KR20000064691A - 선충류-활성독소를코드화하는바실루스츄린겐시스유전자 - Google Patents

선충류-활성독소를코드화하는바실루스츄린겐시스유전자 Download PDF

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쥬얼 페인
케네쓰 이. 나바
제니 퓨
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칼튼 제이. 에이블
마이코겐 코포레이션
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Abstract

본 발명은 균주 PS80JJ1, PS158D5, PS167P, PS169E, PS177F1, PS177G, PS204G4, 및 PS204G6로부터 클로닝된, 선충류 해충에 대해 활성을 갖는 단백질들을 코드화하는, 바실루스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis) 유전자들에 관한 것으로, 상기 독소들은 특히 파나그렐루스 레디비부스(Panagrellus redivivus)에 대해 활성을 갖는다. 상기 독소를 코드화하는 DNA는 독소를 발현하도록 식물과 같은 다양한 숙주에 형질전환될 수 있다.

Description

선충류-활성 독소를 코드화하는 바실루스 츄린겐시스 유전자
[관련출원에 대한 상호참조]
본 출원은 1995년 6월 7일 출원되어 현재 출원중인 미국특허출원 제 08/485,568호의 일부-계속 출원이고; 상기 출원은 1994년 9월 21일 출원된 미국특허출원 제 08/310,197호의 일부-계속 출원이며; 상기 출원은 1993년 7월 15일 출원되어 미국특허 제 5,350,577호로 등록된 미국특허출원 제 08/092,155호의 분할출원이고; 상기 출원은 1992년 7월 21일 출원되어 미국특허 제 5,270,448호로 등록된 미국특허출원 제 07/918,345호의 분할출원이며; 상기 출원은 1990년 7월 27일 출원되어 미국특허 제 5,151,363호로 등록된 미국특허출원 제 07/558,738호의 분할출원이다. 또한 본 출원은 1994년 12월 16일 출원되어 현재 출원중인 미국특허출원 제 08/357,698호의 일부-계속 출원이고; 상기 출원은 1993년 12월 30일 출원되어 현재는 포기된 미국특허출원 제 08/176,403호의 분할출원이며; 상기 출원은 1992년 12월 31일 출원되어 현재는 포기된 미국특허출원 제 07/999,053호의 분할출원이다.
최근 10년까지 비. 티. 살충제의 상업적 이용은 인시류 (모충) 해충의 좁은 범위로 크게 제한되어 왔다. 비. 츄린겐시스 쿠르스타키 변종(B. thuringiensis var. kurstaki)의 포자 및 결정의 조제는 수년간 인시류 해충에 대한 상업적 살충제로 이용되어 왔다. 예를들어, 비. 츄린겐시스 쿠르스타키 변종 HD-1(B. thuringiensis var. kurstaki HD-1)은 수많은 인시류 곤충의 유충에 대해 독성을 나타내는 델타 내독소(δ-endotoxin) 결정체를 생산한다.
그러나, 최근 몇 년 동안에, 연구자들은 훨씬 넓은 범위의 해충에 대해 특이성을 가지는 비. 티. 살충제를 발견하여 왔다. 예를들어, 비. 티.의 다른 종들, 즉, 비. 티. 이스라엘렌시스 (israelensis) 변종과 비. 티. 테네브리오니스 변종 (a.k.a.M-7, a.k.a. B.t. var. san diego)는 각각 쌍시목 및 초시목 해충의 방제를 위해 상업적으로 이용되어 왔다(Gaertner, 1989). 또한 코치 및 비글(Couch,1980 and Beegle, 1978) 참조. Krieg 등(Krieg 등, 1983)은 초시목에 속하는 2 종류의 딱정벌레에 대하여 활성이 있다고 하는, 바실루스 츄린겐시스 테네브리오니스 변종 (Bacillus thuringiensis var. tenebrionis)을 기술하고 있다. 이들은 콜로라도 감자 딱정벌레, 렙티노타르사 디셈리네아타 (Leptinotarsa decemlineata)와 딱정벌레 아젤라스티카 알니(Agelastica alni)이다.
최근에, 신규한 비. 티.의 아종들이 동정되었고, 활성 δ-내독소 단백질의 기능을 담당하는 많은 유전자들이 분리되었다.(Hofte, and Whiteley, 1989). Hofte와 Whiteley는 비. 티. 결정체 단백질 유전자들을 4개의 주된 군으로 분류하였다. 이러한 군들은 CryⅠ(인시류-특이적), CryⅡ(인시류- 및 쌍시류-특이적), CryⅢ(초시류-특이적), 및 CryⅣ(쌍시류-특이적)이었다. 프레폰테인 등(Prefontaine, 1987)은 인시류-활성 유전자들의 분류에 유용한 프로브(probes)들을 기술하고 있다. 다른 해충들에 대해서 특이적으로 독성을 나타내는 균주들의 발견도 보고되었다(Feitelson 등, 1992).
비. 티. 결정성 단백질 유전자의 대장균(Escherichia coli)내에서의 클로닝과 발현은 발간된 문헌에 기술되어 있다(Schnepf 및 Whiteley, 1981). 미국특허 제4,448,885호와 미국특허 제4,467,036호는 모두 이.콜라이 내에서의 비. 티. 결정 단백질의 발현을 개시하고 있다. 미국특허 제4,797,276호 및 제4,853,331호는 다양한 환경에서 초시류 해충을 억제하는데 이용될 수 있는 비. 츄린겐시스 테네브리오니스 변종 (a.k.a. 비. 티. san diego, a.k.a. M-7)을 개시하고 있다. 미국특허 제4,918,006호는 쌍시류 해충에 대해서 활성이 있는 비. 츄린겐시스 이스라엘렌시스 변종 독소를 개시하고 있다. 이 특허는 약 27 kD의 단백질 및 그의 단편들이 쌍시류 활성을 담당한다고 보고한다. 미국특허 제4,849,217호는 알팔파 바구미에 대해서 활성이 있는 비. 티. 분리주를 개시하고 있다. 미국특허 제5,151,363호 및 미국특허 제4,948,734호는 선충류에 대한 활성을 갖는 비.티.의 특정한 분리주들을 개시하고 있다.
그간 허용되었던 선충류의 방제 방법은 약물 벤즈이미다졸 및 그의 동류 약물들을 이용하는 것에 집중되어 왔다. 이들 약물들을 대량으로 이용하면 선충류 집단들은 내성을 갖게 되는 경우가 많이 발생한다(Prichard 등, 1980; Coles, 1986). 보고된 선충류 종들은 100,000 종을 넘는다.
비. 츄린겐시스 종들의 δ-내독소의 다양한 선충류 알에 대한 효과는 발행된 소수의 연구논문에 기술되어 있다. Bottjer 등(1985)은 비. 티. 쿠르스타키 및 비.티. 이스라엘렌시스가 생체내에서 선충류 트리코스트롱일루스 콜루브리포르미스(Trichostrongylus colubriformis)의 알에 대해 독성을 시현하는 것으로 보고하였다. 또한, 28 개의 다른 비.티. 균주들은 광범위한 독성에 대해 시험되었다. 가장 강력한 것은 나노그램 범위의 LD50값을 구비하였다. Ignoffo와 Dropkin(1977)은 바실루스 츄린겐시스로부터의 열안정성 독소(베타 외독소)가 자유-생활 선충류, 파나그렐루스 레디비부스(Panagrellus redivivus)(Goodey); 식물-기생 선충류, 멜로이도지네 인코그니타(Meloidogyne incognita)(Chitwood); 및 진균류-섭식 선충류, 아펠렌쿠스 아베나(Aphelenchus avena)(Bastien)에 대해 활성을 갖는다고 보고하였다. 베타 외독소는 특이성이 거의 없거나 전혀 없는 일반화된 세포독성 약제이다. 또한, Ciordia와 Bizzell(1961)은 비. 츄린겐시스의 일부 가축 선충류에 대한 효과를 보고하였다.
현재, 감염되기 쉬운 숙주에게 상당한 손상을 입히는 다수의 선충류들에 대한 보다 효과적인 방제방법이 요구된다. 효과적인 수단은 비.티. 살충제와 같은 생물학적 약제(biological agents)를 이용하는 것일 것이다. 광범위한 연구와 자본의 투자의 결과로 많은 특허들이 비.티. 분리주들 및 비.티. 분리주들의 신규한 용도에 대해 허여되어 왔다. 그러나, 신규한 비.티. 분리주들 및 공지의 비.티. 분리주들의 신규한 용도의 발견은 아직까지 실험적이고 예측되지 않는 기술분야로 남아 있다.
[발명의 요약]
본 발명은 비.티. 분리주, 선충류 해충에 대해 활성을 갖는 단백질들을 코드화하는, PS167P, PS80JJ1, PS158D5, PS169E, PS177F1, PS177G, PS204G4, 및 PS204G6으로부터 수득가능한 신규한 δ-내독소 유전자들에 관계한다. 이들 독소 유전자들은 후술하는 바와 같이 적당한 숙주내로 전이될 수 있다.
본 발명의 추가의 양상은 본원의 유전자들에 의해 코드화된 선충류-활성 독소들 및 그의 단편들에 관계한다. 본 발명의 다른 구현예는 본 발명의 유전자에 의해 형질전환된 숙주이다. 바람직한 구현예에 있어서, 형질전환된 숙주는 식물이다.
토양 미생물 바실루스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis : B.t.)(비.티.)는 파라스포랄 결정 단백질 함유물(parasporal crystalline protein inclusion)에 의해 특징지워지는 그램-양성, 포자-형성 박테리아(Gram-positive, spore-forming bacterium)이다. 이러한 함유물들은 종종 현미경상으로 독특한 형태의 결정처럼 보인다. 이 단백질들은 해충에 대해 매우 강한 독성을 나타내고 그들의 독성 작용은 특이적이다. 특정한 비. 티. 독소 유전자들은 분리 및 서열 결정되었고 재조합 DNA에 기초한 비. 티. 제품들은 생산되었고 사용인가되었다. 또한 곤충에 대한 내성을 부여하기 위하여 내독소 유전자가 조작된 식물을 이용하는 것과 비. 티. 내독소 전달 비히클로서 안정화된 완전한 미생물 세포를 이용하는 것을 포함하는, 비. 티. 내독소를 농업 환경에 전달하는 새로운 접근방법이 유전공학 기술을 이용하여 개발되고 있는 중이다(Gaertner 및 Kim, 1988). 따라서 분리된 비. 티. 내독소 유전자들은 상업적으로 가치있는 것이 되고 있다.
도 1은 선충류 활성 균주들의 알칼리-가용성 단백질(alkali-soluble proteins)들을 보여주는 9% SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 결과의 사진이다.
겔 A: 레인 (1)단백질 표준, (2)PS17, (3)PS33F2, (4)PS52A1, (5)PS63B, (6)PS69D1, (7)PS80JJ1, (8)PS177F1, (9)PS177G, (10)PS204G6, (11)단백질 표준.
겔 B: 레인 (1)단백질 표준, (2)PS17, (3)PS33F2, (4)PS52A1, (5)PS63B, (6)PS69D1, (7)PS169E, (8)PS167P, (9)PS204G4, (10)PS158D5, (11)단백질 표준.
[서열의 간단한 설명]
서열 1은 80JJ1 및 167P 유전자들의 PCR 증폭에 이용되는 "순방향(foward)" 올리고뉴클레오티드 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 2는 80JJ1 및 167P 유전자들의 PCR 증폭에 이용되는 "역방향(reverse)" 올리고뉴클레오티드 프라이머의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 3은 80JJ1 독소 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 4는 80JJ1 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 5는 167P 독소 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 6은 167P 단백질의 아미노산 서열이다.
본 발명은 선충류-활성 독소를 코드화하는 신규한 유전자에 관계한다. 독소들 자체도 본 발명의 중요한 양상이다. 본 발명의 추가의 구현예는 선충류-활성 독소들을 발현하는 능력을 숙주에 부여하기 위해 적당한 숙주를 형질전환시키는 것이다.
그로부터 본 발명의 유전자들이 수득될 수 있는 바실루스 츄린겐시스 분리주들은 미합중국, 일리노이주 61604, 피오리아, 노쓰 유니버시티 스트리트 1915 소재의 북부 지역 연구 센터, 농업 연구과 특허 배양균 집합소 (NRRL)에 기탁되었다.
배 양 균 수탁번호 기탁일
비. 티. 균주 PS80JJ1 NRRL B-18679 1990. 7. 17
비. 티. 균주 PS158D5 NRRL B-18680 1990. 7. 17
비. 티. 균주 PS167P NRRL B-18681 1990. 7. 17
비. 티. 균주 PS169E NRRL B-18682 1990. 7. 17
비. 티. 균주 PS177F1 NRRL B-18683 1990. 7. 17
비. 티. 균주 PS177G NRRL B-18684 1990. 7. 17
비. 티. 균주 PS204G4 NRRL B-18685 1990. 7. 17
비. 티. 균주 PS204G6 NRRL B-18686 1990. 7. 17
이. 콜라이 NM522(pMYC2379) NRRL B-21155 1993. 11. 3
이. 콜라이 NM522(pMYC2382) NRRL B-21329 1994. 9. 28
본 발명의 배양균들은 본원의 출원중에 37 CFR 1.14 및 35 U.S.C. 122에 의거 미합중국 특허상표청장이 분양받을 권리를 부여한 자에 대한 상기 배양균의 분양을 보장할 것을 조건으로 기탁되었다. 상기 기탁물은 본원의 대응출원 또는 그의 자출원이 출원된 외국에서 해당국 특허법에 의해 요구될 때 입수될 수 있다. 그러나, 이러한 기탁물의 입수가능성이 정부의 행위에 의해 수여된 특허권을 훼손하는 본원 발명의 실시허락을 구성하는 것은 아니라는 사실을 이해하여야만 한다.
더욱이, 본 발명의 배양균 기탁물은 미생물의 기탁에 관한 부다페스트 조약의 규정에 따라 보관되고 공중에게 분양될 수 있는 상태에 놓일 것이다. 즉, 상기 균주들은 미생물 시료의 분양에 대한 최근의 요청후 최소한 5년간, 어떠한 경우라도, 기탁일로부터 최소한 30년간 또는 그 미생물을 개시한 특허의 존속기간 동안 생존하고 오염되지 않도록 유지하는데 필요한 모든 주의를 기울여 보관될 것이다. 기탁자는 기탁물의 상태 때문에 기탁 기관이 분양요청시 분양할 수 없는 경우에 기탁물(들)을 대체할 의무를 지닌다는 것을 인식한다. 본원의 배양균에 대한 공중의 입수에 대한 모든 제한은 그들을 개시한 특허의 허여시에 결정적으로 철회될 것이다.
유전자 및 독소. 본 발명에 따라 유용한 유전자 및 독소들은 개시된 전체 서열 뿐만 아니라 본원에 구체적으로 예시된 독소의 특징적인 살충 활성을 보유하는, 이러한 서열들의 단편들, 변이체들, 돌연변이체들 및 융합 단백질들을 포함한다. 몇몇 경우에, 융합 단백질은 본원에 구체적으로 예시된 독소의 특징적인 살충 활성 이외에, 융합 방법에 의해 부여되는 다른 살충 활성을 포함할 수 있다. 본원에서 이용될 때, 유전자의 "변이체(variants)" 또는 "변형물 (variations)"이라는 용어는 동일한 독소들을 코드화하거나 또는 유사한 살충 활성을 갖는 균등한 독소 (equivalent toxins)들을 코드화하는 뉴클레오티드 서열들을 의미한다. 본원에서 이용될 때, "균등한 독소(equivalent toxins)"라는 용어는 표적 해충에 대하여 본원에서 특허청구된 것과 동일하거나 본질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 독소들을 의미한다.
선충류-활성 독소들을 코드화하는 유전자들이 여러 가지 방법에 의해 동정되고 수득될 수 있다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자들에게 자명한 사실이다. 본원에 예시된 특수한 유전자들은 상술한 배양균 기탁기관에 기탁된 분리주들로부터 수득될 수 있다. 이러한 유전자들, 그의 일부분 또는 변이체들은 예컨대, 유전자 합성기(gene synthesizer)에 의해 합성될 수도 있다. 유전자들의 변형물들은 점 돌연변이(point mutation)를 만드는 표준 기술을 이용함으로써 용이하게 제작될 수 있다. 또한, 이들 유전자들의 단편들은 표준 방법에 따라 시판중인 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 이용함으로써 만들어질 수 있다. 예를 들어, Bal31과 같은 효소 또는 부위-지정 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)은 이들 유전자들의 말단으로부터 뉴클레오티드들을 체계적으로 절단하는데 이용될 수 있다. 또한, 활성 단편을 코드화하는 유전자들은 여러 가지 제한효소를 이용함으로써 수득될 수 있다. 이들 독소들의 활성 단편들을 직접적으로 수득하기 위해 단백질 분해효소(protease)가 이용될 수 있다.
균등한 독소들 및/또는 이들 균등한 독소들을 코드화하는 유전자들은 본원의 교시를 이용함으로써 비.티. 분리주 및/또는 DNA 도서관으로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 살충 독소를 수득하는 방법은 여러 가지가 있다. 예를 들어, 본원에 개시되고 청구된 살충 독소들에 대한 항체들은 단백질들의 혼합물로부터 다른 독소를 동정하고 분리하는데 이용될 수 있다. 구체적으로, 항체들은 가장 일정하고 다른 비.티. 독소들과 가장 상이한 독소의 부분들에 대해 만들어질 수 있다. 이어서 이러한 항체들은 면역침강법, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 또는 웨스턴 블로팅에 의해 특징적인 활성을 갖는 균등한 독소들을 특이적으로 동정하는데 이용될 수 있다. 본원에 개시된 독소들 또는 균등한 독소들 또는 이들 독소들의 단편들에 대한 항체들은 당업계의 표준 방법을 이용함으로써 용이하게 제조될 수 있다. 이어서 이러한 독소들을 코드화하는 유전자들은 미생물로부터 수득될 수 있다.
본원에 예시된 살충 활성을 보유하는 단편들 및 균등물들은 본 발명의 범위내에 포함될 것이다. 또한, 유전암호의 중복성(redundancy) 때문에, 여러 가지 상이한 DNA 서열들이 본원에 개시된 아미노산 서열들을 코드화할 수 있다. 이러한 동일하거나 본질적으로 동일한 독소들을 코드화하는 다른 DNA 서열들을 만드는 것은 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련된 사람의 기술의 범위내에 속할 것이다. 이러한 변이체 DNA 서열들은 본 발명의 범위내에 속한다. 본원에서 이용될 때, "본질적으로 동일한(essentially the same)" 아미노산 서열이란 그 단백질의 살충활성에 중요한 영향을 미치지 않는 아미노산 치환, 결실, 부가 또는 삽입을 갖는 서열들을 의미한다.
본 발명의 독소들 및 유전자들을 동정하는 추가의 방법은 올리고뉴클레오티드 프로브(oligonucleotide probe)를 이용하는 것이다. 이러한 프로브들은 검출 수단을 갖는 뉴클레오티드 서열들이다. 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이, 프로브 분자와 핵산 시료가 두 분자들 사이의 강한 결합을 형성함으로써 혼성화한다면, 프로브와 시료가 상당한 상동성을 갖는다고 합리적으로 추정할 수 있다. 프로브에 의한 검출 수단은 공지의 방법으로 혼성화가 일어났는지 여부를 측정할 수 있는 수단을 제공해준다. 이러한 프로브 분석은 본 발명의 독소-코드화 유전자들의 신속한 동정방법을 제공한다. 본 발명에 따라 프로브로 이용되는 뉴클레오티드 분절들은 표준 방법을 이용함으로써 DNA 합성기의 이용에 의해 합성될 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열들은 본 발명의 유전자들을 증폭하기 위한 PCR 프라이머로도 이용될 수 있다.
본 발명의 특정한 독소들은 본원에 구체적으로 예시되어 있다. 이들 독소들은 단지 본 발명의 독소들의 예일 뿐이므로, 본 발명이 본원에 예시된 독소와 동일하거나 본질적으로 동일한 살충 활성을 갖는 변이체 또는 균등한 독소 (및 균등한 독소들을 코드화하는 뉴클레오티드 서열들)들도 추가로 포함한다는 것은 자명한 사실이다. 이러한 균등한 독소들은 예시된 독소와 아미노산 상동성을 갖는다. 이러한 아미노산 상동성은 일반적으로 75%를 초과하고, 바람직하게 90%를 초과하며, 가장 바람직하게는 95%를 초과할 것이다. 아미노산 상동성은 생물학적 활성을 담당하거나 또는 궁극적으로 생물학적 활성을 담당하게 될 3차원 배열의 결정에 관련된 독소의 중요한 부위에서 가장 높을 것이다. 이와 관련하여, 아미노산 치환들이 활성에 중요하지 않은 부위에서 일어나거나 또는 분자의 3차원 배열에 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)이라면 특정한 아미노산 치환들이 허용가능하고 예상될 수 있다. 예를 들어, 아미노산들은 다음 클래스들로 분류될 수 있다: 비극성, 비하전 극성, 염기성 및 산성. 하나의 클래스의 아미노산이 동일한 타입의 다른 아미노산으로 대체되는 보존적 치환은 그러한 치환이 그 화합물의 생물학적 활성을 실질적으로 변화시키지 않는 한 본 발명의 범위내에 포함된다. 표 1은 각 클래스에 속하는 아미노산들의 예들을 열거한 것이다.
아미노산의 클래스 아미노산들의 예
비극성 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp
비하전 극성 Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln
산성 Asp, Glu
염기성 Lys, Arg, His
몇몇 경우에, 비-보존적 치환도 일어날 수 있다. 결정적으로 중요한 요소는 이러한 치환들이 독소의 생물학적 활성을 현저하게 저하시켜서는 안된다는 것이다.
본 발명의 독소들은 형태 및 독소 함유물의 위치 측면에서도 특징을 갖는다.
하기 표 2에는 본 발명의 특정한 분리주들의 특성을 나타내었다.
선충류에 대해 독성을 나타내는 비.티. 분리주들의 설명
배양균 결정 설명 대략적인분자량(kDa) 혈청형 NRRL기탁번호 기탁일
PS80JJ1 다수결합 130, 90, 47, 37 4a, 4b, sotto B-18679 '90.7.17
PS158D5 부착,무정형 80 신규 B-18680 '90.7.17
PS167P 결합무정형 120 신규 B-18681 '90.7.17
PS169E 결합무정형 150, 128, 33 비-운동성 B-18682 '90.7.17
PS177F1 다수결합 140, 116, 103, 62 비-운동성 B-18683 '90.7.17
PS177G 다수결합 135, 125, 107, 98, 62 비-운동성 B-18684 '90.7.17
PS204G4 다수결합 105, 98, 90, 60, 44, 37 비-운동성 B-18685 '90.7.17
PS204G6 길고,무정형 23, 21 wuhanensis B-18686 '90.7.17
N.D. = 측정하지 않음
재조합 숙주들. 본 발명의 분리주에 의해 수용된 독소-코드화 유전자들은 넓은 범위의 미생물 또는 식물 숙주내에 삽입될 수 있다. 독소 유전자의 발현은 직접 또는 간접적으로 살충제의 세포내 생산 및 보유를 결과시킨다. 예컨대, 슈도모나스(Pseudomonas)와 같은 적당한 미생물 숙주에 의해, 미생물들은 해충의 서식지에 적용되고, 그곳에서 증식하고 해충에 의해 섭취될 것이다. 그 결과로 해충이 방제된다. 대안으로, 독소 유전자를 수용하고 있는 미생물들은 독소의 활성을 연장시키고 세포를 안정화하는 조건하에서 처리될 수 있다. 독성 활성을 보유하는 처리된 세포는 이어서 표적 해충의 환경에 적용될 수 있다.
비.티. 독소 유전자가 적당한 벡터를 통해서 미생물 숙주내에 도입되고, 상기 숙주가 살아있는 상태로 환경에 적용될 때, 특정한 숙주 미생물을 이용하는 것이 유리하다. 예를 들어, 해충의 서식지를 점유하는 것으로 알려진 미생물 숙주들이 선택될 수 있다. 미생물 숙주들은 특수한 종의 해충들과 공생할 수도 있다. 이러한 미생물들은 특정한 환경에서 야생형 미생물들과 성공적으로 경쟁하여 폴리펩타이드 살충제를 발현하는 유전자의 안정한 유지 및 발현을 제공하고, 바람직하게 환경적 분해 및 불활성화로부터 살충제를 효과적으로 보호할 수 있도록 선택된다.
다수의 미생물들이 해충의 서식지에 서식하는 것으로 알려져 있다. 이들 미생물들은 세균, 조류 및 진균류를 포함한다. 특히 중요한 것은, 예컨데 속 슈도모나스 (Pseudomonas), 에르위니아 (Erwinia), 세라티아 (Serratia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 크산토모나스 (Xanthomonas), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 리조비움 (Rhizobium), 로도슈도모나스 (Rhodopseudomonas), 메틸로필리어스 (Methylophilius), 아그로박테리움 (Agrobacterium), 아세토박터 (Acetobacter), 락토바실루스 (Lactobacillus), 아르스로박터 (Arthrobacter), 아조토박터 (Azotobacter), 류코노스톡 (Leuconostoc) 및 알칼리게네스 (Alcaligenes)들과 같은 일례의 세균; 속 메타리지움 (Metarihizium), 바바리아 (Bavaria), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 크립토코커스 (Cryptococcus), 클뤼베로마이세스 (Kluyveromyces), 스포로볼로마이세스 (Sporobolomyces), 로도토룰라 (Rhodotorula) 및 아우레오바시디움 (Aureobasidium)과 같은 일례의 진균류(fungi)를 포함한다. 특히 중요한 것은 슈도모나스 시린가에 (Pseudomonas syringae), 슈도모나스 플루오레스센스 (Pseudomonas fluorescens), 세라티아 마르세스센스 (Serratia marcescens), 아세토박터 크실리눔 (Acetobacter xylinum), 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens), 로도슈도모나스 스페로이데스 (Rhodopseudomonas spheroides), 크산토모나스 캄페스트리스 (Xanthomonas campestris), 리조비움 멜리오티 (Rhizobium melioti) 알칼리게네스 엔트로퍼스 (Alcaligenes entrophus), 및 아조토박터 빈란디 (Azotobacter vinlandii)와 같은 세균 ; 및 로도토룰라 루브라 (Rhodotorula rubra), 알. 글루티니스 (R. glutinis), 알. 마리나 (R. marina), 알. 아우란티아카 (R. aurantiaca), 크립토코커스 알비두스 (Cryptococcus albidus), 시. 디플루엔스 (C. diffluens), 시. 라우렌티 (C. laurentii), 사카로마이세스 로세이 (Saccharomyces rosei), 에스. 프레토리엔시스 (S. pretoriensis), 에스. 세레비시아에 (S. cerevisiae), 스포로볼로마이세스 로세우스 (Sporobolomyces roseus), 에스. 오도루스 (S. odorus), 클뤼베로마이세스 베로나에 (Kluyveromyces veronae), 및 아우레오바시디움 폴루란스 (Aureobasidium pollulans)와 같은 효모 종들을 포함한다. 특히 중요한 것은 색소화된 미생물(pigmented microorganism)이다.
독소를 코드화하는 비.티. 유전자들을 유전자의 안정한 유지 및 발현을 허용하는 조건하에서 미생물 숙주내로 도입시키는데는 여러 가지 방법을 이용할 수 있다. 이들 방법들은 당업자들에게 잘 알려져 있고, 예컨대 본원에 참고자료로 첨부된 미국특허 제5,135,867호에 기술되어 있다.
본 발명의 분리주, 독소 및 유전자들을 이용한 선충류의 방제는 당업자들에게 알려져 있는 다양한 방법들에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 방법들은, 예를 들어, 비.티. 분리주들의 해충(또는 그들의 장소)에 대한 적용, 재조합 미생물들의 해충(또는 그들의 장소)에 대한 적용, 및 본 발명의 살충독소를 코드화하는 유전자에 의한 식물의 형질전환을 포함한다. 재조합 미생물들, 예컨대, 비.티.(B.t.), 이. 콜라이(E. coli), 또는 슈도모나스(Pseudomonas)일 수 있다. 형질전환은 표준기술에 따라 당업자들에 의해 행해질 수 있다. 이러한 형질전환에 필요한 재료들은 본원에 개시되어 있고 그렇지 않은 것들은 당업자들이라면 쉽게 구할 수 있을 것이다. 예를 들어, 167P 독소를 코드화하는 유전자는 본원의 서열 5에 나타내었고, 167P 독소의 추정 아미노산 서열은 서열 6에 나타내었다.
세포의 처리. 상술한 바와 같이, 비.티. 또는 비.티. 독소를 발현하는 재조합 세포들은 독성 활성을 연장하고 세포를 안정화하기 위해 처리될 수 있다. 형성된 살충제 마이크로캡슐은 안정화되고 마이크로캡슐이 표적 해충의 환경에 적용될 때 독소를 보호할 세포 구조물(cellular structure)내에 비.티. 독소를 포함한다. 적당한 숙주 세포들은 진핵세포 또는 원핵세포 모두를 포함할 수 있는데, 보통은 포유동물과 같은 고등생물에 대해서 독성인 물질을 생산하지 않는 세포들로 제한된다. 그러나, 그러한 독성 물질들이 불안정하거나 적용 레벨이 포유동물 숙주에 대해 독성을 끼칠 가능성을 배제할 수 있을 정도로 충분히 낮은 경우에는, 고등생물에 대해 독성인 물질들을 생산하는 유기체도 이용될 수 있다. 숙주로, 긴요한 것은 원핵생물과 진균류와 같은 하등 진핵생물이다.
세포는 처리될 때 대개 완전하고 몇몇 경우에는 포자들이 이용될 수 있다고 하더라도 포자형태(spore form)이기 보다는 증식 형태(proliferative form)일 것이다.
미생물 세포, 예컨대, 비.티. 독소 유전자를 포함하는 미생물의 처리는, 그러한 기술이 독소의 특성에 해로운 영향을 미치지 않고, 독소를 보호하는 세포의 능력을 저하시키지 않는한 화학적 또는 물리적 수단, 또는 화학적 및/또는 물리적 수단의 조합에 의한 것일 수 있다. 화학적 시약의 예로는 할로겐화제, 특히 원자번호 17-80의 할로겐이다. 보다 구체적으로, 요오드는 온화한 조건하에서 목적으로 하는 결과를 달성하기 위한 충분한 시간 동안 이용될 수 있다. 다른 적합한 기술은 글루타르알데하이드와 같은 알데하이드; 제피란 클로라이드 및 세틸피리디니움 클로라이드와 같은 항-감염제; 이소프로필 및 에탄올과 같은 알콜; 루골(Lugol) 요오드, 보우인(Bouin)의 픽서티브, 여러 가지 산들 및 헬리(Helly)의 픽서티브와 같은 조직학적 고정액 (Humanson, 1967 참고)에 의한 처리; 또는 세포가 숙주 동물에 투여될 때 세포내에서 생산된 독소의 활성을 보존하고 연장시키는 물리적(열) 및 화학적 약제의 조합에 의한 처리를 포함한다. 물리적 수단의 예들은 감마-방사 및 X-방사와 같은 단파장 방사, 동결(freezing), UV 조사, 동결건조(lyophilization)등을 포함한다. 미생물 세포들의 처리 방법은 본원에 참고자료로 첨부된 미합중국특허 제 4,695,455호 및 동 4,695,462호에 기술되어 있다.
세포들은 일반적으로 환경 조건에 대한 저항력을 증가시키는 향상된 구조적 안정성을 구비할 것이다. 살충제가 프로폼(proform)이기 때문에, 세포 처리의 방법은 표적 해충 병원체에 의한 프로폼의 성숙된 형태로의 성숙과정을 억제하지 않도록 선택되어야만 한다. 예를들어, 포름알데하이드는 단백질들을 가교시켜 폴리펩타이드 살충제의 프로폼의 성숙을 억제할 수 있다. 세포 처리방법은 적어도 독소의 생체이용율 또는 생물활성의 상당한 부분을 유지해야만 한다.
생산의 목적상 숙주 세포의 선정에 있어 특히 중요한 특성들은 숙주세포내로의 비.티. 유전자의 삽입의 용이성, 발현 시스템의 이용가능성, 발현의 효율성, 숙주내에서의 살충제의 안정성, 및 보조적인 유전적 능력의 존재를 포함한다. 살충제 마이크로캡슐로 이용하기 위한 중요한 특성들은 두꺼운 세포벽, 색소 형성 및 봉입체(inclusion bodies)의 세포내 포장 또는 생성과 같은 살충제에 대한 보호 특성; 수성 환경(aqueous environment)에서의 생존; 포유동물 독성의 결여; 해충들 섭취의 유인; 독소에 대한 손상 없는 치사 및 고정의 용이성 등을 포함한다. 다른 고려해야 할 사항들은 제형화 및 취급의 용이성, 경제성, 저장 안정성 등을 포함한다.
세포들의 생장. 비.티. 살충 유전자를 포함하는 세포 숙주는 임의의 편리한 영양 배지내에서 배양될 수 있는데, 이러한 배지에서 DNA 구조물은 선택적 이점을 제공하여, 실질적으로 모든 세포들 또는 거의 모든 세포들이 비.티. 유전자를 보유하도록 선택배지를 제공한다. 이어서 이들 세포들은 종래의 방법에 따라 회수될 수 있다. 대안으로, 세포들은 회수되기 이전에 처리될 수 있다.
본 발명의 비.티. 세포들은 표준 기술 배지(standard art media) 및 발효 기술을 이용함으로써 배양될 수 있다. 발효 사이클의 완료시 세균들은 당업계에 공지된 방법에 의해 발효 육즙으로부터 비.티. 포자 및 결정들을 1차 분리함으로써 회수될 수 있다. 회수된 비.티. 포자들 및 결정들은 계면활성제, 분산제, 불활성 담체, 및 기타의 특정 표적 해충에의 취급 및 적용을 용이하게 하는 성분들을 첨가함으로써 습윤가능한 분말, 액상 농축액, 과립 또는 다른 제형으로 제형화될 수 있다. 이러한 제형화 및 적용 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 모충과 같은 인시류 해충에 대해 활성적인 시판 균주 비. 츄린겐시스(HD-1)들에 대해 이용된다. 본 발명의 비.티. 균주들(포자 및 결정)은 선충류 해충의 방제에 이용될 수 있다.
본 발명의 비.티. 독소들은 캡슐, 환괴, 또는 정제 또는 포유동물에서 구충제로 이용되는 경우에는 물약의 형태와 같은 제형(unit dosage)의 형태로 경구투여될 수 있다. 물약은 보통 벤토나이트와 같은 현탁제, 및 습윤제 또는 기타의 부형제를 포함하는 활성성분의 물내의 용액, 현탁액, 또는 분산액일 수 있다. 일반적으로, 물약은 제포제(antifoaming agent)를 포함할 수 있다. 물약 제형은 일반적으로 약 0.001부터 0.5중량%까지의 활성 화합물을 포함한다. 바람직한 물약 제형은 0.01부터 0.1중량%까지의 활성화합물을 포함할 수 있고, 캡슐 및 환괴는 전분, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 또는 디칼슘 포스페이트와 같은 담체 부형제(carrier vehicle)와 혼합된 활성 성분을 포함한다.
독소 화합물을 건조된, 고형 제형 형태로 투여하는 것이 바람직한 경우에는, 바람직한 양의 활성화합물을 포함하는 캡슐, 환괴 또는 정제가 보편적으로 이용된다. 이들 제형들은 활성성분들을 적당하게 곱게 분쇄된 희석제, 충전제, 용출제(disintegrating agent), 및/또는 전분, 락토오스, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 식물성 검 등과 같은 결합제와 활성성분을 균질하게 잘 혼합함으로써 제조된다. 이러한 제형들은 치료대상 숙주 동물의 유형, 감염의 심각성과 유형 및 숙주의 체중과 같은 여러 가지 요인들에 의존하여 총중량 및 선충류-활성 약제의 함량이 많이 달라질 것이다.
활성화합물이 동물의 사료를 통해서 투여되는 경우에, 그것은 사료와 잘 혼합되거나 최종 먹이에 첨가될 추비(top dressing) 또는 정제의 형태로 이용되거나 별도로 투여된다. 대안으로, 상기 화합물들은 동물에, 예컨대, 내강내, 근육내, 기관지내, 또는 피하주사에 의해 비경구적으로 투여될 수 있는데, 이 때 활성성분들은 약체 담체 부형제내에 용해되거나 분산된다. 비경구투여의 경우에, 활성물질은 허용가능한 부형제, 바람직하게 피넛 오일, 면실유 등과 같은 식물성 오일과 적당하게 혼합된다. 솔케탈(solketal), 글리세롤, 수성 비경구 제형(aqueous parenteral formulations)을 이용하는 유기 조제(organic preparations)들과 같은 다른 비경구 부형제들도 이용된다. 활성 화합물 또는 화합물들은 비경구 투여용 제형내에 용해되거나 현탁된다; 이러한 제형은 일반적으로 0.005부터 5중량%까지의 활성화합물을 포함한다.
독소들이 동물의 먹이의 하나의 성분으로 투여되거나 마시는 물에 용해되거나 현탁되는 경우에는, 활성 화합물 또는 화합물들이 불활성 담체(inert carrier) 또는 희석제에 잘 분산된 조성물들이 제공된다. 불활성 담체라 함은 선충류-활성 약제와 반응하지 않는 것 및 동물에 안전하게 투여될 수 있는 것을 의미한다. 바람직하게, 먹이 투여를 위한 담체는 동물 먹이의 하나의 성분이거나 성분일 것이다.
적합한 조성물은 활성성분이 비교적 많은 양으로 존재하고 동물에 직접 먹이거나 직접 또는 중간 희석 또는 블렌딩 단계 이후에 먹이에 첨가하기에 적합한 프리믹스(premix) 또는 보충물(supplement)을 포함한다. 이러한 조성물을 위한 전형적인 담체 또는 희석제들은 예를 들어, 증류기 건조 곡물, 맷돌에 탄 옥수수, 발효찌꺼기, 잘게 부순 조개껍대기, 중급 밀가루, 당밀, 옥수수속 가루, 식용 콩분쇄기 사료, 콩 오트밀(soya grits), 분쇄한 석회석 등을 포함한다.
동물의 소화관내에서 구충활성을 갖는 이외에, 살선충류 비.티. 분리주들의 포자들은 동물의 소화관을 통과하여, 변에서 발생하고 증식하여 그 안에서 부화하고 증식하는 선충류 유충들도 방제한다.
당업자들에 의해 이해되는 바와 같이, 살충제 농도는 특정 제형의 특성, 특히 그것이 농축물인지 바로 쓸 수 있는 것인지에 크게 의존한다. 살충제는 적어도 1중량%로 존재하고 100중량%일 수도 있다. 건조 제형은 약 1-95중량% 살충제를 포함하는 반면에, 액상 제형은 일반적으로 액체상 내에 용해되어 있는 약 1-60중량%의 고체일 것이다. 제형들은 일반적으로 약 102부터 약 104세포들/㎎ 까지를 구비할 것이다. 이들 제형들은 헥타당 약 50㎎ (액체 또는 건조) 내지 1㎏ 또는 그 이상의 양으로 투여될 것이다.
제형들은 선충류 해충의 환경, 예컨대, 식물, 토양, 또는 물속에 분무, 산포, 스프링클링 등의 방법에 의해 적용될 수 있다.
돌연변이체. 본 발명의 신규한 비.티. 분리주들의 돌연변이체들은 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의해 만들어질 수 있다. 예를 들어, 무아포 돌연변이체(asporogenous nutant)는 신규한 분리주의 에틸메탄설포네이트(EMS) 돌연변이유발을 통해 수득될 수 있다. 돌연변이체들은 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의해 자외선광 및 니트로소구아니딘을 이용하여 만들어질 수 있다.
적은 비율의 무아포 돌연변이체들이 온전하게 남아 긴 발효 기간 동안 용해되지 않을 것이다: 이러한 균주들을 용해 음성(-)으로 칭한다. 용해 음성 균주(lysis minus strains)들은 진탕 플라스크 배지에서 무아포 돌연변이체들을 스크리닝하여 발효의 말기에 여전히 온전하게 남아 있고 독소 결정을 포함하는 돌연변이체들을 선별해냄으로써 동정할 수 있다. 용해 음성 균주들은 보호되고, 캡슐화된 독소 단백질을 제공할 세포 처리 과정(cell treatment process)에 적합하다.
상기 무아포 돌연변이체의 파아지 내성 변이체(phage resistant varient)를 제조하기 위해, 일정한 분취량의 파아지 용해물을 영양 아가(nutrient agar) 상에 도말하여 건조되도록 방치한다. 상기 플레이트를 30℃에서 인큐베이션한다. 플레이트를 2일간 인큐베이션하면, 많은 콜로니들이 아가 상에 배양된 것을 확인할 수 있다. 이들 콜로니들 중 일부를 취하여 영양 아가 플레이트상에 2차 배양한다. 이러한 분명한 내성 배양균들을 파아지 용해물(lysate)과의 크로스 스트리킹에 의해 내성에 대해 시험한다. 한 줄의 파아지 용해물을 플레이트 상에 스트리킹하고나서 건조시킨다. 이어서 내성으로 추정되는 배양균들을 상기 파아지 라인(phage line)을 가로질러 스트리킹한다. 30℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 내성 세균 배양균(resistant bacterial cultures)은 파아지 라인과 교차된 스트리크의 어디에서도 용해를 시현하지 않는다. 이어서 파아지에 대한 내성을 내성 배양균의 로온(lawn)을 영양 아가 플레이트 상에 플레이팅하여 재확인한다. 민감성 균주도 양성 대조표준으로 작용하도록 같은 방법으로 플레이팅한다. 건조 후, 한 방울의 파아지 용해물을 플레이트의 중앙에 떨어뜨려 건조되도록 방지한다. 내성 배양균들은 30℃에서 24시간 동안 인큐베이션된 후 파아지 용해물이 위치된 지역에서 용해를 시현하지 않았다.
본 발명의 실시 방법을, 최선의 실시양태를 포함하여 설명한 실시예들은 다음과 같다. 이러한 실시예들은 제한적인 것으로 해석되어서는 안된다. 특단의 언급이 없는한 모든 백분율은 중량비이고 모든 용매 혼합비율은 용적비이다.
실시예 1 : 비.티. 분리주의 배양
비.티. 분리주의 2차 배양균을 이용하여 이하의 배지, 펩톤, 글루코오스, 염 배지를 접종할 수 있다.
박토 펩톤 7.50 g/l
글루코오스 1.0 g/l
KH2PO43.4 g/l
K2HPO44.35 g/l
염용액 5.0 ml/l
CaCl2용액 5.0 ml/l
염용액 (100 ml)
MgSO47H2O 2.46 g
MnSO4H2O 0.04 g
ZnSO47H2O 0.28 g
FeSO47H2O 0.40 g
CaCl2용액 (100 ml)
CaCl22H2O 3.66g
pH 7.2
염용액과 CaCl2용액은 접종시에 필터-멸균한후 오토클레이브하여 조리된 육즙에 첨가하였다. 플라스크를 64시간 동안 200 rpm으로 회전하는 회전진탕기상 30℃에서 인큐베이션하였다.
상기 과정은 동업계에 잘 알려진 방법에 따라 대규모 발효기로 스케일 업될 수 있다.
상기 발효 과정에 의해 수득된 비.티. 포자 및 결정들은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 분리될 수 있다. 자주 사용되는 방법은 회수된 발효 육즙을 원심분리와 같은 일례의 분리 기술(separation techniques)로 처리하는 것이다.
실시예 2 - 파나그렐루스 레디비부스(Panagrellus redivivus)에 대한 바실루스 츄린겐시스 분리주의 활성
벌레들을 튜브에 수집하여 약 15분동안 적응하도록 방치하였다. 물이 맑아질 때까지 물을 따라 버리고 새 물로 교환하는 것을 3-4 차례 반복하였다. 250㎕의 수세된 선충류(20-30 마리)들과 100㎕의 포자/결정 현탁액(spore/crystal suspension)을 멀티-웰 트레이내의 각 웰 속의 650㎕의 물에 첨가하였다. 선충류들을 계수하여 그 수를 기록하였다. 4일후, 살아있는 벌레들을 계수하여 폐사율( percent mortality)을 산출하였다.
생물학적 검정 결과
미국특허 제 4,948,734호 비.티. 균주 번호 폐사율(Mortality)
PS17 90%
PS33F2 30%
PS52A1 100%
PS63B 92%
PS69D1 100%
신규한 비.티. 균주 번호
PS80JJ1 99%
PS158D5 99%
PS167P 96%
PS169E 100%
PS177F1 96%
PS177G 100%
PS204G4 100%
PS204G6 100%
대조군 0%
표 4 및 표 5에 각각의 신규한 선충류-활성 균주들의 알칼리-가용성 단백질들의 분자량을 이전에 공지된 비.티. 균주들의 그것과 비교하여 나타애었다.
이전에 공지된 선충류-활성 균주들
비.티. 균주 번호 단백질의 대략적인 분자량(kDa)
PS17 155, 145, 135
PS33F2 140, 94, 86, 68, 65, 62
PS52A1 57, 45
PS63B 84, 82, 78
PS69D1 135, 46, 32
신규한 선충류-활성 균주들
비.티. 균주 번호 단백질의 대략적인 분자량(kDa)
PS80JJ1 130, 90, 47, 37
PS158D5 80
PS167P 120
PS169E 150, 128, 33
PS177F1 140, 116, 103, 62
PS177G 135, 125, 107, 98, 62
PS204G4 105, 98, 90, 60, 44, 37
PS204G6 23, 21
실시예 3 - 바실루스 츄린겐시스 균주 PS80JJ1의 신규 독소 유전자의 클로닝 및 발현.
600nm에서 광학밀도가 1.0이 되도록 배양된 바실루스 츄린겐시스(비.티.) 세포로부터 총 세포 DNA(total celllular DNA)를 준비하였다. 원심분리하여 세포를 펠렛으로 만든후 원형질체 완충액(protoplast buffer)(0.3M 수크로스, 25mM Tris-Cl(pH8.0), 25mM EDTA내의 20mg/ml 라이소자임)에 원형질체로 다시 현탁시켰다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 원형질체(protoplast)를 동결과 해동을 2회 반복하여 용해시켰다. 9 용량(volumes)의 0.1M Nacl, 0.1% SDS, 0.1M Tris-Cl 용액을 첨가하여 용해를 완결하였다. 맑은 용해물(lysate)을 페놀:클로로포름(1:1)으로 2회 추출하였다. 핵산을 2 용량의 에탄올로 침전시키고 원심분리하여 펠렛화하였다. 펠렛을 TE 완충액에 재현탁시키고 RNase를 최종농도 50㎍/ml로 첨가하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이션한 후에, 그 용액을 페놀:클로로포름(1:1) 및 TE-포화 클로로포름으로 각각 1회씩 추출하였다. 1/10 용량의 3M NaOAc및 2 용량의 에탄올을 첨가하여 수성 상(aqueous phase)으로부터 DNA를 침전시켰다. 원심분리하여 DNA를 펠렛화하고, 70% 에탄올로 세정하고 건조시킨후 TE 버퍼에 재현탁하였다.
신규한 PS80JJ1 130 kDa 독소 유전자로부터의 약 700-800bp의 DNA 단편을 PS80JJ1 세포 DNA 및 하기 프라이머를 이용하여 폴리메라제연쇄반응법(PCR) 증폭에 의해 수득하였다:
"순방향": 5' GGACCAGGATTTACAGG(TA)GG(AG)(AG)A 3' (서열 1)
"역방향": 5' TAACGTGTAT(AT)CG(CG)TTTTAATTT(TA)GA(CT)TC 3' (서열 2)
DNA 단편을 pBluescript S/K (Stratagene, La Jolla, CA)내에 )내에 클로닝하여 씨쿼나제(Sequenase)[US Biochemicals, Cleveland, OH]를 이용하여 디데옥시뉴클레오티드 DNA 서열 결정법(Sanger 등, 1977)에 의해 부분적으로 서열결정하였다. 적어도 하나의 PS80JJ1 독소 유전자의 독특한 DNA 서열들을 다른 공지의 δ-내독소 유전자와 컴퓨터 비교함으로써 확인하였다.
700-800bp의 DNA 단편을32P로 방사성동위원소표지하여 PS80JJ1 총 세포 DNA의 서던 블롯의 표준 혼성화에 이용하였다. 혼성화 밴드들은 약 1.8kbp EcoRⅠ 단편과 약 9.5kbp HindⅢ 단편을 포함하였다. 이들 혼성화 DNA 밴드들은 PS80JJ1로부터의 독소 유전자 또는 독소 유전자의 제한단편들을 포함한다.
PS80JJ1 DNA로부터 제조된 유전자 도서관을 NdeⅡ로 부분적으로 절단하였다. 부분적으로 절단된 제한 절단물(partial restriction digests)들을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분류하였다. 크기가 9.3 내지 23kbp인 DNA 단편들을 겔로부터 절제해내어, 겔 슬라이스로부터 전기용출하고 Elutip-D 이온 교환 칼럼(Schleicher and Schuell, Keene, NH)상에서 정제하여 에탄올 침전에 의해 회수하였다. NdeⅡ 삽입물을 BamHⅠ-절단 LamdaGem-11(Promega, Madison, WI)에 연결하였다. 재조합 파아지를 조립하여 이. 콜라이 KW251 세포들상에 플레이팅하였다. 플라크들을 상술한 프로브와의 혼성화에 의해 스크리닝하였다. 혼성화 플라크들을 플라크-정제하고 표준방법(Maniatis 등)에 따라 DNA를 분리하는데 이용하기 위해 이. 콜라이 KW251 세포들의 액상 배양세포들을 감염시키는데 이용하였다.
PS80JJ1 130 kDa 독소를 코드화하는 유전자의 2차클로닝을 위해, 정제량의 파아지 DNA를 XhoⅠ으로 절단하고 아가로스 겔상에서 전기영동하였다. 독소 유전자를 포함하는 약 12 kbp 밴드를 겔로부터 잘라내어, 겔 슬라이스로부터 전기용출하여 상술한 바와 같이 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제된 DNA 삽입물을 XhoⅠ-절단 pHTBlueⅡ(pBluescript S/K (Stratagene, La Jolla, CA)와 상주 비.티. 플라스미드[Lereclus 등]로부터의 복제 기점으로 구성된 이. 콜라이/비. 츄린겐시스 셔틀 벡터)내에 연결하였다. 연결 혼합물을 냉동된 컴피턴트 이. 콜라이 NM522 세포(ATCC 47000)를 형질전환시키는데 이용하였다. β-갈락토시다아제-형질전환체를 상술한 바와 같은 알칼리성 용해물 플라스미드 미니프렙(miniprep)의 제한 절단(restriction digestion)에 의해 스크리닝하였다. 목적 플라스미드 구조물, pMYC2379는 살충 단백질을 포함하는 다른 독소 유전자에 비해 신규한 독소 유전자를 포함한다.
pMYC2379에 의해 코드화된 PS80JJ1 독소 유전자를 ABI373 자동 서열결정 시스템 및 그 시스템내의 소프트웨어를 이용하여 서열결정하였다. 독소 유전자의 서열분석 결과 그것은 DNA 서열로부터 추론된, 약 130,000 달톤의 단백질을 코드화하는 것으로 밝혀졌다. 뉴클레오티드 및 추론 아미노산 서열들은 서열 3 및 서열 4에 각각 도시하였다.
플라스미드 pMYC2379를 아크리스탈리페러스(Cry-) 비. 티.숙주, Cry B(A.Aronson, Purdue University, West Lafayette, IN)내로 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 도입하였다. 약 130 kDa 단백질의 발현을 SDS-PAGE 분석에 의해 확인하였다.
플라스미드 pMYC2379를 포함하는 이. 콜라이 NM522를 1991년 11월 3일 미국 일리노이주 61604, 피오리아, 노쓰 유니버시티 스트리트 1815 소재의 지방 연구 센타 산하, 특허 배양균 기탁소(NRRL)에 기탁하였다. 기탁번호는 NRRL B-21155이다.
실시예 4 - 바실루스 츄린겐시스 균주 PS80JJ1의 신규 독소 유전자의 클로닝 및 발현.
총 세포 DNA는 실시예 3에서와 동일한 방법으로 수득하였다.
신규한 PS167P 130 kDa 독소 유전자로부터의 약 700-800bp의 DNA 단편을 PS167P 세포 DNA 및 서열 1 및 서열 2를 이용하여 폴리메라제연쇄반응법(PCR) 증폭에 의해 수득하였다. DNA 단편을 pBluescript S/K (Stratagene, La Jolla, CA)내에 클로닝하여 씨쿼나제(Sequenase)[US Biochemicals, Cleveland, OH]를 이용하여 디데옥시뉴클레오티드 DNA 서열결정법(Sanger 등, 1977)에 의해 부분적으로 서열결정하였다. 적어도 두 개의 PS167P 독소 유전자들의 독특한 DNA 서열들을 다른 공지의 δ-내독소 유전자와 컴퓨터 비교함으로써 확인하였다.
700-800bp의 DNA 단편을32P로 방사성동위원소표지하여 PS167P 총 세포 DNA의 서던 블롯의 표준 혼성화에 이용하였다. 혼성화 밴드들은 약 1.8kbp 및 2.3kbp의 EcoRⅠ 단편들과 약 5.5kbp 및 8.0kbp의 HindⅢ 단편들을 포함하였다. 이들 혼성화 DNA 단편들은 PS167P의 독특한 독소 유전자 또는 이러한 독소 유전자의 제한단편들을 포함한다.
PS167P DNA로부터 제조된 유전자 도서관을 NdeⅡ로 부분적으로 절단하였다. 부분적으로 절단된 제한 절단물들을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분류하였다. 크기가 9.3 내지 23kbp인 DNA 단편들을 겔로부터 절제해내어, 겔 슬라이스로부터 전기용출하고 Elutip-D 이온 교환 칼럼(Schleicher and Schuell, Keene, NH)상에서 정제하여 에탄올 침전에 의해 회수하였다. NdeⅡ 삽입물을 BamHⅠ-절단 LamdaGem-11(Promega, Madison, WI)에 연결하였다. 재조합 파아지를 조립하여 이. 콜라이 KW251 세포들상에 플레이팅하였다. 플라크들을 상술한 프로브와의 혼성화에 의해 스크리닝하였다. 혼성화 플라크들을 플라크-정제하고 표준방법(Maniatis 등, 1989)에 따라 DNA를 분리하는데 이용하기 위해 이. 콜라이 KW251 세포들의 액상 배양세포들을 감염시키는데 이용하였다.
서던 분석 결과 재조합 파아지 분리주 가운데 하나는 PS167P 독소 유전자 프로브와 혼성화하는 약 5 kbp의 SalⅠ 밴드를 포함하고 있는 것으로 드러났다. PS167P 독소 유전자에 측접하는 SalⅠ 부위들 중 하나는 파아지 벡터 DNA 서열내에 존재하는 반면에, 다른 측접하는 SalⅠ 부위는 PS167P DNA 삽입물내에 위치한다. 이러한 SalⅠ 단편은 DNA 서열분석을 위해 pBluescript S/K (Stratagene, La Jolla, CA)내로 표준 방법에 따라 2차클로닝하였다. DNA 삽입물을 SacⅠ-KpnⅠ 단편으로서 pHTBlueⅡ(pBluescript S/K (Stratagene, La Jolla, CA)와 상주 비.티. 플라스미드[Lereclus 등, 1989]로부터의 복제 기점으로 구성된 이. 콜라이/비. 츄린겐시스 셔틀 벡터)내에 2차클로닝하였다. 비.티.내에서의 독소 유전자의 발현을 시험하기 위하여, pMYC2382를 아크리스탈리페러스(Cry-) 비. 티.숙주, Cry B(A.Aronson, Purdue University, West Lafayette, IN)내로 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 도입하였다. pMYC2382에 의해 코드화된 약 130 kDa의 PS167P 독소 단백질의 발현을 SDS-PAGE 분석에 의해 확인하였다.
pMYC2382에 의해 코드화된 PS167P 독소 유전자를 ABI373 자동 서열결정 시스템 및 그 시스템내의 소프트웨어를 이용하여 서열결정하였다. PS167P 독소 뉴클레오티드(서열 5) 및 추론 아미노산 서열(서열 6)들은 다른 살충 단백질들을 코드화하는 독소 유전자에 비해 신규하였다.
플라스미드 pMYC2382를 포함하는 이. 콜라이 NM522를 1994년 9월 28일 미국 일리노이주 61604, 피오리아, 노쓰 유니버시티 스트리트 1815 소재의 지방 연구 센타 산하, 특허 배양균 기탁소(NRRL)에 기탁하였다. 기탁번호는 NRRL B-21329이다.
실시예 6 - 독소 유전자의 식물내로의 삽입
본 발명의 하나의 양상은 선충류 해충에 대한 활성을 갖는 독소 유전자를 암호화하는 유전자로 식물을 형질전환시키는 것이다. 형질전환된 식물들은 선충류의 공격에 대해 저항적이다.
본 명세서에 개시된 바와 같은, 살충 독소를 암호화하는 유전자들은 동업계에 잘 알려진 여러 가지 기술을 사용하여 식물에서의 발현에 적합하도록 변형되고, 식물 선택가능성 마커 유전자(plant selectable marker)에 연결되고, 식물 세포의 게놈내로 삽입될 수 있다. 피자식물, 나자식물, 외떡잎식물, 쌍떡잎식물을 포함하는 임의의 식물이 본 발명에이용될 수 있다. 바람직한 식물들은, 콩, 해바라기, 면, 감자, 알팔파, 옥수수, 쌀 및 밀을 포함한다. 형질전환 방법 자체는 본 발명에 결정적인 것은 아니지만, 형질전환 약제로서의 아그로박테리움 투메파시엔스 (Aqrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 리조게네스 (Agrobacterium rhizoqenes), 리포좀 융합, 마이크로인젝션, 마이크로프로젝타일 충격, 화학약품 약제(PEG 또는 염화칼슘)-결합 DNA 흡수 또는 일렉트로포레이션 및 기타의 방법을 이용하는 T-DNA에 의한 형질전환을 포함할 수 있다. 공지된 상기 방법의 자세한 내용은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Holsters et al., 1978; Fromm et al., 1985; Horsch et al, 1985; Herrera-Estrella et al., 1983; Crossway et al., 1986; Lin, 1966; Steinkiss and Stabel, 1983.
형질전환에서 식물 선택성 마커를 이용함으로써 삽입된 DNA를 포함하지 않는 세포가 아닌 형진전환된 세포들을 선별해낼 수 있다. 다양한 식물세포용 마커들이 존재하는데, 일반적으로 살생물제, 또는 카나마이신, G 418, 하이그로마이신, 또는 포스피노트리신을 포함하지만, 반드시 이들로 국한되는 것은 아닌, 항생제에 대한 내성을 부여한다. b-글루쿠로니다제, b-갈락토시다제, B-페루 단백질, 녹색 형광 단백질, 및 루시페라제를 포함하지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아닌 육안으로 확인할 수 있는 마커들도 이용할 수 있다. 형질전환후, DNA 삽입물을 포함하는 세포들은 제한된 배지에서 배양하여 마커 발현을 육안으로 또는 내성으로 분석함으로써 선별해낼 수 있다. DNA 삽입물을 포함하는 세포들은 식물로 재생될 수 있다. 안정하게 형질전환된 식물이 수득되는한, 재생에 이용되는 방법은 식물 조직 및 이용한 형질전환 방법에 의존할 것이며, 이는 본 발명에 있어 그리 중요한 사항은 아니다. 그러나, 예를 들어, 세포 현탁액이 형질전환에 이용된 경우, 형질전환된 세포들은 칼리(calli)를 생산하도록 유도될 수 있고, 칼리는 이어서 새싹을 형성하도록 유도될 수 있으며, 새싹은 적당한 영양배지로 옮겨져 식물로 재생될 수 있다. 대안으로, 배축(hypocotyl) 조직 및 배와 같은 식물외식편(explants)들은 형질전환되어 적당한 배지에서 새싹으로 재생될 수 있고, 이어서 뿌리 및 전체 식물로 재생될 수 있다. 어떠한 재생 방법이 이용되든지간에, 결과적으로 형질전환된 형질을 자손에게 무성적으로 및 유성적으로 전달하여 필요한 경우 형질전환된 식물이 형질전환되지 않은 식물과 교배되어 그 형질을 더욱 적당한 생식질(germplasm)로 전달하여 발아하게 할 수 있는 안정하게 형질전환된 식물이 수득된다.
실시예 6 - 신규한 비. 티. 유전자의 곤충 바이러스내로의 클로닝
다수의 바이러스들이 곤충을 감염시키는 것으로 알려져 있다. 예를들어, 이들 바이러스들은 바큘로바이러스 및 엔토모폭시바이러스를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에 있어서, 상기한 바와 같은 선충류-활성 유전자는 곤충 바이러스의 게놈에 위치되어 바이러스의 감염성을 증가시킬 수 있다. 비.티. 독소 유전자를 포함하는 곤충 바이러스를 구성하는 방법은 주지되어있고 동업계의 전문가에 의해 용이하게 실행될 수 있다. 예를들어 이러한 방법은 Merryweather등,(1990) 및 Mertens등 (1990)에 기술되어 있다.
본 명세서에 기술된 실시예 및 실시태양은 단지 본 발명을 설명하기 위한 것일뿐으로 본 발명의 다양한 변형 또는 수정들이 동업계의 전문가에게 제안될 수 있으며 또한 본 출원의 정신 및 범위내 그리고 별첨된 특허청구 범위의 범주내에 포함될수 있다는 사실이 이해되어야 한다.
[참고문헌]
미합중국특허
미합중국특허 제 4,448,885 호
미합중국특허 제 4,467,036 호
미합중국특허 제 4,495,455 호
미합중국특허 제 4,695,462 호
미합중국특허 제 4,797,276 호
미합중국특허 제 4,849,217 호
미합중국특허 제 4,853,331 호
미합중국특허 제 4,918,006 호
미합중국특허 제 4,948,734 호
미합중국특허 제 5,135,867 호
미합중국특허 제 5,151,363 호
외국특허
유럽특허 제 120 516호.
기타 참고문헌
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(ii) 분자 형태: DNA (합성)
(xi) 서열 : 서열번호 2:
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(ii) 분자 형태: DNA (게놈성)
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(B) 서열의 형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 : 서열번호 4:
(2) 서열 번호 5에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 3504 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ii) 분자 형태: DNA (게놈성)
(xi) 서열 : 서열번호 5:
(2) 서열 번호 6에 대한 정보:
(ⅰ) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 1167 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 : 서열번호 6:

Claims (11)

  1. 선충류 해충에 대해 활성을 갖는 독소를 코드화하는, PS80JJ1, PS158D5, PS167P, PS169E, PS177F1, PS177G, PS204G4, 및 PS204G6으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 바실루스 츄린겐시스 분리주(Bacillus thuringiensis)로부터의 폴리뉴클레오티드 서열.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 서열 4의 독소를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 서열 3의 서열인 폴리뉴클레오티드 서열.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 서열 6의 독소를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 서열 5의 서열인 폴리뉴클레오티드 서열.
  6. 프라이머로서 서열 1 및 서열 2를 이용하여 증폭될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코드화되는 선충류에 대해 독성인 단백질을 코드화하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 서열 4 및 서열 6으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 독소를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 서열 3 및 서열 5로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  9. 선충류-활성 독소를 발현하는, 제 1항의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 형질전환된 재조합 숙주.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 숙주가 식물인 재조합 숙주.
  11. 제 1항의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코드화된 선충류-활성 독소.
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