)；以及椿象，如绿蝽(拟绿蝽)、棕色大理石纹蝽(茶翅蝽)、南方绿椿象(Nezara viridula)、稻蝽(美洲稻蝽)、森林红蝽(Pentatoma rufipes)、欧洲蝽(Rhaphigaster nebulosa)、以及盾椿象(Troilusluridus)。

对于主要作物的本发明的昆虫有害生物包括：玉蜀黍：玉米螟(Ostrinianubilalis)，欧洲玉米蛀虫(European corn borer)；球菜夜蛾(Agrotis ipsilon)，小地老虎(black cutworm)；棉铃虫(Helicoverpa zea)，玉米穗虫(corn earworm)；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，秋夜蛾(fall armyworm)；玉米杆草螟(Diatraeagrandiosella)，西南玉米螟(southwestern corn borer)；小玉米螟(Elasmopalpuslignosellus)，小玉米茎蛀虫(lesser cornstalk borer)；小蔗螟(Diatraeasaccharalis)，甘蔗蛀虫(surgarcane borer)；玉米根叶甲(Diabrotica virgifera)，西方玉米根虫(western corn rootworm)；巴氏长角玉米根叶甲(Diabrotica longicornisbarberi)，北方玉米根虫(northern corn rootworm)；十一星叶甲食根亚种(Diabroticaundecimpunctata howardi)，南方玉米根虫(southern corn rootworm)；梳爪叩头虫属物种(Melanotus spp.)，铁线虫(wireworms)；北方方头甲(Cyclocephala borealis)，北方独角仙(northern masked chafer)(蛴螬)；无斑方头甲(Cyclocephala immaculata)，南方独角仙(southern masked chafer)(蛴螬)；日本金龟子(Popillia japonica)，日本甲虫(Japanese beetle)；蚤凹胫跳甲(Chaetocnema pulicaria)，玉米跳甲(corn fleabeetle)；玉米尖隐喙象(Sphenophorus maidis)，玉米象虫(maize billbug)；玉米缢管蚜(Rhopalosiphum maidis)，玉米蚜(corn leaf aphid)；玉蜀黍圆尾蚜(Anuraphismaidiradicis)，玉米根蚜(corn root aphid)；美洲毛谷杆长蝽(Blissus leucopterusleucopterus)，麦长蝽(chinch bug)；红足黑蝗(Melanoplus femurrubrum)，红腿蚱蜢(redlegged grasshopper)；血黑蝗(Melanoplus sanguinipes)，迁徙蚱蜢(migratorygrasshopper)；玉米种蝇(Hylemya platura)，种蝇(seedcorn maggot)；美洲黍潜叶蝇(Agromyza parvicornis)，玉米潜叶蝇(corn blot leafminer)；玉米黄呆蓟马(Anaphothrips obscrurus)，锯尾蓟马(grass thrips)；骚扰水蚁(Solenopsis milesta)，窃叶蚁(thief ant)；二斑叶螨(Tetranychus urticae)，二点叶螨(twospotted spidermite)；高粱：斑禾草螟(Chilo partellus)，高粱蛀虫(sorghum borer)；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，秋夜蛾(fall armyworm)；兜夜蛾(Spodoptera cosmioides)；亚热带夜蛾(Spodoptera eridania)；棉铃虫(Helicoverpa zea)，玉米穗虫(cornearworm)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)，小玉米茎蛀虫(lessercornstalk borer)；地生脏切叶蛾(Feltia subterranea)，斑点切根夜蛾(granulatecutworm)；长毛食叶鳃金龟(Phyllophaga crinita)，蛴螬；伪金针虫属(Eleodes)、宽胸金针虫属(Conoderus)、和Aeolus属物种，铁线虫(wireworms)；橙足负泥虫(Oulemamelanopus或cereal leaf beetle)；蚤凹胫跳甲(Chaetocnema pulicaria)，玉米跳甲(corn flea beetle)；玉米尖隐喙象(Sphenophorus maidis)，玉米象虫(maize billbug)；玉米尖隐喙象(Sphenophorus maidis)，玉米象虫(maize billbug)；牛鞭草蚜(Siphaflava)，甘蔗黄蚜(yellow sugarcane aphid)；美洲毛谷杆长蝽(Blissus leucopterusleucopterus)、麦长蝽(chinch bug)；高梁瘿蚊(Contarinia sorghicola或sorghummidge)；朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)，棉叶螨(carmine spider mite)；二斑叶螨(Tetranychus urticae)，二点叶螨(twospotted spider mite)；小麦：单点黏虫(Pseudaletia unipunctata)，行军虫(army worm)；草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)，秋夜蛾(fall armyworm)；小玉米螟(Elasmopalpus lignosellus)，小玉米茎蛀虫(lesser cornstalk borer)；灰地老虎(Agrotis orthogonia)，西部切根虫(westerncutworm)；小玉米螟(Elasmopalpus lignosellus)，小玉米茎蛀虫(lesser cornstalkborer)；橙足负泥虫(Oulema melanopus或cereal leaf beetle)；斑点苜蓿象甲(Hyperapunctata)，车轴草叶象虫(clover leaf weevil)；十一星叶甲食根亚种(Diabroticaundecimpunctata howardi)，南方玉米根虫(southern corn rootworm)；俄罗斯小麦蚜(Russian wheat aphid)；麦二叉蚜(Schizaphis graminum)，绿蚜(greenbug)；麦长管蚜(Macrosiphum avenae或English grain aphid)；红足黑蝗(Melanoplus femurrubrum)，红腿蚱蜢(redlegged grasshopper)；异黑蝗(Melanoplus differentialis)，长额负蝗(differential grasshopper)；血黑蝗(Melanoplus sanguinipes)，迁徙蚱蜢(migratorygrasshopper)；黑森瘿蚊(Mayetiola destructor)，小麦瘿蚊(Hessian fly)；麦红吸浆虫(Sitodiplosis mosellana)，小麦吸浆虫(wheat midge)；美州宽头秆蝇(Meromyzaamericana)、美州麦杆蝇(wheat stem maggot)；麦秆蝇(Hylemya coarctata或wheat bulbfly)；烟褐花蓟马(Frankliniella fusca)，烟蓟马(tobacco thrips)；小麦茎蜂(Cephuscinctus或wheat stem sawfly)；麦瘿螨(Aceria tulipae)，郁金香瘤螨(wheat curlmite)；向日葵：向日葵螟(Suleima helianthana)，向日葵卷叶蛾(sunflower bud moth)；向日葵同斑螟(Homoeosoma electellum)，向日葵蛾(sunflower moth)；向日葵叶甲(zygogramma exclamationis或sunflower beetle)；胡萝卜金龟(Bothyrus gibbosus或carrot beetle)；向日葵籽瘿蚊(Neolasioptera murtfeldtiana或sunflower seedmidge)；棉花：绿棉铃虫(Heliothis virescens)，棉蚜虫(cotton budworm)；棉铃虫(Helicoverpa zea或cotton bollworm)；甜菜夜蛾(Spodoptera exigua或beetarmyworm)；棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)，红铃虫(pink bollworm)；棉铃象甲(Anthonomus grandis)，棉铃象虫(boll weevil)；棉蚜虫(Aphis gossypii)，棉蚜(cottonaphid)；棉跳盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus)、棉盲蝽(cotton fleahopper)；翅粉蝨(Trialeurodes abutilonea或bandedwinged whitefly)；美洲牧草盲蝽(Lyguslineolaris)、牧草盲椿(tarnished plant bug)；红足黑蝗(Melanoplus femurrubrum)，红腿蚱蜢(redlegged grasshopper)；异黑蝗(Melanoplus differentialis)，长额负蝗(differential grasshopper)；烟蓟马(Thrips tabaci)，葱蓟马(onion thrips)；Franklinkiella fusca，烟蓟马(tobacco thrips)；朱砂叶螨(Tetranychuscinnabarinus)，棉叶螨(carmine spider mite)；二斑叶螨(Tetranychus urticae)，二点叶螨(twospotted spider mite)；稻：小蔗螟(Diatraea saccharalis)，甘蔗蛀虫(surgarcane borer)；草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，秋夜蛾(fall armyworm)；兜夜蛾(Spodoptera cosmioides)；亚热带夜蛾(Spodoptera eridania)；棉铃虫(Helicoverpa zea)，玉米穗虫(corn earworm)；棕色肖叶甲(Colaspis brunnea)，葡萄肖叶甲(grape colaspis)；正稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus)，稻水象甲(ricewater weevil)；米象(Sitophilus oryzae)，稻象甲(rice weevil)；黑尾叶蝉(Nephotettix nigropictus)，水稻叶蝉(rice leafhopper)；美洲毛谷杆长蝽(Blissusleucopterus leucopterus)、麦长蝽(chinch bug)；拟绿蝽(Acrosternum hilare)，稻绿蝽(green stink bug)；二化螟(Chilu suppressalis)，亚洲稻螟(Asiatic rice borer)；大 豆：大豆夜蛾(Pseudoplusia includens或soybean looper)；藜豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis或velvetbean caterpillar)；苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra或greencloverworm)；玉米螟(Ostrinia nubilalis)，欧洲玉米蛀虫(European corn borer)；球菜夜蛾(Agrotis ipsilon)，小地老虎(black cutworm)；甜菜夜蛾(Spodoptera exigua或beet armyworm)；兜夜蛾(Spodoptera cosmioides)；亚热带夜蛾(Spodoptera eridania)；绿棉铃虫(Heliothis virescens)，棉蚜虫(cotton budworm)；绿棉铃虫(Heliothisvirescens)，棉蚜虫(cotton budworm)；墨西哥豆象(Epilachna varivestis)，墨西哥豆瓢虫(Mexican bean beetle)；桃蚜(Myzus persicae)，绿桃蚜(green peach aphid)；马铃薯叶蝉(Empoasca fabae)，马铃薯微叶蝉(potato leafhopper)；拟绿蝽(Acrosternumhilare)，稻绿蝽(green stink bug)；红足黑蝗(Melanoplus femurrubrum)，红腿蚱蜢(redlegged grasshopper)；异黑蝗(Melanoplus differentialis)，长额负蝗(differential grasshopper)；玉米种蝇(Hylemya platura)，种蝇(seedcorn maggot)；大豆蓟马(Sericothrips variabilis或soybean thrips)；烟蓟马(Thrips tabaci)，葱蓟马(onion thrips)；土耳其斯坦叶螨(Tetranychus turkestani)，土格斯坦红叶螨(strawberry spider mite)；二斑叶螨(Tetranychus urticae)，二点叶螨(twospottedspider mite)；大麦：玉米螟(Ostrinia nubilalis)，欧洲玉米蛀虫(European cornborer)；球菜夜蛾(Agrotis ipsilon)，小地老虎(black cutworm)；麦二叉蚜(Schizaphisgraminum)，绿蚜(greenbug)；美洲毛谷杆长蝽(Blissus leucopterus leucopterus)、麦长蝽(chinch bug)；拟绿蝽(Acrosternum hilare)，稻绿蝽(green stink bug)；褐臭蝽(Euschistus servus或brown stink bug)；Euschistus heros，新热带褐臭蝽(neotropical brown stink bug)；灰地种蝇(Delia platura)，种蝇(seedcorn maggot)；黑森瘿蚊(Mayetiola destructor)，小麦瘿蚊(Hessian fly)；麦岩螨(Petrobia latens或brown wheat mite)；油菜：甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)，菜蚜(cabbage aphid)；萝卜菜跳甲(Phyllotreta cruciferae)，跳甲(Flea beetle)；蓓带夜蛾(Mamestraconfigurata)，披肩粘虫(Bertha armyworm)；小菜蛾(Plutella xylostella)，Diamond-back moth)；地种蝇属物种(Delia ssp.)，根蛆(Root maggots)。

增加植物产量的方法

提供了增加植物产量的方法。该方法包括：提供植物或植物细胞，该植物或植物细胞表达编码本文披露的杀有害生物多肽序列的多核苷酸，并且种植植物或其种子在大田，该大田感染了(或易感染)该多肽对其具有杀有害生物活性的有害生物。在一些实施方案中，所述多肽具有针对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、半翅目或线虫有害生物的杀有害生物活性，并且所述大田被鳞翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目或线虫有害生物侵染。如在此所定义的，植物的“产量”是指植物产生的生物质的质量和/或数量。“生物质”是指任何测量的植物产物。生物质生产的增加是测量的植物产物的产量的任何提高。增加植物产量具有若干商业应用。例如，增加植物叶片的生物质可以增加绿叶蔬菜的产量供人类或动物消费。此外，增加的叶生物质可以用于增加植物源性制药或工业产品的产量。产量的增加可以包括任何统计上显著的增加，包括但不限于，相比不表达杀有害生物序列的植物在产量上增加至少1％、至少3％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少70％、至少100％、或更多。在具体方法上，植物产量的提高是由于表达本文披露的杀有害生物蛋白质的植物的有害生物抗性增加。杀有害生物蛋白质的表达导致有害生物感染或摄食能力降低。

植物也可以用一种或多种化学组合物，包括一种或多种除草剂、杀虫剂或杀真菌剂处理。典型的化学组合物包括：水果/蔬菜除草剂：莠去津、除草定、敌草隆、草甘膦、利谷隆、嗪草酮、西玛津、氟乐灵、吡氟禾草灵、草铵磷、氯吡延命菊、百草枯、戊炔草胺、稀禾定、氟丙嘧草酯、氯吡、茚嗪氟草胺；水果/蔬菜杀虫剂：涕灭威、苏云金杆菌、西维因、呋喃丹、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、阿维菌素、氟氯氰菊酯/高效氟氯氰菊酯、高氰戊菊酯、高效氯氟氰菊酯、灭螨醌、联苯肼酯、甲氧虫酰肼、氟酰脲、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、嘧螨酯、螺螨酯、γ-氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、多杀菌素、溴氰虫酰肼、杀铃脲、螺虫乙酯、吡虫啉、氟虫酰胺、硫双威、氰氟虫腙、氟啶虫胺腈、丁氟螨酯、腈吡螨酯(cyenopyrafen)、噻虫胺、噻虫嗪、斯诺托姆(spinotoram)、硫双威、氟啶虫酰胺、灭虫威、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、茚虫威、苯线磷、吡丙醚、苯丁氧化物；水果/蔬菜杀真菌剂：唑嘧菌胺、嘧菌酯、苯噻菌胺酯、啶酰菌胺、克菌丹、多菌灵、百菌清、铜、氰霜唑、环氟菌胺、霜脲氰、环唑醇、嘧菌环胺、苯醚甲环唑、烯酸吗啉、二氰蒽醌、咪唑菌酮、环酰菌胺、氟啶胺、咯菌腈、氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟唑菌酰胺、灭菌丹、三乙膦酸、异菌脲、异丙菌胺、异皮姆、醚菌酯、代森锰锌、双块酉先菌胺、甲霜灵/精甲霜灵、代森联、苯菌酮、腈菌唑、戊菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、霜霉威、丙环唑、丙森锌、碘喹唑酮、丙硫菌唑、唑菌胺酯、嘧霉胺、喹氧、螺环菌胺、硫、戊唑醇、甲基硫菌灵、肟菌酯；谷物除草剂：2,4-D、酰啼磺隆、溴苯腈、氟酮唑草-E、绿麦隆、氯磺隆、块草酸-P、二氯吡啶酸、麦草畏、禾草灵-M、吡氟草胺、精恶唑禾草灵、双氟横草胺、氟卡巴腙-NA、氟噻草胺、氟啶嘧磺隆-M、氟草烟、弗勒泰蒙、草甘膦、碘甲磺隆、碘苯腈、异丙隆、MCPA、甲磺胺磺隆、甲磺隆、二甲戊乐灵、唑啉草酯、丙氧基卡巴腙、苄草丹、甲氧磺草胺、磺酰磺隆、噻吩磺隆、肟草酮、醚苯磺隆、苯磺隆、氟乐灵、三氟甲磺隆；谷物杀真菌剂：嘧菌酯、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌灵、百菌清、环氟菌胺、环唑醇、嘧菌环胺、醚菌胺、氟环唑、苯锈、丁苯吗啉、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟喹唑、氟唑菌酰胺、异皮姆、醚菌酯、叶菌唑、苯菌酮、吡噻菌胺、啶氧菌酯、咪鲜胺、丙环唑、碘喹唑酮、丙硫菌唑、唑菌胺酯、喹氧、螺环菌胺、戊唑醇、甲基硫菌灵、肟菌酯；谷物杀昆虫剂：乐果、λ-三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、顺式氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、联苯菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、毒死蜱、抗蚜威、灭虫威、氟啶虫胺腈；玉蜀黍除草剂：莠去津、甲草胺、溴苯腈、乙草胺、麦草畏、二氯吡啶酸、(S-)噻吩草胺、草铵膦、草甘膦、异氟草、(S-)异丙甲草胺、甲基磺草酮、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、砜嘧磺隆、磺草酮、甲酰氨磺隆、苯唑草酮、特波三酮、嘧啶肟草醚、噻酮磺隆、氟噻草胺、比莎留锋(Pyroxasulfon)；玉蜀黍杀昆虫剂：克百威、毒死蜱、联苯菊酯、氟虫腈、吡虫啉、高效氯氟氰菊酯、七氟菊酯、特丁硫磷、噻虫嗪、噻虫胺、甲螨酯、氟虫酰胺、杀铃脲、氯虫酰胺、溴氰菊酯、硫双威、β-氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、联苯菊酯、虱螨脲、丁基嘧啶磷、乙虫腈、溴氰虫酰胺、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、阿维菌素；玉蜀黍杀真菌剂：嘧菌酯、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、环唑醇、醚菌胺、氟环唑、种衣酯、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟唑菌酰胺、异皮姆、叶菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、丙环唑、丙硫菌唑、唑菌胺酯、戊唑醇、肟菌酯；水稻除草剂：丁草胺、敌稗、四唑喃磺隆、苄嘧磺隆、氰氟草、杀草隆、四唑酸草胺、咪唑横隆、苯噻草胺、恶嗪草酮、吡嘧磺隆、稗草畏、二氯喹啉酸、杀草丹、茚草酮、氟噻草胺、四唑酸草胺、氯吡嘧磺隆、噁嗪草酮、双环磺草酮、环酯草醚、五氟磺草胺、双草醚，丙炔恶草酮、乙氧嘧磺隆、丙草胺、甲基磺草酮、特糠酯酮、恶草灵、精恶唑禾草灵、比密苏凡(Pyrimisulfan)；水稻杀昆虫剂：二嗪磷、仲丁威、丙硫克百威、噻嗪酮、呋虫胺、氟虫腈、吡虫啉、异丙威、噻虫啉、环虫酰肼、噻虫胺、乙虫腈、氟虫酰胺、氯虫酰胺、溴氰菊酯、啶虫脒、噻虫嗪、溴氰虫酰胺、多杀菌素、斯诺托姆(spinotoram)、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、高效氯氰菊酯、毒死蜱、醚菊酯、克百威、丙硫克百威、氟啶虫胺腈；水稻杀真菌剂：嘧菌酯、多菌灵、环丙酰菌胺、双氯氰菌胺、苯醚甲环唑、克瘟散、嘧菌腙、庆大霉素、己唑醇、恶霉灵、异稻瘟净(IBP)、稻瘟灵、异噻菌胺、春雷霉素、代森锰锌、苯氧菌胺、肟醚菌胺、戊菌隆、噻菌灵、丙环唑、丙森锌、咯喹酮、戊唑醇、甲基托布津甲基、參酰菌胺、三环唑、肟菌酯、井冈霉素；棉花除草剂：敌草隆、伏草隆、MSMA、乙氧氟草醚、扑草净、氟乐灵、唑草酮、烯草酮、吡氟禾草灵、草甘膦、达草灭、二甲戊乐灵、嘧草硫醚、三氟啶磺隆、吡喃草酮、草铵膦、丙炔氟草胺、噻苯隆；棉花杀昆虫剂：乙酰甲胺磷、涕灭威、毒死稗、氯氰菊酯、溴氰菊酯、阿维菌素、啶虫脒、甲维盐、吡虫啉、茚虫威、λ-氯氟氰菊酯、多杀菌素、硫双威、γ-氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、啶虫丙醚、氟啶虫酰胺、氟虫酰胺、杀铃脲、氯虫酰胺、β-氟氯氰菊酯、螺虫乙酯、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、呋虫胺、氟虫酰胺、氰虫酰胺、多杀菌素、斯诺托姆(spinotoram)、γ-氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、硫双威、阿维菌素、氟啶虫酰胺、啶虫丙醚、螺甲螨酯、砜虫啶；棉 花杀昆虫剂：嘧菌酯、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌灵、百菌清、铜、环唑醇、苯醚甲环唑、醚菌胺、氟环唑、咪唑菌酮、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟唑菌酰胺、异菌脲、吡唑萘菌胺、异噻菌胺、代森锰锌、代森锰、苯氧菌胺、吡噻菌胺、啶氧菌酯、甲基代森锌、丙硫菌唑、唑菌胺酯、五氯硝基苯、戊唑醇、氟醚唑、甲基硫菌灵、肟菌酯；大豆除草剂：甲草胺、苯达松、氟乐灵、氯嘧磺隆、氯酯磺草胺、精恶唑禾草灵、氟磺胺草醚、吡氟禾草灵、草甘膦、甲氧咪草烟、灭草喹、咪草烟、(S-)异丙甲草胺、嗪草酮、二甲戊乐灵、吡喃草酮、草铵膦；大豆杀昆虫剂：λ-氯氟氰菊酯、灭多威、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、氟虫酰胺、氯虫酰胺、溴氰虫酰胺、多杀菌素、斯诺托姆(spinotoram)、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氟虫腈、乙虫腈、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ和λ-氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、螺虫乙酯、螺螨酯、杀铃脲、氟啶虫酰胺、硫双威、β-氟氯氰菊酯；大豆杀真菌剂：嘧菌酯、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌灵、百菌清、铜、环唑醇、苯醚甲环、醚菌胺、氟环唑、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、粉唑醇、氟唑菌酰胺、异皮姆、扑海因、异噻菌胺、代森锰锌、代森锰、叶菌唑、苯氧菌胺、腈菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、丙环唑、丙森锌、丙硫菌唑、唑菌胺酯、戊唑醇、氟醚唑、甲基硫菌灵、肟菌酯；甜菜除草剂：氯草敏、甜菜安、甜菜呋、甜菜宁、野麦畏、二氯吡啶酸、吡氟禾草灵、环草定、苯嗪草酮、喹草酸、噻草酮、氟胺磺隆、吡喃草酮、精喹禾灵；甜菜杀昆虫剂：吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、溴氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、γ-/λ-氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、七氟菊酯、氯虫酰胺、塞斯比(Cyaxypyr)、氟虫腈、克百威；卡诺拉除 草剂：二氯吡啶酸、禾草灵、吡氟禾草灵、草铵膦、草甘膦、吡草胺、氟乐胺苯磺隆、喹草酸、精喹禾灵、烯草酮、吡喃草酮；卡诺拉杀真菌剂：嘧菌酯、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌灵、环唑醇、苯醚甲环、醚菌胺、氟环唑、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟硅唑、氟唑菌酰胺、扑海因、异皮姆、甲哌鎓、叶菌唑、苯氧菌胺、多效唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、咪鲜胺、丙硫菌唑、唑菌胺酯、戊唑醇、甲基硫菌灵、肟菌酯、乙烯菌核利；卡诺拉杀昆虫剂：克百威、噻虫啉、溴氰菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、啶虫脒、呋虫胺、β-氟氯氰菊酯、γ和λ-氯氟氰菊酯、τ-弗沃勒瑞特(tau-Fluvaleriate)、乙虫腈、多杀菌素、斯诺托姆(spinotoram)、氟虫酰胺、氯虫酰胺、溴氰虫酰胺、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮。

将本发明的基因引入到另一种植物中的方法

在此还提供了将本发明的核酸引入到另一种植物中的方法。本发明的核酸或其片段可以通过以下方式引入到第二种植物中：轮回选择、回交、系谱育种(pedigreebreeding)、家系选择(line selection)、混合选择(mass selection)、诱变育种和/或遗传标记增强的选择。

因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括将包含本发明的核酸的第一植物与第二植物杂交以产生F1子代植物并且选择包含本发明的核酸的F1子代植物。这些方法可以进一步包括将选定的子代植物与包含本发明的核酸的第一植物杂交以产生回交的子代植物并且选择包含本发明的核酸的回交的子代植物。用于评估杀有害生物活性的方法在本文其他地方提供。这些方法可以进一步包括依次重复这些步骤一次或多次，以产生包含本发明的核酸的所选定的第二次或更高次回交的子代植物。

在本发明的方法中可以使用涉及选择所希望的表型的植物的任何培育方法。在一些实施方案中，F1植物可以自花授粉，以产生分离的F2代。然后可以选择在每一代(F3、F4、F5)中代表所希望的表型(例如，杀有害生物活性)的个别植物，直到这些性状是纯合的或固定在育种群体中为止。

第二植物可以是具有所希望的性状的植物，这些性状诸如除草剂耐受性、昆虫耐受性、耐旱性、线虫控制、水利用效率、氮利用效率、提高的营养价值、抗病性、提高的光合作用、提高的纤维品质、胁迫耐受性、提高的再生、以及类似性状。第二植物可以是如在本文其他位置所述的原种事件。

在多个实施方案中，可以从所得杂交物收获植物部分(全株植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚等)并且可以增殖或收集以用于下游用途(诸如，食物、饲料、生物燃料、油、面粉、粗粉(meal)等)。

获得植物产品的方法

本发明还涉及一种用于获得商品产品的方法，该方法包括从包含本发明的核酸的作物中收获并且/或者研磨谷物，以获得该商品产品。农艺学上和商业上重要的产品和/或物质组合物包括但不限于动物饲料、商品、以及旨在用作人消耗的食物或用于旨在用于人消耗的组合物和商品中的植物产品和副产品，具体地是失活的种子/谷物产品，包括由此类谷物/种子产生的(半加工)加工产品，其中所述产品是或包括完整或加工的种子或谷物、动物饲料、玉米或黄豆粗粉、玉米或黄豆面粉、玉米、玉米淀粉、大豆粗粉、黄豆面粉、麦片、黄豆蛋白浓缩物、黄豆蛋白分离物、增稠的黄豆蛋白浓缩物、化妆品、护发产品、黄豆黄油、纳豆、印尼豆豉(tempeh)、水解的黄豆蛋白、喷射奶油、起酥油、卵磷脂、可食用性完整大豆(生的、烘烤过的、或作为日本青豆)、黄豆奶酪、豆腐乳、豆腐、腐竹、以及煮熟、研磨、蒸熟、烘焙或煮半熟的谷物等，如果这些产品和物质组合物含有可检测量的在此所述的核苷酸和/或核酸序列作为含有此类核苷酸序列的任何植物的诊断，则它们旨在处于本发明的范围内。

以下实施例是举例说明而不是任何形式的限制。

实验实施例

实施例1新颖的杀有害生物基因的发现

使用以下步骤从蜡状芽孢杆菌菌株中鉴定出新颖的杀有害生物基因：

-通过高通量焦磷酸测序方法对片段化DNA进行测序。

-经由同源性和/或其他计算分析鉴定推定的毒素基因。

表1.鉴定的bp005基因

合成Bp005并克隆到His标记的载体中以产生质粒pGHis-bp005。该克隆通过测序确认并且将pGHis-bp005转化进Bl21感受态细胞中。单菌落接种在LB培养基中，并在37℃生长直到对数期，并在20℃下用0.5mM IPTG诱导16小时。根据标准方案，将纯化的BP005对半翅目有害生物进行生物测定。Bp005对南方绿椿象(Nezara viridula)具有活性(75％死亡率)。

从表2中列出的细菌菌株中鉴定出bp005的同源物。根据标准方案，将同源物也对南方绿椿象进行生物测定。该生物测定的结果在表2中显示。

表2.bp005的同源物对南方绿椿象的活性

为了阐明可能对bp005的功能至关重要的潜在氨基酸残基，在bp005v04(SEQ IDNO:3)中进行了一系列突变，并针对南方绿椿象(Nezara viridula)进行了测试。生物测定结果显示在表3中。

表3.bp005的突变体对南方绿椿象(Nezara viridula)的活性

实施例2.分析bp005的同源物和变体的氨基酸组成

进行计算分析以鉴定可能能够区分活性和非活性bp005同源物的潜在关键基序。使用MEGA初始地比对经确认的活性和非活性序列。然后将序列分成氨基酸字母三字组(即三个氨基酸组的滑动窗口)，然后编码成目录。然后使用编码序列及其活性信息构建决策树分类器。然后列出由分类器识别为在分类中最重要的序列位置，并且鉴定出在那些位置中出现的关键三字组。该分析中最重要的三字组是对应于bp005v04的位置35-37的三字组。

进行了对南方绿椿象(Nezara viridula)具有活性的所有同源物的氨基酸序列的比较，并且在表4中记录了出现在与bp005v04具有至少90％序列同一性的95％同源物中的残基。表4第2列中的“X”表明在该位置的氨基酸在同源物中是可变的。

表4.bp005同源物的组成

实施例3.杀有害生物活性分析

可以测试本发明的核苷酸序列产生杀有害生物蛋白的能力。通常以多种方式评估杀有害生物蛋白在有害生物上作为杀有害生物剂的能力。本领域熟知的一种方法是进行饲喂测定。在这样的饲喂测定中，将有害生物暴露于含有待测化合物的样品或对照样品中。通常，这通过将待测材料或这种材料的合适稀释物放置在有害生物将摄取的材料(例如人工饲料)上来进行。待测材料可以由液体、固体或浆液组成。可将待测材料置于表面上，然后使其干燥。备选地，可以将待测材料与熔融人工饲料混合，然后分配到测定室中。测定室可以是例如杯子、盘子或微量滴定板的孔。

用于吸吮有害生物(例如蚜虫)的测定可以包括通过隔断将测试材料与昆虫分离，理想地所述隔断是可以被吸吮昆虫的吸嘴部分刺穿的部分，以允许摄取测试材料。通常将测试材料与进食刺激剂(例如蔗糖)混合以促进测试化合物的摄取。

其他类型的测定可以包括将测试材料显微注射到有害生物的口，或者肠中，以及产生转基因植物，然后测试有害生物进食转基因植物的能力。测试的植物可以包括隔离通常食用的植物部分，例如附着在叶子上的小笼子，或者在含有昆虫的笼子中隔离整个植物。

用于测定有害生物的其他方法和方式是本领域已知的，并且可以在如下中找到，例如Robertson和Preisler,编辑(1992)Pesticide bioassays with arthropods[节肢动物杀有害生物剂生物测定],CRC,佛罗里达州博卡拉顿。备选地，测试通常描述于期刊Arthropod Management Tests[节肢动物管理测试]和Journal of Economic Entomology[经济昆虫杂志]中或通过与美国昆虫学会(ESA)成员的讨论中描述。

在一些实施方案中，将编码本文披露的杀有害生物蛋白的毒素区的DNA区克隆到大肠杆菌表达载体pMAL-C4x中的编码麦芽糖结合蛋白(MBP)的malE基因后面。这些框内融合导致MBP-bp005融合蛋白在大肠杆菌中表达。

为了在大肠杆菌中表达，用单个质粒转化BL21*DE3。将单个菌落接种在补充有羧苄青霉素和葡萄糖的LB中，并在37℃生长过夜。第二天，将1％的过夜培养物接种于新鲜培养基中，并在37℃生长至对数期。随后，在20℃用0.3mM IPTG诱导培养物过夜。将每个细胞沉淀悬浮于20mM Tris-Cl缓冲液、pH 7.4+200mM NaCl+1mM DTT+蛋白酶抑制剂中并超声处理。通过SDS-PAGE分析可用于确认融合蛋白的表达。

然后将总无细胞提取物在与快速蛋白质液相色谱(FPLC)连接的直链淀粉柱上进行运行，用于MBP-bp005融合蛋白的亲和纯化。用10mM麦芽糖溶液从树脂上洗脱结合的融合蛋白。然后用因子Xa或胰蛋白酶切割纯化的融合蛋白，以从BP005蛋白中除去氨基末端MBP标签。蛋白质的切割和溶解度可通过SDS-PAGE测定。

实施例4.运载基因用于植物表达

本发明的编码区与合适的启动子和终止子序列连接以便在植物中表达。此类序列是本领域熟知的，并且可包括用于在单子叶植物中表达的稻肌动蛋白启动子或玉蜀黍泛素启动子，用于在双子叶植物中表达的拟南芥UBQ3启动子或CaMV 35S启动子，以及nos或PinII终止子。用于产生和确认启动子-基因-终止子构建体的技术也是本技术领域中熟知的。

在本发明的一个方面，设计和产生合成的DNA序列。这些合成的序列相对于亲本序列具有改变的核苷酸序列，但是编码的蛋白质基本上与亲本序列相同。

在本发明的另一个方面，设计修饰形式的合成基因以至于产生的肽被靶向至植物细胞器，如内质网或质外体。已知导致融合蛋白靶向至植物细胞器的肽序列在本技术领域是已知的。例如，来自白羽扇豆(Lupinus albus)的酸性磷酸酶基因的N-末端区域(ID GI:14276838，Miller等人(2001)Plant Physiology[植物生理学]127:594-606)是本技术领域公知的导致异源蛋白质的内质网靶向。如果产生的融合蛋白在C-末端还包含内质网滞留序列(该内质网滞留序列包含肽N-末端-赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸(即“KDEL”基序，SEQ ID NO:68))，该融合蛋白将靶向内质网。如果融合蛋白在C-末端缺乏内质网靶向序列，该蛋白质将被靶向至内质网，但最终将被隔离在质外体中。

因此，这个基因编码融合蛋白，该融合蛋白包含酸性磷酸酶基因的N-末端31个氨基酸(来自白羽扇豆白羽扇豆(Lupinus albus)(ID GI:14276838，上文，Miller等人，2001))融合至本发明的氨基酸序列的N-末端，并且在C-末端包含KDEL(SEQ IDNO:68)序列。因此，产生的蛋白质在植物细胞中表达后被预测为靶向植物内质网。

上文描述的植物表达盒与合适的植物可选择标记组合以帮助转化细胞和组织的选择，并连接到植物转化载体中。这些可以包括来自农杆菌介导的转化的二元载体或用于喷气溶胶或基因枪(biolistic)转化的简单质粒载体。

实施例5.大豆转化

用本领域已熟知的方法实现大豆转化，该方法诸如实质上利用Paz等人(2006),Plant cell Rep.[植物细胞报告]25:206所述的方法使用根瘤农杆菌介导的转化大豆半种子外植体的一种所述方法。用环磺酮(tembotrione)作为选择性标记鉴别转化体。观察绿芽的外观，并且将其记录为对除草剂异噁唑草酮(isoxaflutole)或环磺酮的耐受性的指示。耐受性转基因芽将显示出比得上未用异噁唑草酮或环磺酮处理的野生型大豆芽的正常绿色，而用相同量的异噁唑草酮或环磺酮处理的野生型大豆芽将完全漂白。这表明HPPD蛋白的存在使得具有对HPPD抑制剂除草剂如异噁唑草酮或环磺酮的耐受性。

将耐受性绿芽转移到生根培养基中或接枝。在适应周期之后将生根的小植物转移到温室中。然后用补充有硫酸铵甲酯菜籽油的HPPD抑制剂除草剂喷洒含有该转基因的植物，例如用环磺酮以100g AI/ha的速率或用甲基磺草酮(mesotrione)以300g AI/ha的速率喷洒。在施加十天后，评估由施加除草剂引起的症状并且将其与在相同条件下在野生型植物上观察到的症状相比。

实施例6：棉花T0植物建立和选择。

用本领域已熟知的方法实现棉花转化，特别是在PCT专利公开WO 00/71733中所述的方法中的优选方法。将再生的植物转移到温室中。在适应周期后，用补充有硫酸铵和甲酯菜籽油的HPPD抑制剂除草剂喷洒足够生长的植物，这些除草剂例如等同于100或200gAI/ha的环磺酮。在喷洒应用七天后，评估由用除草剂处理引起的症状并且将其与在相同条件下经受相同处理的野生型棉花植物上观察到的症状相比。

实施例7.用本文所述的杀有害生物蛋白基因转化玉蜀黍细胞

最好在传粉后8-12天收集玉蜀黍穗。从穗中分离胚，并且将大小0.8-1.5mm的那些胚优选用于转化。将胚铺板于适当的孵育培养基(小盾片面朝上)(例如DN62A5S培养基(3.98g/L N6盐；1mL/L(1000x储备液)N6维生素；800mg/L L-天冬酰胺；100mg/L肌醇；1.4g/L L-脯氨酸；100mg/L酪蛋白氨基酸；50g/L蔗糖；1mL/L(1mg/mL储备液)2,4-D)。然而，除DN62A5S之外的培养基和盐是合适的并且是本领域已知的。将胚在25℃下在黑暗中孵育过夜。然而，胚本身不需要孵育过夜。

将得到的外植体转移到网眼方型平板(每个平板30-40个孔)中，转移到渗透培养基上约30-45分钟，然后转移到束射板(beaming plate)上(参见，例如，PCT公开号WO/0138514和美国专利号5,240,842)。

使用气溶胶束射加速器，使用基本上如PCT公开号WO/0138514中所述的条件，将设计用于植物细胞中本发明基因的DNA构建体加速到植物组织中。束射后，将胚在渗透培养基上孵育约30分钟，并在25℃下在黑暗中置于孵育培养基上过夜。为了避免过度损坏的经束射的外植体，将它们在转移至恢复培养基之前孵育至少24小时。然后将胚扩散到恢复培养基上在黑暗中在25℃下持续约5天，然后转移到选择性培养基中。根据所利用的具体选择的性质和特征，将外植体在选择性培养基中孵育多达八周。在选择期间之后，将所得愈伤组织转移到胚成熟培养基中，直到观察到成熟体细胞胚形成为止。然后将所得成熟体细胞胚置于弱光下，并且通过本领域已知的方法开始再生过程。允许所得苗在生根培养基中生根，并且将所得植物转移到育苗盆中并增殖为转基因植物。

材料

DN62A5S培养基

用1N KOH/1N KCl将溶液的pH调节至pH 5.8，以高达3g/L的浓度添加Gelrite(西格玛公司(Sigma))，并将培养基高压灭菌。冷却至50℃后，添加2ml/L的5mg/ml硝酸银储备液(植物技术实验室公司(Phytotechnology Labs))。

实施例8.通过农杆菌介导的转化，在植物细胞中转化本发明的基因

最好在传粉后8-12天收集穗。从穗中分离胚，并且将大小0.8-1.5mm的那些胚优选用于转化。将胚以小盾片侧朝上的方向置于适合的孵育培养基上，并且在25℃在黑暗中孵育过夜。然而，本身不必需孵育胚过夜。将胚与含有适当载体的农杆菌菌株接触，以进行Ti质粒介导的转移约5-10min，并且然后将其接种到共培养培养基上约3天(在黑暗中在22℃)。在共培养之后，将外植体转移到恢复期培养基5-10天(在黑暗中在25℃)。根据所利用的具体选择的性质和特征，将外植体在选择性培养基中孵育高达八周。在选择期间之后，将所得愈伤组织转移到胚成熟培养基中，直到观察到成熟体细胞胚形成为止。然后将所得成熟体细胞胚置于低照度下，并且如本领域已知地开始再生过程。

实施例9.稻的转化

从在温室中很好控制条件下生长的供体植物中收集未成熟的稻种子(包含在正确的发育阶段的胚)。种子的消毒后，切下未成熟的胚并在固体培养基上预诱导3天。预诱导后，胚在携带目的载体的农杆菌悬浮液中浸泡几分钟。然后胚被共培养在含有乙酰丁香酮的固体培养基中并暗培养4天。然后外植体被转入含有草铵膦(phosphinotricin)作为选择剂的第一选择性培养基。大约3周后，具有愈伤组织发育的小盾片被切割成多个更小块，并转移到相同的选择性培养基。大约每2周进行随后的传代培养。在每次传代培养后，生长活跃的愈伤组织被切成更小的片并培养在第二选择性培养基上。经过几个星期后，对草铵膦具有明显抗性的愈伤组织被转移到选择性再生培养基。产生的小植株被培养在半强度MS中以便完全伸长。将植物最终转移至土壤，并在温室中生长。

说明书中提到的所有出版物和专利申请都表明了本发明相关领域技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请以相同程度通过引用并入本文作为参考，如同这些出版物或专利申请中的每一个都是特定地和单独地通过引用并入本文作为参考。

尽管出于清楚地理解的目的，本发明通过说明和实施例加以详细描述，显而易见的是，可以在随附的权利要求书的范围内作出一定的改变和修改。

Claims (26)

1.重组核酸分子，其包含编码具有杀有害生物活性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自：

a)任一SEQ ID NO:71、69、70和72-106中所示的核苷酸序列；

b)编码包含任一SEQ ID NO:4、1-3、5-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66或67的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；

c)编码以下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与任一SEQ ID NO:4、1-3、5-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66或67的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，

并且其中所述核苷酸序列与异源启动子有效地连接。

2.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列是已设计用于在植物中表达的合成序列。

3.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述异源启动子能够指导所述核苷酸序列在植物细胞中的表达。

4.载体，其包含如权利要求1所述的重组核酸分子。

5.如权利要求4所述的载体，其进一步包含编码异源多肽的核酸分子。

6.宿主细胞，其含有如权利要求1所述的重组核酸。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其是细菌宿主细胞。

8.如权利要求6所述的宿主细胞，其是植物细胞。

9.转基因植物，其包含如权利要求8所述的宿主细胞。

10.如权利要求9所述的转基因植物，其中所述植物选自：玉蜀黍、高粱、小麦、甘蓝、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦以及油籽油菜。

11.转基因种子，其包含如权利要求1所述的核酸分子。

12.具有杀有害生物活性的重组多肽，其选自：

a)包含任一SEQ ID NO:4、1-3、5-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66或67的氨基酸序列的多肽；和

b)包含与任一SEQ ID NO:4、1-3、5-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66或67的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列的多肽。

13.如权利要求12所述的多肽，其进一步包含异源氨基酸序列。

14.组合物，其包含如权利要求12所述的多肽。

15.如权利要求14所述的组合物，其中所述组合物选自：粉剂、尘剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体和溶液。

16.如权利要求14所述的组合物，其中所述组合物通过脱水、冷冻干燥、均质化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩细菌细胞培养物来制备。

17.如权利要求14所述的组合物，其包含按重量计从约1％至约99％的所述多肽。

18.一种用于控制鳞翅目、半翅目、鞘翅目、线虫、或双翅目有害生物群体的方法，该方法包括使所述群体与杀有害生物有效量的如权利要求12所述的多肽接触。

19.一种用于杀死鳞翅目、半翅目、鞘翅目、线虫、或双翅目有害生物的方法，该方法包括使所述有害生物与杀有害生物有效量的如权利要求12所述的多肽接触或向所述有害生物饲喂杀有害生物有效量的如权利要求12所述的多肽。

20.一种用于产生具有杀有害生物活性的多肽的方法，该方法包括在编码所述多肽的核酸分子表达的条件下培养如权利要求6所述的宿主细胞。

21.一种植物或植物细胞，该植物或植物细胞在其基因组中稳定地掺入DNA构建体，所述DNA构建体包含编码具有杀有害生物活性的蛋白质的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自：

a)任一SEQ ID NO:71、69、70和72-106中所示的核苷酸序列；

b)编码包含任一SEQ ID NO:4、1-3、5-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66或67的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；和

c)编码以下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与任一SEQ ID NO:4、1-3、5-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66或67的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

22.一种用于针对有害生物保护植物的方法，该方法包括在植物或其细胞中表达编码杀有害生物多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自：

a)任一SEQ ID NO:71、69、70和72-106中所示的核苷酸序列；

b)编码包含任一SEQ ID NO:4、1-3、5-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66或67的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；和

c)编码以下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与任一SEQ ID NO:4、1-3、5-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66或67的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述植物产生对鳞翅目、半翅目、鞘翅目、线虫、或双翅目有害生物具有杀有害生物活性的杀有害生物多肽。

24.一种增加植物产量的方法，该方法包括在大田种植基因组中稳定地掺入了DNA构建体的植物或其种子，所述DNA构建体包含编码具有杀有害生物活性的蛋白质的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自：

a)任一SEQ ID NO:71、69、70和72-106中所示的核苷酸序列；

b)编码包含任一SEQ ID NO:4、1-3、5-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66或67的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；和

c)编码以下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与任一SEQ ID NO:4、1-3、5-40、42、43、45-48、50、51、52、54、56、58-64、66或67的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；

其中所述大田被有害生物侵染，所述多肽具有针对该有害生物的杀有害生物活性。

25.如权利要求1所述的核酸用于针对有害生物保护植物的用途，所述核酸编码的氨基酸具有针对该有害生物的杀有害生物活性。

26.一种商品产品，其包含如权利要求1所述的核酸分子或由所述核酸分子编码的蛋白质，其中所述产品是选自：完整或加工的种子或谷物、动物饲料、玉米或黄豆粗粉、玉米或黄豆面粉、玉米淀粉、大豆粗粉、黄豆面粉、麦片、黄豆蛋白浓缩物、黄豆蛋白分离物、增稠的黄豆蛋白浓缩物、化妆品、护发产品、黄豆黄油、纳豆、印尼豆豉、水解的黄豆蛋白、喷射奶油、起酥油、卵磷脂、可食用性完整大豆、黄豆奶酪、豆腐乳、豆腐、腐竹、以及煮熟、研磨、蒸熟、烘焙或煮半熟的谷物。