RO123431B1

RO123431B1 - Proteine cu activitate pesticidă

Info

Publication number: RO123431B1
Application number: ROA200100438A
Authority: RO
Inventors: E. Kenneth Narva; H. Ernest Schnepf; Mark Knuth; R. Michael Pollard; A. Guy Cardineau; E. George Schwab; Tracy Ellis Michaels; Lee Stacy Finstad; Paula Diehl; Joanna Dojillo; Lisa Stamp; A. Rod Herman
Original assignee: Mycogen Corporation
Priority date: 1999-08-20
Filing date: 2000-08-21
Publication date: 2012-04-30
Also published as: WO2001014417A3; AU6922500A; AU784060B2; EP2036982A1; IL142170A0; US6900371B2; US6372480B1; ID29577A; WO2001014417A2; US20030106093A1; EP1187922A2; BR0007027A; HUP0103794A2; JP2003509018A; CA2344469A1; ZA200103145B; RU2267535C2; US7355003B2; UA84666C2; KR20010099680A

Abstract

Invenţia se referă la noi clase de proteine, active ca pesticide, şi la secvenţe de polinucleotide care codifică aceste proteine. Proteinele conform invenţiei au de preferinţă greutăţi moleculare de aproximativ 40...50 kDa şi de aproximativ 10...15 kDa.

Description

RO 123431 Β1

Prezenta invenţie se referă la o proteină şi o polipeptidă cu activitate pesticidă.

Este cunoscut faptul că, coleopterele sunt un grup semnificativ al dăunătorilor agricoli care provoacă distrugeri, de mari proporţii, culturilor în fiecare an. Exemple de dăunători coleoptere includ omida porumbului şi gărgăriţele de lucernă. Gărgăriţa de lucernă, Hypera postica şi gărgăriţa de lucernă egipteană, foarte apropiată, Hypera brunneipennis, sunt cele mai importante insecte dăunătoare ale lucernei, care cresc în Statele Unite, unde în 1984 existau 2,9 milioane de acri infestaţi. Anual este cheltuită o sumă de 20 de milioane de dolari pentru controlul acestor dăunători. Gărgăriţa de lucernă egipteană este specia predominantă în sud-vestul Statelor Unite, unde trece prin estivaţie (adică hibernează) pe timpul lunilor fierbinţi de vară. în toate celelalte privinţe, este identică cu gărgăriţa de lucernă, care predomină în tot restul Statelor Unite.

Stadiul larval este cel mai distrugător din ciclul de viaţă al gărgăriţei. Hrănindu-se pe vârfurile plantelor de lucernă în creştere, larva provoacă scheletizarea frunzelor, atrofierea, creşterea redusă a plantei, şi în final, producţii reduse. Infestările severe pot distruge o întreagă recoltă de fân. Adulţii, care se hrănesc de asemenea cu frunze, provoacă pagube suplimentare, dar mai puţin semnificative.

Aproximativ 10 milioane de acri din porumbul din Statele Unite este infestat cu complexul de specii de omizi în fiecare an. Complexul de specii de omizi include omida porumbului Diabrotica barberi, omida porumbului D. undecinpunctata howardi şi omida porumbului D. virgifera virgifera. Larvele cu localizare în sol a acestor specii Diabrotica se hrănesc cu rădăcina plantei de porumb, provocând culcarea plantelor. Culcarea reduce în final recolta de porumb şi adesea are ca urmare moartea plantei. Hrănindu-se cu mătasea porumbului, gărgăriţele adulte reduc polenizarea şi, prin urmare, afectează negativ recolta de porumb per plantă. în plus, adulţii şi larvele din genul Diabrotica atacă culturile de cucurbitacee (castraveţi, pepeni, dovleci, etc) şi multe legume şi lanuri de culturi din producţia comercială cât şi din cele crescute în grădini pe lângă casă.

Controlul omizii porumbului a fost îndreptat parţial către metodele de cultivare, cum ar fi rotaţia culturilor şi aplicarea de niveluri ridicate de azot pentru a stimula creşterea unui sistem adventiv de rădăcini. Totuşi, insecticidele chimice reuşesc cu greu să garanteze nivelul dorit de control. Insecticidele sunt fie răspândite pe sol, fie sunt încorporate în acesta. Problemele asociate cu utilizarea unora dintre insecticidele chimice sunt contaminarea mediului şi dezvoltarea rezistenţei printre populaţiile de insecte tratate.

Microbul de sol Bacillus thunngiensis (B.t.) este o bacterie Gram-pozitivă, formatoare de spori, caracterizată prin incluziuni proteice parasporale, care microscopic pot apărea ca nişte cristale formate în mod distinc. Anumite tulpini de B.t. produc proteine care sunt toxice pentru anumite ordine specifice de dăunători. Anumite gene de toxine ale B.t. au fost izolate şi secvenţiate, şi s-au produs şi aprobat spre folosire produse pe bază de ADN recombinat din B.t. în plus, prin utilizarea tehnicilor de inginerie genetică, suntîn dezvoltare noi abordări pentru livrarea acestor endotoxine B.t. mediilor agricole, incluzând utilizarea de plante modificate prin inginerie genetică, cu gene de endotoxine pentru rezistenţa insectelor şi utilizarea de celule microbiene intacte stabilizate ca purtători de livrare a endotoxinelor B.t. (Gaertner, F.H., L. Kim [1988] TIBTECH 6: S4-S7). Astfel, genele de endotoxine B.t. izolate încep să aibă valoare comercială.

Utilizarea comercială a pesticidelor B.t. a fost iniţial limitată la un domeniu îngust de dăunători lepidoptere (omizi). Preparatele din spori şi cristale din subspecia kurstaki a B. thunngiensis au fost folosite mulţi ani drept insecticide comerciale pentru dăunătorii lepidoptere. De exemplu, B. thunngiensis varianta kurstaki HD-1 produce o δ-endotoxină cristalină care este toxică pentru larvele unui număr de insecte lepidoptere. 2 RO 123431 Β1 în ultimii ani, totuşi, cercetătorii au descoperit pesticide B.t. cu specificităţi pentru un 1 domeniu mai larg de dăunători. De exemplu, alte specii de B. t., şi anume israelensis şi tenebrionis (cunoscute de asemenea şi ca B.t. M-7, sau B.t. san diego), au fost utilizate 3 comercial pentru controlul insectelor din ordinul Diptera şi respectiv Coleoptera (Gaertner, F.H., [1989] "Cellular Delivery Systems for Insecticidal Proteins: Living and Non-Living 5 Microorganisms", in Controlled delivery of Crop Protection Agents, R.M. Wilkins, editura Taylorand Hrancis, New York and London, 1990, pag. 245-255). A se vedea de asemenea 7 Couch, T. L. (1980) "Mosquito Pathogenicity of Bacill as thuringiensis varianta israelensis", Developments in Industrial Microbiology 22: 61-76; Beegle, CC, (1978) "Use of 9 Entomogenous Bacteria in Agroecosystems," Developments in Industrial Microbiology 20: 97-104. Krieg, A., A.M. Huger, G.A. Langenbruch, W. Schnetter (1983) Z. ang. Ent. 96:500- 11 508, descriu Bacillus thuringiensis varianta tenebrionis, care s-a dovedit activă împotriva a doi gândaci din ordinul Coleoptera. Acestea sunt gândacul de Colorado al cartofului 13 Leptinotarsa decemlineata şi Agelastica alni.

Recent, au fost identificate noi subspecii de B.t. şi au fost izolate gene responsabile 15 pentru proteinele δ-endotoxine active (Hofte, H., H.R. Whiteley [1989] Microbiological Reviews 52(2): 242-255). Hofte şi Whiteley au clasificat genele de proteine cristaline B.t. în 17 patru clase principale. Clasele au fost Cryl (specifice pentru lepidoptere), Crylll (specifice pentru lepidoptere şi diptere), Crylll (specifice pentru coleoptere) şi CrylV (specifice pentru 19 diptere). S-a raportat descoperirea de tulpini toxic specifice pentru alţi dăunători. (Feitelson, J.S., J. Payne, L. Kim [1992] Bio/Technology 10: 271-275). 21

Nomenclatorul din 1989 şi schema de clasificare a lui Hofte şi Whiteley pentru proteinele cristaline s-au bazat atât pe secvenţa de aminoacizi dedusă cât şi pe domeniul 23 gazdei al toxinei. Acest sistem a fost adaptat pentru a acoperi 14 tipuri diferite de gene de toxină care au fost împărţite în cinci clase principale. Deoarece au mai fost descoperite gene 25 de toxine, acest sistem a început să fie greu de utilizat, deoarece s-a descoperit că genele cu secvenţe similare au specificităţi ca insecticide semnificativ diferite. A fost propusă o 27 schemă de nomenclatură revizuită, care se bazează numai pe identitatea aminoacidului (Crickmore şi col. [1996] Society for Invertebrate Pathology, 29th Annual Meeting, 3rd 29 Colloquium on Bacillus thuringiensis, University of Cordoba, Cordoba, Spain, September 1-6, rezumat). Mnemonica "cry" a fost păstrată pentru toate genele de toxină, cu excepţia cytA 31 şi cytB, care rămân o clasă separată. Cifrele romane au fost schimbate cu cifre arabe în primul rang, iar parantezele din rangul trei au fost eliminate. Limitele curente reprezintă 33 aproximativ 95% (rangul trei), 75% (rangul al doilea) şi 48% (rang primar) identitate de secvenţă. Multe dintre numele originale au fost păstrate, cu excepţiile amintite, deşi un 35 număr dintre acestea au fost reclasificate. A se vedea de asemenea, N. Crickmore, D.R.

Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum şi D.H. Dean (1998) 37 "Revisions of the Nomenclatura for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins", Microbiology and Molecular Biology Reviews voi. 62: 807-813; şi Crickmore, Zeigler, 39 Feitelson, Schnepf, Van Rie, Lereclus, Baum şi Dean. "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature" (1999) 41 htto: //www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil Crickmore/Bt/index.html.

Acest sistem utilizează aplicaţiile software disponibile liber CLUSTAL Wşi pHYLIP. 43 Aplicaţia NEIGHBQR din pachetul pHYLIP utilizează un algoritm de medii aritmetice (UF34A). 45

Clonarea şi expresia unei gene de proteină cristalină B.t. în Escherichia coli a fost descrisă în literatura publicată (Schnepf, H.E., H.R. Whiteley [1981] Proc. Natl. Acad. Sci. 47 USA 78: 2893-2897). Brevetele US 4448885 şi 4467036 descriu amândouă expresia proteinei cristaline B.t. în E. coli. 49 3 RO 123431 Β1

Brevetele US 4797276 şi 4853331 descriu tulpina tenebrionis a B. thuringiensis (cunoscută de asemenea ca M-7, sau B.t. san diego), care poate fi utilizată pentru controlul dăunătorilor coleoptere în diverse medii. Brevetul US 4918006 dezvăluie toxine B.t. care au activitate împotriva dipterelor. Brevetul US 4849217 dezvăluie izolate B.t. care au activitate împotriva gărgăriţei lucernei. Brevetul US 5208077 dezvăluie izolate de Bacillus thuringiensis active împotriva coleopterelor. Brevetul US 5632987 dezvăluie o toxină de 130 kDa din PS80JJ1 care are activitate împotriva omizii porumbului. WO 94/40162, care este înrudită cu prezenta cerere, descrie noi clase de proteine care sunt toxice pentru omida porumbului.

Brevetele US 5151363 şi 4948734 dezvăluie anumite izolate de B.t. care au activitate împotriva nematodelor.

Brevetul US 6083499 şi WO 97/40162 dezvăluie "toxine binare". Obiectul invenţiei este distinct faţă de toxinele împotriva ţânţarilor produse de Bacillus sphaericus. A se vedea EP 454 485; Davidson şi col. (1990), "Interaction of the Bacillus sphaericus mosquito larvicidal proteins" Can. J. Microbiol 36(12): 870-8; Baumann şi col. (1988), "Sequence analysis of the mosquitocidal toxin genes encoding 51.4- şi 41.9-kilodalton proteins from Bacillus sphaericus 2362 and 2297", J. Bacteriol. 170: 2045-2050; Oei şi col. (1992), "Binding of purified Bacillus sphaericus binary toxin and its deletion derivatives to Culex quinquefasciatus gut: elucidation of funcţional binding domains”, Journal of General Microbiology 138(7): 1515-26.

Problema pe care o rezolvă invenţia este de a prezenta o proteină cu activitate pesticidă, o polinucleotidă care codifică proteina şi o celulă gazdă transgenică care o conţine.

Polinucleotidă conform invenţiei înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că cuprinde o primă secvenţă de aminoacizi care codifică o polipeptidă de aproximativ 45 kDa şi o a doua secvenţă de aminoacizi care codifică o polipeptidă de 15 kDa, în care polipeptidele menţionate sunt toxice pentru dăunătorul, viermele rădăcinilor porumbului, care ingerează respectivele polipeptide, în care secvenţa de nucleotide care codifică prima secvenţă de aminoacizi hibridizează cu complementul unei secvenţe de acizi nucleici selectată dintre SECV. ID. NR. 10, SECV ID Nr. 42 şi SECV. ID NR. 45 şi în care secvenţa de nucleotide care codifică a doua secvenţă de aminoacizi hibridizează, în prezenţa sau absenţa condiţiilor stringente, cu complementul unei secvenţe de acizi nucleici selectate dintre SECV. ID. NR. 31, SECV ID Nr. 40 şi SECV. ID NR. 44.

Proteina conform invenţiei înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că aceasta cuprinde o primă secvenţă de aminoacizi care este secvenţa unei polipeptide aproximativ 45 kDa şi o a doua secvenţă de aminoacizi este secvenţa unei polipeptide aproximativ 15 kDa, în care polipeptidele menţionate sunt toxice pentru dăunătorul, viermele rădăcinilor porumbului, care ingerează respectivele polipeptide, în care secvenţa de nucleotide care codifică prima secvenţă de aminoacizi hibridizează, în prezenţa condiţiilor stringente, cu complementul unei secvenţe de acizi nucleici selectată dintre SECV. ID. NR. 10, SECV ID Nr. 37, SECV ID Nr. 42 şi SECV. ID NR. 45 şi în care secvenţa de nucleotide care codifică a doua secvenţă de aminoacizi hibridizează, în prezenţa condiţiilor stringente, cu complementul unei secvenţe de acizi nucleici selectate dintre SECV. ID. NR. 31, SECV ID Nr. 35, SECV ID Nr. 40 şi SECV. ID NR. 44.

Celulă gazdă transgenică conform invenţiei, înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea că cuprinde polinucleotidă cu activitate pesticidă definită în revendicarea 1, în care respectiva celulă gazdă este selectată din grupul alcătuit dintr-o celulă de plantă şi o celulă bacteriană.Prin aplicarea invenţiei se obţin următoarele avantaje: - mediul de cultură nu este contaminat, aşa cum se întâmplă în cazul insecticidelor sau pesticidelor; 4 RO 123431 Β1 - celula gazdă care conţine gena insecticid poate fi crescută în orice mediu nutritiv. 1 Prezenta invenţie priveşte noi materiale şi metode pentru controlul dăunătorilor care nu sunt mamifere. într-o variantă preferată, invenţia prezintă materiale şi metode pentru 3 controlul dăunătorilor coleoptere. în variante şi mai preferate, materialele şi metodele descrise aici sunt folosite pentru controlul omizii porumbului - în special omida porumbului 5 Diabrotica virgifera virgifera. Dăunătorii lepidoptere (inclusiv sfredelitorul porumbului şi Helicoverpa zea) pot fi, de asemenea, controlaţi de proteinele cu activitate pesticidă ale 7 prezentei invenţii.

Prezenta invenţie prezintă, în mod avantajos, polinucleotide şi proteine cu activitate 9 pesticidă, codificate de polinuclotide. în variantele preferate, sunt folosite împreună o proteină de 40-50 kDa şi o proteină de 10-15 kDa, acestea având, în combinaţie, activitate 11 pesticidă. Astfel, la cele două clase de proteine ale prezentei invenţii se pot face referiri ca "toxine binare". Aşa cum este utilizat aici, termenul "toxină" sau "proteină cu activitate 13 pesticidă" include ambele clase ale acestor proteine. Folosirea unei proteine de 40-50 kDa cu o proteină de 10-15 kDa este preferată, dar nu neapărat necesară. O clasă de secvenţe 15 de polynucleotide, aşa cum sunt descrise aici, codifică proteine care au o greutate moleculară a lungimi totale de aproximativ 40-50 kDa. într-o variantă specifică, aceste 17 proteine au o greutate moleculară de aproximativ 43-47 kDa. O a doua clasă de polinucleotide ale prezentei invenţii codifică proteine cu activitate pesticidă de aproximativ 19 10-15 kDa. într-o variantă specifică, aceste proteine au o greutate moleculară de aproximativ 13-14 kDa. Trebuie înţeles clar că fiecare tip de toxină/genă este o variantă a prezentei 21 invenţii. într-o variantă preferată specifică, o proteină de 40-50 kDa din prezenta invenţii este utilizată în combinaţie cu o proteină de 10-15 kDa. Astfel, proteinele prezentei invenţii pot fi 23 utilizate pentru a mări şi/sau să uşureze activitatea altor toxine din proteine.

Prezenta invenţie include polinucleotide care codifică toxinele de 40-50 kDa sau 10- 25 15 kDa, polinucleotide care codifică porţiuni sau fragmente toxinelor cu lungime totală care menţin activitatea pesticidă (de preferinţă atunci când sunt utilizate în combinaţie) şi 27 polinucleotide care codifică ambele tipuri de toxine. Noile exemple de proteine de fuziune (o proteină de 40-50 kDa şi o proteină de 10-15 kDa fuzionate împreună) şi polinucleotidele 29 care le codifică sunt de asemenea prezentate aici. în anumite variante, toxinele B.t. utile în conformitate cu invenţia includ toxine care 31 pot fi obţinute din noile izolate B.t. descrise aici. Trebuie înţeles foarte clar că, atunci când toxinele de 40-50 kDa şi 10-15 kDa, de exemplu, sunt folosite împreună, un tip de toxină 33 poate fi obţinut dintr-un izolat, iar celălalt tip de toxină poate fi obţinut din alt izolat.

Prezenta invenţie include, de asemenea, utilizarea variantelor de izolate şi toxine B.t. 35 exemplificate care au, în mod substanţial, aceleaşi proprietăţi de activitate împotriva coleopterelorca izolatele şi toxinele B.t. specific exemplificate. Asemenea variante de izolate 37 includ, de exemplu, mutanţii. Procedurile pentru realizarea mutanţilor sunt binecunoscute în domeniul microbiologiei. Lumina ultravioletă şi mutagenii chimici cum ar fi nitrozoguanidina, 39 sunt folosite pe scară largă în acest scop. în varinte preferate, prezenta invenţie se referă la plante şi celule de plante care au 41 cel puţin o polinucleotidă izolată a prezentei invenţii. De preferinţă, celulele de plante transgenice exprimă toxine cu activitate pesticidăîn ţesuturile consumate de dăunătorii vizaţi. 43 în mod alternativ, izolatele B.t. ale prezentei invenţii sau microbii recombinaţi care exprimă toxinele descrise aici, pot fi utilizate pentru controlul dăunătorilor. în această privinţă, 45 invenţia include tratamentul celulor B.t. substanţial intacte şi/sau celule recombinate care conţin toxinele exprimate ale invenţiei, tratate pentru a prelungi activitatea pesticidă atunci 47 când celulele substanţial intacte sunt aplicate mediului unui dăunător vizat. Celula tratată acţionează ca un înveliş de protecţie pentru toxina cu activitate pesticidă. 49 5 RO 123431 Β1

Toxinele prezentei invenţii sunt intoxicanţi orali care afectează celulele tractului digestiv mediu al insectei, după ingestia de către insecta vizată. Astfel, prin consumarea celulelor gazdă recombinate, de exemplu, care exprimă toxina, insecta vizată ia astfel contact cu proteinele prezentei invenţii, care sunt toxice pentru dăunător. Acest lucru are ca urmare controlul dăunătorilor vizaţi.

Prezenta invenţie se referă la două clase noi de secvenţe de polinucleotide cât şi la noi proteine cu activitate pesticidă codificate de aceste polinucleotide. într-o variantă, proteinele de lungime totală au o greutate moleculară de aproximativ 40-50 kDa. în variantele specifice exemplificate aici, aceste proteine au o greutate moleculară de aproximativ 43-47 kDa. într-o a doua variantă, proteinele cu activitate pesticidă au o greutate moleculară de aproximativ 10-15 kDa. în variante specifice exemplificate aici, aceste proteine au o greutate moleculară de aproximativ 13-14 kDa. în variante preferate, sunt folosite împreună o proteină de 40-50 kDa şi o proteină de 10-15 kDa, iar proteinele au activitate pesticidă în combinaţie. Astfel, la cele două clase de proteine ale prezentei invenţii se pot face referiri ca "toxine binare". Aşa cum este folosit aici, termenul "toxină" include ambele clase de proteine cu activitate pesticidă. Prezenta invenţie se referă la polinucleotide care codifică atât toxina de 40-50 kDa cât şi toxina de 10-15 kDa, polinucleotide care codifică porţiuni sau fragmente ale toxinelor cu lungime totală care păstrează activitatea pesticidă atunci când sunt folosite în combinaţie şi secvenţe de polinucleotide care codifică ambele tipuri de toxine. într-o alcătuire preferată, aceste toxine sunt active împotriva dăunătorilor coleoptere, în special omida porumbului şi cel mai bine omida porumbului Diabrotica virgifera virgifera. Pot fi vizaţi, de asemenea, şi dăunătorii lepidoptere.

Aici sunt exemplificate câteva toxine specifice. Pentru toxinele care au o secvenţă de aminoacizi cunoscută, greutatea moleculară este, de asemenea, cunoscută. Specialiştii în domeniu vor recunoaşte că greutatea moleculară aparentă a unei proteine determinată prin electroforeză pe gel va diferi, uneori, de greutatea moleculară reală. Prin urmare, referirea de aici, de exemplu la o proteină de 45 kDa sau la o proteină de 14 kDa, este înţeleasă ca referirea la proteine, aproximativ de mărimea respectivă chiar dacă greutatea moleculară reală este întrucâtva diferită.

Prezenta invenţie se referă nu numai la polinucleotide care codifică aceste clase de toxine, dar de asemenea la utilizarea acestor polinucleotide pentru producerea de gazde recombinate care exprimă toxina. într-un alt aspect, prezenta invenţie se referă la utilizarea combinată a unei toxine de aproximativ 40-50 kDa din prezenta invenţie, împreună cu o toxină de aproximativ 10-15 kDa a prezentei invenţii pentru a realiza un control de mare eficienţă al dăunătorilor, inclusiv coleoptere cum ar fi omida porumbului. De exemplu, rădăcinile unei plante pot exprima ambele tipuri de toxine.

Astfel, controlul dăunătorilor folosind izolate, toxine şi gene din prezenta invenţie poate fi realizat printr-o varietate de metode cunoscute specialiştilor din domeniu. Aceste metode includ, de exemplu, aplicarea izolatelor de B.t. dăunătorilor (sau locaţiei acestora), aplicarea de microbi recombinaţi dăunătorilor (sau locaţiei acestora) şi transformarea plantelor cu gene care codifică toxinele cu activitate pesticidă ale prezentei invenţii. Microbii pentru utilizarea conform prezentei invenţii pot fi de exemplu, B.t., E. coli şi/sau Pseudamonas. Gazdele recombinate pot fi realizate de specialiştii din domeniu folosind tehnici standard. Materialele necesare pentru aceste transformări sunt descrise aici sau sunt disponibile cu uşurinţă specialiştilor din domeniu. Controlul insectelorşi a altor dăunători cum ar fi nematode şi căpuşe, poate fi realizat, de asemenea, de către specialiştii din domeniu folosind tehnici standard combinate cu-învăţăturile furnizate aici. 6 RO 123431 Β1

Noile clase de toxine şi secvenţe de polinucleotide furnizate aici sunt definite conform 1 mai multor parametri. O caracteristică critică a toxinelor descrise aici este activitatea pesticidă. într-o alcătuire particulară, aceste toxine au activitate împotriva dăunătorilor 3 coleoptere. Toxinele active împotriva lepidopterelor sunt, de asemenea, avute în vedere. Toxinele şi genele prezentei invenţii pot fi definite suplimentar de către secvenţele lor de 5 aminoacizi şi de nucleotide. Secvenţele moleculelor din fiecare clasă nouă pot fi identificate şi definite în termenii similarităţii sau identităţii lor cu anumite secvenţe exemplificate cât şi 7 în termenii capacităţii de a hibridiza cu, sau de a fi amplificate de anumite probe sau primeri exemplificaţi. Clasele de toxine furnizate aici pot fi identificate, de asemenea, pe baza 9 imunoreactivităţii lor cu anumiţi anticorpi şi pe baza aderenţei lor la o formulă generică.

Trebuie să fie evident unui specialist din domeniu că genele care codifică proteine 11 cu activitate pesticidă conform prezentei invenţii pot fi obţinute prin mai multe mijloace.

Genele specifice exemplificate aici pot fi obţinute din izolate depozitate într-un depozit de 13 culturi aşa cum este descris aici. Aceste gene şi toxine ale prezentei invenţii pot fi de asemenea construite sintetic, de exemplu, prin utilizarea unui sintetizator de gene. 15

Secvenţa de trei toxine de 45 kDa de model, este furnizată ca SECV ID NR.: 11, 43 şi 38. în variante preferate, toxinele acestei clase au o secvenţă care este conformă cu 17 secvenţa generică prezentată drept SECV ID NR.: 28. în alcătuiri preferate, toxinele acestei clase vor fi conforme cu secvenţa de consens arătată în fig. 1. 19

Cu învăţăturile furnizate aici, un specialist din domeniu poate produce uşor şi folosi diverse toxine şi secvenţe de polinucleotide ale noilor clase descrise aici. 21

Microorganismele utile conform prezentei invenţii au fost depozitate în colecţia permanentă a Agricultural Research Service Patent-Culture Collection (NRRL), Northern 23 Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, llinois 61604, S.U.A. 25

Numerele din depozitul de culturi ale tulpinilor depozitate sunt după cum urmează: Cultură Nr. depozit Data depunerii B.t. tulpina PS80JJ1 NRRL B-16679 17 iulie 1990 B.t. tulpina PS149B1 NRRL B-21553 28 martie 1996 B.t. tulpina PS167H2 NRBL B-21554 28 martie 1996 E. coli NM522 (pMYC2365) NRRL B-21170 5 ianuarie 1994 E. coli NM522 (pMYC2382) NRRL B-21329 28 septenbrie 1994 E. coli NM522 (pMYC2379) NRRL B-21155 3 noienbrie 1993 E. coli NM522 (pMYC2421) NRRL B-21555 28 martie 1996 E. coli NM522 (pMYC2427) NRRL B-21672 26 martie 1997 E. coli NM522 (pMYC2429) NRRL B-21673 26 martie 1997 E. coli NM522 (pMYC2426) NRRL B-21671 26 martie 1997 B.t. tulpina PS185GG NRBL B-30175 19 august 1999 B.t. tulpina PS187G1 NRRL B-30185 19 august 1999 B.t. tulpina PS187Y2 NRRL B-30187 19 august 1999 27 29 31 33 35 37 7 39 RO 123431 Β1

Tabel (continuare)

Cultură Nr.depozit Data depunerii B.t. tulpina PS201G NRRL B-30188 19 august 1999 B.t. tulpina PS201HH2 NRRL B-30190 19 august 1999 B.t. tulpina PS242K10 NRRL B-30195 19 august 1999 B.t. tulpina PS69Q NRRL B-30175 19 august 1999 B.t. tulpina KB54A1-6 NRRL B-30197 19 august 1999 B.t. tulpina KR589 NRRL B-30198 19 august 1999 B.t. tulpina PS185L12 NRRL B-30179 19 august 1999 B.t. tulpina PS185W3 NRRL B-30180 19 august 1999 B.t. tulpina PS187L14 NRRL B-30186 19 august 1999 B.t. tulpina PS186FF NRRL B-30182 19 august 1999 B.t. tulpina PS131W2 NRRL B-30176 19 august 1999 B.t. tulpina PS158T3 NRRL B-30177 19 august 1999 B.t. tulpina PS185X10 NRRL B-30178 19 august 1999 B.t, tulpina PS185FF NRRL B-30182 19 august 1999 B.t. tulpina PS187F3 NRRL B-30184 19 august 1999 B.t. tulpina PS201L3 NRRL B-30189 19 august 1999 B.t. tulpina PS204C3 NRRL B-30191 19 august 1999 B.t. tulpina PS204G4 KRRL B-18685 17 iulie 1990 B.t. tulpina PS204I11 NRRL B-30192 19 august 1999 B.t. tulpina PS204J7 NRRL B-30193 19 august 1999 B.t. tulpina PS236B6 NRRL B-30194 19 august 1999 B.t. tulpina PS246P42 NRRL B-30196 19 august 1999 B.t. tulpina KR1209 NPRL B-30199 19 august 1999 B.t. tulpina KR1369 NRRL B-30200 19 august 1999 B.t. tulpina MR1506 NRRL B-30298 1 iunie 2000 B.t. tulpina MR1509 NRRL B-30330 8 august 2000 B.t. tulpina MR1510 NRRL B-30331 6 august 2000 B.t. tulpina MR1607 NBRL B-30332 6 august 2000

Izolatul PS80JJ1 este disponibil pentru public pe baza acordării brevetului US 5151363 şi a altor brevete.

Un alt aspect al prezentei invenţii priveşte noi izolate şi toxinele şi genele care se pot obţine din aceste izolate. Noile izolate au fost depuse şi sunt incluse în lista de mai sus. 8 RO 123431 Β1

Aceste izolate au fost depozitate în condiţii care asigură faptul că accesul la culturi va fi 1 disponibil pe perioada cât această cerere de brevet va fi în examinare şi până la obţinerea unuia determinat de Comisarul de brevete şi mărci conform 37 CFR 1.14 şi 35 USC 122. 3

Depozitele sunt disponibile aşa cum este cerut de legile de brevete străine în ţările în care sunt depuse cereri corespondente ale prezentei cereri sau descendenţi ai acesteia. Totuşi, 5 trebuie înţeles că disponibilitatea depozitului nu constituie un permis pentru punerea în practică a prezentei invenţii prin derogarea de la drepturile de brevet acordate prin acţiune 7 guvernamentală. în continuare, depozitele de cultură ale cererii vor fi depozitate şi făcute disponibile 9 publicului în conformitate cu prevederile Tratatului de la Budapesta pentru Depunerea de Microorganisme, adică ele vor fi depozitate cu toată grija necesară pentru a fi păstrate viabile 11 şi-necontaminate pentru o perioadă de cel puţin cinci ani după cea mai recentă cerere pentru furnizare unui eşention a unui depozit şi în orice caz, pentru o perioadă de cel puţin 30 de 13 ani după data de depozitare sau pe perioada de aplicare a oricărui brevet care poate rezulta din dezvăluirea culturilor. Depozitarul va aduce la cunoştinţă datoria înlocuirii 15 depozitului(elor) dacă depunătorul nu este capabil să furnizeze un eşantion la cerere, datorită stării depozitului(elor). Toate restricţiile referitoare la disponibilitatea pentru public 17 ale depozitelor de culturi ale cererii vor fi irevocabil eliminate la acordarea unui brevet care le dezvăluie. 19

Mai jos este prezentat un tabel care prezintă caracteristicile unor anumite izolate de B.t. care sunt utile conform prezentei invenţii. 21

Tabelul 1 23

Descrierea tulpinilor de B.t. toxice pentru coleoptere Cultură Descrierea cristalului Greutate moleculară aproximativă (kDa) Serotip Depozit NBRL Data de depunere PS80JJ1 multiplu ataşat 130, 90, 47, 37, 14 4a4b, sotto B-18679 7-17-90 PS149B1 130, 47, 14 B-21553 3-2 B-96 PS167H2 70, 47, 14 B-23554 3-26-96 29 25 27 31

Alte izolate ale prezentei invenţii pot fi, de asemenea, caracterizate în termeni de formă şi localizare a incluziunilor toxinei. 33

Toxine, gene şi probe

Polinucleotidele prezentei invenţii pot fi folosite pentru a forma "gene" complete 35 pentru a codifica proteine sau peptide într-o celulă gazdă dorită. De exemplu, aşa cum vor recunoaşte specialiştii din domeniu, unele dintre polinucleotidele din lista de secvenţe 37 ataşată sunt arătate fără codoni stop. De asemenea, polinucleotidele din invenţie pot fi plasate adecvat sub controlul unui promotor într-o gazdă de interes, aşa cum se ştie deja în 39 domeniu. Aşa cum specialiştii din domeniu vor recunoaşte uşor, ADN-ul există de obicei într-o 41 formă dublu catenară. în această dispunere, o catenă este complementară celeilalte catene şi vice-versa. Pe măsură ce ADN-ul este replicat într-o plantă (de exemplu), sunt produse 43 catene suplimentare, complementare de ADN. "Catena de codificare" este adesea utilizată în domeniu pentru referirea la catena care se leagă cu catena anti-sens. ARMn este transcris 45 din catena "anti-sens" a ADN-ului. Catena "sens" sau "de codificare" are o serie de codoni 9 RO 123431 Β1 (un codon reprezintă trei nuclotide care pot fi citite trei odată pentru a rezulta un aminoacid particular) care pot fi citiţi ca un cadru de citire deschis (ORF) pentru a forma o proteină sau peptidă de interes. Pentru a exprima o proteină in vivo, o catenă de ADN este de obicei transcrisă într-o catenă complementară de ARNm care este utilizat ca o matriţă pentru proteină. Astfel, prezenta invenţie include utilizarea polinucleotidelor arătate în lista de secvenţe ataşată şi/sau catenele complementare. ARN şi ANP (acid nucleic peptidic) care sunt funcţional echivalenţi cu ADN-ul exemplificat sunt incluşi în prezenta invenţie.

Toxinele şi genele prezentei invenţii pot fi identificate şi obţinute prin utilizarea de exemplu, a probelor de oligonucleotide. Aceste probe sunt secvenţe de nucleotide detectabile care pot fi detectabile în virtutea unei marcări adecvate sau pot fi făcute inerent fluorescente aşa cum este descris în cererea internaţională WO 93/16094. Probele (şi polinucleotidele prezentei invenţii) pot fi ADN, ARN sau APN. în plus faţă de adenină (A), citozină (C), guanină (G), timină (T) şi uracil (U); pentru moleculele ARN, probele sintetice (şi polinucleotidele) prezentei invenţii pot avea de asemenea inozină (o bază neutră capabilă de împerecherea cu toate patru bazele; uneori folosită în locul unui amestec de toate patru bazele în probele sintetice). Astfel, atunci când aici se face referire la o oligonucleotidă degenerată, sintetică şi se utilizează în general "n", "n" poate fi G, A, T, C sau inozină. Codurile de ambiguitate aşa cum sunt folosite aici suntîn concordanţă cu standardul IUPAC pentru convenţii de numire cât şi cu depunerea prezentei cereri (de exemplu, R înseamnă A sau G, Y înseamnă C sau T, etc). Aşa cum este binecunoscut în domeniu, dacă molecula probă şi eşantionul de acid nucleic hibridizează prin formarea unei legături puternice între cele două molecule, se poate presupune rezonabil că proba şi eşantionul au substanţial omologie/simlaritate/identitate. De preferinţă, hibridizarea este condusă în condiţii stringente prin tehnici binecunoscute în domeniu, aşa cum sunt descrise de exemplu în Keller, G.H., M.M., Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press New York, NY, pag. 169-170. De exemplu, aşa cum s-a afirmat aici, condiţiile de înaltă stringenţă pot fi realizate printr-o primă spălare cu 2xSSC (citrat salin standard)/0,1% SDS (sulfat dodecil de sodiu) timp de 15 min la temperatura camerei. De obicei se realizează două spălări. Stringengenţa ridicată poate fi apoi realizată prin reducerea concentraţiei de sare şi/sau prin creşterea temperaturii. De exemplu, spălarea descrisă mai sus poate fi urmată de două spălări cu 0,1xSSC/0,1% SDS timp de 15 min, fiecare la temperatura camerei, urmate de spălări ulterioare cu 0,1xSSC/0,1% SDS timp de 30 min, fiecare la 55°C. Aceste temperaturi pot fi utilizate cu alte protocoale de hibridizare şi spălare explicate aici şi care sunt cunoscute specialiştilor din domeniu (poate fi folosit SSPE ca sare în loc de SSC, de exemplu). 2xSSC/0,1% SDS poate fi preparat prin adăugarea de 50 ml de 20xSSC şi 5 ml de 10% SDS la 445 ml de apă. 20xSSC poate fi preparat prin combinarea de NaCI (175,3 g/0,150 M), citrat de sodiu (88,2 g/0,015 M) şi apă la un litru, urmată de ajustarea pH-ului la 7,0 cu NaOH 10 N. 10% SDS poate fi preparat prin dizolvarea a 10 g SDS în 50 ml de apă autoclavată, diluând la 100 ml şi alicotare.

Detectarea probei asigură un mijloc pentru a determinarea într-un mod cunoscut dacă hibridizarea a avut loc. O asemenea analiză a probei furnizează o metodă rapidă de identificare a genelor care codifică toxinele prezentei invenţii. Segmentele de nucleotide care sunt utilizate ca probe, conform invenţiei, pot fi sintetizate folosind un sintetizator de ADN şi proceduri standard. Aceste secvenţe de nucleotide pot fi, de asemenea, folosite ca primeri PCR pentru a amplifica genele prezentei invenţii.

Caracteristicile de hibridizare ale unei molecule pot fi utilizate pentru a defini polinucleotidele prezentei invenţii. Astfel, obiectul invenţiei include polinucleotide (şi/sau complementele lor, de preferinţă complementele lor complete) care hibridizează cu o poli-nucleotida exemplificată aici (cum ar fi secvenţele de ADN incluse în SECVID NR.: 46-66). 10 RO 123431 Β1 Aşa cum este utilizat aici, condiţii "stringente" pentru hibridizare se referă la condiţii 1 care realizează acelaşi, sau aproape acelaşi, grad de specificitate al hibridizării ca şi condiţiile utilizate de prezenţii solicitanţi. în mod specific, hibridizarea ADN-ului imobilizat pe 3 Southern blot cu probe specifice pentru gene marcate 32P a fost realizată prin metode standard (Maniatis, T., E.F. Fritsch, J. Sambrook [1982] Molecular Cloning: A Laboratory 5 Manual: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). în general, hibridizarea şi spălările ulterioare au fost realizate în condiţii stringente care au permis detectarea 7 secvenţelor ţintă (cu omologie cu genele de toxine PS80JJ1, de exemplu). Pentru probelede de gene ADN dublu catenar, hibridizarea a fost realizată peste noapte la 20-25°C sub 9 temperatura de topire (Tm) a hibridului ADN în 6xSSPE, 5x soluţie Denhardt, 0,1% SDS, 0,1 mg/ml AEN denaturat. Temperatura de topire este descrisă de următoarea formulă 11 (Beltz, G. A., K.A. Jacobs, T,H. Eickbush, P.T. Cherbas şi F.C. Kafatos [1983] Methods of Enzymology, R. Wu, L. Grossman and K. Moldave, Academic Press, New York 100: 266- 13 285):

Tm=81, 5°C+16,6 Log[Na+]+0,41 (%G+C)-0,61 (%formamidă)-600/lungimea 15 duplexului în perechi de baze.

Spălările sunt realizate de obicei după cum urmează: 17 (1) De două ori la temperatura camerei timp de 15 în IxSSPE, 0,1% SDS (spălare de stringenţă redusă). 19 (2) O dată la Tm-20°C timp de 15 min în 0,2xSSPE, 0,1 % SDS (spălare de stringenţă moderată). 21

Pentru probele de oligonucleotide, hibridizarea a fost realizată peste noapte la 10-20°C sub temperatura de topire CM) a hibridului, în 6xSSPE, 5xsoluţie Denhardt, 0,1 % SDS, 23 0,1 mg/ml ACN denaturat. Tm pentru probele de oligonucleotide a fost determinată cu formula următoare: 25

Tm(°C)=2 (număr T/A perechi de baze)+4(numărG/C perechi de baze) (Suggs, S.V., T. Miyake, E.H. Kawashime, M.J. Johnson, K. Itakura şi R.B. Wallace [1981] ICN-UCLA 27 Syirp. Dev. Biol. Using Purified Genes, D.D. Brown, Academic Press, New York, 23: 683-693). 29

Spălările s-au realizat, în mod obişnuit, după cum urmează: (1) De două ori la temperatura camerei timp de 15 în IxSSPE, 0,1% SDS (spălare 31 de stringenţă redusă). (2) O dată la temperatura de hibridizare timp de 15 min în IxSSPE, 0,1% SDS 33 (spălare de stringenţă moderată).

Toxinele care pot fi obţinute din izolate PS149B1, PS167H2 şi PS80JJ1 au fost 35 caracterizate ca având cel puţin una dintre caracteristicile următoare (noile toxine ale prezentei invenţii pot fi în mod similar caracterizate cu acestea şi alte informaţii de 37 identificare prezentate aici): (a) toxina menţionată este codificată de o secvenţă de nucleotide care hibridizează 39 în condiţii stringente cu o secvenţă de nucleotide selectată din grupul care constă din: ADN care codifică SECVID NR.: 2; ADN care codifică SECVID NR.: 4; ADN care codifică SECV 41 ID NR.: 6, SECV ID NR.: 8; SECV ID NR.: 10, ADN care codifică SECV ID NE: 11, SECV ID NR.: 12, ADN care codifică SECV ID NR.: 13, SECV ID NR.: 14, ADN care codifică SECV 43 ID NR.: 15, ADN care codifică SECV ID NR.: 16, ADN care codifică SECV ID NR.: 17, ADN care codifică SECV ID NR.: 18, ADN care codifică SECV ID NR.: 19, SECV ID NR.: 20, 45 SECV ID NR.: 21, SECV ID NR.: 22, SECV ID NR.: 23, SECV ID NR.: 24, SECV ID NR.: 25 SECV ID NR.: 26, SECV ID NR.: 27, ADN care codifică o porţiune cu activitate pesticidă a 47 SECV ID NR.28, SECV ID NR.: 37, ADN care codifică SECV ID NR.: 38, SECV ID NR.: 42 şi ADN care codifică SECV ID NR.: 43; 49 11 RO 123431 Β1 (b) toxina menţionată imunoreacţionează cu un anticorp la o toxină de aproximativ 40-50 kDa, sau un fragment al acesteia, dintr-un izolat de Bacillus thuringiensis selectat din grupul care constă în PS80JJ1 având caracteristicile de identificare ale NRRL B-18679, PS149B1 având caracteristicile de identificare ale NRRL B-21553 şi PS167H2 având caracteristicile de identificare ale NRRL B-21554; (c) toxina menţionată este codificată de o secvenţă de nucleotide în care o porţiune a secvenţei de nucleotide menţionată poate fi amplificată prin PCR folosind o pereche de primeri selectată din grupul care constă din SECV ID NR.-20 şi 24 pentru a produce un fragment de aproximativ 495 bp, SECV ID NR.: 20 şi 25 pentru a produce un fragment de aproximativ 594 bp, SECV ID NR.: 21 şi 24 pentru a produce un fragment de aproximativ 471 bp şi SECV ID Nr.: 21 şi 25 pentru a produce un fragment de aproximativ 580 bp; (d) toxina menţionată cuprinde o porţiune cu activitate pesticidă a secvenţei de aminoacizi prezentată în SECV ID NR.: 28; (e) toxina menţionată cuprinde o secvenţă de aminoacizi care are cel puţin aproximativ 60% omologie cu o porţiune cu activitate pesticidă a unei secvenţe de aminoacizi selectată din grupul care constă din SECV ID NR.: 11, SECV ÎD NR.: 13, SECV ID NR.: 15, SECV ID NR.: 38 şi SECV ID NR.: 43; (f) toxina respectivă este codificată de o secvenţă de nucleotide care hibridizează în condiţii stringente cu o secvenţă de nucleotide selectată din grupul care constă din ADN care codifică SECV ID NR.: 3, AND care codifică SECV ID NR.: 5, ADN care codifică SECV ID NR.: 7, ADN care codifică SECV ID NR.-32, ADN care codifică SECV ID NR.: 36 şi ADN care codifică SECV ID NR.: 41; (g) toxina respectivă reacţionează imunonologic cu un anticorp anti toxină cu activitate pesticidă de aproximativ 10-15 kDa sau un fragment al acesteia, de la un izolat de Bacillus thuringiensis selectat din grupul care constă din PS80JJ1 având caracteristicile de identificare ale NRRL B-18679, PS149B1 având caracteristicile de identificare ale NRRL B-21553 şi PS167H2 având caracteristicile de identificare ale NRRL B21554; (h) toxina respectivă este codificată de o secvenţă de nucleotide în care o porţiune a secvenţei de nucleotide menţionată poate fi amplificată prin PCR folosind perechea de primeri a SECV ID NR.: 29 şi SECV ID KR: 33; şi (i) toxina menţionată cuprinde o secvenţă de aminoacizi care are cel puţin 60% omologie cu o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul care constă din SECV ID NR.: 3, SECV ID NR.: 5, SECV ID NR.: 7, porţiuni cu activitate pesticidă ale SECV ID NR.: 32, porţiuni cu activitate pesticidă ale SECV ID NR.: 36 şi porţiuni cu activitate pesticidă ale SECV ID NR.: 41.

Modificarea genelor şi toxinelor

Toxinele şi genele utile conform prezentei invenţii include, nu numai secvenţele de lungime totală specific exemplificate, ci şi porţiuni şi/sau fragmente (inclusiv deleţii interne şi/sau terminale în comparaţie cu moleculele cu lungime totală) ale acestor secvenţe/ variante/mutanţi/himere şi fuziuni ale acestora. Proteinele din prezenta invenţie pot avea aminoacizi substituiţi atâta timp cât păstrează activitatea pesticidă caracteristică proteinelor exemplificate specific aici. Genele "variante" au secvenţe de nucleotide care codifică aceleaşi toxine sau care codifică toxine care au activitate pesticidă echivalentă unei proteine exemplificată. Aşa cum este utilizat aici, termenul "toxine echivalente" se referă la toxine care au aceeaşi sau esenţial aceeaşi activitate biologică împotriva de dăunătorii vizaţi ca şi toxinele exemplificate. Aşa cum este utilizat aici, referirea la "esenţial aceeaşi" secvenţă se face la secvenţe care au substituţii de aminoacizi, deleţii/adiţii sau inserţii care nu afectează material activitatea pesticidă. Fragmentele care păstrează activitatea pesticidă sunt, de asemenea, incluse în această definiţie. Fragmentele şi echivalentele care păstrează activitatea pesticidă a toxinelor exemplificate vor fi în întinderea prezentei invenţii. 12 1 RO 123431 Β1

Toxinele echivalente şi/sau genele care codifică aceste toxine-echivalente pot fi derivate din izolate de tip spontan sau recombinate şi/sau din alte organisme de tip spontan sau recombinate folosind învăţături furnizate aici. Alte specii de Bacillus, de exemplu, pot fi utilizate drept izolate sursă.

Variaţiile de gene pot fi uşor construite folosind tehnici standard, pentru a face de exemplu mutaţii punctiforme. De asemenea, brevetul US 5605793 de exemplu, descrie metode pentru obţinerea unei diversităţi moleculare suplimentară prin folosirea adunării ADN după fragmentare aleatoare. Genele variante pot fi utilizate pentru producerea de proteine variante; gazdele recombinate pot fi folosite pentru a produce proteine variante. Fragmentele de gene cu lungime totală pot fi realizate utilizând exonucleaze sau endonucleaze disponibile comercial, conform procedurilor standard. De exemplu, enzimele cum ar fi Bal31 sau poate fi folosită mutageneză direcţionată pe situs pentru a decupa nucleotide de la capetele acestor gene. De asemenea, genele care codifică fragmente active pot fi obţinute folosind o diversitate de enzime de restricţie. Proteazele pot fi folosite pentru a obţine direct fragmente active ale acestor toxine.

Există un număr de metode pentru obţinerea toxinelor cu activitate pesticidă ale prezentei invenţii. De exemplu, anticorpii anti toxinelor cu activitate pesticidă descrise şi revendicate aici pot fi folosiţi pentru a identifica şi izola alte toxine dintr-un amestec de proteine, în mod specific, anticorpii pot fi crescuţi la porţiunile toxinelor care sunt cel mai constante şi distincte din alte toxine B.t. Aceşti anticorpi pot fi apoi folosiţi pentru a identifica, în mod specific, toxine echivalente cu activitate caracteristică prin imunoprecipitare, test cu anticorpi adsorbiţi legaţi de enzime (ELISA) sau Western blotting. Anticorpii anti toxinelor dezvăluite aici, sau ai toxinelor echivalente, sau ale fragmentelor acestor toxine, pot fi preparaţi uşor folosind proceduri standard. Genele care codifică aceste toxine pot fi apoi obţinute din microorganismul sursă.

Datorită redundanţei codului genetic, o varietate de secvenţe ADN diferite pot codifica secvenţele de aminoacizi prezentate aici. Un specialist din domeniu poate crea aceste secvenţe ADN alternative care codifică aceleaşi, sau esenţial aceleaşi toxine. Aceste secvenţe ADN variante sunt în întinderea prezentei invenţii.

Anumite toxine ale prezentei invenţii au fost exemplificate în mod specific aici. Deoarece aceste toxine sunt doar exemple ale toxinelor prezentei invenţii, ar trebui să fie evident faptul că prezenta invenţie cuprinde toxine variante sau echivalente (şi secvenţe de nucleotide care codifică toxinele echivalente) care au aceeaşi activitate pesticidă sau activitate pesticidă similară cu toxina exemplificată. Toxinele echivalente vor avea similaritate de aminoacizi (şi/sau omologie) cu o toxină exemplificată. Identitatea de aminoacizi va fi în mod obişnuit mai mare de 60%, de preferinţă mai mare de 75%, şi mai preferat mai mare de 80%, chiar şi mai preferat mai mare de 90%, şi poate fi mai mare de 95%. Polinucleotidele şi proteinele preferate ale prezentei invenţii pot fi, de asemenea, definite în termeni de identitate mai specifică şi/sau domenii de similaritate. De exemplu, identitatea şi/sau similaritatea pot fi 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 sau 99% comparativ cu o secvenţă exemplificată aici. Dacă nu se specifică altfel, aşa cum este utilizat aici, procentul de identitate a secvenţei şi/sau similaritatea a doi acizi nucleici este determinat folosind algoritmul lui Karlin şi Altschul (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, modificat ca în Karlin şi Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877. Un asemenea algoritm este încorporat în programele NBIAST şi XBLAST ale lui Altschul şi col. (1990), J. Mol. Biol. 215: 402-410. 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 13 47 RO 123431 Β1 Căutările de nucleotide BLAST sunt realizate cu programul NBLAST, scor=100, lungime cuvânt=12, pentru a obţine secvenţe de nucleotide cu procentul de identitate dorit. Pentru a obţine alinieri întrerupte în scopuri comparative, se foloseşte Gapped BLAST aşa cum-este descris în Altschul şi col. (1997) Nuci. Acids Res. 25: 3389-3402. Atunci când se utilizează programele BLAST şi Gapped Blast, sunt folosiţi parametrii impliciţi ai programelor respective (NBLAST şi XBLAST). A se vedea http: //www.ncbi.nih.gov. Scorurile pot fi de asemenea calculate folosind metodele şi algoritmii lui Crickmore şi col. aşa cum este descris mai sus.

Omologia aminoacizilor va fi cea mai ridicată în regiunile critice ale toxine care contează pentru activitatea biologică sau sunt implicate în determinarea configuraţiei tridimensionale care, în ultimă instanţă, este răspunzătoare pentru activitatea biologică. în această privinţă, sunt acceptabile anumite substituţii de aminoacizi şi pot fi de aşteptat dacă aceste substituţii sunt în regiuni care nu sunt critice pentru activitatea sau sunt substituţii conservatoare de aminoacizi care nu afectează configuraţia tri-dimensională a moleculei. De exemplu, aminoacizii pot fi plasaţi în clasele următoare: non-polari, neîncărcaţi polar, bazici şi acizi. Substituţiile conservatoare atunci când un aminoacid dintr-o clasă este înlocuit cu alt aminoacid de acelaşi tip sunt în întinderea prezentei invenţii atâta timp cât substituţia nu modifică material activitatea biologică a compusului. Tabelul 2 prezintă o listă de exemple de aminoacizi care aparţin fiecărei clase.

Tabelul 2

Clasa de aminoacid Exemple de aminoacizi Non-polari Ala, Val, Leu, lle, Pro, Met, pHe, Trp Neîncărcaţi polar Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gin Acizi Asp, Glu Bazici Lys, Arg, His

In anumite exemple, se pot face de asemenea substituţii neconservatoare. Factorul critic este acela că aceste substituţii nu trebuie să devieze semnificativ de la activitatea biologică a toxinei. Aşa cum este folosit aici, referirea la polinucleotide "izolate" şi/sau toxine "purificate" se referă la acele molecule atunci când ele nu sunt asociate cu alte molecule cu care ele ar fi găsite în natură; aceşti termeni vor include utilizarea lor în plante, astfel, referirea la "izolate" şi/sau purificate semnifică implicarea mâinii omeneşti, aşa cum s-a descris aici.

Genele sintetice care sunt funcţionale echivalent cu toxinele prezentei invenţii pot fi de asemenea utilizate pentru a transforma gazdele. Metodele pentru producerea de gene sintetice pot fi găsite, de exemplu, în brevetul US 5380831.

Gazde transgenice

Genele care codifică toxinele prezentei invenţii pot fi introduse într-o largă varietate de gazde microbiene sau vegetale. în alcătuirile preferate, expresia genei toxinei are ca urmare direct sau indirect, producerea intracelulară şi menţinerea proteinelor cu activitate pesticidă. Atunci când celulele gazdă transgenice/recombinate/transformate sunt ingerate de dăunători, dăunătorii vor ingera toxina. Acesta este modul preferat în care se realizează contactul dintre dăunător şi toxină. Rezultatul este un control (uciderea sau îmbolnăvirea) dăunătorului. Alternativ, pot fi aplicate zonei dăunătorilor, unde unele pot prolifera şi sunt ingerate de dăunătorii vizaţi, gazde microbiene adecvate, de exemplu Pseudomonas cum ar fi P.Fluorescens. Microbul care găzduieşte gena toxinei poate fi tratat în condiţii care prelungesc activitatea toxinei şi stabilizează celula. Celula tratată, care păstrează activitatea toxică, poate fi apoi aplicată mediului dăunătorului vizat. 14 RO 123431 Β1 în variante preferate, sunt utilizate plante şi celule recombinate de plante. Plantele 1 preferate (şi celulele de plante) sunt cerealele şi/sau porumbul.

Acolo unde gena toxinei de B.t. este introdusă într-o gazdă microbiană prin 3 intermediul unui vector adecvat, şi gazda menţionată este aplicată mediului într-o stare in vivo, trebuie utilizaţi anumiţi microbi gazdă. Gazdele microorganisme care sunt selectate sunt 5 cunoscute ca ocupând "fitosfera" (filoplanul, filosfera, rizosfera şi/sau-rizoplanul) uneia sau mai multora culturi de interes. Aceste microorganisme sunt selectate astfel încât să fie 7 capabile să concureze cu succes în mediul particular (cultură şi alte habitaturi ale insectelor) cu microorganismele de tip spontan, să asigure menţinerea stabilă şi expresia genei care 9 exprimă pesticidul polipeptidic şi este de dorit, să asigure protecţie îmbunătăţită a pesticidului faţă de degradarea şi inactivarea mediului. 11

Este cunoscut un număr mare de microorganisme care trăiesc în filoplan (suprafaţa frunzei plantelor) şi/sau rizosferă (solul care înconjoară rădăcinile plantelor) a unei mari 13 varietăţi de culturi importante. Aceste microorganisme includ bacterii, alge şi ciuperci. De un interes particular sunt microorganismele cum ar fi bacteriile, de exemplu genurile 15

Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, 17 Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc şi Alcaligenes; ciuperci, în particular drojdii, de exemplu genurile Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, 19

Rhodotorula şi Aureobasidium. De interes particular sunt acele specii de bacterii din fitosferă cum ar fi Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, 21 Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus şi Azotdbacter vinlandii; 23 şi specii de drojdii din fitosferă cum ar fi Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. 25 pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae şi Aureobasidium pollulans. De interes particular sunt microorganismele pigmentate. 27 O largă varietate de căi sunt disponibile pentru introducerea linei gene B.t. care codifică o toxină, în gazda vizată, în condiţii care permit o menţinere stabilă şi expresia 29 genei. Aceste metode sunt binecunoscute specialiştilor din domeniu şi sunt descrise, de exemplu, în brevetul US 5135867, care este încorporat aici prin referinţă. 31

Tratarea celulelor Aşa cum s-a menţionat mai sus, celulele B.t. sau recombinate care exprimă o toxină 33 B.t. pot fi tratate pentru a prelungi activitatea toxinei şi pentru a stabiliza celula. Microcapsula de pesticid care se formează cuprinde toxina B.t. într-o structură celulară care a fost 35 stabilizată şi va proteja toxina atunci când microcapsula este aplicată mediului dăunătorului vizat. Celulele gazdă adecvate includ atât procariote cât şi eucariote, fiind limitate în mod 37 normal la acele celule care nu produc substanţe toxice organismelor superioare, cum ar fi mamiferele. Totuşi, organismele care produc substanţe toxice pentru organismele superioare 39 pot fi folosite, acolo unde substanţele toxice sunt instabile sau nivelul de aplicare suficient de redus astfel încât să se evite posibilitatea de toxicitate pentru o gazdă mamifer. Drept 41 gazde de interes, în particular vor fi procariotele şi eucariotele inferioare, cum ar fi ciupercile.

Celulele vor fi, în mod obişnuit, intacte şi vor fi substanţial în formă proliferativă atunci 43 când vor fi tratate, doar în formă de spori, deşi doar în anumite situaţii pot fi utilizaţi sporii.

Tratarea celulei microbiene, de exemplu un microb care conţine gena toxinei B.t. 45 poate fi făcută prin mijloace chimice sau fizice, sau printr-o combinaţie de mijloace fizice şi/sau chimice, atâta timp cât tehnica nu afectează negativ proprietăţile toxinei, nici nu 47 diminuează capacitatea celulară de protecţie a toxinei. Exemple de reactanţi chimici sunt 15 RO 123431 Β1 agenţii de halogenare, în particular halogenii cu număr atomic 17-80. Mai particular, poate fi folosit iod în condiţii slabe şi suficient timp pentru a realiza rezultatele dorite. Alte tehnici adecvate includ tratamentul cu aldehide, cum ar fi glutaraldehida; anti-infecţioase cum ar fi clorură de zefiran şi clorură de cetilpiridin; alcooli, cum ar fi izopropil şi etanol; diverşi fixativi histologici, cum ar fi iod Lugol, fixativ Bouin, diverşi acizi şi fixativ Helly (a se vedea Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W.H. Freeman şi campania, 1967); sau o combinaţie de agenţi fizici (căldura) şi chimici care păstrează şi prelungesc activitatea toxinei produsă în celulă atunci când celula este administrată mediului gazdă. Exemplu de mijloace fizice sunt radiaţia cu lungime de undă joasă, cum ar fi radiaţia gamma şi radiaţia X, îngheţarea, iradierea cu UV, liofilizarea şi altele asemănătoare. Metodele pentru tratarea celulelor microbiene sunt prezentate în brevetele US 4695455 şi 4695462, care sunt încorporate aici prin referinţă.

Celulele vor avea, în general, stabilitate structurală îmbunătăţită ceea ce va îmbunătăţi rezistenţa la condiţii de mediu. Acolo unde pesticidul este într-o formă prematură, metoda de tratare a celulei trebuie selectată astfel încât să nu inhibe procesarea formei premature către forma matură a pesticidului prin patogenul dăunătorului vizat. De exemplu, formaldehida va lega proteine şi ar putea inhiba procesarea formei premature a unui pesticid polipeptidic. Metoda de tratament trebuie să reţină cel puţin o porţiune substanţială din bio-disponibilitatea sau bio-activitatea toxinei.

Caracteristicile de interes particular în selectarea unei celule gazdă în scopul producţiei, includ uşurinţa introducerii genei B.t. în gazdă, disponibilitatea sistemelor de expresie, eficacitatea expresiei, stabilitatea pesticidului în gazdă şi prezenţa capacităţilor genetice auxiliare. Caracteristicile de interes pentru utilizarea ca microcapsulă de pesticid includ calităţi protectoare pentru pesticid, cum ar fi pereţi celulari groşi, pigmentare şi împachetare intracelulară sau formarea de corpuri de incluziune; supravieţuirea în medii apoase; lipsa toxicităţii faţă de mamifere; să fie atractive pentru dăunători în scopul ingestiei; uşurinţa de a ucide şi fixare fără deteriorarea toxinei; şi altele asemănătoare. Alte consideraţii includ uşurinţa formulării şi manipulării, considerente economice, stabilitate de stocare şi altele asemănătoare.

Creşterea celulelor

Gazda celulară care conţine gena insecticid B.t. poate fi crescută în orice mediu nutritiv convenabil, de preferinţă acolo unde construcţia ADN asigură un avantaj selectiv, asigurând un mediu selectiv astfel încât substanţial toate sau chiat toate celulele păstreze gena B.t.. Aceste celule pot fi apoi recoltate în conformitate cu modurile convenţionale. în mod alternativ, celulele pot fi tratate anterior recoltării.

Celulele B.t. ale invenţiei pot fi cultivate folosind medii şi tehnici de fermentare standard în domeniu. La completarea ciclului de fermentare, bacteriile pot fi recoltate, separând mai întâi sporii B.t. şi cristalele din bulionul de fermentare prin mijloace binecunoscute în domeniu. Sporii B.t. recuperaţi şi cristalele pot fi formulate într-o pudră care prezintă capacitate de umezire, concentrat lichid, granule sau alte formulări prin adăugarea de surfactanţi, dispersanţi, purtători inerţi şi alte componente pentru a facilita manipularea şi aplicarea pentru dăunători vizaţi particulari. Aceste formulări şi proceduri de aplicare sunt binecunoscute în domeniu.

Formulări. Granulele formulate sub formă de momeală care conţin un element care le face atractive şi spori şi cristale de izolate B.t., sau microbi recombinaţi care cuprind genele ce pot fi obţinute din izolate B.t. dezvăluite aici, pot fi aplicate pe sol. Produsul formulat poate fi, de asemenea, aplicat sub formă de înveliş al seminţei sau tratament al rădăcinilor sau tratament total al plantei în stadii târzii ale ciclului de cultură. Tratamentele plantei şi ale solului cu celule B.t. pot fi utilizate ca pudre cu capacitate de umezire, granule 16 RO 123431 Β1 sau prafuri, prin amestecarea cu diverse materiale inerte, cum ar fi minerale anorganice 1 (filosilicaţi, carbonaţi, sulfaţi, fosfaţi şi altele asemănătoare) sau materiale botanice (coceni măcinaţi, coji de orez, coji de nucă, şi altele asemănătoare). Formulările pot include adjuvanţi 3 de împrăştiere şi aderenţă, agenţi de stabilizare alţi aditivi cu activitate pesticidă, sau surfactanţi. Formulările lichide pot fi apoase sau neapoase şi utilizate ca spume, geluri, 5 suspensii, concentrate emulsifiabile sau-altele asemănătoare. Ingredientele pot include agenţi reologici, surfactanţi, emulsifianţi, dispersanţi sau polimeri. 7 Aşa cum va fi apreciat de către un specialist în domeniu, concentraţia cu activitate pesticidă va putea varia larg în funcţie de natura specifică a formulării, în particular dacă este 9 un concentrat sau dacă se va utiliza direct. Pesticidul va fi prezent în cel puţin 1 % în greutate şi poate fi de 100% în greutate. Formulările uscate vor avea aproximativ 1-95% în greutate 11 din pesticid în timp ce formulările lichide vor fi în general de aproximativ 1-60% în greutate din solide în fază lichidă. Formulările vor avea, în general, de la aproximativ 102 până la 13 aproximativ 104 celule/mg. Aceste formulări vor fi administrate aproximativ 50 mg (lichid sau uscat) până la 1 kg sau mai mult la hectar. 15

Formulările pot fi aplicate mediului dăunătorului, de exemplu sol sau frunze, prin pulverizare, prăfuire, stropire sau altele asemănătoare. 17

Mutanţi

Mutanţii izolatelor invenţiei pot fi realizaţi prin proceduri binecunoscute în domeniu. 19 De exemplu, un mutant nesporogen poate fi obţinut prin mutageneză cu etilmetan sulfonat (EMS) a unui izolat. Mutanţii pot fi realizaţi folosind lumină utltravioletă şi nitrozoguanidină 21 prin proceduri binecunoscute în domeniu.

Un mic procent din mutanţii nesporogeni vor rămâne intacţi şi nu vor liza pe perioade 23 extinse de fermentaţie; aceste tulpini sunt desemnate liză minus (-). Tulpinile liză minus pot fi identificate prin sortarea mutanţilor nesporogeni în medii în recipiente agitate şi selectarea 25 acelor mutanţi care sunt încă intacţi şi conţin cristalele de toxină la sfârşitul fermentaţiei. Tulpinile liză minus sunt adecvate pentru un proces de tratare a celulelor care va produce 27 o proteină de toxină, încapsulată, protejată.

Pentru a prepara o variantă rezistentă a fagului mutantului nesporogen menţionat, 29 o parte alicotă a lizatului fagului este împrăştiată pe agar nutritiv şi este lăsat să se usuce. O alicotă a tulpinei bacteriene-sensibilă a fagului este apoi pusă direct peste lizatul uscat şi 31 este lăsată să se usuce. Plăcile sunt incubate la 30°C. Plăcile sunt incubate timp de 2 zile şi, în acel moment, pe agar pot fi văzute crescând numeroase colonii. Unele dintre aceste 33 colonii sunt adunate şi subcultivate pe plăci de agar nutritiv. Aceste culturi aparent rezistente sunt testate la rezistenţă prin încrucişare cu lizatul de fag. O linie a lizatului fagului este 35 întinsă pe placă şi lăsată să se usuce. Culturile prezumtiv rezistente sunt întinse apoi încrucişat peste linia de fag. Culturile bacteriene rezistente nu vor prezenta liză nicăieri în 37 linia încrucişată cu linia de fag după incubarea peste noapte la 30°C. Rezistenţa la fag este apoi reconfirmată prin placarea unui strat de cultură rezistentă pe o placă de agar nutritiv. 39 Tulpina sensibilă este, de asemenea, placată în acelaşi mod, pentru a servi drept control pozitiv. După uscare, o picătură din lizatul de fag este plasată în centrul plăcii şi lăsată să 41 se usuce. Culturile rezistente nu au prezentat liză în zona unde lizatul de fag a fost plasat, după incubarea la 30°C timp de 24 h. 43 în continuare, se prezintă 28 de exemple de realizare a invenţiei, în legătură cu figurile şi secvenţele care reprezintă: 45

Fig. 1 arată trei exemple de toxine cu activitate pesticidă, de 43-47 kDa cât şi o secvenţă de consens pentru aceste toxine cu activitate pesticidă. 47

Fig. 2 arată relaţiile dintre secvenţele de 14 şi 45 kDa ale PS80JJ1 (SECV ID NR.: 31 şi 10). 49 17 RO 123431 Β1

Fig. 3 arată o comparaţie a valorilor LC50 pentru studiul de amestec din exemplul 23.

Fig. 4 arată alinierile proteinelor ale toxinelor şi genelor de Bacillus sphaericus de 51 şi 42 kDa şi genele şi gena şi toxina 149B1 de 45 kDa.

Fig. 5 arată alinierile secvenţei de nucleotide a toxinelor şi genelor de Bacillus sphaericus de 51 şi 42 kDa şi toxina şi gena 149B1 de 45 kDa. SECV ID NR.: 1 este o secvenţă N-terminală de 5 aminoacizi a toxinei de 80JJ1 de aproximativ 45 kDa. SECV ID NR.: 2 este o secvenţă N-terminală de 25 aminoacizi a toxinei de 80JJ1 de aproximativ 45 kDa. SECV ID NR.: 3 este o secvenţă N-terminală de 24 aminoacizi a toxinei de 80JJ1 de aproximativ 14 kDa. SECV ID NR.: 4 este o secvenţă N-terminală a toxinei de 149B1 de aproximativ 47 kDa. SECV ID NR.: 5 este o secvenţă de aminoacizi N-terminală având 50 aminoacizi pentru proteina purificată de aproximativ 14 kDa din PS149B1. SECV ID NR.: 6 este o secvenţă N-terminală a toxinei din 167H2 de aproximativ 47 kDa. SECV ID NR.: 7 este o secvenţă N-terminală de 25 aminoacizi pentru proteina purificată clin PS167H2 de aproxiinativ 14 kDa. SECV ID NR.: 8 este o probă de oligonucleotidă pentru gena care codifică toxina PS80JJ1 de 44.3 kDa şi este un primer cap-coadă pentru PS149B1 şi PS167H2 folosit conform prezentei invenţii. SECV ID NR.: 9 este un primer coadă-cap pentru PS149B1 şi PS167H2 folosit conform prezentei invenţii. SECV ID NR.: 10 este secvenţa de nucleotide a genei care codifică toxina PS80JJ1 de aproximativ 45 kDa. SECV ID NR.: 11 este secvenţa de aminoacizi pentru toxina PS80JJ1 de aproxiinativ 45 kDa. SECV ID NR.: 12 este secvenţa parţială de nucleotide a genei care codifică toxina PS149E1 de aproxiinativ 44 kDa. SECV ID NR.: 13 este secvenţa parţială de aminoacizi pentru toxina PS149B1 de aproximativ 44 kDa. SECV ID NR.: 14 este secvenţa parţială de nucleotide a genei care codifică toxina PS167H2 de aproximativ 44 kDa. SECV ID NR.: 15 este secvenţa parţială de aminoacizi pentru toxina PS167H2 de aproxiinativ 44 kDa. SECV ID NR.: 16 este o secvenţă de peptide utilizată în configuraţie de primer conform prezentei invenţii. SECV ID NR.: 17 este o secvenţă de peptide utilizată în configuraţie de primer conform prezentei invenţii. SECV ID NR.: 18 este o secvenţă de peptide utilizată în configuraţie de primer conform prezentei invenţii. SECV ID NR.: 19 este o secvenţă de peptide utilizată în configuraţie de primer conform prezentei invenţii. SECV ID NR.: 20 este o secvenţă de nucleotide care corespunde peptidei din SECV ID NR.: 16. SECV ID NR.: 21 este o secvenţă de nucleotide care corespunde peptidei din SECV ID NR.: 17. 18 RO 123431 Β1 SECVID NR.: 22 este o secvenţă de nucleotide care corespunde-peptidei din SECV 1 ID NR.: 18. SECV ID NR.: 23 este o secvenţă de nucleotide care corespunde peptidei din SECV 3 ID NR.: 19. SECV ID NR.: 24 este un primer coadă-cap bazat pe complementul invers dinSECV 5 ID NR.: 22 SECV ID NR.: 25 este un primer coadă-cap bazat pe complementul invers din SECV 7 ID NR.: 23. SECV ID NR.: 26 este un primer cap-coadă bazat pe toxina PS80JJ1 de 44.3 kDa. 9 SECV ID NR.: 27 este un primer coadă-cap bazat pe toxina PS80JJ1 de 44.3 kDa. SECV ID NR.: 28 este o secvenţă generică care reprezintă o nouă clasă de toxine 11 conform prezentei invenţii. SECVID NR.: 29 este o probă de oligonucleotidă utilizată conform prezentei invenţii. 13 SECV ID NR.: 30 este secvenţa de nucleotide a întregului loc genetic care conţine cadre de citire deschise ale ambelor toxine PS80JJ1 de 14 şi 45 kDa şi secvenţele de 15 nucleotide de flancare. SECV ID NR.: 31 este secvenţa de nucleotide a cadrului de citire deschis a toxinei 17 PS80JJ1 de 14 kDa. SECV ID NR.: 32 este secvenţa de aminoacizi dedusă a toxinei PS80JJ1 de 14 kDa. 19 SECVID NR.: 33 este un primer coadă-cap oligonucleotidă utilizat conform prezentei invenţii. 21 SECV ID NR.: 34 este secvenţa de nucleotide a întregului locus genetic care conţine cadre de citire deschise ale ambelor toxine PS167H2 de 14 şi 44 kDa şi secvenţele de 23 nucleotide de flancare. SECV ID NR.: 35 este secvenţa de nucleotide a genei care codifică toxina PS167H2 25 de aproximativ 14 kDa. SECV ID NR.: 36 este secvenţa de aminoacizi pentru toxina PS167H2 de aproximativ 27 14 kDa. SECV ID NR.: 37 este secvenţa de nucleotide a genei care codifică-toxina PS167H2 29 de aproximativ 44 kDa. SECV ID NR.: 38 este secvenţa de nucleotide pentru toxina PS167H2 de aproximativ 31 44 kDa. SECV ID NR.: 39 este secvenţa de nucleotide a întregului locus genetic care conţine 33 cadre de citire deschise ale ambelor toxine PS149B1 de 14 şi 44 kDa şi secvenţele de nucleotide de flancare. 35 SECV ID NR.: 40 este secvenţa de nucleotide a genei care codifică toxina PS149B1 de aproximativ 14 kDa. 37 SECV ID NR.: 41 este secvenţa de aminoacizi pentru toxina PS149B1 de aproximativ 14 kDa. 39 SECV ID NR.: 42 este secvenţa de nucleotide a genei care codifică toxina PS149B1 de aproximativ 44 kDa. 41 SECV ID NR.: 43 este secvenţa de aminoacizi pentru toxina PS149B1 de aproximativ 44 kDa. 43 SECV ID NR.: 44 este o secvenţă de genă optimizată pentru porumb care codifică toxina de aproximativ 14 kDa a 80JJ1. 45 SECV ID NR.: 45 este o secvenţă de genă optimizată pentru porumb care codifică toxina de aproximativ 44 kDa a 80JJ1. 47 SECV ID NR.: 46 este secvenţa de ADN a unui primer coadă-cap utilizat în exemplul 15 de mai jos. 49 19 RO 123431 Β1 SECVID NR.: 47 este secvenţa de ADN a unui primer cap-coadă (vezi exemplul 16). SECV ID NR.: 48 este secvenţa de ADN a unui primer coadă-cap (vezi exemplul 16). SECV ID NR.: 49 este secvenţa de ADN a unui primer cap-coadă (vezi exemplul 16). SECV ID NR.: 50 este secvenţa de ADN a unui primer coadă-cap (vezi exemplul 16). SECVID NR.: 51 este secvenţa ADN din PS131W2 care codifică proteina de 14kDa. SECV ID NR.: 52 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS131W2. SECV ID NR.: 53 este o secvenţă parţială de ACN din PS131W2 pentru proteina de 44 kDa. SECV ID NR.: 54 este o secvenţă parţială de aminoacizi pentru proteina de 44 kDa a PS131W2. SECV ID NR.: 55 este secvenţa de ADN din PS158T3 care codifică proteina de 14 kDa. SECV ID NR.: 56 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS158T3. SECV ID NR.: 57 este o secvenţă parţială de ADN din PS158T3 pentru proteina de 44 kDa. SECV ID NR.: 58 este o secvenţă parţială de aminoacizi pentru proteina de 44 kDa a PS158T3. SECV ID NR.: 59 este secvenţa de ADN din PS158X10 care codifică proteina de 14 kDa. SECV ID NR.: 60 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS158X10. SECV ID NR.: 61 este secvenţa de ACN din PS185FF care codifică proteina de 14 kDa. SECV ID NR.: 62 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS185FF. SECV ID NR.: 63 este o secvenţă parţială de ADN din PS185FF pentru proteina de 44 kDa. SECV ID NR.: 64 este o secvenţă parţială de aminoacizi pentru proteina de 44 kDa a PS185FF. SECV ID NR.: 65 este secvenţa de ADN din PS185GG care codifică proteina de 14 kDa. SECV ID NR.: 66 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 KDa a PS185GG. SECV ID NR.: 67 este secvenţa de ADN din PS185GG pentru proteina de 44 kDa. SECV ID NR.: 68 este secvenţa de aminoacizi pentru proteina de 44 kDa a PS185GG. SECV ID NR.: 69 este secvenţa de ADN din PS185L12 care codifică proteina de 14 kDa. SECV ID NR.: 70 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS185L12. SECV ID NR.: 71 este secvenţa de AEN din PS185W3 care codifică proteina de 14 kDa. SECV ID NR.: 72 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS185W3. SECV ID NR.: 73 este secvenţa de A32J din PS186FF care codifică proteina de 14 kDa. SECV ID NR.: 74 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS186FF. SECV ID NR.: 75 este secvenţa de MW din PS187F3 care codifică proteina de 14 kDa. SECV ID NR.: 76 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS187F3. SECV ID NR.: 77 este o secvenţă parţială de ADN din PS187F3 pentru proteina de 44 kDa. SECV ID NR.: 78 este o secvenţă parţială de aminoacizi pentru proteina de 44 kDa a PS187F3. 20 RO 123431 Β1 SECV ID NR.: 79 este secvenţa de MN din PS187G1 care codifică proteina de 1 14 kDa. SECV ID NR.: 80 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS187G1. 3 SECV ID NR.: 81 este o secvenţă parţială de ADN din PS187G1 pentru proteina de 44 kDa. 5 SECV ID NR.: 82 este o secvenţă parţială de aminoacizi pentru proteina de 44 kDa a PS187G1. 7 SECV ID NR.: 83 este secvenţa de ADN din PS187L14 care codifică proteina de 14 kDa. 9 SECV ID NR.: 84 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS187L14. SECV ID NR.: 85 este o secvenţă parţială de ADN din PS187L14 pentru proteina de 11 44 kDa. SECV ID NR.: 86 este o secvenţă parţială de aminoacizi pentru proteina de 44 kDa 13 a PSI87L14. SECV ID NR.: 87 este secvenţa de ADN din PS187Y2 care codifică proteina de 15 14 kDa. SECV ID NR.: 88 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS187Y2. 17 SECV ID NR.: 89 este o secvenţă parţială de ADM din PS187Y2 pentru proteina de 44 kDa. 19 SECV ID NR.: 90 este o secvenţă parţială de ADN pentru proteina de 44 kDa a PS187Y2. 21 SECV ID NR.: 91 este secvenţa de ADN din PS201G care codifică proteina de 14 kDa. 23 SECV ID NR.: 92 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS201G. SECVID NR.: 93 este secvenţa ADN din PS201HH care codifică proteina de 14 kDa. 25 SECV ID NR.: 94 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS201HH. SECV ID NR.: 95 este secvenţa de ADN din PS201L3 care codifică proteina de 27 14 kDa. SECV ID NR.: 96 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS201L3. 29 SECV ID NR.: 97 este secvenţa de ADN din PS204C3 care codifică proteina de 14 kDa. 31 SECV ID NR.: 98 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS204C3. SECV ID NR.: 99 este secvenţa de ADN din PS204G4 care codifică proteina de 14 33 kDa. SECV ID NR.: 100 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS204G4. 35 SECV ID NR.: 101 este secvenţa de ADN din PS204I11 care codifică proteina de 14 kDa. 37 SECV ID NR.: 102 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS204I11. SECV ID NR.: 103 este secvenţa de ADN din PS204J7 care codifică proteina de 39 14 kDa. SECV ID NR.: 104 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS204J7. 41 SECV ID NR.: 105 este secvenţa de SDN din PS236B6 care codifică proteina de 14 kDa. 43 SECV ID NR.: 106 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS236B6. SECV ID NR.: 107 este secvenţa de MW din PS242K10 care codifică proteina de 45 14 kDa. SECV ID NR.: 108 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS242KL0. 47 SECV ID NR.: 109 este o secvenţă parţială de ADN din PS242K10 pentru proteina de 44 kDa. 49 21 RO 123431 Β1 SECVID NR.: 110 este o secvenţă parţială de aminoacizi pentru proteina de 44 kDa a PS242K10. SECV ID NR.: 111 este secvenţa de ADN din PS246P42 care codifică proteina de 14 kDa. SECV ID NR.: 112 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS246P42. SECV ID NR.: 113 este secvenţa de AEN din PS69Q care codifica proteina de 14 kDa. SECV ID NR.: 114 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS69Q. SECV ID NR.: 115 este secvenţa de ADN din PS69Q pentru proteina de 44 kDa. SECV ID NR.: 116 este secvenţa de aminoacizi pentru proteina de 44 kDa a PS69Q. SECV ID NR.: 117 este secvenţa de ADN pentru KB54 care codifică proteina de 14 kDa. SECV ID NR.: 118 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a KB54. SECV ID NR.: 119 este secvenţa de AEN din KR1209 care codifică proteina de 14 kDa. SECV ID NR.: 120 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a KR1209. SECV ID NR.: 121 este secvenţa de ADN din KR1369 care codifică proteina de 14 kDa. SECV ID NR.: 122 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a KR1369. SECV ID NR.: 123 este secvenţa de ADN din KR589 care codifică proteina de 14 kDa. SECV ID NR.: 124 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a KR589. SECV ID NR.: 125 este o secvenţă parţială de ADN din KR589 pentru proteina de 44 kDa. SECV ID NR.: 126 este o secvenţă parţială de aminoacizi pentru proteina de 44 kDa a KR589. SECV ID NR.: 127 este o secvenţă de polinucleotide pentru o genă desemnată 149B1-15-P0, care este optimizată pentru expresia în Zea mays. Această genă codifică o toxină de aproximativ 15 kDa ce poate fi obţinută din PS149B1 care este dezvăluită în WO 97/40162. SECV ID NR.: 128 este o secvenţă de polinucleotide pentru o genă desemnată 149B1-45-PO, care este optimizată pentru expresia în Zea mays. Această genă codifică o toxină de aproximativ 45 kDa ce poate fi obţinută din PS149B1 care este dezvăluită în WO 97/40162. SECV ID NR.: 129 este o secvenţă de polinucleotide pentru o genă desemnată 80JJ1-15-PO7, care este optimizată pentru expresia în porumb. Aceasta este o genă alternativă care codifică o toxină de aproximativ 15 kDa. SECV ID NR; 130 este o secvenţă de aminoacizi pentru o toxină codificată de gena desemnată 80JJ1-15-PO7. SECV ID NR.: 131 este un primeroligonucleotidă(15kfor1) folosit conform prezentei invenţii (vezi exemplul 20). SECV ID NR.: 132 este un prijneroligonucleotidă (45krev6) folosit conform prezentei invenţii (vezi exemplul 20). SECV ID NR.: 133 este secvenţa de AEN din PS201L3 care codifică proteina de 14 kDa. SECV ID NR.: 134 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS201L3. SECV ID NR.: 135 este o secvenţă parţială de ADN din PS201L3 pentru proteina de 44 kDa. 22 RO 123431 Β1 SECVID NR.: 136 este o secvenţă parţială de aminoacizi pentru proteina de 44 kDa 1 a PS201L3. SECV ID NR.: 137 este secvenţa de KW din PS187G1 care codifică proteina de 3 14 kDa. SECV ID NR.: 138 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS187G1. 5 SECV ID NR.: 139 este secvenţa de KW din PS187G1 care codifică proteina de 44 kDa. 7 SECV ID NR.: 140 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 44 kDa a PS187G1. SECV ID NR.: 141 este secvenţa de ADN din PS201HH2 care codifică proteina de 9 14 kDa. SECV ID NR.: 142 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS201HH2. 11 SECV ID NR.: 143 este o secvenţă parţială de ADN din PS201HH2 pentru proteina de 44 kDa. 13 SECV ID NR.: 144 este o secvenţă parţială de aminoacizi pentru proteina de 44 kDa a PS201HH2. 15 SECV ID NR.: 145 este secvenţa de ADN din KR1369 care codifică proteina de 14 kDa. 17 SECV ID NR.: 146 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a KR1369. SECV ID NR.: 147 este secvenţa de ADN din KR1369 care codifică proteina de 19 44 kDa. SECV ID NR.: 148 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 44 kDa a KR1369. 21 SECV ID NR.: 149 este secvenţa de ADN din PS137A care codifică proteina de 14 kDa. 23 SECV ID NR.: 150 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS137A. SECV ID NR.: 151 este secvenţa de ADN din PS201V2 care codifică proteina de 25 14 kDa. SECV ID NR.: 152 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS201V2. 27 SECV ID NR.: 153 este secvenţa de ADN din PS207C3 care codifică proteina de 14 kDa. 29 SECV ID NR.: 154 este secvenţa de aminoacizi a proteinei de 14 kDa a PS207C3. SECV ID NR.: 155 este un primeroligonucleotidă (F1new) pentru utilizarea conform 31 prezentei invenţii (vezi exemplul 22). SECV ID NR.: 156 este un primeroligonucleotidă (R1new) pentru utilizarea conform 33 prezentei invenţii (vezi exemplul 22). SECV ID NR.: 157 este un primer oligonucleotidă (F2new) pentru utilizarea conform 35 prezentei invenţii (vezi exemplul 22). SECV ID NR.: 158 este un primer oligonucleotidă (R2new) pentru utilizarea conform 37 prezentei invenţii (vezi exemplul 22). SECV ID NR.: 159 este o proteină de fuziune de aproximativ 58 kDa. 39 SECV ID NR.: 160 este o genă de fuziune care codifică proteina din SECV ID NR.: 159. 41 SECV ID NR.: 161 este un primer 45kD5' pentru utilizarea conform prezentei invenţii (vezi exemplul 27). 43 SECV ID NR.: 162 este un primer 45kD3'rc pentru utilizarea conform-prezentei invenţii (vezi exemplul 27). 45 SECV ID NR.: 163 este un primer 45kD5'01 pentru utilizarea conform prezentei invenţii (vezi exemplul 27). 47 SECV ID NR.: 164 este un primer 45kD5'02 pentru utilizarea conform prezentei invenţii (vezi exemplul 27). 49 23 RO 123431 Β1 SECV ID NR.: 165 este un primer 45kD3'03 pentru utilizarea conform prezentei invenţii (vezi exemplul 27). SECV ID NR.: 166 este un primer 45kD3'04 pentru utilizarea conform prezentei invenţii (vezi exemplul 27).

Următoarele exemple ilustrează procedurile pentru punerea în practică a invenţiei. Aceste exemple nu trebuie considerate ca limitative. Toate procentele sunt în greutate şi toate proporţiile amestecurilor sunt în volum, dacă nu se specifică altfel.

Exemplul 1. Cultivarea izolatelor B.t. ale invenţiei O subcultură de izolate B.t. sau mutanţi ai acestora pot fi folosiţi pentru a inocula mediul următor, o peptonă, glucoză, mediu salin.

Bacto peptonă 7,5 g/l

Glucoză 1,0 g/l KH2P04 3,4 g/l K2HP4 4,35 g/l

Soluţie salină 5,0 ml/l

Soluţie CaCI2 5,0 ml/l pH 7,2

Soluţie de săruri (100 ml)

Mg S04 · 7H20 2,46 g

Mn S04 · 7H20 0,04 g

Zn S04 · 7H20 0,28 g

Fe S04 · 7H20 0,40 g

Soluţie CaCI2 (100 ml)

CaCI2 · 2H20 3,66 g

Soluţiile saline şi soluţia de CaCI2 sunt filtrate şi sterilizate şi adăugate la soluţia autoclavată şi fiartă la momentul inoculării. Recipientele sunt incubate la 30°C pe un agitator rotativ la 200 rpm timp de 64 h.

Procedura de mai sus poate fi scalată uşor pentru aparate de fermentat mari prin proceduri binecunoscute în domeniu.

Sporii B.t. şi/sau cristalele obţinute în fermentarea de mai sus pot fi izolate prin proceduri binecunoscute în domeniu. O procedură frecvent utilizată este de a supune soluţia de fermentare recoltată unor tehnici de separare, de exemplu centrifugare.

Exemplul 2. Activitatea culturilor de Bacillus thuringiensis cu spori asupra omizii porumbului

Culturile lichide de PS80JJ1, PS149B1 sau PS167H2 au fost crescute pentru sporificare în recipiente agitate şi peletulte prin centrifugare. Peletele de cultură au fost resuspendate în apă şi testate pentru activitate împotriva omizilor porumbului în dozări cantitative biologice aşa cum se descrie mai jos. Cantităţile de proteine de 14 kDa şi 44,3 kDa prezente în peletele de cultură au fost estimate prin densitometrie şi folosite pentru a calcula activitatea specifică exprimată ca LCM. Activitatea fiecărei tulpine native de B. thuringiensis este prezentată în tabelul 3 (Testarea biologică a tulpinilor B.t. pentru omida porumbului Diabrotica virgifera virgifera). 24 RO 123431 Β1

Tabelul 3 1

Testarea biologică a tulpinilor B.t. pentru omida porumbului Diabrotica virgifera virgifera Tulpină B.t. LC50 mg/cm2)* 95% CL Pantă PS80JJ1 6 4-8 1,5 PS167H2 6 4-9 1,6 PS149B1 8 4-12 1,8 control de celulă CryB 4% nedisponibil nedisponibil control apă 4% nedisponibil nedisponibil ‘Procentul mortalităţii la doze ridicate este furnizat pentru controale 3 5 7 9

Exemplul 3. Purificarea proteinei pentru proteina P580JJ1 de 45 kDa 11

Un gram de pudră liofilizată de PS80JJ1 a fost suspendat în 40 ml de soluţie tampon care conţine 80 mM tris CI pH 1,8, 5 mM EDTA, 100 mM EMSF 0,5 pg/ml Leupeptină, 13 0,7 pg/ml Pepstatină şi 40 pg/ml Bestatină. Suspensia a fost centrifugată, iar supranatantul rezultat a fost eliminat. Peletele au fost spălate de cinci ori, folosind 35-40 ml din soluţia 15 tampon de mai sus la fiecare spălare. Peletul spălată a fost resuspendată în 10 ml de NaBr 40%, 5 nM EDTA, 100 μΜ FMSF, 0,5 μ/ml Leupeptină, 0,7 pg/ml Pepstatină şi 40 pg/ml 17 Bestatină şi plasată pe o platformă oscilantă timp de 75 min. Suspensia NaBr a fost centrifugată, supranatantul eliminate, iar peletul a fost tratat a doua oară cu NaBr 40%, 5 nM 19 EDTA, 100 μΜ FMSF, 0,5 μg/ml Leupeptină, 0,7 pg/ml Pepstatină şi 40 pg/ml Bestatină ca mai sus. Supranatanţii (NaBr 40% solubil) au fost combinaţi şi dializaţi în 10 mM CAPS pH 21 10,0, 1 mM EDTA la 4°C. Extractele dializate au fost centrifugate, iar supranatantul rezultat a fost eliminat. Peletul (peletul de dializă a NaBr 40%) a fost suspendat în 5 ml de H20 şi 23 centrifugată. Supranatantul rezultat a fost îndepărtat şi eliminat. Peletul spălat a fost spălat a doua oară în 10 ml H20 şi centrifugat ca mai sus. Peletul spălat a fost suspendat în 1,5 ml 25 de H20 şi a conţinut în principal trei benzi de proteină cu mobilităţi aparente de aproximativ 47 kDa, 45 kDa şi 15 kDa atunci când a fost analizat folosind SDS-PAGE. La acest stadiu 27 al purificării, peletul de dializă NaBr 40% a conţinut aproximativ 21 mg/ml proteină determinată prin test Lowry. 29

Proteinele din suspensia de pelet au fost separate folosind SDS-FAGE (Laemlli, UK [1970] Nature227:680) în geluri acrilamidice 15%. Proteinele separate au fost apoi colorate 31 prin electroforeză pe o membrană PVDF (Millipore Corp.) în 10 nM CAPS pH 11,0, MeOH 10% la 100 V constant. După o oră, membrana PVDF a fost clătită scurt în apă şi plasată 33 timp de 3 min în 0,25% albastru comasiv R-250, 50% metanol, 5% acid acetic. Membrana colorată a fost decolorată în 40% MeOH, 5% acid acetic. Membrana decolorată a fost uscată 35 în aer la temperatura camerei (LeGendre şi col L1989] în A Practicai Guide to Proteln Purification For Microsequencing, P. Matsudaira, editura Academic Press, New York, NY). 37 Membrana a fost secvenţiată folosind degradare Edman în fază gazoasă automată (Hunkapillar, M.W., R,M. Hewick, W.L. Dreyer, L.E. Hood [1983] Meth. Enzymol. 91: 399). 39

Analiza aminoacizilor a dezvăluit că secvenţa N-terminală a catenei de 45 kDa a fost după cum urmează: Met-Leu-Asp-Thr-Asn (SECV ID NR.: 1) 41

Catena de 47 kDa a fost, de asemenea, analizată şi secvenţa N-terminală de aminoacizi a fost determinată a fi aceeaşi secvenţă de 5 aminoacizi ca SECV ID NR.: 1. Prin 43 urmare, secvenţele N-terminale de aminoacizi ale peptidei de 47 kDa şi peptidei de 45 kDa au fost identice. 45 25 RO 123431 Β1

Această secvenţă de aminoacizi corespunde de asemenea unei secvenţe obţinută dintr-o peptidă de 45 kDa obţinută din pudre-spori/cristale de PS80JJ1, folosind un alt protocol de purificare, cu secvenţa N-terminală după cum urmează: Met-Leu-Asp-Thr-Asn-Lys-Val-Tyr-Glu-lle-Ser-Asn-Leu-Ala-Asn-Gly-Leu-Tyr-Thr-Ser-Thr-Tyr-Leu-Ser-Leu(SECV ID NR.: 2).

Exemplul 4. Purificarea peptidei de 14 kDa a PS80JJ1 0,8 ml din suspensia albă de dializă (aproximativ 21 mg/ml) care conţin peptidele de 47 kDa, 45 kDa şi 15 kDa, au fost dizolvaţi în 10 ml NaBr 40% şi s-au adăugat 0,5 ml din EDTA, 100 mM. După 18 h (peste noapte), s-a obţinut o suspensie opacă albă. Aceasta a fost colectată prin centrifugare şi eliminată. Supranatantul a fost concentrat într-un aparat Centricon-30 (Amicon Corporation) până la un volum final de aproximativ 15 ml. Volumul filtrat a fost spălat cu apă prin dializă pe filtru şi incubat pe gheaţă, formând în final o suspensie alb-lăptoasă. Suspensia a fost centrifugată, iar peletul şi supranatantul au fost separate şi reţinute. Peletul a fost suspendată apoi în 1,0 ml apă (aproximativ 6 mg/ml). Peletul a conţinut proteină de 15 kDa pură atunci când a fost analizată prin SDS-PAGE.

Secvenţa N-terminală de aminoacizi a fost determinată a fi: Ser-Ala-Arg-Glu-Val-His-Ile-Glu-lle-Asn-Asn-Thr-Arg-His-Thr-Leu-GIn-Leu-Glu-Ala-Lys-Thr-Lys-Leu (SECV ID NR.: 3).

Exemplul 5. Testarea biologică a proteinei

Un preparat din fracţia insolubilă din extractul de NaBr dializat al 80JJ1 care conţine peptidele de 47 kDa, 45 kDa şi 15 kDa au fost testate biologic împotriva omizii porumbului (Diabrotica virgifera virgifera) şi au fost găsite ca prezentând activitate semnificativă ca toxină.

Exemplul 6. Purificarea proteinei şi caracterizarea proteinei de 45 kDa a PS149B1

Peletul P1 a fost resuspendată cu două volume de apă deionizată pe unitate de greutate, iar la aceasta s-au adăugat 9 volume de bromură de sodiu apoasă 40% în greutate. Aceasta şi toate operaţiile următoare s-au efectuat pe gheaţă la 4-6°C. După 30 min, suspensia a fost diluată cu 36 volume de apă răcită şi centrifugată la 25.000 g timp de 30 min pentru a da un pelet şi un supranatant.

Peletul rezultată a fost resuspendată în 1-2 volume de apă şi întinsă pe un gradient de bromură de sodiu 20-40% (în greutate) şi centrifugată la 8.000 g timp de 100 min. Stratul care determinat o stratificare de aproximativ 32% (în greutate) bromură de sodiu (incluziunile sau INC) a fost recuperat şi dializat peste noapte în apă folosind o membrană de dializă cu un prag de greutate moleculară de 6-8 kDa. Materialul sub formă de particule a fost recuperat prin centrifugare la 25.000 g, resuspendat în apă şi alicotat şi testat pentru proteine prin metoda lui Lowry şi prin SDS-PAGE.

Supranatantul rezultat a fost concentrat 3 până la 4 ori folosind concentratoare Centricon-10, apoi dializate peste noapte în apă folosind o membrană de dializă cu un prag cu greutate moleculară de 6-8 kDa. Materialul sub formă de particule a fost recuperat prin centrifugare la 25.000 g, resuspendat în apă şi alicotat şi testat pentru proteine prin metoda Lowry şi prin SDS-PAGE. Această fracţiune a fost notată P1.P2.

Proteinele din suspensia peletei au fost separate folosind SDS-PAGE (Laemlli, U.K., de mai sus) în geluri acrilamidice 15%. Proteinele separate au fost depuse prin electroforeză pe o membrană PVDF (Millipore Corp.) în CAPS 10 mM, pH 11,0, 10% MeOH la 100 V constant. După o oră membrana PVDF a fost clătită scurt în apă şi plasată timp de 3 min în 0,25% albastru comasiv R-250, 50% metanol, 5% acid acetic. Membrana colorată a fost decolorată în 40% MeOH, 5% acid acetic. Membrana decolorată a fost uscată la aer la temperatura camerei (LeGendre şi col, supra). Membrana a fost secvenţiată prin degradare Edman cu faza gazoasă automată (Hunkapillar şi col., supra). 26 RO 123431 Β1

Analiza proteinelor a indicat prezenţa a două polipeptide majore, cu greutăţi 1 moleculare de 47 kDa şi 14 kDa. Greutăţile moleculare au fost măsurate faţă de polipeptidele standard de greutate moleculară ştiută. Procedeul asigură numai o estimare a greutăţii 3 moleculare reale. Banda de 47 kDa de la PS149B1 a migrat la SDS-PAGE într-un mod insesizabil la proteina de 47 kDa de la PS80JJ1. De asemenea, banda de 14 kDa de la 5 PS149B1 a migrat la SDS-PAGE într-un mod insesizabil la benzile de 14kDa de la PS167H2 şi PS80JJ1. în afară de aceste două polipeptide, care s-a estimat că reprezintă 25-35% 7 (47 kDa) şi respectiv 33-35% (15 kDa) din materialul de colorare comasiv, au existat benzi minore, incluzând pe acelea de greutăţi moleculare estimate la 46 kDa, 130 kDa si 70 kDa. 9 Analiza proteinelor a indicat că fracţiunea INC a conţinut o singură polipeptidă cu greutatea moleculară a proteinei de 47 kDa, şi că fracţiunea P1. P2 a conţinut o singură 11 polipeptidă cu greutatea moleculară a proteinei de 14 kDa. Aceste polipeptide au fost recuperate în cantităţi mai mari de 50% din P1. 13

Secvenţa N-terminală de aminoacizi pentru proteina purificată de 14 kDa din PS149B1 este: Met-Leu-Asp-Thr-Asn-Lys-Val-Tyr-Glu-lle-Ser-Asn-His-Ala-Asn-Gly-Leu-Tyr- 15

Ala-Ala-Thr-Tyr-Leu-Ser-Leu (SECV ID NR.: 4).

Secvenţa N-terminală de aminoacizi pentru proteina purificată de 14 kDa din 17 PS149B1 este: Ser-Ala-Arg-Glu-Val-His-lle-Asp-Val-Asn-Asn-Lys-Thr-Gly-His-Thr-Leu-GIn-Leu-Glu-Asp-Lys-Thr-Lys-Leu-Asp-Gly-Gly-Arg-T rp-Arg-Thr-Ser-Pro-Xaa-Asn-Val -Ala-Asn- 19

Asp-Gln-1 le-Lys-Thr-Phe-Val-Ala-Glu-Ser-Asn (SECV ID NR.: 5).

Exemplul 7. Secvenţa de aminoacizi pentru toxinele de 45 kDa şi 14 kDa din 21 PS167H2

Secvenţa N-terminală de aminoacizi pentru proteina purificată de 45 kDa din 23 PS167H2este: Met-Leu-Asp-Thr-Asn-Lys-lle-Tyr-Glu-lle-Ser-Asn-Tyr-Ala-Asn-Gly-Leu-His-Ala-Ala-Thr-Tyr-Leu-Ser-Leu (SECV ID NR.: 6) 25

Secvenţa N-terminală de aminoacizi pentru proteina purificată de 14 kDa din PS 16VH2 este: Ser-Ala-Arg-Glu-Val-His-lle-Asp-Val-Asn-Asn-Lys-Thr-Gly-His-Thr-Leu-GIn-Leu- 27 Glu-Asp-Lys-Thr-Lys-Leu (SECV ID NR.: 7)

Aceste secvenţe de aminoacizi pot fi comparate cu secvenţa obţinută pentru peptida 29 de 47 kDa obţinută din pudrele de cristale sau spori de 80JJ1 cu secvenţa N-terminală (SECV ID NR.: 1) şi cu secvenţa obţinută pentru peptida de 14 kDa obţinută din pudrele de 31 cristale sau spori de 80JJ1 cu secvenţa terminală (SECV ID NR.: 3). în mod clar, proteinele de 45-47 kDa sunt puternic înrudite, iar proteinele de 14 kDa 33 sunt puternic înrudite.

Exemplul 8. Testarea biologică a proteinelor 35

Fracţiunile de proteine purificate din PS149B1 au fost testate biologicîmpotriva omizii porumbului (Diabrotica virgifera virgifera) şi s-a observat că prezintă activitate semnificativă 37 de toxină atunci când sunt combinate. De fapt, combinaţia a restaurat activitatea la aceea remarcată în prepararea originală (PI). Următoarele date de testare biologică prezintă 39 mortalitatea în procente şi demonstrează acest efect.

Tabelul 4 41

Concentraţie (pg/cm2) P1 INC P1, P2 INC + P1, P2 300 88, 100, 94 19 13 100 100 94, 50, 63 31 38 94 33,3 19, 19, 44 38 13 50 11,1 13, 56, 25 12 31 13 3,7 0, 50, 0 0 31 13 1,2 13, 43, 12 0 12 19 _QA_ _6, 12, 6_ 2 19 6 43 45 47 27 49 RO 123431 Β1

Exemplul 9. donare moleculară, expresie şi analiza secvenţei de ADN a unei noi gene de δ-endotoxină din tulpina PS80JJ1 de BaciIIus thuringiensis ADN-ul celular total a fost preparat din celule de Bacillus thuringiensis (B.t.) crescute până la o densitate optică, la 600 nm, de 1,0. Celulele au fost peletulte prin centrifugare şi resuspendate în soluţie tampon protoplast (20 mg/ml lizozom în sucroză 0,3 M, 25 mM Tris CI 25 mM [pH 8,0], 25 mM EDTA). După incubarea la 37°C timp de o oră, protoplaştii au fost lizaţi prin două cicluri de îngheţare-dezgheţare. S-au adăugat nouă volume dintr-o soluţie de NaCI 0,1 M, 0,1% SDS, Tris CI 0,1 M, pentru a încheia liza. Lizatul limpede a fost extras de două ori cu fenol: cloroform (1:1). Acizii nucleici au fost precipitaţi cu două volume de etanol şi peletulţi prin centrifugare. Peletul a fost resuspendat în soluţie tampon TE şi s-a adăugat RNAază până la o concentraţie finală de 50 pg/ml. După incubarea la 37°C timp de o oră, soluţia a fost extrasă o dată cu fenol: cloroform (1: 1) şi cloroform saturat cu TE. ADN-ul a fost precipitat din faza apoasă prin adiţia de 1-10 volume de NaOAc 3M şi două volume de etanol. ADN-ul a fost peletuit prin centrifugare, spălat cu 10% etanol, uscat şi resuspendat în soluţie tampon TE. O probă de oligonucleotidă pentru gena care codifică toxina de 45 kDa a PS80JJ1 a fost desemnată din datele secvenţei de peptidă N-terminală. Secvenţa probei de oligonucleotidă de 29 baze a fost: 5'-ATG YTWGAT ACWAAT AAA GTWTAT GAA AT-3' (SECV ID NR.: 8). Această oligonucleotidă a fost amestecată la patru poziţii aşa cum este arătat. Această probă a fost radiomarcată cu 32P şi folosită în hibridizarea în condiţii standard de Southern blotale ADN-ului celular total digerat de PS80JJ1 cu diverse endonucleaze de restricţie. Datele autoradiografice reprezentative de la aceste experimente care arată mărimile fragmentelor de restricţie ACN care conţin omologia secvenţei cu proba de oligonucleotidă a toxinei de 44,3 kDa a SECV ID NR.: 8 sunt prezentate în tabelul 5. RFLP a fragmentelor de ADN celular a PS80JJ1 pe Southern blot care hibridizează în condiţii standard cu probe de oligonucleotidă a-genei toxinei de 44,3 kDa (SECV ID NR.: 8)

Tabelul 5

Enzimă de restricţie Mărimea aproximativă fragmentului (kbp) EcdRI 6,0 Hindlll 8,3 Kpnl 7,4 Pstl 11,5 Xbal 9,1

Aceste fragmente de ADN identificate în aceste analize, conţin toate segmentele sau doar un segment din gena toxinei de 45 kDa din PS80JJ1. Mărimile aproximative ale fragmentelor ADN de hibridizare din tabelul 5, sunt în acord rezonabil cu mărimile unui subset de fragmente PS80JJ1 care hibridizează cu o probă de subgenă a toxinei de 45 kDa din PS80JJ1 folosite în experimente separate, aşa cum s-a prevăzut (a se vedea tabelul 6 de mai jos) O bancă de gene a fost construită din ADN de PS80JJ1 parţial digerat cu Sau3AI. Digeratele de restricţie parţiale au fost fracţionate prin eletroforeză pe gel de agaroză. 28 RO 123431 Β1

Fragmente de ADN de mărime 9,3 până la 23 kbp au fost excizate de pe gel, electroeluate 1 din porţia de gel, purificată într-o coloană de schimb ionic Elutip D (Schleicher şi Schuell,

Keene, NH) şi recuperate prin precipitare în etanol. Inserturile Sau3AI au fost ligate în 3

LambdaGem-11 digerat cu BanBI (Promega, Madison, Wl). Fagul recombinat a fost împachetat şi pus pe plăci, pe celule de E. coli KW251. Plăcile au fost cercetate prin 5 hibridizare cu proba de oligonucleotidă descrisă mai sus. Fagii de hibridizare au fost purificaţi pe placă şi folosiţi pentru a infecta culturile lichide de celule E. coli KW251 pentru izolarea 7 de ADN prin proceduri standard (Maniatis şi col, supra).

Analiza Southern blot a dezvăluit că unul dintre izolatele de fagi recombinaţi a 9 conţinut banda Xbal-Sacl de aproximativ 4,8 kbp care a hibridizat la proba genei toxinei PS80JJ1. Situsul Saci de flancare a genei toxinei PS80JJ1 este un situs de donare a 11 vectorului fagului, în timp ce situsul de flancare Xbal este localizat în insertul ADN PS80JJ1.

Acest fragment de restricţie ADN a fost subclonat prin metode standard în pBluescript S/K 13 (Stratagene, SanDiego, CA) pentru analiza secvenţei. Plasmidul rezultant a fost desemnat pMYC2421. Insertul de ADN a fost, de asemenea, subclonat în pHTBIuell (un vector purtător 15 E. coli/B. thuringiensis care a cuprins pBluescript S/K [Stratagene, La Jolla, CA] şi originea de replicare a unui plasmid B.t. rezident [D. Lereclus şi col., (1989) FEMS Microbiology 17 Letters 60: 211-218] pentru a produce FMYC2420. O probă de oligonucleotidă pentru gena care codifică toxina de 14 kDa din PS80JJ1 19 a fost desemnată din datele secvenţei de peptidă N-terminală. Secvenţa de probă de oligonucleotidă de 28 de baze a fost: 5' GW GAA GTW CAT ATW GAA ATW AAT AAT AC 21 3' (SECV ID NR.: 29) . Această oligonucleotidă a fost amestecată la patru poziţii aşa cum este arătat. Proba a fost radiomarcată cu 32P şi folosită în hibridizarea în condiţii standard de 23

Southern blot a PS80JJ1 celular total şi ADN pMTC2421 digerat cu diverse endonucleaze de restricţie. Aceste experimente de cartare RFLP demonstrează că gena care codifică 25 toxina de 14 kDa este situată pe acelaşi fragment genomic EcoRI care conţine secvenţa N-terminală de codificare pentru toxina de 44.3 kDa. 27

Pentru a testa expresia genelor toxinei de PS80JJ1 în B.t., pMYC2420 a fost transformat în gazda B.t. necristaliferă (Cry-), CryB (A. Aronson, Purdue University, West 29 Lafayette, IN) prin electroporare. Expresia atât a toxinei de aproximativ 14 kDa cât şi 44,3 kDa a PS80JJ1 codificate prin pMYC2420, a fost demonstrată prin analiza SDS-PAGE. 31 Preparatele de cristale de toxină din tulpina recombinată CryB[pMYC2420], MR536, au fost analizate şi s-a găsit că sunt active împotriva omizii porumbului Diabrotica virgifera virgifera. 33

Genele toxinei PS80JJ1 au fost secvenţiate folosind programul de secvenţiere automată ABI373 şi softul asociat. Secvenţa întregului locus genetic care conţine atât 35 cadrele de citire deschise cât şi secvenţele de nucleotide de flancare sunt prezentate în SECV ID NR.: 30). Codonul de terminare al genei toxinei de 14 kDa este un codon cu 121 37 perechi de baze în avalul (5') codonului de iniţiere al genei toxinei de 44 kDa (Figura 2). Secvenţa de nucleotide a cadrului de citire deschis al toxinei PS80JJKSECV ID NR.: 31), 39 secvenţe de nucleotide a cadrului de citire deschis (SECV ID NR.: 10) a toxinei de 44.3 kDa şi respectivele secvenţe de aminoacizi deduse (SECV ID NR.: 32 şi SECV ID NR.: 11) sunt 41 noi în comparaţie cu alte gene de toxine care codifică proteine cu acţiune pesticidă.

Astfel, secvenţa de nucleotide care codifică toxina de 14 kDa a PS80JJ1 este 43 prezentată în SECV ID NR.: 31. Secvenţa de aminoacizi dedusă a toxinei de 14 kDa a PS80JJ1 este prezentată în SECV ID NR.: 32. Secvenţele de nucleotide care codifică 45 ambele toxine de 14 kDa de 45 kDa a PS80JJ1, cât şi secvenţele de flancare, sunt arătate în SECV NR.: 30. Relaţia dintre aceste secvenţe este arătată în fig. 2. 47 29 RO 123431 Β1 1 O subcultură de E. coli NM522 care conţine plasmida pMYC2421 a fost depozitată în colecţia permanentă Patent Culture Collection (NRRL), Regional Research Center, 1815 3 North Uhiversity Street, Peoria, IL 61604 SUA pe 28 martie 1996. Numărul de acces este NRRL B-21555. 5 Exemplul 10. Analiza RFLP şi PCR a genelor noi adiţionale de 5-endotoxină din tulpinile PS149B1 şi PS167H2 ale Bacillus thuringiensis 7 Două tulpini adiţionale active împotriva omizii porumbului, PS149B1 şi PS167H2 produc, de asemenea, cristale de proteină parasporală, alcătuite în parte din polipeptide de 9 mărime aproximativă de 14 şi 45 kDa. Hibridizarea Southern şi analiza secvenţei ADN parţială au fost utilizate pentru a examina înrudirea acestor toxine cu toxinele 80JJ1. ADN-ul 11 a fost extras din aceste tulpini de B.t. aşa cum s-a descris mai sus şi s-au realizat hibridizări Southern standard, folosindu-se proba de oligonucleotidă a toxinei de 14 kDa (SECV ID 13 NR.: 29) şi un fragment PCR de aproximativ 800 bp al secvenţei de codificare a genei toxinei de 44.3 kDa a 80JJ1. Datele RFLP din aceste experimente care arată mărimile fragmentelor 15 de restricţie ADN care conţin omologia secvenţei cu toxina de 44.3 kDa, sunt prezentate în tabelul 6. Datele RFLP din aceste experimente care arată mărimile fragmentelor de restricţie 17 ADN conţinând omologia cu toxina de aproximativ 14 kDa sunt prezentate în tabelul 7. 19 RFLP a fragmentelor de ADN celular de PS80JJ1, PS149B1 şi PS167H2 la

Southern blot care au hibridizat cu proba subgenei de aproximativ 800 bp a toxinei 21 de 4,3 kDa a PS80JJ1

Enzima de restricţie Tulpina PS80JJ1 PS149B1 PS167H2 Mărimea aproximativă a fragmentului (kbp) EcoRI 6,4 5,7 2,6 1,3 2,8 0,6 Hindlll 8,2 6,2 4,4 Kpnl 7,8 10,0 11,5 Pstl 12,0 9,2 9,2 8,2 Xbal 9,4 10,9 10,9 Saci 17,5 15,5 11,1 13,1 10,5 6,3

Tabelul 6 23 25 27 29 31 33 35

37 Fiecare dintre cele trei tulpini au prezentat modele RFLP unice. Fragmentele ADN de hibridizare de la PS149B1 sau PS167H2 conţin toate sau o parte din genele toxinei cu 39 omologie a secvenţei cu toxina de 44,3 kDa a PS80JJ1. 30 RO 123431 Β1

Polimorfismele lungimii fragmentelor de restricţie a fragmentelor de ADN celular de 1 PS80JJ1, PS149B1 şi PS167H2 pe Southern blot care au hibridizat cu proba de oligonucleotidă a toxinei de 14 kDa-a PS80JJ1 în condiţii standard 3 Tabelul 7 5

Enzima de restricţie Tulpina PS80JJ1 PS149B1 PS167H2 Mărimea aproximativă a fragmentului (kbp) EcoRI 5,6 2,7 2,7 Hindi 11 7,1 6,0 4,7 Xbal 8,4 11,2 11,2 7 9 11

Fiecare dintre cele trei tulpini a prezentat modele RFLP unice. Fragmentele ADN de hibridizare de la PS149B1 sau PS167H2 conţin toate sau o parte din genele toxinei cu 13 omologie a secvenţei cu gena toxinei de 14 kDa a PS80JJ1.

Porţiuni din genele toxinei din PS149B1 sau PS167H2 au fost amplificate prin PCR 15 folosind perechi de primeri de oligonucleotide cap-coadă şi coadă-cap desemnaţi pe baza secvenţei genei toxinei de 44,3 kDa a PS80JJ1. Pentru PS149B1, s-a folosit următoarea 17 pereche de primeri: cap-coadă: 19 5-ATG YTWGAT ACW AAT ABA GTWTAT GAA AT-3' (SECV ID NR.: 8) coadă-cap: 21 5' -GGA TTA TCT ATC TCT GSG TGT TCT TG-3' (SECV ID NR.: 9).

Pentru PS167H2, a fost folosită aceeaşi pereche de primeri. Aceste fragmente 23 derivate din PCR au fost secvenţiate folosind sistemul de secvenţiere automată ABI373 şi programul software asociat. Gena parţială şi secvenţele de peptide obţinute sunt arătate în 25 SECV ID NR.: 12-15. Aceste secvenţe conţin porţiuni ale secvenţelor de codificare a nucleotidelor şi secvenţele de peptide pentru noile toxine active împotriva omizii porumbului, 27 prezente în tulpinile PS149B1 şi PS167H2 ale B.t.

Exemplul 11. donarea moleculară şi analiza secvenţei de ACM a noilor gene de δ- 29 endotoxină din tulpinile PS149B1 şi P5167H2 ale Bacillus thuringiensis ADN-ul celular total a fost extras din tulpinile PS149B1 şi PS167H2 aşa cum s-a 31 descris pentru PS80JJ1. S-au construit bănci de gene ale fragmentelor de restricţie parţiale Sau3A fracţionate după mărime, în Lambda-Gemll pentru fiecare tulpină respectivă aşa cum 33 s-a descris anterior. Fagii recombinaţi au fost împachetaţi şi depuşi pe plăci pe celule de E. coli KW251. Plăcile au fost cercetate prin hibridizare cu proba de oligonucleotidă specifică 35 pentru gena toxinei de 44 kDa. Fagii de hibridizare au fost purificaţi pe placă şi au fost folosiţi pentru a infecta culturile lichide de celule de E. coli KW251 pentru izolarea de ADN prin 37 proceduri standard (Maniatis şi col., supra).

Pentru PS167H2, analiza Southern blot a dezvăluit că unul dintre izolatele de fagi 39 recombinaţi a conţinut o bandă HindiII de aproximativ 4,0 până la 4,4 kbp care a hibridizat cu sonda de oligonucleotidă 5' a genei toxinei de 44 kDa a PS80JJ1 (SECV ID NR.: 8). Acest 41 fragment de restricţie ADN a fost subclonat prin metode standard în pBluescript S/K (Stratagene, San Diego, CA) pentru analiza secvenţelor. Fragmentul a fost de asemenea 43 subclonatîn vectorul purtător cu număr mare de copii, pHT370 (Arantes, O., Lereclus [1991]

Gene 108:115-119) pentru analizele expresiei în Bacillus thuringiensis (a se vedea mai jos). 45 31 RO 123431 Β1

Plasmidul bifuncţional cu mare număr de copii, recombinat rezultat a fost desemnat PMYC2427.

Genele toxinei PS167H2 codificate de pMYC2427 au fost secvenţiate folosind sistemul de secvenţiere automată ABI şi programul software asociat. Secvenţa întregului locus genetic care conţine atât cadrele de citire deschise cât şi secvenţele nucleotidelor de flancare este arătată în SECVID Nr.: 34. Codonul de terminalizare al genei toxinei de 14 kDa este la 107 baze perechi în aval (5') faţă de codonul de iniţiere al genei toxinei de 44 kDa. Secvenţa de codificare a toxinei de 14 kDa a PS167H2 (SECV ID Nr.: 35), secvenţa de codificare a toxinei de 44 kDa (SECV ID NR.: 37) şi respectivele secvenţe de aminoacizi deduse SECV ID Nr.: 36 şi SECV ID NR.: 38 sunt noi în comparaţie cu alte gene de toxine cunoscute care codifică proteine cu activitate pesticidă. Genele toxinei sunt aranjate într-un mod similar şi au oarecare omologie cu toxinele de 14 şi 44 kDa ale PS80JJ1. O subcultură a E. coli NM522 care conţine plasmidul pMYC2427 a fost depozitată în colecţia permanentă a Patent Culture Collection (NRRL), Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 S.U.A. pe 26 martie 1997. Numărul de acces este NRRL B-21672.

Pentru PS149B1, analiza Southern Blot folosind proba 5' de oligonucleotidă de 44 kDa a PS80JJ1 (SECV ID NR.: 8) a demonstrat hibridizarea unui fragment ADN dai de aproximativ 5,9 kbp. Digeratele complete de Clal ale PS149B1 au fost fracţionate după mărime pe geluri de agaroză şi donate în pHTBIuell. Fragmentul a fost de asemenea subclonat în vectorul purtător cu număr mare de copii, pHT370 (Arantes O., D. Lereclus [1991] Gene 108: 115-119) pentru analizele expresiei în Bacillus thuringiensis (a se vedea mai jos). Plasmidul bifuncţional, cu număr mare de copii, recombinat rezultant a fost desemnat pMTC2429.

Genele toxinei PS149B1 codificate de pMYC2429 au fost secvenţiate folosind sistemul de secvenţiere automată ABI şi programul software asociat. Secvenţa întregului locus genetic, care conţine atât cadrele de citire deschise, cât şi secvenţele nucleotidelor de flancare, este arătată în SECV ID NR.: 39. Codonul de terminalizare al genei toxinei de 14 kDa este la 108 baze perechi în aval (5') faţă de codonul de iniţiere al genei toxinei de 44 kDa. Secvenţa de codificare a toxinei de 14 kDa a PS149B1 (SECV ID NR.: 40), secvenţa de codificare a toxinei de 44 kDa (SECV ID NR.: 42) şi respectivele secvenţe de aminoacizi deduse SECV ID NR.: 41 şi SECV ID NR.: 43 sunt noi în comparaţie cu alte gene de toxine cunoscute care codifică proteine cu activitate pesticidă. Genele toxinei sunt aranjate într-un mod similar şi au oarecare omologie cu toxinele de 14 şi 44 kDa ale PS149B1 şi PS167H2. împreună, aceşti trei operoni de toxine cuprind o nouă familie de toxine cu activitate pesticidă. O subcultură de E. coli NM522 care conţine plasmidul pMTC2429 a fost depozitată în colecţia permanentă a Patent Culture Collection (NRRL), Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 S.U.A. pe 26 martie 1997. Numărul de acces este NRRL B-21673.

Exemplul 12. Amplificarea PCR pentru identificarea şi donarea noilor toxine adive împotriva omizii porumbului

Secvenţele de SEN şi peptide ale celor trei noi toxine active împotriva omizii porumbului de aproximativ 45 kDa din PS80JJ1, PS149B1 şi PS167H2 (SECV ID NR.: 12-15) au fost aliniate cu programul Pileup pentru analiza secvenţelor de la Genetics Computer Group folosind o greutate de gap de 3,00 şi o greutate a lungimii de gap de 0,10. Alinierile secvenţelor au fost folosite pentru identificarea secvenţelor de peptide conservate la care primerii oligonucleotide au fost desemnaţi ca fiind posibil să hibridizeze la gene care codifică 32 RO 123431 Β1 membri ai acestei noi familii de toxine. Asemenea primeri pot fi utilizaţi în PCR pentru a 1 amplifica fragmentele de ADN de diagnostic pentru acestea şi pentru gene de toxine înrudite. Numeroase configuraţii de primeri pentru diverse secvenţe sunt posibile, dintre care patru 3 sunt descrise aici, pentru a furniza un exemplu. Aceste secvenţe de peptide sunt:

Asp-lle-Asp-Asp-Tyr-Asn-Leu (SECV ID Nr.: 16) 5

Trp-Phe-Leu-Phe-Pro-lle-Ssp (SECV ID Nr.: 17)

Gln-lle-Lys-Thr-Thr-Pro-Tyr-Tyr (SECV ID Nr.: 18) 7

Tyr-Glu-Trp-Gly-Thr-Glu (SECV ID Nr.: 19).

Secvenţele de nucleotide corespunzătoare sunt: 9 5'GATATOGATGAYTAYBAYTTR-3' (SECV ID Nr.: 20) 5' -TGGTTTTTRTTTCCWATWGAY-3' (SECV ID Nr.: 21) 11 5' -CAAATH ASAAC WAC WCCAT ATT AT-3' (SECV ID Nr.: 22) 5'-TAYGARTGGGGHftCAGAA-3' (SECV ID N.r: 23) 13

Primerii cap-coadă pentru amplificarea polimerazei în reacţii termocidice au fost desemnaţi pe baza secvenţelor de nucleotide ale SECV ID Nr.: 20 şi 21. 15

Primerii coadă-cap au fost desemnaţi pe baza complementului invers al SECV ID NR.: 22 şi 23: 17 5'-ATAATATGGWGTWGTTTTBATTTG-3' (SECV ID Nr.: 24) 5'-TTCTGTDCCCCAYTCRTA-3' (SECV ID Nr.: 25). 19

Aceşti primeri pot fi utilizaţi în combinaţie pentru a amplifica fragmentele ADN de mărimea următoare (tabelul 8) care identifică genele care codifică noile toxine pentru omida 21 porumbului. 23 Mărimi prevăzute pentru fragmente de ADN (perechi de baze) de diagnostic care pot fi amplificate cu primeri specifici pentru noile toxine active împotriva omizii porumbului 25 Tabelul 8 27

Pereche de primari (SECV ID NR.:) Mărimea fragmentului ADN (bp) 20 + 24 495 20 + 25 594 21 +24 471 21 +25 580 29 31 în mod similar, genele întregi care codifică noi toxine active împotriva omizii 33 porumbului pot fi izolate prin amplificarea polimerazei în reacţii termocidice folosind primeri desemnaţi pe baza secvenţelor de ADN de flancare a cadrelor de citire deschise. Pentru 35 toxina de 44.3 kDa a PS80J J1, o asemenea pereche de primeri a fost desemnată, sintetizată şi utilizată pentru a amplifica un fragment de ADN de diagnostic de 1613 bp care a inclus 37 întreaga secvenţă de codificare a toxinei. Aceşti primeri sunt: cap-coadă: 5'-CTCMAGCGGATCAGGAG-3' (SECV ID Nr.: 26) 39 coadă-cap: 5'-GCGTATTCGGATATGCTTGG-3' (SECV ID Nr.: 27).

Pentru amplificarea PCR a toxinei de 14 kDa a PS80JJ1, poate fi folosită- 41 oligonucleotida care codifică secvenţa de peptide N-terminală (SECV ID Nr.: 29) în combinaţie cu diverşi primeri de oligonucleotidă pe baza secvenţelor din locusul genei toxinei 43 PS80JJ1. Un asemenea primer coadă-cap are următoarea secvenţă. 5'CATGAGATTTATCTCCTGATCCGC-3' (SECV ID Nr.: 33) 45 33 RO 123431 Β1

Atunci când este folosită în reacţii PCR standard, această pereche de primeri a amplificat un fragment de ADN de diagnostic de 1390 bp care include întreaga secvenţă de codificare a toxinei de 14 kDa şi câteva secvenţe de flancare 3' care corespund spaţiatorului intergenic de 121 baze şi o porţiune din gena toxinei de 44.3 kDa. Atunci când este folosită în combinaţie cu primenii cap-coadă de 14 kDa, PCR va genera un fragment de ADN de diagnostic de 322 perechi de baze.

Exemplul 13. Testarea biologică doză-răspuns a clonei

Operonul toxinei PS80JJ1 a fost subclonat din pMTC2421 în pHT370 pentru comparaţia directă a bioactivităţii cu toxinele recombinate donate din PS149B1 şi Psl67H2. Plasmidul bifuncţional, cu număr mare de copii, recombinat, rezultat a fost desemnat pMYC2426. O subcultură a E. coli NM522 care conţine plasmidul pMYC2426 a fost depozitată în colecţia permanentă a Patent Culture Collection (NRRL), Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 SUA, pe 26 martie 1997. Numărul de acces este NRRL B-21671.

Pentru a testa expresia genei toxinei PS80JJ1, PS149B1 şi PS167H2 în B.t., pMYC2426, pMYC2427 şi pMYC2429 au fost transformaţi separatîn gazda B.t. necristaliferă (Cry-), CryB (A. Aronson, Purdue University, West Lafayette, IN) prin electroporare.

Tulpinile recombinate au fost desemnate MR543 (CryB [pMYC2426]), MR544 (CryB [pMYC2427]) şi respectiv MR546 (CryB [pMYC2429]). Expresia ambelor toxine de aproximativ 14 kDa şi 44 kDa a fost demonstrată prin analiza SDS-PAGE pentru fiecare tulpină recombinată.

Preparatele din cristale de toxină din tulpinile recombinate au fost analizate împotriva omizii porumbului. Dieta lor a fost amendată cu acid sorbic şi SIGMA pen-strep-ampho-B. Materialul a fost adus la o rată de 50 pi de suspensie per cm2 arie a suprafeţei de dietă. S-au efectuat analize biologice cu larve neonate de omida porumbului (Diabrotica virgifera virgifera), timp de 4 zile, la aproximativ 25°C. Procentul de mortalitate şi estimările LC50 pentru clone (pelete) sunt prezentate în tabelul 9. Un control dH20 a produs o mortalitate de 7%.

Tabelul 9

Probă Procentul de mortalitate la anumite concentraţii ale proteinei (pg/cm2) 50 pg/cm2 5 pg/cm2 0,5 pg/cm2 pelet MR543 44% 19% 9% pelet MR544 72% 32% 21% pelet MR546 52% 32% 21%

Cantităţile de proteine de 14 kDa şi 44.3 kDa prezente în preparatele cristaline au fost estimate prin densitometrie şi folosite pentru a calcula activitatea specifică exprimată ca LC50. Estimările LC50 pentru clone (pelete) sunt prezentate în tabelul 10 (testarea biologică a clonelor B.t. pentru omida porumbului Diabrotica virgifera virgifera). 34 RO 123431 Β1

Testarea biologică a clonelorB.t. pentru omida porumbului Diabrotica virgifera virgifera 1 Tabelul 10 Clonă B.t. Tulpină parentală B.t. LC50 (pg/cm2)* 95% CL Pantă MR543 PS80JJ1 37 17-366* 0,79 MR544 PS167H2 10 6-14 1,6 MR546 PS149B1 8 4-12 1,5 nedisponibil Control celulă CryB 4% nedisponibil nedisponibil nedisponibil Control apă 4% nedisponibil nedisponibil * Procentul de mortalitate la doza maximă este furnizat pentru controale ** 90% CL 3 5 7 9 11

Exemplul 14. Analiza mutaţională a polipeptidelor de 14 kDa şi 44 kDa în o peronul toxinei binare PS80JJ1 13

Genele toxinelor binare ale prezentei invenţii sunt, în starea lor naturală, aranjate în mod obişnuit într-un operon în care gena proteinei de 14 kDa este mai întâi transcrisă, urmată 15 apoi de cea a genei proteinei de 45 kDa. Aceste gene sunt separate printr-o regiune relativ scurtă necodificatoare. ORF reprezentative sunt arătate în SECV ID NR.: 30, SECV ID 17 NR.: 34 şi SECV ID NR.: 39.

Pentru a investiga contribuţia proteinelor cristaline individuale de 14 kDa şi 44.3 kDa 19 pentru activitatea împotriva omizii porumbului, fiecare genă din operonul PS80JJ1 a fost supusă mutaţiei în experimente separate pentru a aboli expresia uneia dintre proteine. Gena 21 intactă a fost apoi exprimată în B.t. şi proteinele recombinate au fost testate pentru activitatea împotriva omizii porumbului. 23

Mai întâi, gena de 44.3 kDa codificată în pMTC2421 a fost supusă mutaţiei prin trunchiere la situsul EcdRI la poziţia bazei 387 a cadrului de citire deschis. Această 25 trunchiere şi ligare ulterioară cu secvenţe de vector au avut ca rezultat un cadru de citire deschis care codifică o proteină de fuziune ipotetică de aproximativ 14 kDa. Operonul 27 rezultat, care codifică gena intactă de 14 kDa şi gena trunchiată de 45 kDa, a fost subclonat în vectorul purtător cu număr mare de copii, pHT370 (Arantes, O., D. Lereclus [1991] Gene 29 108: 115-119) pentru analizele expresiei în Bacillus thuringiensis. Plasmidul rezultat, pMYC2424 a fost transformat în gazda B.t. necristaliferă (Cry-), CryB (A. Aronson, Purdue 31 University, West Lafayette, IN), prin electroporare. Tulpina recombinată rezultată a fost desemnată MR541. Doar proteina PS80JJ1 de 14 kDa a fost detectabilă prin analiza SDS- 33 PAGE a culturilor de spori de MR541. în testele biologice împotriva omizii porumbului nu s-a observat mortalitate pentru preparatele de MR541 care exprimă doar proteina PS80JJ1 de 35 14 kDa.

Apoi, gena de 14 kDa codificată pe pMYC2421 a fost supusă mutaţiei prin inserţie 37 pe un linker oligonucleotidă care conţine codoni de terminalizare în toate cadrele de citire deschise posibile la situsul Nrul la poziţia bazei 11 a cadrului de citire deschis. Secvenţa 39 acestui linker este 5'-TGAGTAACTAGATCTATTCAATTA. 3'. Linker-ul introduce un situs BgXII pentru confirmarea inserţiei prin digerarea restricţiei BgITL. Clonele plasmid care conţin 41 linker-ul mutagen au fost identificate cu flgrJII şi secvenţiate pentru verificare. Insertul operon care codifică mutaţiile nonsens de 14 kDa a fost subclonat în pHT370, rezultând plasmidul 43 pMYC2425. Acest plasmid a fost transformat în CryB prin electroporare pentru a produce tulpina B.t. recombinată MR542. Doar proteina PS80JJ1 de 44.3 kDa a fost exprimată în 45 35 RO 123431 Β1 culturile de spori de MR542 aşa cum este arătat de analiza SDS-PAGE. Mortalitatea împotriva omizii porumbului nu a fost observată pentru preparatele de MR542 care exprimă doar proteina PS80JJ1 de 44.3 kDa.

Exemplul 15. Expresia heterologă a unei singure gene, purificarea şi testarea biologică a polipeptidelor de 14 şi 44.3 kDa din PS149B1 în Pseudomonas fluorescens

Genele polipeptidelor de 14 kDa şi 44.3 kDa din PS149B1 au fost separate în vectorii pasmid prin metode standard de donare ADN şi transformate în Pseudomonas fluorescens. Tulpina de Pseudomonas fluorescens recombinată care exprimă numai gena de 14 kDa a PS149B1 a fost desemnată MR1253. Tulpina de Pseudomonas fluorescens recombinată care exprimă numai gena de 44.3 kDa a PS149B1 a fost desemnată MR1256. MR1253 şi MR1256 exprimă fiecare individual una dintre cele două proteine binare, au fost crescute în cuve de fermentare de 1 I. O porţiune din fiecare cultură a fost apoi peletată prin centrifugare, lizată cu lizozom şi tratată cu ADNază I pentru a obţine incluziuni de proteine semipure. Aceste incluziuni au fost apoi solubilizate în citrat de sodiu 50 mM (pH 3,3) prin agitare uşoară la 4°C, timp de o oră.

Proteina de 14 kDa s-a dizolvat uşor în această soluţie tampon, în timp ce proteina de 44.3 kDa a fost parţial solubilă. Fracţiunile solubilizate au fost apoi centrifugate la 15.000 g, timp de 20 min, iar supranatanţii au fost reţinuţi.

Proteina de 14 kDa a fost suplimentar purificată prin cramatografie cu schimb de ioni. Proteina de 14 kDa solubilizată a fost legată la o coloană Econo-S şi eluată cu clorură de sodiu gradient 0-1 M. MR1253 (proteina de 14 kDa) pură din punct de vedere cromatografic şi preparatul solubilizat de citrat de sodiu (pH 3,3) al MR1256 (proteina de 45 kDa) au fost apoi testate pentru activitate asupra omizii porumbului individual sau împreună, la un raport molar de 1 până la 10 (proteina de 45 kDa faţă de proteina de 14 kDa). Mortalitatea observată pentru fiecare dintre proteinele singure nu a fost peste nivelurile de fond (ale probei apă/control), dar a avut ca urmare o mortalitate de 87% atunci când au fost combinate în raportul de mai sus (vezi tabelul 11).

Tabelul 11

Raport molar (45 kDa faţă de 14 kDa) Volum de încărcare ug 45 kD/godeu ug 14 kD/godeu Proteină totală ug Mortalitate la omida porumbului Ola 1 100 ul 0 260 260 13 1 laO 200 ul 260 0 260 9 1 la 10 100 ul 65 195 260 87 apă 100 ul 0 0 0 11

Exemplul 16. Identificarea noilor gene de toxine adiţionale de 14 kDa şi 44.3 kDa prin hibridizarea ADN genomic total de B.t. şi prin RFLP ADN genomic total de la fiecare izolat a fost preparat folosind un kit Qiagen CNEasy cu 96 godeuri pentru ţesuturi. ADN-ul din 96 godeuri a fost denaturat anterior colorării prin adăugarea de 10 ul din fiecare-mostră ADN şi 10 ul de NaOH 4 M la 80 ul apă distilată sterilă. Mostrele au fost incubate la 70°C, timp de o oră, după care la fiecare godeu s-au adăugat 100 ul de 20xSSC. Cu fiecare set din 94 mostre s-a adăugat ADN genomic total de 36 RO 123431 Β1 PS149B1 ca un control pozitiv de hibridizare, iar ADN genomic total de cryB- a fost inclus 1 în fiecare set din 94 de mostre ca un control negativ de hibridizare. Fiecare set din 96 de mostre a fost aplicat pe membrane de nailon Magnacharge folosind două distribuitoare cu 3 48 de godeuri (Hoefer Scientific), urmată de două spălări cu 10xSSC. Membranele au fost încălzite la 80°C timp de o oră şi au fost păstrate uscate până la folosire. Membranele au fost 5 prehibridizate şi hibridizate în soluţie standard de formamidă (50% formamidă, 5xSSPE, 5x soluţie Denhardt, 2% SDS, 100 ug/ml ADN monocatenar) la 42°C. Membranele au fost 7 spălate în două condiţii: 2xSSC/0,1 % SDS la 42°C (stringenţă redusă) şi 0,2xSSC/0,1 % SDS la 65°C (stringenţă moderată până la ridicată). Membranele au fost probate cu un fragment 9 PCR de aproximativ 1,3 kbp al genei de 44.3 kDa al PS149B1 amplificat din pMTC2429, folosind primenii cap-coadă SECV ID NR.: 8 şi un primer coadă-cap cu secvenţa 5'- 11 GTAGAAGCAGAACAAGAAGGTATT 3'(SECV ID NR.: 46). Proba a fost marcată radioactiv folosind un Prime-it II (Stratagene) şi 32-P-dCTP, purificată în coloane cu Sephadex, 13 denaturată la 94°C şi adăugată la soluţia proaspătă de hibridizare. Tulpinile care conţin gene cu omologie cu proba PS149B1 au fost identificate prin expunerea membranelor la un film 15 de radiaţii X.

Următoarele tulpini au fost identificate prin reacţii de hibridizare pozitive: PS184M2, 17 PS185GG, PS187G1, PS187Y2, PS201G, PS201HH2, PS242K10, PS69Q, KB54A1-6, KR136, KR589, PS185L12, PS185W3, PS18SZ11, PS186L9, PS187L14, PS186FF, 19 PS131W2, PS14702, PS158T3, PS158X10, PS185FF, PS187F3, PS198H3, PS201H2, PS201L3, PS203G2, PS203J1, PS204C3, PS204G4, PS204I11, PS204J7, PS210B, 21 PS213E8, PS223L2, PS224F2, PS236B6, PS246P42, PS247C16, KR200, KR331, KR625, KR707, KR959, KR1209, KR1369, KB2C-4, KB10H-S, KB456, KB42C17-13, KB45A43-3, 23 KB54A33-1 ,-KB58A10-3, KB59A54-4, KB59A54-5, KB53B7-8, KB53B7-2, KB60F5-7, KB60F5-11, KB59A58-4, KB60F5-15, KB61A18-1, KB65A15-2, KB65A15-3, KB65A15-7, 25 KB65A15-8, KB65A15-12, KB65A14-1, KB3F-3, T25, KB53A71-6, KB65A11-2, KB68B57-1, KB63A5-3, şi KB71A118-6. 27

Identificarea suplimentară şi clasificarea noilor gene de toxine în preparate de ADN genomic total a fost realizată folosind probele marcate cu 32P şi în condiţiile de hibridizare 29 descrise mai sus în acest exemplu. ADN-ul total genomic a fost preparat ca mai sus sau cu Qiagen Genamic-Tip 20/G şi a fost folosit pentru analiza Southern Genomic DNA. BufferSet 31 conform protocolului pentru bacterii Gram-pozitive (Qiagen Inc.; Valencia, CA.). Pentru Southern blot, aproximativ 1-2 pg din ADN-ul genomic total de la fiecare tulpină identificat 33 prin analiză Slot blot a fost digerat cu enzime Dral şi Ndel, supuse electroforezei pe gel de agaroză 0,8% şi imobilizate pe o membrană de nailon folosind metode standard (Maniatis 35 şi col.). După hibridizare, membranele au fost spălate în condiţii de stringenţă redusă (2xSSC/0,1 % SDS la 42°C) şi expuse la film. Mărimile fragmentelor de ADN au fost estimate 37 folosind programul software BioRad Chemidoc. A fost utilizat polimorfismul lungimii fragmentelor de restricţie pentru a clasifica (arbitrar) genele care codifică toxina de 44 kDa. 39 Aceste clasificări sunt prezentate în tabelul 12. 37 RO 123431 Β1

Tabelul 12

Clasă RFLP (45 & 14 kD) Numele tulpinei izolate A 149B1 A' KR331, KR1209, KR1369 B 167H2, 242K10 C 184M2, 201G, 201HH2 D 185GG, 187Y2, 185FF1, 187F3 E 187G1 F 80JJ1, 186FF, 246P42 G 69Q H KB54A1-6 I KR136 J KR589 K 185L12, 18SW3, 185Z11, 186L9, 187L14 L 147U2, 21OB, KB10H-5, KB58A10-3, KB59A54-4, KB59A54-5, KB59A58-4, KB65A14-1 M 158T3, 158X10 N 201H2, 201L3, 203G2, 203J1,204C3, 204G4, 204111, 204J7, 236B6 P 223L2, 224F2 P' 247C16, KB45A43-3, KB53B7-8, KB53B7-2, KB61A18-1, KB3F-3, KB53A71-6, KB65M1-2, KB68B57-1, KB63A5-3, KB71A118-6 Q 213E8, KB60F5-11, KB60F5-15 R KR959 S KB2C-4, KB46, KB42C17-13 T KB54A33-1, KB60F5-7 u T25 V KB65A15-2, KB6SM5-3, KB65A15-7, KB65M5-8, KB65M5-12

Exemplul 17. Secvenţierea ADN a genelor toxinelor binare adiţionale Oligonucleotide degenerate au fost desemnate să amplifice toate sau o parte din genele de 14 şi 44.3 kDa de la tulpini B.t. identificate prin hibridizare cu produsul PCR149B1 descris mai sus. Oligonucleotidele au fost desemnate pe blocurile de secvenţe conservate-identificate prin alinierea genelor de 14 kDa sau 44.3 kDa de la PS149B1, PS167H2 şi PS80JJ1. Primeri cap-coadă pentru ambele gene au fost desemnaţi să înceapă la codonul de iniţiere ATG. Primerii coadă-cap au fost desemnaţi pe cât posibil aproape de capătul 3' al fiecărei gene respective. 38 RO 123431 Β1

Primerii desemnaţi să amplifice gena de 14 kDa sunt după cum urmează: 1 149DEG1 (cap-coadă): 5'- ATG TCA GCWCGY GAA GTWCAY ATT G-3' (SECV ID NR.: 47) 3 149DEG2 (coadă-cap): 5'- GTY TGA ATH GTA TAH GTH ACA TG-3' (SECV ID NR.: 48) 5

Aceşti primeri amplifică un produs de aproximativ 340 perechi de baze.

Primerii desemnaţi să amplifice gena de 44.3 kDa sunt după cum urmează: 7 149DEG3 (cap-coadă): 5'- ATG TTA GAT ACWAAT AAA RTWTAT G-3' (SECV ID NR.: 49) 9 149DEG4 (coadă-cap): 5'- GTW ATT TCT TCW ACT TCT TCA TAH GAA G-3' (SECV ID NR.: 50) 11

Aceşti primeri amplifică un produs de aproximativ 1.100 perechi de baze.

Condiţiile PCR utilizate pentru a amplifica produsele genetice sunt după cum 13 urmează: 95°C, 1 min, un ciclu 15 95°C, 1 min 50°C, 2 min, acest set este repetat 35 de cicluri 17 72°C, 2 min 72°C, 10 min, un ciclu 19

Produsele PCR au fost fracţionate pe geluri de agaroză 1 % şi purificate din masa de gel folosind un kit Qiaexll (Qiagen). Fragmentele purificate rezultate au fost ligate în vectorul 21 de donare pCR-TOPO-folosind un kit de donare TOPO TA (Invitrogen). După ligare, jumătate din reacţia de ligare a fost transformată în celule ultracompetent XL10 Gold 23 (Stratagene). Transformaţii au fost apoi cercetaţi prin PCR cu primerii vectori 1212 şi 1233. Clonele care conţin inserturile au fost crescute pe medii LB/carbenicilină pentru prepararea 25 plasmidelor folosind un kit "Qiagen DNA plasmid miniprep". Fragmentele derivate din PCR donate au fost apoi secvenţiate folosind sistemul de secvenţiere automată Applied 27 Biosystems şi programul software asociat. Secvenţele de gene de toxine noi adiţionale şi polipeptidele înrudite cu toxinele holotip de 14 şi 44.3 kDa de la PS80JJ1 şi PS149B1 sunt 29 listate ca SECV ID NR.: 51-126. Secţiunea de mai înainte cu descrierea pe scurt a secvenţelor asigură expicaţii suplimentare ale acestor secvenţe. 31

Toxinele de tip 44.3 kDa şi genele de la trei tulpini suplimentare B.t., PS137A, PS201V2 şi PS207C3, au fost de asemenea secvenţiate folosind procedurile de mai sus (cu 33 orice diferenţă notată mai jos). A fost realizat un test PCR folosind primerii 149DEG1 (cap-coadă) şi 149DEG2 (coadă-cap). Aceşti primeri amplifică un produs de aproximativ 340 35 perechi de baze. PCR a fost realizat în următoarele condiţii: 1.95°C, 3 min 37 2. 94°C, 1 min 3. 42°C, 2 min 39 4. 12°C, 3 min + 5 sec/ciclu 5. etapele 2 până la 4 repetate de 29 de ori. 41

Produsele PCR au fost purificate pe gel folosind un kit de extracţie a gelului QiaQuick (Qiagen), fragmentul purificat a fost ligat în vectorul de donare pCR-TOPO folsind un kit 43 TOPO-TA (Invitrogen) şi ulterior transformat în celule de E. coli Ultracompetent XLIO-Gold (Stratagene). Prepararea ADN-ului transformat este descrisă mai sus. Secvenţe de gene de 45 toxină de 14 kDa pentru fiecare din cele trei noi tulpini au fost obţinute ca mai sus. Secvenţele de nucleotide şi peptide sunt prevăzute în Lista de Secvenţe ataşată după cum 47 urmează: PS137A (SECV ID NR.: 149 şi-150), PS201V2 (SECV ID NR.: 151 şi 152) şi PS207C3 (SECV ID NR.: 153 şi 154). 49 39 RO 123431 Β1

Exemplul 18. Transgene de toxină PS149B1 şi transformarea plantelor

Transgene sintetice separate optimizate pentru utilizarea cu codonul porumbului au fost desemnate atât pentru componentele toxinei de 14 kDa cât şi pentru cea de 44.3 kDa. Versiunile sintetice au fost desemnate pentru a modifica codonul guaninei şi citozinei către un nivel mai tipic pentru ADN de plante. Transgene preferate optimizate pentru plante sunt descrise în SECV ID NR.: 127-128. Regiunea promotor folosită pentru expresia ambelor transgene a fost promotorul ubiquitină Zea mays plus exonul 1 Z. mays. şi intronul 1 Z. mays. (Christensen, A.H, şi col. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689). Terminatorul de transcripţie folosit pentru ambele transgene a fost terminatorul inhibitor II proteinază (Pinii) al cartofului (An, G, şi col., 1989 Plant Cell 1: 115-22). A fost folosită fosfinotricin acetiltransferaza (PAT) ca marker selectabil pentru transformarea plantei. Gena fosfinotricin acetiltransferaza (pat) a fost izolată din bacteria Streptomyces viridochromogenes (Eckes P. şi col., 1989). Proteina PAT acetilează fosfinotricina, sau precursorul acesteia demetilfosfinotricina, conferind toleranţă la o fosfinotricină sintetizată chimic cum ar fi erbicidul glufozinat de amoniu. Acetilarea converteşte fosfinotricina la o formă inactivă care nu mai este toxică pentru plantele de porumb. Glufozinatul de amoniu este un erbicid neselectiv, nesistemic, de spectru larg. Ţesutul de regenerare al porumbului sau plantele individuale de porumb tolerante la erbicidul glufozinat de amoniu pot fi uşor identificate prin încorporarea PAT într-un mediu de regenerare sau prin aplicare prin pulverizare a erbicidului pe frunze.

Versiunea sintetică a genei pat a fost produsă pentru a modifica codonul guaninei şi citozinei la un nivel mai tipic pentru ADN de-plante. Promotorul pentru gena pat este promotorul CaMV al transcriptului 35S de la virusul mozaic al conopidei (Pietrzak şi col., 1986). Terminatorul de transcripţie este terminatorul CaMV 35 S.

Pentru transformarea ţesutului de porumb, a fost excizată dintr-un plasmid complet o porţiune liniară de ADN, care conţine atât PS149 de 14 şi 44.3 kDa şi secvenţele de codificare marker selectabil pat, cât şi componentele de reglare necesare pentru expresie. Această porţiune liniară de ADN a desemnat un insert care a fost utilizat în procesul de transformare.

Plantele de porumb care conţin transgenele de 14 kDa şi 44.3 kDa ale PS149B1 au fost obţinute prin bombardament cu microproiectile folosind tunul de particule Biolistic®0 PDS-1000He fabricat de Bio-Rad, descris în esenţă de Klein şi col (1987). Embrionii imaturi, izolaţi din ştiuleţi de porumb recoltaţi la aproximativ 15 zile după polenizare, au fost cultivaţi pe medii iniţiatoare de calus timp de trei până la opt zile. O zi după transformare, particule microscopice de wolfram au fost acoperite cu ADN purificat şi accelerate în embrionii cultivaţi, unde insertul ADN a fost încorporat în cromozomul celular. Şase zile după bombardament, embrionii bombardaţi au fost transferaţi pe mediul iniţiator de calus care conţine glufozinat (Bialaphos) ca agent de selecţie. A fost obţinut ţesut de calus sănătos, rezistent şi a fost transferat, în mod repetat, pe mediu de selecţie proaspăt, timp de aproximativ 12 săptămâni. Plantele au fost regenerate şi transferate în seră. A fost obţinut un număr total de 436 plante regenerate. Eşantioane de frunze au fost prelevate pentru analiză moleculară, pentru a se verifica prezenţa transgenelor prin PCR şi pentru a se confirma expresia proteinei străine prin ELISA. Plantele au fost apoi supuse unei testări biologice complete folosind omida porumbului Diabrotica virgifera virgifera. Plantele pozitive au fost încrucişate cu linii endogame pentru a se obţine seminţe de la plantele transformate iniţial. S-a descoperit că aceste plante sunt rezistente la stricăciunile produse de omida porumbului la testele atât în seră, cât şi pe câmp. 40 RO 123431 Β1

Exemplul 19. Teste biologice suplimentare

Preparate proteice din tulpini identificate în exemplul 16 au fost testate pentru activitate împotriva omizii porumbului Diabrotica virgifera virgifera folosind metodele de testare de bază, aşa cum au fost descrise în exemplul 13. Rezultatele sunt arătate în tabelul 13.

Tabelul 13

Tulpină LC50 (ug/cm2) 95% CI KB45A43-3 9,48 6,58-15,27 213Έ8 10,24 7,50-19,87 KR707 11,17 8,27-22,54" 185GG 11,53 7,51-16,81 187Y2 13,82 11,08-17,67 149B1 14,77 4,91-27,34 69Q 27,52 117,28-114,77" 167H2 31,38 19,35-47,60 KB54A33-10 32,62 24,76-83,85 185Z11 34,47 nefăcut KB60F5-7 34,67 19,15-124,29 242K10 34,73 21,08-58,25 201G 34,90 13,20-355,18" 204J7 38,57 29,83-48,82 KB60F5-15 38,62 15,00-2,59E03 80JJ1 41,96 27,35-139,43 203J1 43,85 23,18-69,51 KR589 47,28 29,83-230,71" 201HH2 49,94 23,83-351,77 KB60F5-11 51,84 19,38-1313,75" 158X10 52,25 43,13-77,84" KB58A10-3 53,77 ne făcut 201L3 55,01 41,01-78,96 158T3 58,07 39,59-211,13 184M2 60,54 26,57-411,88 204G4 69,09 52,32-93,83 41 RO 123431 Β1 1 Tabelul 13 (continuare)

Tulpină LC50 (ug/cm2) 95% CI 3 KB59A58-4 70,35 48,90-144,90 201H2 71,11 52,40-130,35 5 203G2 81,93 57,13-226,33 KBS9A54-4 82,03 38,50-1,63E03 7 204111 88,41 62,48-173,07 236B6 89,33 64,16-158,96 9 KR1369 93,25 71,97-205,04" KB63A5-3 94,52 51,56-542,46 11 204C3 125,45 85,26-427,67" KR1209 128,14 91,57-294,56 13 185W3 130,61 ne făcut KR625 160,36 nefăcut 15 210B 201,26 48,51-0,14E+06" KB10H-5 214,25 87,97-8,22E+03 17 KB68B57-1 264,30 48,51-8,95E+04" 223L2 3,81 E+02 nefăcut 19 KR136 7,83E+02 - T25 1.30E+03 nefăcut 21 KB61A18-1 2.58E+03 nefăcut 147U2 3.67E+03 nefăcut 23 KR200 2.14E+05 nefăcut KB59A54-5 3.32E+05 nefăcut 25 KB3F-3 4.07E+05 nefăcut 187GI(bs) 3,50E+07 nefăcut 27 MR559 20*** nedisponibil KB42C17-13 26%** nedisponibil 29 224F2 33%** nedisponibil KR959 41%** nedisponibil 31 KB2C-4 42%** nedisponibil 198H3 46%** nedisponibil 42 RO 123431 Β1

Tabelul 13 (continuare) Tulpină LC50 (ug/cm2) 95% CI KR331 47%** nedisponibil KB46 55%** nedisponibil KB71A118-6 71%** nedisponibil KB53B7-2 84%** nedisponibil 187Y2 nefăcut nedisponibil 185L12 nefăcut nefăcut 186L9 nefăcut nedisponibil KB54A1-6 nefăcut nedisponibil 187L14 nefăcut nedisponibil 187G1(b) nt nt 187G1(s) nt nt 1 3 5 7 9 11 13

Exemplul 20. Clonane moleculară, expresie şi analiza secvenţelor ADN ale unei noi 15 endotoxine binare de la tulpina PS201L3 de Bacillus thuringiensis ADN-ul genomic de la PS201L3 a fost preparat din celule crescute în culturi în 17 recipiente agitate folosind un kit Qiagen Genomic tip 500/G şi Genomic DNA Buffer Set conform protocolului pentru bacterii Gram-pozitive (Qiagen Inc.; Valencia, CA). A fost 19 construită o bancă de gene din ADN de PS201L3 parţial digerat cu Sau3AI. Digeratele de restricţie parţiale au fost fracţionate prin electroforeză pe gel de agaroză. Fragmentele ADN 21 de mărime 9,3 până la 23 kbp au fost excizate din gel, electroeluate din porţiile de gel, purificate pe coloană de schimb ionic Elutin-D (Schleicher and Schuell, Keene, NH) şi 23 recuperate prin precipitare în etanol. Inserturile Sau3AI au fost ligate în LambdaGem-11 (Promega, Madison, Wl) digerate în BanHI. Fagii recombinaţi au fost împachetaţi folosind 25 Gogapack III XL Packaging Extract (Stratagene La Jolla, CA) şi placate pe celule de E. coli KW251. Plăcile au fost ridicate pe membrane de transfer Nytran Nylon (Schleicher & Schuell, 27 Keene, NH) şi probate cu probă de genă marcată cu 32P-dCTP pentru secvenţele de codificare a toxinei binare. Această probă de genă a fost un produs PCR de aproximativ 1,0 29 kb amplificat folosind matriţa de ADN genomic de PS201L3şi oligonucleotidele "15kfor1" şi "45krev6". 31

Aceste secvenţe de nucleotide folosite pentru PCR şi secvenţiere sunt după cum urmează: 33

15kfor1 (SECVID NR.: 131) ATGTCAGCTCGCGAAGTACAC 45krev6 (SECV ID NR.: 132) GTCCATCCCATTAATTGAGGAG 35

Membranele au fost hibridizate cu proba peste noapte la 65°C apoi spălate de trei ori cu IxSSPE şi 0,1% SDS. Treisprezece plăci au fost identificate prin autoradiografie. Aceste 37 plăci au fost ulterior adunate şi înmuiate peste noapte în 1 ml 31 Buffer + 10 ul CH3CI3. Fagii au fost placaţi pentru liză confluentă pe celule gazdă KW251; 6 plăci confluente au fost 39 îmbibate în SM şi folosite pe scară largă pentru preparate ADN de fagi. ADN de fagi a fost digerat cu diverse enzime şi pus pe geluri de agaroză 0,7%. Gelurile au fost transferate pe 41 membrane Nytran prin Southern blotting şi probate cu acelaşi fragment ADN amplificat prin 43 RO 123431 Β1 PCR ca mai sus. A fost identificată o catenă Xbal de hibridizare de aproximativ 6,0 kb şi subclonată în pHT370, un vector purtător de E. coli/Bacillus thuringiensis (Arantes O, D. Lereclus [1991] Gene 108: 115-19) pentru a genera pMYC2476. Celulele de E. coli XL10 Gold Ultracorapetent (Stratagene) transformate cu pMYC2476 au fost desemnate MR1506. PMYC2476 a fost transformat ulterior în celule CryB necristalifere prin electroporare şi selecţie pe plăci EM3+eritromicină (20 ug/ml) la 30°C. CryB[pMYC2476] recombinat a fost desemnat MR561. O subcultură de MR1506 a fost depozitată în colecţia permanentă a Patent Culture Collection (NRRL), Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 USA pe 1 iunie, 2000. Numărul de acces este B-30298.

Tulpina B.t. MR561 a fost examinată pentru expresia proteinelor toxine binare PS201L3 prin imunoblotting. Celulele au fost crescute în mediu lichid NYS-CAA + eritromicină (10 ug/ml) peste noapte, la 30°C. Cultura a fost apoi peletată prin centrifugare şi o porţiune din peletele celulare au fost resuspendate şi puse pe geluri SDS-PAGE. Ambele proteine de 14 kDa şi 44 kDa au fost evidente prin analiză Western Blot atunci când au fost probate cu anticorpi specifici pentru ambele toxine de 14 kDa sau respectiv 44 kDa de PS149B1.

Secvenţierea ADN a genelor de toxine codificate pe pMYC2476 a fost realizată folosind un secvenţiator automat ABI377. Secvenţa de ADN pentru gena PS201L3 de 14 kDa este arătată în SECV ID NR.: 133. Secvenţa de peptide dedusă pentru toxina de 14 kDa a PS201L3 este arătată în SECV ID NR.: 134. Secvenţa de ADN pentru gena de 44 kDa a PS201L3 este arătată în SECV ID NR.: 135. Secvenţa de peptide dedusă pentru toxina de 44 kDa a PS201L3 este arătată în SECV ID NR.: 136.

Tabelul următor arată similaritatea şi identitatea de secvenţe a genelor binare şi proteinelor din 201L3 şi 149B1. Pentru aceste comparaţii a fost folosit programul BESTFIT (parte din pachetul software GCG). BESTFIT foloseşte algoritmul omologiei locale a lui Smith şi Waterman (Advances in Applied Mathematics 2: 482: 489(1981)).

Tabelul 14 201L3 faţă de 149B1 % similaritate % identitate secvenţa de nucleotide de 14 kDa - 71,1 secvenţa de peptide de 14 kDa 63,9 54,1 secvenţa de nucleotide de 45 kDa - 76,1 secvenţa de peptidede 45 kDa 70,9 62,7

Exemplul 21. donarea moleculară şi analiza de secvenţe ADN a noilor gene de δ-endotoxine din tulpinile PS187G1, P3201HH2 şi KR1369 de Bacillus thuringiensis S-a preparat ADN celular total din tulpinile PS187G1, PS201HH2 şi KR1369 de Bacillus thuringiensis crescute până la o densitate optică de 0,5-1,0 la lumină vizibilă de 600 nm în bullion Luria Bertani (LB). ADN-ul a fost extras folosind un kit Qiagen Genomic-tip 500/g şi Gencmic CNR. Buffer Set conform protocolului pentru bacteriile Gram-pozitive (Qiagen Inc.; Valencia, CA). Băncile de cosmide PS187G1, PS201HH2 şi KR1369 au fost construite în vectorul SuperCOsI (Stratagene) folosind inserturi de ADN celular total de PS187G1, PS201HH2 şi KR1369, digerate parţial cu Nde II. Celulele XLI-Blue MR (Stratagene) au fost transfectate cu cosmidele împachetate pentru a obţine clone rezistente 44 RO 123431 Β1 lacarbenilicinăşikanamicină. Pentru fiecare tulpină, au fost crescute 576 colonii de cosmide 1 în blocuri de 96 de godeuri în 1 ml LB + carbenicilină (100 ug/ml) + kanamicină (50 ug/ml) la 37°C timp de 18 h şi replicate pe filtre de nylon pentru screening prin hibridizare. 3

Un amplicon PCR care conţine aproximativ 1000 bp din operonul toxinei de 14 kDa şi 44 kDa al PS187G1, PS201HH2 sau KR1369 a fost amplificat din ADN genomic de 5 PS187G1, PS201HH2 sau KR1369 folosind primeri desemnaţi pentru a amplifica omologi binari: 7 15kfor1: 5'-ATG TCA GCT CGC GAA GTA CAC-3' (SECV ID NR.: 131) 45krev6: 5'-GTC CAT CCC ATT AAT TGA GCA G-3' (SECV ID NR.: 132) 9

Fragmentul ADN a fost purificat pe gel folosind extracţia QiaQuick (Qiagen). Proba a fost radiomarcată cu 32P-dCTP folosind un kit Prime-lt II (Stratagene) şi folosită în soluţie 11 apoasă de hibridizare (6xSSPE, 5x soluţie Denhardt, 0,1% SDS, 0,1 mg/ml ADN denaturat) cu filtrele de colonie la 65°C, timp de 16 h. Filtrele de colonie au fost spălate scurt, o dată în 13 0,5xSSC/0,1%SDS la temperatura camerei, urmată de două spălări adiţionale timp de 10 min la 65°C în 0,5xSSC/0,1 %SDS. Filtrele au fost apoi expuse la film de raze X timp de 15 20 min (PS187G1 şi PS201HH2) şi timp de o oră (KR1369). Oclonăcosmid care a hibridizat puternic cu proba a fost selectată pentru analize suplimentare pentru fiecare tulpină. S-a 17 confirmat că aceste clone cosmid conţin gena vizată de aproximativ 1000 bp a toxinei de 14 kDa şi 44 kDa prin amplificare PCR cu primerii listaţi mai sus. Clona cosmid a PS187G1 19 a fost desemnată PMYC3106; celulele recombinate E. coli XLI-Blue MR care conţin pMYC3106 sunt desemnate MR1508. Clona cosmid a PS201HH2 a fost desemnată 21 pMYC3107; celulele recombinate E. coli XLI-Blue MR care conţin pMYC3107 sunt desemnate MR1509. Clona cosmid a KR1369 a fost desemnată pMYC3108; celulele 23 recombinate E. coli XLI-Blue MR care conţin pMYC3108 sunt desemnate MR1510. Subculturi de M R1509 şi M R1510 au fost depozitate în colecţia permanentă a Patent Culture 25

Collection (NRRL), Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 USA pe 8 august, 2000. Numerele de acces sunt NRRL B-30330 şi respectiv NRRL-B 27 31331.

Genele toxinelor de 14 kDa şi 44 kDa din PS187G1, PS201HH2 şi KR1369 codificate 29 de pMYC3106, pMYC3107 şi respectiv pMYC3108 au fost secvenţiate folosind sistemul automat de secvenţiere ABI377 şi programul software asociat. 31

Secvenţele de nucleotide de 14 kDa şi 44 kDa din PS187G1 şi secvenţele de polipeptide deduse sunt arătate ca SECV ID NR.: 137-140. Ambele gene de toxine de 33 14 kDa şi 44 kDa sunt cadre de citire deschise complet. Secvenţele de nucleotide cadre de citire deschise ale toxinei de 14 kDa a PS187G1, secvenţele de nucleotide cadre de citire 35 deschise a toxinei de 44 kDa şi respectivele secvenţe de aminoacizi deduse sunt noi în comparaţie cu alte gene de toxine care codifică proteine cu activitate pesticidă. 37

Secvenţele de nucleotide de 14 JcDa şi 44 kDa ale PS201HH2 şi secvenţele de polipeptide deduse sunt arătate ca SECV ID NR.: 41-144. Secvenţa genei toxinei de 14 kDa 39 este cadrul de citire deschis complet. Secvenţa genei toxinei de 44 kDa este o secvenţa parţială a acestei gene. Secvenţa de nucleotide cadru de citire deschis al toxinei de 14 kDa 41 a PS201HH2, secvenţa parţială de nucleotide cadru de citire deschis şi respectivele secvenţe de aminoacizi deduse sunt noi în comparaţie cu alte gene de toxine care codifică 43 proteine cu activitate pesticidă.

Secvenţele de nucleotide de 14 kDa şi 44 kDa ale KR1369 şi secvenţele de 45 polipeptide deduse sunt arătate ca SECV ID NR.: 145-148. Ambele secvenţe de gene ale toxinei de 14 kDa şi 44 kDa sunt cadre de citire deschise complete. Secvenţa de nucleotide 47 cadru de citire a toxinei de 14 kDa a KR1369, secvenţe de nucleotide cadru de citire a toxinei de 44 kDa şi respectivele secvenţe de aminoacizi deduse sunt noi în comparaţie cu alte gene 49 de toxine care codifică proteine cu activitate pesticidă. 45 RO 123431 Β1

Exemplul 22. Construcţia şi expresia unei gene hibride de fuziune care conţine genele de toxine binare de 14 kDa şi 44 kDa ale PS149B1.

Primerii de oligonucleotide au fost desemnaţi la capetele 5' şi 3' ale ambelor gene de 14 kDa şi 44 kDa de la PS149B1. Aceste oligonucleotide au fost desemnate pentru a crea o fuziune de genă prin SOE-PCR ("Gene Splicing By Overlap Extension: Tailor-made Genes Using PCR", Biotechniques 8: 528-535, May 1990). Cele două gene au fuzionat împreună în ordinea inversă găsită în operonul toxinei binare native (adică mai întâi gena de 44 kDa, urmată de gena de 14 kDa).

Secvenţele oligonucleotidelor folosite pentru SOE-PCR au fost următoarele: F1new: AAATATTATTTTATGTCAGCSDSTGAAGTACaCATTG (SECV ID NR.: 155) R1new: tctctGGTACCttaTTAtgatttatgcccatatcgtgagg (SECV ID NR.: 156) F2new: agagaACTAGTaaaaaggagataaccATGttagatactaataaag (SECV ID NR.: 157) R2new: CGTGCTGACATAAAATAATATTTTTTTAATTTTTTTAGTGTACTTT (SECV ID NR.: 158)

Oligonucleotida "F1new" a fost desemnată pentru amplificarea directă de la capătul 5' al genei de 14 kDa şi hibridizează la capătul 3' al genei de 44 kDa. Oligonucleotida "R1new" a fost desemnată pentru amplificarea directă de la capătul 3' al genei de 14 kDa. Acest primer a fost desemnat cu doi codoni stop pentru a asigura terminarea translaţiei. Acesta a fost de asemenea desemnat cu un situs Kpnl pentru donarea direcţională într-un vector de expresie plasmidic pentru Pseudomonas fluorescens. Oligonucleotida "F2new" a fost desemnată pentru amplificarea directă de la capătul 5' al genei de 44 kDa. Acesta include de asemenea o secvenţă de legare a ribozomului şi un situs de clonare-Spel. Oligonucleotida "R2new" a fost desemnată pentru amplificarea directă de la capătul 3' al genei de 44 kDa şi hibridizează la capătul 5' al genei de 14 kDa.

Cele două gene au fost mai întâi amplificate independent din ADN genomic de PS149B1; gena de 14 kDa folosind "F1new" şi "R1new", iar gena de 44 kDa folosind „F2new" şi "R2new". Produşii au fost apoi combinaţi într-un tub PCR şi amplificaţi împreună folosind "R1new" şi "F2new”. în acest moment, s-a folosit Herculase™ Enhanced Polymerase Blend (Stratagene, La Jolla, CA), la o temperatură de coacere de 48°C pentru a amplifica fragmentul de ADN de aproximativ 1,5 kb care conţine gena de fuziune. Acest fragment ADN a fost digerat ulterior folosind Kpnl şi Spel, fracţionat pe geluri de agaroză şi purificat prin electroeluţie. Vectorul plasmidic a fost de asemenea digerat cu Kpnl şi Spel, fracţionat pe geluri de agaroză, purificat prin eletroeluţie şi tratat cu fosfatază. Vectorul şi insertul au fost apoi ligaţi împreună peste noapte la 14°C. Fragmentele ADN ligate au fost transformate în celule P.f. MB214 prin electroporare şi selecţie peste noapte pe plăci LB+tetraciclină (30 ug/ml). Tulpinile care conţin gena de fuziune au fost identificate prin diagnostic PCR şi secvenţiate pentru verificarea matisării cu succes a genelor. O tulpină reprezentativă care conţine gena de fuziune donată a fost desemnată MR1607; plasmidul recombinat a fost desemnat pMYC2475. O subcultură de MR1607 a fost depozitată în colecţia permanentă a Patent Culture Collection (NRRL), Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 SUA, pe 8 august 2000. Numărul de acces este NRRL B-30332. MR1607 a fost crescută, iar producţia de proteină a fost verificată prin SDS-PAGE şi imunobloting. O catenă proteică de aproximativ 58 kDa care reprezintă produsul de fuziune 44 kDa +14 kDa a fost identificat atunci când s-a analizat conform Western blotting cu anticorpi specifici atât toxinei de 14 kDa cât şi toxinei de 44 kDa.

Secvenţa proteinei de fuziune de 58 kDa este furnizată în SECV ID NR.: 159. Secvenţa de ADN pentru gena de fuziune este prevăzută în SECV ID NR.: 160. 46 RO 123431 Β1

Exemplul 23. Studiul amestecului omolog binar al creşterii tulpinilor omoloage 1

Au fost selectate patru tulpini, una din fiecare familie majoră de toxine binare-149B1, 80JJ1, 210L3 şi 167H2. Pentru a reduce timpul pierdut cu purificarea proteinelor de toxine 3 individuale, au fost crescute următoarele clone de Pseudomons fluorescens (P.f.): MR1253 (14 kDa de 149B1) şi MEU256 (44 kDa de 149B1). în mod similar, s-au folosit clonele B.t. 5 MR541 (care exprimă 14 kDa de 80JJ1) şi MR542 (44 kDa de 80JJ1). Tulpinile B.t. au fost crescute aşa cum s-a descris în exemplul 1. Peletele au fost spălate de 3 ori cu apă şi 7 stocate la -20°C până când a fost nevoie. Tulpinile de P.f. au fost crescute în loturi de 10 I în fermentatoare Biolafitte folosind proceduri standard. Peletele au fost depozitate la -80°C 9 până când a fost nevoie.

Extracţia şi purificarea toxinelor 11

Purificarea 167H2, MR541, MR542,201L3. Extracţiile peletelor celulare au fost făcute folosind soluţie tampon de citrat de sodiu 100 mM la un pH care a variat de la 3,0 până la 13 5,5. într-o extracţie tipică, peletele au fost extrase cu un volum de soluţie tampon de 1/10 până la 1/3x din volumul de cultură original. Peletele au fost suspendate în soluţie tampon 15 şi plasate pe o platformă oscilantă la 4°C pe perioade de timp variind de la 2,5 h până la o noapte întreagă. Extractele au fost centrifugate, iar supranatanţii au fost reţinuţi. Această 17 procedură a fost repetată cu fiecare tulpină până când s-a obţinut cel puţin 10 mg din fiecare proteină. SDS-PAGE a confirmat prezenţa/absenţa proteinelor de toxine în extracte folosind 19 sistemul cu gel NuPAGE Bis/Tris (Invitrogen). Au fost preparate eşantioane conform instrucţiunilor fabricantului şi au fost încărcate pe geluri 4-12%, iar electroforetogramele au 21 fost dezvoltate cu tampoane MES. Excepţia de la această procedură a fost prepararea tuturor eşantioanelor 201L3. Aceste eşantioane au fost preparate prin diluarea 1/2x cu 23 soluţie soluţie tampon de eşantion Laemmli de la BioRad şi încălzirea la 95°C, timp de 4 min. Dozarea proteinelor a fost făcută prin densitometrie pe gel cu scanare laser cu BSA drept 25 standard (Molecular Dynamics Personal Densitometer SI). Extractele au fost limpezite prin filtrare printr-un filtru membrană de 0,2 pm şi depozitate la 4°C. 27

Purificarea MR1253 şi MR1256. Proteinele recombinate MR1253 şi MR1256 corespunzând proteinelor de 14 kDa şi respectiv 44 kDa ale149B1, au fost preparate ca 29 incluziuni solubilizate. Corpii de incluziune au fost preparaţi folosind proceduri standard.

Corpii de incluziune au fost solubilizaţi în EDTA InM, citrat de sodiu 50 nM, pH 3,5. 31

Purificarea toxinelor individuale 167H2 şi 201L3. Toate extractele cunoscute că ar conţine fie 14 kDa fie 44 kDa, fie pe ambele, au fost combinate. Extractul combinat a fost 33 dializat în citrat de sodiu 100 mM, NaC1150 nM, pH 4. Tubul de dializă a fost de la Pierce (Snakeskin 10K MWCO). Eşantioanele au fost dializate de obicei timp de aproximativ 6 h şi 35 apoi din nou peste noapte în soluţie tampon proaspătă.

Extractele au fost apoi concentrate de obicei fie cu dispozitive de filtrate centrifugale 37 Centriprep 10, fie cu Centricon Plus-20 (Biomax-5, 5000 NMWL), dozate pentru ambele proteine de 14 kDa şi 44 kDa şi supuse la croroatografie de filtrare pe gel. 39 în prepararea pentru cromatografie, toate eşantioanele şi soluţiile tampon au fost filtrate prin filtre de 0,2 pm şi degazate. Eşantioanele au fost apoi aplicate pe coloane de 41 filtrare cu gel HiPrep 26/60 Sephacryl care au fost echilibrate cu două volume de soluţii tampon de separare, citrat de sodiu 100 nM, pH 4,0. Volumele de eşantioane au variat de 43 la 5 până la 10 ml. Testele au fost controlate de un purificator AKTA sistem 100 FPLC (Amersham pHarmacia). Cromatografia a fost realizată la temperatura ambiantă. Soluţia 45 tampon care a curs prin coloană pe timpul procedurii a fost menţinută la 0,7 ml/min. Proteinele au fost detectate prin monitorizarea absorbţiei UV la 280 nm. Fracţiunile au fost 47 colectate şi depozitate la 4°C. Fracţiunile care conţin atât proteina de 14 kDa cât şi pe cea de 44 kDa au fost adunate şi verificate pentru puritate prin SDS-FAGE aşa cum s-a descris 49 mai sus. 47 RO 123431 Β1

Pentru eşantioanele 167H2, s-au detectat două maxime mari şi au fost separate unul de celălalt în godeuri la referinţă. SDS-PAGE aplicat fracţiunilor a arătat că fiecare maxim a reprezentat una dintre proteinele toxinelor. în eşantionul 201L3, trei godeuri au definit maxime şi s-a detectat un maxim rotunjit. SDS-PAGE a dezvăluit că primul maxim a reprezentat o proteină de 100 kDa plus o proteină de 80 kDa. Al doilea maxim a reprezentat proteina de 44 kDa, în timp ce maximul rotunjit a fost o proteină de 40 kDa. Al treilea maxim a fost proteina de 14 kDa. Fracţiunile cu proteina de 44 kDa din ambele eşantioane au fost combinate, aşa cum au fost şi toate fracţiunile care conţin proteina de 14 kDa.

Proteinele 149B1 fuseseră obţinute individual din clonele Pf MR1253 şi MR1256 şi prin urmare, nu a mai fost necesară purificarea suplimentară. în mod similar, recombinaţii 80JJ1, MR541 şi MR542 au produs proteinele individuale de 14 kDa şi 44 kDa, în felul acesta eliminând purificarea suplimentară.

Prepararea eşantioanelor pentru testarea biologică LCS0 pentru omida porumbului Diabrotica virgifera virgifera

Dializă. Eşantioane din toxinele binare individuale au fost dializate în 6 I de citrat de sodiu 20 mM, pH 4,0. Prima dializă a durat mai multe ore, eşantioanele au fost transferate în soluţie tampon proaspătă şi au fost lăsate să dializeze pentru noapte. în final, eşantioanele au fost transferate în soluţie tampon proaspătă şi dializate încă câteva ore. Sursele de eşantioane de proteine au fost fie fracţiunile adunate de la filtrarea pe gel (167H2, 201L3), extractele de pelete (MR541, MR542), fie extractele de pelete de incluziune (MR1253, MR1256). Toate eşantioanele au fost filtrate prin membrane de 0,2 pm pentru sterilizare.

Concentraţie. Eşantioanele au fost concentrate cu dispozitive de filtrare centrifugale Centricon Plus-20 (Biomax-5, 5000 ÎMWL) (Millipore).

Dozare. Eşantioanele au fost dozate pentru proteine ca mai sus. Pentru a întruni cerinţele testării biologice LC50, a fost nevoie de un minimum de 6,3 mg din fiecare proteină de toxină, la o concentraţie variind între 0,316 până la 1,36 mg/ml pentru diverse combinaţii. Dacă a fost necesar, eşantioanele au fost concentrate ca mai sus, sau au fost diluate cu soluţie tampon (citrat de sodiu 20 mM, pH 4,0) şi redozate.

Mixarea testării biologice LCştfbinare. Pentru fiecare dintre cele patru tulpini, proteina de 14 kDa a fost combinată cu o cantitate de 44 kDa din fiecare tulpină, pentru a da un raport de masă de 1/1. Doza extremă a fost de 50 ug/cm2 pentru amestecuri, cu excepţia amestecurilor cu proteina de 14 kDa a 203J1. Dozele extreme ale amestecurilor cu această proteină au fost doar de 44 ug/cm2. Pentru controale, fiecare proteină a fost supusă individual, cum a fost şi soluţia tampon de extracţie, citrat de sodiu 20 mM pH 4,0. Combinaţiile native au fost de asemenea testate (adică 14 kDa + 44 kDa ale 149B1). Toate combinaţiile de toxine şi soluţii tampon de control au fost evaluate de trei ori prin testare biologică împotriva omizii porumbului Diabrotica virgifera virgifera, în timp ce toxinele individuale au fost testate doar o dată.

Rezultatele sunt prezentate mai jos în tabelul 15 (Rezultatele LC50 pentru combinaţiile de toxine) şi tabelul 16 (Compararea potenţelor tulpinilor cu 149B1). 48 RO 123431 Β1

Tabelul 15 1 Combinaţia de toxine încărcarea extremă ul/godeu LC50 (ug/cm2) 80JJ114+ 80JJ144 96 28(19-44 C.l.) 167H2 44 159 > doza extremă 201L3 44 172 fără răspuns la doză 149B1 44 78 fără răspuns la doză 167H2 14+ 167H2 44 161 19(13-27 C.l.) 80JJ1 44 97 fără răspuns la doză 201L3 44 174 14(10-22 C.l.) 149B1 44 80 fără răspuns la doză 201L3 14+ 201L3 44 193 fără răspuns la doză 80JJ1 44 116 fără răspuns la doză 167H2 44 180 fără răspuns la doză 149B1 44 99 fără răspuns la doză 149B114+ 149B1 44 45 10 (7-15 C.l.) 80JJ1 44 63 11 (8-16 C.l.) 167H2 44 126 8(6-11 C.l.) 201L3 44 139 18 (13-27 C.l.) 3 5 7 9 11 13 15 17 19

Tabelul 16

Comparaţia poţentelor tulpinilor cu 149B1 Combinaţia de toxine Potenţă relativă 149B1 14+ 149B1 44 cu care sunt comparate toate celelalte 149B1 14 + 80JJ1 44 0,9 149B1 14+ 167H2 44 1,3 149B1 14 + 201L3 44 0,5 80JJ1 14 + 80JJ1 44 0,4 167H2 14 + 167H2 44 0,5 167H2 14 + 201L3 44 0,7 23 25 27 29 21

Rezultatele sunt afişate de asemenea grafic în fig. 3. 31

Combinaţiile native au fost puternic active împotriva omizii porumbului Diabrotica virgifera virgifera mai puţin pentru 201L3. Totuşi, 44 kDa din 201L3 a fost activă atunci când 33 a fost combinată fie cu 14 kDa de 167H2 sau 149B1. Alte combinaţii active au fost 14 kDa de 149B1 cu 44 kDa de 80JJ1 sau 167H2, cea din urmă părând să fie mai activă decât 35 amestecul nativ 149B1. Nu s-a înregistrat răspuns la doză pentru ambele proteine individuale, soluţia tampon şi controalele apă. 37 49 RO 123431 Β1

Exemplul 24. Controlul omizii porumbului Diabrotica undecimpunctata howardi cu proteina de 14 kDa a PS149B1. O pudră care conţine aproximativ 50%, în greutate, dintr-o δ-endotoxină de 14 kDa, descoperită la origine în tulpina PS149B1 de Bacillus thuringiensis, a fost izolată din tulpina recombinată MR1253 de Pseudomonas fluorescens. Această pudră a fost evaluată pentru activitatea insecticidă folosind procedura următoare. O dietă artificială pentru insecte (R.l. Rose şi J.M. McCabe(1973) "Laboratory rearing techniques for rearing corn rootworm" J. Econ. Entomol. 66(2): 398-400 a fost dispersată la aproximativ 0,5 ml/eprubetăîn tăvi de testare biologică, cu 128 de godeuri (C-D International, Pitman, NJ) pentru a produce o arie a suprafeţei de aproximativ 1,5 cm2. Suspensii de soluţii tampon (fosfat de potasiu 10 mM, pH 7,5) ale pudrei de proteină de 14 kDa au fost aplicate pe suprafaţa dietei artificiale pentru insecte la 50 μΙ/godeu, iar suprafaţa dietei a fost lăsată să se usuce. Controalele soluţiei tampon au fost, de asemenea, incluse în fiecare test. Un singur neonat de omida porumbului de Diabrotica undecimpunctata howardi, a fost plasat în fiecare godeu, iar godeurile au fost capsulate cu capacele care au fost prevăzute împreună cu tăvile. Probele au fost menţinute timp de 6 zile la 28°C, timp după care larvele vii au fost cântărite ca un grup pentru fiecare tratament. Procentul de inhibare a creşterii a fost calculat prin scăderea greutăţii insectelor vii din fiecare tratament din greutatea insectelor vii de control, şi apoi împărţirea cu greutatea controlului. Acest rezultat a fost înmulţit cu 100 pentru a converti numărul la un procent. Inhibarea creşterii a fost calculată pentru fiecare dintre cele 5 teste care au conţinut fiecare 16 insecte pe tratament, iar inhibarea creşterii a fost mediată pe teste.

Rezultatele demonstrează că proteina de 14 kDa a inhibat creşterea omizii porumbului Diabrotica undedecimpunctata howardi\ntr-o maniară dependentă de concentraţie. Tabelul 17 arată inhibarea creşterii omizii porumbului Diabrotica undeciupunctata howardi cu proteina de 14 kDa.

Tabelul 17 T ratament Concentraţie în pg ia/cm2 % inhibare creştere proteina de 14 kDa 1 32 proteina de 14 kDa 3 55 proteina de 14 kDa 9 78 ia = ingredient activ

Exemplul 25. Controlul sfredelitorului porumbului şi a omizii porumbului Helicoverpa Zea cu toxinele binare PS149B1 O pudră care conţine 54% dintr-o δ-endotoxină de 14 kDa, şi altă pudră care conţine 37% dintr-o δ-endotoxină de 44 kDa, ambele descoperite la origine în tulpina PS149B1 de Bacillus thuringiensis, au fost izolate din tulpinile recombinate MR1253 şi respectiv MR1256 de Pseudomonas fluorescens. Amestecuri ale acestor pudre au fost evaluate pentru activitate insecticidă folosind următoarea procedură.

Dieta artificială pentru insecte (R. I. Rose and J.M. McCabe (1973), "Laboratory rearing techniques for rearing corn rootworm" J. Econ. Entomol. 66(2): 398-400 au fost dispersate la aproximativ 0,5 ml/godeu în tăvi testare biologică cu 128 de godeuri (C-D International, Pitman, NJ) pentru a produce o arie a suprafeţei de aproximativ 1,5 cm2. Suspensii de soluţii tampon (fosfat de potasiu 10 nM, pH 7,5) ale pudrelor de proteine au fost amestecate şi au fost aplicate pe suprafaţa dietei artificiale pentru insecte la 50 μΙ/eprubetă. Suprafaţa dietei a fost lăsată să se usuce. Controalele soluţii tampon au fost de asemenea incluse în fiecare test. O singură larvă neonată a fost plasată în fiecare eprubetă, iar epru-betele au fost capsulate cu capacele care au prevăzute împreună cu tăvile. Testele au fost realizate cu sfredelitorul porumbului Osthnia Nubiiedis şi omida porumbului Helicoverpa zea 50 RO 123431 Β1 (ambii fiind lepidoptere) Probele au fost menţinute timp de 6 zile la 28°C, timp după care 1 larvele vii au fost cântărite ca un grup pentru fiecare tratament. Procentul de inhibare a creşterii a fost calculat prin scăderea greutăţii insectelor vii din fiecare tratament din 3 greutatea insectelor vii de control, şi apoi împărţirea cu greutatea controlului. Acest rezultat a fost înmulţit cu 100 pentru a converti numărul la un procent. Inhibarea creşterii a fost 5 calculată pentru fiecare dintre cele 4 teste, care au conţinut fiecare 14 până la 16 insecte pe tratament, iar inhibarea creşterii a fost mediată pe teste. 7

Rezultatele demonstrează că proteina de 14 kDa a inhibat creşterea sfredelitorului porumbului şi a omizii porumbului Helicoverpa Zea într-o manieră dependentă de 9 concentraţie. Tabelul 18 arată inhibarea creşterii sfredelitorului porumbului (ECB) şi a omizii porumbului Helicoverpa Zea (CEW) cu amestecurile de proteine PS149B1. 11

Tabelul 18 proteina de 14 kDa + proteina 44 kDa concentraţia în pg ia/cm2 % inhibare creştere CEW ECB 3,7 + 11 42 59 11+33 57 77 33+100 61 89 ia= ingredient activ 13 15 17 19

Exemplul 26. Caracterizarea suplimentară a proteinelor de 45 kDa şi configuraţia primer pentru identificarea proteinelor şi polinucleotidelor adiţionale 21

Prezenta invenţie nu include numai secvenţele exemplificate în mod specific. Porţiuni din genele şi toxinele prezenţei invenţii pot fi utilizate pentru a identifica alte gene şi toxine 23 înrudite. Astfel, prezenta invenţie include polinucleotide care codifică proteine sau polipeptide care cuprind cel puţin zece aminoacizi adiacenţi, de exemplu, ale oricăreia dintre proteinele 25 de tip binar sau polipeptide incluse în lista de secvenţe ataşată şi descrise aici. Alte alcătuiri includ polinucleotide care codifică de exemplu, cel puţin 20, 30,40, 50,60, 70, 80, 90 şi 100 27 de aminoacizi adiacenţi, ai unei proteine exemplificate aici; aceste numere se aplică, în mod similar, şi nucleotidelor adiacente ale unei proteine exemplificate aici. Proteinele codificate, 29 de asemenea, polinucleotide sunt incluse în prezenta invenţie. Asemenea, polinucleotide care cuprind nucleotide adiacente (care codifică proteine sau polipeptide ce cuprind peptide 31 de aceste mărimi aproximative) sunt incluse în prezenta invenţie.

Deşi diferite cele mai "apropiate" toxine de cele ale prezentei invenţii, se crede că 33 sunt proteinele de 51 şi 42 kDa cu acţiune împotriva ţânţarilor ale Bacillus sphaericus. Ataşate drept figurile 4 şi 5 sunt alinieri de proteine şi alinieri de secvenţe de nucleotide ale 35 toxinelor şi genelor sphaericus de 51 şi 42 kDa şi toxina şi gena de 45 kDa a 149B1. în alinierea nucleotidelor sunt subliniate două blocuri de secvenţe, la care pot fi făcuţi 37 primeri. O pereche de primeri PCR de exemplu, este inclusă mai jos, şi în orientarea 5-3' (45kD3'rc) este arătat drept complement). Aceşti primeri au fost folosiţi cu succes pentru a 39 identifica membri adiţionali ai familiei binare de 45 kDa. Secvenţe complet redundante şi o pereche profetică sunt de asemenea incluse mai jos. 41 45kD5': GAT RAT RAT CAA TAT ATT ATT AC (SECV ID NR.: 161) 45kD3'rc: CAA GGT ART AAT GTC CAT CC (SECV ID NR.: 162) 43

Aceste secvenţe sunt utile atât ca secvenţe scrise cât şi ca nişte complemenţi inverşi (03 şi 04 sunt complementari lui 45kD3'rc, primenii coadă-cap exemplificaţi). 45 45kD5'01: GAT GATGrTmrAk wwATTATTrC A (SECV ID NR.: 163) 45kD5'02: GAT GATGrTmrAT ATATTATTrC A (SECV ID NR.: 164) 47 45kD3'03: GGAwG krCdyTwdTm CCwTGTAT (SECV ID NR.: 165) 45kD3'04: GGAwG kACryTAdTA CCTTGTAT (SECV ID NR.: 166) 49 51 RO 123431 Β1

Referitor la modul în care au fost identificate toxinele sphaericus, o căutare în baza de date BLAST (Altschul şi col, (1997) "Gapped BLAST şi PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs" Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) folosind proteina de 45 kDa a 149B1 a găsit potriviri la proteina de incluziune cristalină de 42 kDa a B. sphaericus (scor de aşteptare 3*1014) şi proteina de incluziune cristalină de 51 kDa a B. sphaericus (scor de aşpteptare 3*10"9). O aliniere a secvenţei peptidei de 45 kDa a 149B1 cu proteina de incluziune cristalină de 42 kDa a B. sphaericus a avut drept rezultat o aliniere care are 26% identitate în peste 325 reziduuri. Scorul de aliniere este 27,2 sd peste scorul mediu a 100 alinieri aleatoare. O analiză similară a secvenţei peptidei de 45 kDa a 149B1 la proteina de incluziune cristalină de 42 kDa a B. sphaericus are ca rezultat o aliniere ce are 29% identitate peste 229 reziduuri. Scorul de aliniere este 23,4 sd peste scorul mediu a 100 de alinieri aleatoare. Scorurile de aliniere > 10 sd peste media alinierilor aleatoare au fost considerate semnificative (Lipman, D.J. şi Pearson, W.R. (1985) "Rapid and sensitive similariţy searches" Science 227: 1435-1441; Doolittle, R.F. (1987), Of URFs and ORFs: a primer on how to analyze derived amino acid sequences, University Science Books, Mill Valley, CA).

Pentru referinţă, secvenţele de proteine similare structural CrylAa, Cry2Aa şi Cry3Aa au fost comparate în acelaşi fel. Cry2Aa faţă de CrylAa şi Cry2Aa faţă de Cry3Aa partajează 29% şi 27% identitate peste 214 şi respectiv 213 reziduuri, cu scoruri de aliniere 32,2 sd şi 29,5 sd peste scorul mediu a 100 de alinieri aleatoare. O aliniere a secvenţei proteinei de 45 kDa a 149B1 şi secvenţa proteinei Cry2Aa a avut ca rezultat un scor de aliniere în 1 sd al mediei a 100 de alinieri aleatoare.

Sunt reţinute, de asemenea, următoarele comparaţii:

Tabelul 19

Comparaţie Calitate Lungime Raport Spaţii Similaritate Identitate Calitate medie* ps149b1 -45.pep x 07712 189 325 0,612 12 35,135 26,351 39,4 ± 5,5 ps149b1 -45.pep x 07711 161 229 0,742 9 36,019 28,910 39,3 ± 5,2 cry2aal.pep x crylaal.pep 182 214 0,888 6 37,688 28,643 43,5 ± 4,3 cry3aal.pep x cry2aal.pep 187 213 0,926 6 40,500 27,000 42,3 ± 4,9 ps149b1 -45.pep x cry2aal.pep 40 28 1,429 0 42,857 35,714 41,6 ±5,6 * pe baza a 100 randomizări

Pentru comparaţii suplimentare şi pentru configuraţii primer suplimentare, sunt notate următoarele referinţe:

Oei şi col., "Binding of purified Bacillus sphaericus binary toxin and its deletion derivatives to Culex quinquefasciatus gut: elucidation of funcţional bindings domains" Jouxnal of General Microbiology 138(7): 1512-26.

Pentru 51 kDa: 35-448 este activă; 45-448 nu este; 4-396 este activă; 4-392 nu este.

Pentru 42 kDa: 18-370 este activă; 35-370 nu este; 4-358 este activă; 4-349 nu este.

Lucrarea a fost făcută cu fuziuni G5T purificate şi clivate cu trombină. Toate trunchierile au fost testate cu ale altor subunităţi intacte. Toate deleţiile au avut anumite pierderi de activitate. P51deltaC56 se leagă, dar nu internalizează 42. P51 delta N45 nu se leagă. Doar 42 kDa + 41 kDa sunt internalizate. Ambele proteine netoxice N-terminale şi C-terminale eşuează în legarea la proteina de 51 kDa sau la complexul receptor 51 kDa.

Davidson şi col., (1990) "Interaction of the Bacillus sphaericus mosquito larvicidal proteins" Can. J, Microbiol. 36(12): 870-8. Terminalele N ale proteinelor purificate prin SDS-PAGE obţinute de la B. sphaericus. S29 şi N31 ale 51 kDa şi S9 a 42 kDa în complexe 68-74 kDa (neredus). S9 şi S29 ale 51 şi N31 a catenei de la 42 la 51 kDa (neredusă). în geluri reduse catena de 45 kDa a avut S29 şi N31 ale 51 kDa, iar catena de 39 kDa a conţinut S9 a proteinei de 42 kDa. 52 RO 123431 Β1

Baumann şi col. (1988) "Sequence analysis of the mosquitocidal toxin genes 1 encoding 51.4- şi 41.9 -kilodalton proteins from Bacillus sphaericus 2362 and 2297, J. Bacteriol. 17: 2045-2050. Terminalul de 41.9 kDa la D5 de la protează de B. sphaericus şi 3 111 de la chimotripsină; C-terminus urmează după R349 cu tripsină. Regiunile de similaritate îmbunătăţită au fost identificate ca fiind corespunzătoare multora dintre cele de mai sus. 5 Blocuri de secvenţe similare A până la D între proteinele de 51 şi 42 kDa. în sumar, toxinele de sphaericus discutate mai sus nu se intenţionează să fie incluse 7 în întinderea prezentei invenţii (de fapt, acestea sunt excluse în mod specific). în această privinţă, secvenţele adiacente divergente, aşa cum au fost exemplificate în alinieri (figurile 9 4 şi 5) discutate mai sus, pot fi folosite ca primeri pentru a identifica toxine unice care sunt sugerate, dar nu exemplificate în mod specific aici. Totuşi, secvenţele adiacente conservate, 11 aşa cum sunt prezentate în alinieri, pot fi de asemenea utilizate conform prezentei invenţii pentru a identifica toxine binare de tip 14/45 kDa noi (active împotriva omizii porumbului şi 13 a altor dăunători).

Exemplul 27. Inserţia şi expresia genelor de toxine în plante 15

Un aspect al prezentei invenţii este transformarea plantelor cu polinucleotide ale prezentei invenţii, care exprimă proteine ale prezentei invenţii. Plantele transformate sunt 17 rezistente la atacul dăunătorilor vizaţi.

Noile gene active împotriva omizii porumbului descrise aici pot fi optimizate pentru 19 expresia în alte organisme. De exemplu, secvenţe de gene optimizate pentru porumb care codifică toxinele PS80JJ1 de 14 JcDa şi 44 kDa sunt prezentate în SECV ID NR.: 44 şi 21 respectiv SECV ID NR.: 45.

Genele care codifică proteine cu activitate pesticidă, aşa cum sunt prezentate aici, 23 pot fi inserate în celule de plante folosind o diversitate de tehnici care sunt binecunoscute în domeniu. De exemplu, un mare număr de vectori de donare care cuprind un sistem de 25 replicare în E. coli. şi un marker ce permite selecţia celulelor transformate sunt disponibile pentru prepararea şi inserţia genelor străine în plantele superioare. Vectorii cuprind, de 27 exemplu, pBR322, serii pUC, serii M13mp, pACYC184, etc. în consecinţă, secvenţa care codifică toxina B.t. poate fi inserată în vector la un situs de restricţie adecvat. Plasmidul 29 rezultat este folosit pentru transformarea în E. coli. Celulele de E. coli sunt cultivate într-un mediu nutritiv adecvat, apoi sunt recoltate şi lizate. Plasmidul este recuperat. Analiza 31 secvenţelor, analiza restricţiei, electroforeza şi alte metode biologice de biochimie moleculară sunt folosite, în general, ca metode de analiză. După fiecare manipulare, secvenţa ADN 33 folosită poate fi clivată şi unită la secvenţa ADN următoare. Fiecare secvenţă de plasmid poate fi donată în acelaşi plasmid sau în alte plasraide. Depinzând de metoda de inserţie 35 a genelor dorite în plantă, pot fi necesare alte secvenţe de ADN. Dacă, de exemplu, este folosit plasmidul Ti sau Ri pentru transformarea celeulei plantei, atunci cel puţin la marginea 37 dreaptă, dar adesea la marginea dreaptă şi stângă a ADN-T a plasmidului Ri sau Ti trebuie unită ca regiune de flancare a genelor care se inserează. 39

Utilizarea ADN-T pentru transformarea celulelor de plante a fost cercetată intensiv şi descrisă suficient în EP 120 516; Hoekema (1985): The Binary Plant Vector System, 41 Offset-durkkerij Kanters B.V. Alblasserdam, capitol 5; Fraley şi col. Cric. Rev. Plant Sci. 4: 1-46 şi An şi col. (1985) EMBO J. 4: 277-287. 43

Odată ce ADN-ul inserat a fost integrat în genom, acesta este relativ stabil acolo şi ca regulă, nu mai iese afară. Acesta conţine în mod normal un marker de selecţie care 45 conferă celulelor de plante transformate rezistenţă la un biocid sau un antibiotic cum ar fi kanamicina, G 418, bleomicina, higromicina sau cloramfenicol, inter alia. Markerul utilizat 47 individual trebuie în consecinţă să permită mai degrabă selecţia celulelor transformate decât a celulelor care nu conţin ADN-ul inserat. 49

Sunt disponibile un număr mare de tehnici pentru inserarea de ADN într-o celulă gazdă vegetală. Aceste tehnici includ transformarea cu ADN-T folosind Agrobacterium 51 tumefaciens sau Agrobacterium rhizogenes ca agent de transformare, fuziune, injecţie, 53 RO 123431 Β1 biolistică (bombardament cu microparticule) sau electroporare cât şi alte metode posibile. Dacă se foloseşte Agrobacteria pentru transformare, ADN-ul de inserat trebuie donat în plasmide speciale, şi anume fie într-un vector intermediar, fie într-un vector binar. Vectorii intermediari pot fi integraţi în plasmidele Ti sau Ri prin recombinarea omoloagă ce conţine secvenţele care sunt omologe secvenţelor din ADN-T. Plasmidele Ti sau Ri cuprind, de asemenea, regiunea vir necesară pentru transferul ADN-T. Vectorii intermediari nu se pot replica ei înşişi în Agrobacteria. Vectorul intermediar poate fi transferat în Agrobacterium tmefaciens prin intermediul unei plasmide helper (conjugare). Vectorii binari se pot replica ei înşişi atât în E. coli cât şi în Agrobacteria. Aceştia cuprind o genă marker de selecţie şi un linker sau poli-linker care este încadrat de regiunile de margine ADN-T stângă şi dreaptă. Aceştia pot fi transformaţi direct în Agrobacteria (Holstersşi col. [1978] Mol. Gen. Genet 163: 181-187). Agrobacterium folosite ca celulă gazda trebuie să cuprindă un plasmid care poartă regiunea vir. Regiunea vir este necesară pentru transferul ADN-T în celula de plantă. Poate fi conţinut ADN-T suplimentar. Bacteria transformată astfel este folosită pentru transformarea celulelor de plantă. Plantele explantate pot fi cultivate în mod avantajos cu Agrobacterium tumefaciens sau Agrobacterium rhizogenes pentru transferul ADN în celula plantei. Plante întregi pot fi apoi regenerate din materialul vegetal infectat, (de exemplu, bucăţi de frunză, segmente de tulpină, rădăcini, dar de asemenea protoplaşti sau celule cultivate în suspensie) într-un mediu adecvat, care poate conţine antibiotice sau biocide pentru selecţie. Plantele obţinute astfel pot fi testate pentru prezenţa ADN-ului inserat. Nu sunt condiţii speciale pentru plasmide în cazul injectării şi electroporării. Este posibil să se folosească plasmide obişnuite cum ar fi, de exemplu, derivaţi pUC.

Celulele transformate cresc în interiorul plantei în modul obişnuit. Acestea pot forma celule germinative şi transmit trăsătura(ile) plantelor urmaşe. Asemenea plante pot fi crescute în modul normal şi încrucişate cu plante care au aceiaşi factori ereditari transformaţi sau alţi factori ereditari. Indivizii hibrizi rezultaţi au proprietăţile fenotipice corespunzătoare. într-o alcătuire preferată a prezentei invenţii, plantele vor fi transformate cu gene în care utilizarea codonului a fost optimizată pentru plante. A se vedea de exemplu, brevetul US 5380831, care este încorporat aici prin referinţă. De asemenea, vor fi utilizate în mod avantajos plantele care codifică o toxină trunchiată. Toxina trunchiată va codifica de obicei aproximativ 55 până la aproximativ 80% din toxina cu lungime totală. Metodele pentru crearea de gene B.t. sintetice pentru utilizarea în plante sunt cunoscute în domeniu.

Exemplul 28. donarea genelor B.t. în virusuri ai insectelor

Este cunoscut un număr de virusuri care infectează insectele. Aceste virusuri includ, de exemplu, baculovirusuri şi entomopoxvirusuri. într-o alcătuire a prezentei invenţii, genele care codifică toxine cu activitate insecticidă, aşa cum au fost descrise aici, pot fi plasate îngenomul virusului insectei, astfel îmbunătăţind patogenicitatea virusului. Metodele pentru construirea de virusuri pentru insecte care cuprind gene de toxine B.t. sunt binecunoscute şi practicate uşor de către specialiştii din domeniu, aceste proceduri sunt descrise de exemplu, în Merryweatherşi col. (Merryweather, A.T., U. Weyer, M.P.G. Harris. M. Hirst, T. Booth, R.D. Possee (1990) J. Gen. Virol 71:1535-1544) şi Martens şi col. (Martens, J.W.M., G. Honee, D. Zuidema, J.W.M van Lent, B. Visser, J.M. Vlak (1990)/Lpl. Environmental Microbiol. 56(9):2764-2770).

Toate brevetele, cererile de brevet, aplicaţii tranzitorii şi publicaţii referite sau citate aici sunt încorporate prin referinţă în întregime în măsura în care nu sunt nepotrivite faţă de învăţăturile explicite ale acestei descrieri.

Trebuie înţeles că exemplele şi alcătuirile descrise aici suntdoarîn scopuri ilustrative şi că diverse modificări sau schimbări în lumina acestora vor fi sugerate de specialişti din domeniu şi trebuie incluse în spiritul şi domeniul acestei cereri şi întinderea revendicărilor anexate. 54 RO 123431 Β1

LISTA DE SECVENŢE

<110> MYCOGEN CORPORATION <120> Toxine pesticide <13Q> MA-703C3 <140> 09/378.088 <141> 1999-08-20 <160> 166 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 5

<212> PRT <213> Organism necunoscut <220> <223> Descrierea organismului necunoscut: peptidă <400> 1

Met Leu Asp Thr Asn 1 5 <210> 2: <211> : 25

<212> PRT <213> organism necunoscut <22Q> <223> Descrierea organismului necunoscut: proteină <400> 2:

Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu lle Ser Asn Leu Ala Asn Gly 1 5 10 15

Leu Tyr Thr Ser Thr Tyr Leu Ser Leu 20 25 <210 3: 55 RO 123431 Β1

<211 >24 <212> PRT <213> organism necunoscut <220> <223> Descrierea organismului necunoscut: proteină <400> 3:

Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Asn Asn Thr Arg His Thr Leu li li 15

Gin Leu Glu Ala Lys Thr Lys Leu 20 <210> 4:

<211 >25 <212> PRT <213> organism necunoscut <220> <223> Descrierea organismului necunoscut; proteină <400> 4:

Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn His Ala Asn Gly 15 10 15

Leu Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu 20 25 <210 5: <211> 50

<212> PRT <213> organism necunoscut <220 <221 > NESIGUR <222> (35) <223> Aminoacid nedeterminat <400 5: 56 RO 123431 Β1

Ser Ala Arg Glu Val His Ile Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His Thr

1 Si 10 ÎS

Gin ifeeu Glu jţ$p Lys Thr Lys* Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg Thr 20 25 30

Se# Pro Xaa Ahh Val Ala Asn Asp Gin Ile :ţ»yş: Thx iha "Val Ala Glu 35 40 45

Se# Asn 5 0 <210> 6:

<211> 25 <212> PRT <213> organism necunoscut <220> <223> Descrierea organismului necunoscut: proteină <400>6'

Met Leu Asp Thr Asn Lys Ile Tyr Glu Ile Ser Asn Tyr Ala Asn Gly I 5 10 15

Lei His Ala :&la, Thr· #yr" Leu ier Leu ' 'm m <210> 7:

<211> 25 <212> PRT <213> organism necunoscut <220* <223> Deşertarea organismului necunoscut^protiirii <400 7 ier Ala Arg Glu Val His rle Asp Val Aţn Asii Lys Thr Gly His Thr •a îs m ts .;Leu Gli Lei; Glu Asp Lys Thr Lys Leu m "25 57 RO 123431 Β1 <210> 8:

<211> : 29 <212> ADN <213> Secvenţă artificială <220> <223> Descrierea secvenţei artificiale: AND sintetic <220 <221> caracteristici diverse <222> (4) <223> orice nucleotidă <220 <221 > caracteristici diverse <222> (6) <223> orice nucleotidă <220> <221 > caracteristici diverse <222> (12) <223> orice nucleotidă <220> <221 > caracteristici diverse <222> (21) <223> orice nucleotidă <400> 8: ATGNTNGATA CNAATAAAGT NTATGAAAT 29 <210> 9: <211> 26

<212> PRT <213> Secvenţă artificială <220> <223> Descrierea secvenţei artificiale: AND sintetic <400 9: GGATTATCTA TCTCTGAGTG TTCTTG 26 <210> 10:

<211> 1158 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis 58 RO 123431 Β1 (xi) <4Θ0> 10:

ATGTTAGATA .G.îAA'fAAAGT""TTAT.QMAT&. AGeftftîCTîG CTAATâSSSrr ASÎACAICA SO ACTTATTTAA GTCTTGATGA TTCAGGTGTT AGTTTAATGA GTAAAAAGGA TGAAGATATT 120 GATGAITAOft AfffftAAATfG ^ΟΤΓΤΓίΑΤΙΤCGTATfGATA ATAATCRATA '•ERSTATmCA·:· 1β«

ÂGCTATGGAG CTAATAATTG TAAAGTTTGG AATGTTMM ATGATAAAAT AAATGTTTCA :2M ACTTATTCTT CAACAAACTC TGTACAAAAA XGGCAAATAA AAGCTAAAGA TTCTTCATAT 300 ATAATACAAA GTGATAATGG AAAGGTCTTA. ACAOCAGGAG TAG3TCAATC TCTTGGAATA 360 GTACGCCTAA CTGATGAATT TCCAGAGAAT TCTAACCAAC .AATGGAWIT AACTCCTGTA :"43:©· CAAACAATTC AACTCCCACA AAÂACCTAAA ATAGA \Ά ΑΛΤ i'AAAAGA i?CATCCTGAA *6® TATTCAGAAA CCGGAAATAT AAATCCTAAA ACAACTCCTC AATTAATGGG ATGGACATTA 640 GTACCTTGTA TTATGGTAAA UGATTGSAAA ATAGAÎAAAA ACACTCAAAT TAAAACTACT 600 CCATATTATA ΪΪΤ'ΪΤΑΑΑΑΑ ATATAAATAC TGGAATCTAG CAAAAGGAAG TAATGTATCT 660 TTACTI’CCAC ATf’AAAAAAG ATCATATGAT TATGAATGGG GTACAGAAAA AAATCAAAAA 720 ACAACTATTA TTAATACACJT AlîtSAT'fCJCAA ATTAATATAfl A'iTCft'JGAAT GAAATTTGAA 780 GTACCAGAAG TAGGAGGAGG TACAGAAGAC ATAAAAACAC AATTAACTGA AGAATTAARA" 84 0 β-ΓΓάΛΑϊΑΤΑ GCAâtGAAAC:: €ΑΑΑΑΤΑΑ«3 AGGAAATATG AAGAACACTC ftGAGAÎftGAT 900 aatcoaacîa atcaaccaat gaattiitata goacxtciia· tttatacttc ’M’tagaatta sse TATCSATATA ACGCiTACAGA ΑΑΤΓΑΑΠΑΤΑ ATGGACAÎftG AAACTTCAGA ^CAraAăACT 1020 ^^îieTCttA CTTCTTATCC AAATCATAAA GAAGCATTAT TACTTCTCAC AAACCATTCG 1080 '^ATGAAGAMI ;-TAGAAGABAÎ AACAAAAATA CCTAAGCATA CACTTATAAA ATTGAAAAAA 1140 miastniş aaaaataa lise <210> 11: <211> 385 <2i2> Pftr <213> Bacillus thuringiensis <400> 11 59 RO 123431 Β1

Met Leu Asp Thr Aeţi Lys val Tyr Oii 11a Ser han Leu Ala Asn Gly ^ 5 10 15 Î*U Tyr Tar Ser Thr. Tyr Leu Ser Leu Asp hap set Gly Val Ser: Leu 20 25 30

Met Ser Lys Lys Asp Slu Asp Ile Aap Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe 35 40 45

Leu Phe pro Ile Asp Asn Asn Gin Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Oly Ala 50 55 60

Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Lys Asn Asp Lys Ile Asn val Ser 65 70 75 80

Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Val Gin Lys -Trp Gin Ile Lyi: Ala Ly»,' 85 90 S5

Asp Ser Ser Tyr Ile Ile Gin Ser Asp Asr. Gly. Lys Val Leu Tfet Ala 100 105 110

Gly. Vsl eiyOah Ser Leu Gly Iie 'Vil: fttg 'Lets Thr Asp Glu Phe Pro 115 "" 120 125 al.U" Asn Ser;.*8î» Gin Gin Trp Asr» :'L0«: .thr'Pro Val Gin •rnr 11« ITlt 130 138 140 :,fen Pro Gln/iLys Pse Ly· ile Asp :'0|u:· Lys 'Leu Lye Asp Mii: Pr* Glu =1*5 150 ::155 160 =fyr Ier, Gle Thr Gly Aih, île^Asn Trei Ljfs Thr Thr Pro QÎn Leu Mat :.16.5 I3Q": 175 51 y Trp Thr leu 'Val Tre:; Cy»'·· ile Met Vel Asn Asp ser Lys Ile Asp 180 185 190

Ly* Afin Thr'Gin îl· :'Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Pire Lys Lys Tyr 115 200 205 .Lys Tyr Trp Asn..'Leu Al»· Lys Gly Ser Asn Val ser Leu Leu 'Pro Hi6 210 215 220 03n :%Τ Arg ser'Tyf :Aep Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Lys Asn Gin Lys 225 " 2':3«" 235 240

Thr :;Tlir îl·. Ile Asn Thr· Vel fifţy Leu Gin Ile Asn Ile Asp Ser Gly 24S 250 255

Met ::.Ljr· Phe Glu Val Pro SÎU Vil Gly Gly Gly'i'Ttai! Olui. Asp Ile ,Lys 260 265 270

Thr'.oin Leu Thr Glu Glu teu Lys Val Glu Tyr Ser Thr Glu 'Thr Lys .275 310' 28,5'

Ile Met Thr Lye Tyr Gin Glu Hi» Ser Glu |1·.· Αβρ Aii Pxp; Thr''''::,S*p 290 295 300

Gin Pro Met Aen, Seriile Gly Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Leu GlUv'Leu »05 ...tio' 3iS .'320 60 RO 123431 Β1

Tyr Arg Tyr Asn Gly Thr Glu Ile Lys ile Met Asp Ile Glu Thr Ofer 325: 330 335

Asp His Asp Thr Tyr Thr Leu Thr Ser Tyr Pro Asn His Lys Glu Ala* ' 340 345 350

Leu Leu Leii Leu Thr Asn Hie Ser Tyr Glu Glu Val Glu Glu Ile Thr 355 360 365

Lys Ile Pro Lys His Thr Leu Ile Lys Leu Lys Lys His Tyr Phe Lys 370 375 ................ 380

Lys 385

<210> 12 <211> 834 <212> ADN <213> BadJItişnthuringîinsis <4§0> 12 GGACTATATG CAGCAACTTA TTTAAGTTTA GATGATTCAG GTGTTAOTTT AATGAATAAA 60 AATGATGATG ATATTGATGA TTATAACTTA AAATGGTTTT TATTTCCTAT TGATGATGAT 120 CAATATATTA TTACAAGCTA TGCAGCAAAT AATTGTAAAG TTTGGAATGT TAATAATGAT 180 AAAATAAATG TTTÎ»OTTA TTCTTCAACA AATTCAATAC AAAAATGGCA AATAAAAGCT 240 AATGGTTCTT CATftT6TAAT ACAAfti3Ttî»f: AATGGAAAAG TCTTAACAGC AGGAACCGGT 300 CAASCTCTTG C»lT«*fteG:'''*®PTAACTGAT eAATCerCM.J:ATAATCC'C^:· TCAACAATGG 360 AA$TÎAACTT: CTPGiîftjEAAAC AATTCAACTT CCACAAAAAG CTATAATAGA TACAAAATTA 420 'AAWSĂTTAfC:· CCftSTATTC ACCAACTGGA AATATAGATA ATGGftACATC TCCTCAATTA 480 ATHSSATGBA· iaTtlâTACC TTGTATTATG GTAAATGATC εΑΑΑτΑΤΑσΑ TAAAAATACT 540 eAftAÎTAAM âTASTCCATA TTATATTTTA AAAAAATATC AATATTGGCA ACQAQCAGTA .«00 CIGAAGTăATS TAGCTTTACG TCCACATGAA AAAAAATCAT ATACTTATGA ATGG^CftC». 660 ΟΑΑΑΤΑΘΑΤβ;: AAAAAACAAC AATTATAAAT ACATTAGGAT TTCAAATCAA TATASATfCA 720 ''G6AAT3AĂAT: TTGATATACC AGAAGTAGGT GGAGGTACAG ATGAAATAAA AACACAACTA 780 AMTSAAGAAT: TAAAAftTAGA ATATAGTCAT GAAACTAAAA TAATGGAAAA ATAT 834 <210> 13:

<211 > 278 <212> PRT <213> Organism necunoscut 47 61 RO 123431 Β1 <220> <223> Descrierea organismului necunoscut: ADN sintetic <400> 13:

GlyÎLeu Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leii: Asp Asp Ser Gly Val Ser 1 5 10 ‘ 15

Leu Met Asn Lys Asn Asp Asp Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp 20 25 30

Phe Leu Phe Pro Ile Asp Asp Asp Gin Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Ala 35 40 45

Ala Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Asn Asn Asp Lys Ile Asn val 50 55 60 .Ser Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Ile Gin Lys Trp Gin Ile Lys Ala *s;· 70 75 80

Tyr Val Ile Gin fier Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr 85 90 95

Ala Gly :Thr Gly Gin Ala Leu Gly Leu Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser 10 0 105 no

Ser Asn Asn Pr0:«Aiil'.6l« Gin Trp Asn Leu Thr Ser Val Gin Thr Ile 1.15 120 125 :Ql« Leu Pro .GinLys /$ro,:.Ile Ile Asp Thr Lys Leu Lys Asp Tyr Pro 130 135 140 liy*e Tyr Ser AeG'.'Tht.Oly Asn.'.fîe Asf A*« Gly Thr Ser Pro Gin Leu 145.= ISO ' ÎS 5 160 M»t::Gly:::Trp:''vThr LeuvVal. Pro CyS 11« Met Val Asn Asp Pro Asn Ile 165 ::ifO 175

Asp Lys Asn Thr Gin Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Leu Lys Lys 180;'. 185 190

Tyx Gin Tyr Ttp: Glft-Arg Ala Val, Gly ser Asn Val Ala Leu Arg Pro 195 ..... 200. 205 14*: fiu.. Lys':. Lys Ser vîyr Thr Tyr Glu Trp Gly Thr Glu ile Asp Gin 210 215 ...... 220

Lys Thr Thr Ile. 11« Asn Thr Leu Gly Phe Gin Ile Asn Ile Asp Ser 225 230 235 " 240 62 RO 123431 Β1

Cly Mec Lys Phe Asp Ile Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Asp Glu Ile 245 2S0 255

Lys Thr Gin Leu Asn Glu Glu Leu Lys Ile Glu Tyr Ser His Glu Thr 260 265 270

Lys Ţie Met Glu Lys Tyr 275

<210 14 <211> 829 <212> ADN <213> Baciilus thuringiensis <400> 14 ACAT^^GCA JŢ^ATTTAA STTTAGATGA TTCAGGTGTT AGTTTAATGA ATAAAAATGA 60 GATGACTATA ATTTAAGGTG GTTTTTATTT CCTATTGATG ATAATCAATA 120 .ŢAtiJffiEACA AGCTACGCAG CGAATAATTO TAAGGTTTGG AATGTTAATA ATGATAAAAT 160 ''mM&OTCh ACTTATTCTT CAACAAACTC GATACAGAAA TGGCAAATAA AAGCTAATGC 240 ΤΗ?ΓΤ<»ΤΑΤ GTAATACAAA GTAATAATGG GAAAGTTCTA ACAGCAGGAA CCGGTCAATC 300 TCTTGGATTA ATACGTTTAA CGGATGAATC ACCAGATAAT CCCAATCAAC AATGGAATTT 360

AftCTCCTGTA CAAACAATTC AACTCCCACC AAAACCTACA ATAGATACAA AGTTAAAAGA 420 TTACCCCAAA TATTCACAAA CTGGCAATAT AGACAAGGGA ACACCTCCTC AATTAATGGG 490 ATGGAGATŢA ATACCTTGTA TTATGGTAAA TGATCCCAAT ATAGATAAAA ACACTCAAAT 540 CAAAACTACT CCAÎStSATA ŢŢlSAÎauU». ATATCAATAT TGGCAACAAG CAGTW^M 600 TAATGTAGCT TTACGTCCGC ATGAAAAAAA ATCATATGCT TATGAGTGGG GTACAGAAAT S60 AGATCAAAAA ACAACTATCA ΤΤΑΑΤΑΟΑΦΓ AGGATTTCAG ATTAATATAG ATTCGGGAAT 720 GAftAJm^® iAŢftSSOAiGBlAG TAGGTGGAGG TACAGATGAA ATAAAAACAC AATTAAACGA. 780 AGAATTAAAA ATAGAATATA GGÎ^lffiAftAC CAAAATAATG GAAAAATAT 829 <210> 15:

<211> 276 <212* PRT <213> Organism necunoscut <220» <223» Descrierea organismuluinecunoscut· proteină <400» 15: 63 RO 123431 Β1

Hia Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu «ap: «şp Ser Gly Vel'" Serveau Met. 1 5 10 15 JUtt Lys Asn Asp Asp «sg lle Asp «sg: Ty* Asn L«:s: ftrg· Trp Phe: Leu 20 3S·· 30

Phe Pro: lle Asp Asp Asn Gin Tyr lle lle Thr Ser Tyr Ala Ala Wsiy 35 «G" ' «5, ASn Cya Lys Val Trp Asn Vpl/ Asp Asn Asp'.'Lys lle .'.«an Val Ser Thr sa· :is..... ea.....

Tyr Ser Ser Thr Asn Ser lle Gin Lys Trp Gin lle Lys Ala Asn Ala 65 70 75 80

Ser Ser Tyr Val lle Gin Ser Asn Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala Gly ..................05 98 95

Thr Gly Gin ser Leu Gly Leu lle Arg Leu Thr Asp 11« ser fete Asp IOC " 05 1.10

Asn Pro Asn Gin GIp Trp: Asn Leu Thr1 Pro Val: Gin Thr 118::.:,Gin C§«. 115 130; 125

Pro Pro Lys Pro Thr lle Asp Thr Lys' Leu,'1^8'Asp'tyr Pro Lys Tyr 130 .135 140

Ser Gin ΤίϊΡ Gly Asn lle Asp Lys Gly Thr Pro Pro Gin Leu Mec Gly 145 ISO 155 160

Trp Thr Leu lle Pro Cys lle Met Val Asn Asp Pro Asn lle Asp Lys 165 170 175 «*n Thr Gin lle Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr lle Leu Lys Lys Tyr Gin 180 185 190

Tyi: Trp: Sin..Gin Ala,;Val, Gly Ser Asn Vşi..Aia Leu Arg Pro His Glu ..........i«5....... 280 205

Lys &ys:· Ser "Tyr Ala Tyr Glu Trp Gi'y. Thr'.:«1« He Asp Gin Lys Thr; 2,18.. 21'·: 220

Thi llff: fie Asn, Thr Leu Gly Phe Gin lle Asn Ile;,:«âp BeP'Gly Met 225 230 235 240

Lys Phe Asp lle Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Asp Glu lle Lys Thr 245 250 255

Gin Leu Asn Glu Glu Leu Lys lle Glu Tyr Ser Arg Glu Thr Lys lle 2:6'8 ................ 2€5 -> •Met «iu Lys Tyfc: '2,55,

<210> 16 <211> 7 <212> PRT <21 3> Organism necunoscut '<2205*: 64 RO 123431 Β1 <223> Descrierea organismului necunoscut: proteină 1 <400> 16: 3 5 Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu 1 s 7 <210> 17 9 <211>7 <212> PRT 11 <213> Organism necunoscut 13 <220> <223> Descrierea organismului necunoscut: proteină 15 <400> 17: 17 Trp Mae Leu Phe Pro Ile Asp 19 1 ’ 5 21 <210> 18 <211> 8 <212> PRT 23 <213> Organism necunoscut 25 <22Q> <223> Descrierea organismului necunoscut: proteină 27 <400> 18: 29 31 Gin ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr 1 S 33 <210> 19 35 <211> 6 <212> PRT <213> Organism necunoscut 37 39 <220> <223> Descrierea organismului necunoscut: proteină 41 <400> 19: 43 Tyr Glu Trp Gly Thr Glu 1 s 45 65 RO 123431 Β1 <210 20 <211> 21

<212> ADM <213> Secvenţă artificială <220> <223> Descrierea secvenţei artificiale: ADN sintetic î <22 0> <221> caracteristici diverse <212> (6) <213> orice nueleotidă <220 > <221> caracteristici diverse <212> {21} <213> orice nueleotidă <400> 20 GATAT NGATG ANTAYAAYTT N 21

<210> 21 <211> 21 <212> ADN <213> Secvenţă artificială <220> <223> Descrierea secvenţei artificiale: ADN sintetic <220> <221 > caracteristici diverse <212> (9) <213> orice nueleotidă <220> <221 > caracteristici diverse <212> (15) <213> orice nueleotidă <220> <221 > caracteristici diverse <212> (21) <213> orice nueleotidă <220> <221> caracteristici diverse <212> (21) <213> orice nueleotidă 66 RO 123431 Β1 <400> 21 TGGTTTTTNT TTCCNATNGA IM 21

<210> 22 <211> 24 <212> ADN <213> Secvenţă artificială <220> <223> Descrierea secvenţei artificiale: ADN sintetic <220> <221 > caracteristici diverse <212> (6) <213> orice nucieotidă <220 > <221 > caracteristici diverse <212> (12) <213> orice nucieotidă <220 <221 > caracteristici diverse <212> (15) <213> orice nucieotidă <400> 22 CAAATNAAAA CNACNCCATA TTÂT 24

<210> 23 <211> 18 <212> ADN <213> Secvenţă artificială <220> <223> Descrierea secvenţei artificiale: ADN sintetic <220> <221 > caracteristici diverse <212> (3) <213> orice nucieotidă <220> <221 > caracteristici diverse <212> (6j <213> orice nucieotidă 47 67 RO 123431 Β1 <220> <221> caracteristici diverse <212> (12) <213> orice nucleotidă <400> 23 TANGANTGGG GNACAGAA 18 <210> 24

<211 >24 <212> ADN <213> Secvenţă artificială <220> <223> Descrierea secvenţei artificiale: ADN sintetic <220> <221> caracteristici diverse <212> (10) <213> orice nucleotidă <220> <221 > caracteristici diverse <212> (13) <213> orice nucleotidă <220> <221> caracteristici diverse <212> (19) <213> orice nucleotidă <400> 24 ATAATATGGN GTNGTTTTNATTTG 24 <210> 25

<211> 18 <212> ADN <213> Secvenţă artificială <220> <223> Descrierea secvenţei artificiale: ADN sintetic <220> <221 > caracteristici diverse <212> (7) <213> orice nucleotidă 68 RO 123431 Β1 <220> <221 > caracteristici diverse <212> (13) <213> orice nucieotidă <220> <221 > caracteristici diverse <212> (16) <213> orice nudeotîda <400> 25 TTCTGTNCCC CANTCNTA 18 <210> 26 <211 > 18 <212> ΛΠΝ <213> Secvenţă artificială <220> <223> Descrierea secvenţei artificiale: ADN sintetic <400> 26: CTCAAAGCGG ATCAGGAG 18

<2IC» 27 <211 > 20 <212> ADN <213> Secvenţă artificială <220> <223> Descrierea secvenţei artificiale: ADN sintetic <40Q> 27 GCGTATTCGG ATATGCTTGG 20 <210> 28 <211 > 386 <212> PR l <213> organism necunoscut <220> <223> Descrierea organismului necunoscut: proteină <220> <221 > NESIGUR. <212> (1)...(20) 69 RO 123431 Β1 <213> orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (34) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESiGUR <212> (36) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (38) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESiGUR <212> (46) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESiGUR <212> (54)...(55) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESiGUR <212> (63) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESiGUR <212> (73) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESiGUR <212> (88) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESiGUR <212> (96)...(97) <213> orice aminoacid <220>

<221 > NESiGUR 70 RO 123431 Β1 <212> (101) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (105) <213> orice aminoacid <220>

<221> NESIGUR <212> (114) <213> orice aminoacid <220>

<221> NESIGUR <212> (117) <213> orice aminoacid <220>

<221> NESIGUR <212> (120)...(121) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (127)...(129) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (131) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (139) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (147) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (150) <213> orice aminoacid 71 <220> RO 123431 Β1 <221> NESIGUR <212> (153) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (158) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (160) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (163) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (168)...(170) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (172) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (181) <213> orice aminoacid <220

<221 > NESIGUR <212> (189)...(190) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (205) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (209) <213> orice aminoacid 72 RO 123431 Β1 <220> <221 > NESIGUR <212> (212),..(213) <213-- orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (215) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (220) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (222) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (225) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (227) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (230) <213> orice aminoacid <220> <221> NESIGUR <212> (237)...(238) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (247) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (249) <213> orice aminoacid 73 RO 123431 Β1 <220> <221 > NESIGUR <212> (260)...(261) <213> orice aminoacid <220> <221 > NESIGUR <212> (269)...(270) <213> orice aminoacid <220>

<221 > NESIGUR <212> (276) <213> orice aminoacid :<220> <221 > NESIGUR <212> (281) <213> orice aminoacid <220> <221> NESIGUR <212> (285) <213> orice aminoacid <220 <221 > NESIGUR <212> (291) <213> orice aminoacid <220>

<221> NESIGUR <212> (294)...(386) <213> orice aminoacid <400 28 X33;.. X33 X33 X^ă Xi33 Xaă Xaa Xâă Xâ3 X83 ;xs:a,:.xsâ x#a: 15 io îs

Xaa: la® xaa Xaa Thr Tyr Leu. Ser Leu Asp Asp Ser Gly 'Val Ser Leu 20 25 30

Met Xaa Lys Xaa Asp Xaa Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Xaa Trp Phe 35 40 45

Leu Phe Pro Ile Asp Xaa Xaa Gin Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Xaa Ala 50 55 60

Asn Ase Cys Lys Val Trp Asn Val Xaa Asn Asp Lys. Ile .Asn Val Ser

65 """ -T0'...... yş: ;sO

Thr Tyr Ser Ser Thr Asn :Ser Xaa Gin Lys Trp Gin ţie Lys Ala Xaa 85 90 95

Xaii· Ser Ger Tyr Xaa ..Xle de ::Ser Xaa Asn Gly Lys -'Val Leu Thr Ala 100 105 110

Gly Xaa Gly Gin Xaa Leu Gly Xaa Xaa Arg Leu Thr Asp Olu Xaa Xaa 115 120 125 74 RO 123431 Β1 'Ifi' A«u Xaa Aşn Gin Cin Trp Asn Leu Thr Xaa Val Gin Thr Ile Gin 1 Leu 13 :Pjfo Xa* iliy® ;::Pro xaa 135 Ile Asp Xaa Lys 140 Leu Lys Asp Xaa Pro Xaa 3 'MS: ISO 155 160 5 Ţpr·:' Sar Xaa Th« Oly Asn :»« X» Xaa xaa Thr Xaa Pro Gin Leu Met ies 170 1T5: 7 siy; Trp Thr .•ie» :x*a wo cya IB Met Val Asn Asf Xaa Xaa Ile Asp ISO 185 190 9 byn Asn Thr. CM: 11# &ys.: Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Xaa Lys Lys Tyr 11 195 200 205 xa&" Tyi Trp Xaa Xs# Ala Xaa Gly Sex As» Val xaa :Liett Xaa Pro His 13 210 215 220 X-Sicl Ly# Şt*. fer Tyr Xaa Tyr Qlu Trp Gly Thr Glu Xaa Xaa Gin Lys 15 235 235 240 Thr fte: ii* fie Am. Thr Xi* Gly xaa Gin 11# Ase lle :Aap Ser Gly 17 MS, 250 255 19 Met 1*«:' .$&*· Xaa Xaa pro Sttt Vai Giy Gly Gly Thr Xaa Xaa Ile Lys 260 265 270 21 Thr fii' i*## :;Ml9Lâ Qlu ΟΐΐΛ' :|>eu: Lys Xaa Glu Tyr Ser Xaa Glu Thr Lys S"ţ:S': 280 285 23 X le Met" Xaa Lys Tyr Xaa: Xd 3 XcLâ Xâ3 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 2:SW 23L 30# 25 Vi®..®'· Λ sa» Xaa Xaa Xaa Xea Xaa: Xaa. Xaa Xaa: 'Xaa Xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 27 105:' 110; 31.5 320 Xaa Xaa Xaa Xaa Mae xaa 325 ' 'Jflk Mt ' 3BI'01' «* '"M'' A 06* :Mb' Xaa 3» Xaa Xas Xaa 315 Xaa 29 Yma.. -A «Elf Xaa Xaa Xaa :Xi« xaa 'M:0i Xaa Xaa Xaa :31¾¾ xaa xaa Xaa Xaa. :.:s:«ţfi· Xaa: Xaa 31 33 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa X:&& Xaa Xaa Xelct .Xaa. 'Vm-fli,.: A<psn 3(¾¾ 3'S». 360 365 35 xaa Xaa Xaa X»* xaa Xăa Y-sa va* ΫΛβ Atici ACfU .MP> Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa V ^ *“i Ala 370 375 380 37 X««'': Xaa ιβ».: 39 <210> 29 <211> 23

<212> ADN <213> Secvenţă artificiali 75 RO 123431 Β1 <220 <223> Descrîafe^;secvenţei: artificiale: ADM sintetic <220> «221> caracteristici diverse <212> (2) <213> orice nuplsdtidi <220 <221> caracteristici diverse <212> (8) <213> oricevn'liCieotidi <220> <221 > caracteristici diverse «212> (14) <213> orice, nueieotidi <220 <221 > caracteristici diverse <212> (20) <213> oricertţicleotida <400> 29 GNGAA&TNQA TATMGftAATN AATAATAC 28 <210> 30: <211 >2015 <212> <213> Baeilfus thuringtensis <400>30

ATTAATTTTA TGGAGGTTGA TATTTATGTC AGCTCGCGAA GTACACATTG AAATAAACAA TAAAACACGT CATACATTAC AATTAGAGGA TAAAACTAAA CTTAGCGGCG GTAGATGGCG AACATCACCT ACAAATGTTG CTCGTGATAC AATTAAAACA TTTGTAGCAG AATCACATGG TTTTATGACA GGAGTAGAAG GTATTATATA TTTTAGTGTA AACGGAGACG CAGAAATTAG trmehxmt GACAATCCTT ATATAGGTTC TAATAAATGT GATGGTTCTT CTGATAAACC TQAATATGAA GTTATTACTC AAAGCGGATC AGGAGATAAA TCTCATGTGA CATATACTAT

TCAGACAGTA ŢCffTAGGAI' TATAAGGAftA ATTTATAAAA ACTGTAŢTTT TTACTAAAAT ACCAAAAAAf: »Cil»ăStM ΤΤΓΤΤ8βΤΐΤ TTTCTAATAT CAAATATGAA TTATAAAAAT ATTAATAAAK AI«tâATAft AAATTATOPT AGATACTAAT ftftftOTTTATG AAATAAGCAA TCTTGCTAAŢ· GGATTATATA CATOU®EEA TTTAAGTCTT .9AT0ATKAG GTGTTAGTTT AATGAGTAAA' ATATnlftiGA TTACAATTTA ΑΑΑΤβΟΤΤΤΓ TATTTCCTAT TGATAATAAT CAATATATTA TTACAAGCTA TGGAGCTAAT AATTGTAAAG TTTGGAATGT TAAAAATGAT AAAATAAATG TTTCAACTTA TTCTTCAACA AACTCTGÎAC AAAAATGGCA AATAAAAGCT AAAGATTCTT CATATATAAT ACAAAGTGAT AATGGAAAGG TCTTAACAGC AGGAGTAGGT CAATCTCTTG GAATAGTACG CCXAACTGAT GAATTTCCAG AGAATTCTAA

eGAAGAftfCG aatttaactc CTGTACAMC AATTCAACTC ccAcaPrac :.CÎAftAATAGA tgaaaAatîa aaagatcatc ctgaatattc agmaccgga :ΑΑΤΑϊααατε 'cîaaaacaac tecîcAATi» atgggatoca cattagtacc ttgtattatg mmmmtr :c«aaAaî«3A 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 66» 720 760 840 900 960 .1020 76 1080 RO 123431 Β1

.TSftWttCftCT :C»yW3!AAAA· CTACTCCATA TTATATTTTT AAAAAAXATA AATACTGGAA 114D TCTAOCAAAA GGAAGTAATG TATCTTTACT TCCACATCAA AAAAGATCAT ATGATTAXGA 1200 ATGGGGXACA GAAAAAAATC AAAAAACAAC ΓΑΤΪΑΤΤΑΑΤ ACAPTAGOAT TGCAAATTAA 1260 TATAGATTCA GGAATGAAAT TTGAAGTACC AGAAGTAGGA GGAGGTACAG AAGACATAAA 1320 AACACAATTA ACTGAAGAAT TAAAAGTTGA ATATAGCACX GAAACCAAAA XAATGACGAA 1330 ATATCAAGAA CACTCAGRGA TAGATAATCC AACTAATCAĂ CCAATGAATT CTATAGGACT 1440 TCXTATTTAT ACfTCTTTAG AATTATATCG ATATAACGGT ACAGAAATTA RGATAATGGA 1:5Of CATAGAAACT TCAJ3AXCATG ATACTIACAC TGWACTTCT TATCCAAATC ATAAAGAAGC 1360 ATTATTACTT ctcacaaacc aîtcgtatga agaagtagaa GAAATAACAA AAATACCTAA 162® gcatacacxt ataaaattga aaaaacatxa ttttaaaaaa taaaaaacat aatatataaa |«io TGACTGATTA ATATCTCTCG AAAAGGTTCT GGTGCAAAAA TAGTGGGAIA Τ&ΑΑΑΛΛΑΓΧ. |?40- AAAAGATTCC TAACGGAATG GAACATTAGG CXGTTAAATC AAAAAGTTTA TTGATAAAAT 1000 ATATCTGCCT TTGGACAGAC TTCTCCCCXT GGAGAGTTTG TCCTTTTTTG ACCATATGCA 2860 TAGCTTCTAT TCCGGCAATC ATTTTTGXAG CTGTTTGCAA GGATTTTAAT CCAAGCATAT 1920 CCGAATACGC TTTTTGATAA CCGATGTCTT GTTCAATGAT ATTGTTTAAT ATTTTCACAC 1980 GAAXXSGeXft CTGTGCGGTA TCCTGTCTCC TTTAT 2015 <210> 31 <211> 380

<212> ADN <213> Bacillus thuringîensis AÎQTSAGCTC QCÎQAAGTACA OVTTGAAATA AACAAfAA», CACOTCATAC iATTACAATTA -.6..0.. GAGGATAAAA CT|*ACTTAC CQGCOGTAGA TGGCOAACAT CACCXACAAA TGTTGCrCO» 1?0:' GATACAATTA AAAGATTTGT AGCAOAATCA CATGeTTTTA, TGACAGGAGT AGAAGGTAXT 180 ATATATTTTA GTGTAAACGG AGACGCAGAA ATTAGTTTAC ATTTTGACAA TOCXTATATA: 340 GGTTCTAATR AATGTGATGG TTCTTCTGAT AAACCTGAAT ATGAAGTTAT TACTCAAAGC 300 GGATCAGGAG ATAAATCTCA TGTGACATAT ACTATTCAGA CAGTATCTTX ACGATTATAA 360 <210> 32 <211> 119

<212> PRT <213> Bacillus thuringîensis <io«2 77 RO 123431 Β1

Met Set Ala Arg Glu Val His Ile lle Asn Asn Lys Thr Arg His i s io i|;'

Thr Leu Gin Leu GlU Asp Lvs tlir Lys Leu Ser Gly Gly Arg Trp Arg 20 25 30

Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Arg Asp Thr 1:1* Lys Thr Phe Val M* 35 40 45 ..Slu- Ser His Gly Phe Mec Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Tyr Phe Ser 50 55 50

Val Asn Gly Asp Ala Glu Ile Ser Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ile 65 70 75 80

Gly Ser Asn Lys Cys Asp Gly Ser Ser Asp Lys Pro Glu Tyr Glu Val 85 90 95

Ile Thr Gin Ser Gly Ser <31y Asp:: Lys Ser His Val· Thr Tyr Thr." Ile ioo 10S no

Gin Thr Val Ser Leu Arg; Leu 115

<210 33 <211 >24 <212> ADN <213> Secvenţă artificială » <210> <211> Descrierea secvenţei artificiale; Secvenţă ADN <400> 33 CAT<mGAriTAWCCTGAT€i©G 24

<210 34 <211 >2240 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis <400> 34 78 RO 123431 Β1 ACTATGACAA TGATTATGAC TţSCTGATGSA TTAGCTTTAT CAATACCAGG AŢATTCTAAA 60 CCATCAAATA TAACAGGAGA ţaaaagtaaa GATACATTAT TTACTAATAT AftTTOGAGAT ţjŞo ATTCftAATAA AAGATCAAGC AACATTTGGG GTTGTTTTTG ATCCCCCTCT 18:0 AAGAATeAAS TAAGTTTATT GATGTATATT ATCcrrcTGA AGATAGTAAC 240 ATCAATTTAT AAAAGTAGCA ATTGATTTTG ATATTAATGA AGATTTTATŢ 300 aattttaata ATCATGACAA ΤΑίΑθάβΑϊΆ TTTAATTTTG TTACACGAAA TTTTŢTATTA m o AATAAT3AAA ATGATTAATA AAAAATTTAA a®θιγγαϊτ® TTTGAAAATT 420 GAATGCATAT ATTAATCGAO TATGTGTAAT !::1?ţXAÎî(3GA<SG TTGATATTTA *eo :fl<&CASCACG TGAAGTACAC ATTGATGTAA A1SA$ASSAC;:' AfâGTCASACA TTACAATTAG ::S40 AAGATAAAAC AAAACTTGAT GGTGGTAGAT GGCGftAfîAa® AGCTACAftAT: GTTGCTAATG AOO AACATTTGTA GCAGAATCAC ΑΜδΦΐϊΙΕΑΤ cac^oiaGA :#AAţîŞTACTA 'filO: TATATTATAG TATAAATGGA GAAGCAGAAA TTAGTTTATA fÎÎBSASAAT CCTTATTCAG 720 GTTCTAATAA ATATGATGGG mmmmm AAAATCAATA TGAAGTTATT ACCCAAGGAG 780 GATCAGGAAA TCAATCTCAT jEŞPSAe^EASA CTATTCAAAC TGTATCTTCA CGATATGGGA 840 ATAATTCATA MAIAA»»®W TTTTTTTACG AAAATACCAA ΑΑΑΑΑΤΓΓΤΤ ®»θο®αττττ 900 CTAATAfîi® 'ÎCftîWttŞI® AAATTATAAG mmxmrG 960 TTAGATACTA ATAAAATTTA TGAAATAAGT AATTATGCTA ATGGATTACA TGCAGCAACT 1020 :¾¾¾¾¾¾¾¾ TAGATGATTC AGGTGTTAGT TTAATGAAtA AAMîSJWGA ÎGAÎJVÎOTAT 1080 GACTATAATT TAAGGTGGTT TTTATTTCCT ATTGATGATA ATCAATATAT TATTACAftGC :»40 TACGCAOCGA ATAATTGTAA QGTTTGGAAT gttaataatq ATAAAATAAA TGTTTCAACT ϊ2βο: TATTCTTCAA CAAACTCGAT ACAGAAATGG caaataaaag ctaatgcttc TTCGTATGTA 126® ATACAAAGTA ATAA.TGGGAA AGTTCTAACA GCAGGAACCG GTCAATCTCt TGGATTAATA ;ΐ32ο: CGTTTAACQQ ATGAATCACC AGATAATCCC AATCAACAAÎ GGAATTTAAC TCCTGtACAA:· :1380 TCCCACCAAA. ACCTACAATA GATACAAAOT TAAAAGATTA CCCCAAATAT 14.40 TCACAAACTG gcaatataga CAAGGGAACA CCTCCTCAAT TAATGGGATG GACATTAATA ISO® 79 RO 123431 Β1 TCCAAATATA GATAAAAACA CTCAAATCAA AACTACTCCA isfo TCAATATtee CAACAAGCAG TAG3AAGTAA TGTAGCTTTA t«:20; I 3 GAGTGGGGTA CAGAAATAGA tcaaaaaaca l»8 0; 5 Π I AATATAGATT CGGGAATOM atttgatata 1:740' AGATGAAATA AAÂACÂCAAT TAAACGAAGA attaaaaata 180.» AATAATOGAK AAATATCAGG A AC AA TCAGA qatagataat itio TTCTATAOGA TTCCTCACTA TTACTTCnîT agaattatat i»a» TAGTGTAATG AAAATTCAAA cttcagaTAA TGATACTTAC W«S: TCAT CAACAA GCTCÎATTAC TTCTTACAAA TCATTCATAT 2»4»": AAATATTCCC AAAATATCAC TGAAAAAATT AAAAAAATAŢ 210» ATTTTGAT AG CTTTTTAAAA ATAAAGATTG TTCAAAGTAA 2»0 GAAACTTTAA TACAATAAAA GAGOAATATT TTCTTATAAG 3220: 223».

CCTTGTATTA tggtaaatga ΤΑΤΓΑΤΑΤ7Τ ταλααααατα eaTCPfCATŞ jyqyuua^Tc AeÎAWATTII',:»TACm>aG CCft^QÎăâ :#®eiMOfAC QMm»eCf''-OîeftSftCC»A eeaewpTc αα«»α*<ϊαα :a^eşaft«AT mmmecr «m^csaga

:GAAffiîftGfftG ÎAAâlftăîEAAC T^TTCTAAA ACATAATTAT '«AOTAAAGAA AATCTTTTAÎ .'ÎAtrrifierrG

<210> 35 <211 >372 <212> ADN <213> Bacillus thurmgiensls <400* 35 ATGTCAGCAC GTGAAOTACA CATTGATGTA AATAATAAGA CAGGTCATAC ATTACAATTA 60 GAAGATAAAA CAAAACTTGA TGGTGGTAGA TGGCGAACAT CACCTACAAA TGTTGCTAAT 120 GATCAAATTA AAACATTTGT AGCAGAATCA CATGGTTTTA TGACAGGTAC AGAAGGTACT 180 ATATATTATA GTATAAATGG AGAAGCAGAA ATTAGTTTAT ATTTTGACAA TCCTTATTCA 240 ggttctaata aatatgatgg gcattccaat AAAAATCAAT ATGAAGTTAT TACCCAAGGA 300 GGATCAGGAA ATCAATCTCA TGTTACGTAT ACTATTCAAA CTGTATCTTC ACGATATGGG 360 ,AAÎASTS*£®3P AA 372

<210> 36 <211 > 123 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 36 80 RO 123431 Β1

Mjţţ Ser Ala Arg: Glu Val His Ile % 5

Thr Letţ GlnllLep Glu Asp hys Thr TIîi* Sep Pro Thp· Asn, Val Ala Asn 35 40

Glft Ser Kie Gly Phe Met Thr Gly SQ 55

Ile Asn City Siv: Ala Glu Ile Ser 65 70

Gly ..Ser Aşn Lyş; ‘Tyr^Asp Gly His 85·

Ile :»*: Gin Gly Gly Ser Gly Asn ioo

Gin Thr Val Ser Ser Arg Tyr Gly 11S ' 120

<210> 37 <211> 1152 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis <I00>'37::

Asp VŞl Asn Asn hys Thr Gly His 1 10 15 Lys Leu Asp;:: Gly Gly Arg Trp Arg 3 25 30 Asp Gin Iile" Lyp Thr; phe 45 Val Ala 5 Thr Glu Gl^y'Th'r 60 ile Tyr Tyr Ser 7 Tyr phe^ASp 9 Leu Asn Pro Tyr Ser 75 80 11 Ser" Asn hys;:Asn Gin; Tyr Glu Val 90 95 13 Gin Ser :HîC''Val Thr^Tyr Thr Ile 105 110 15 Asn As» ser· 17 19 21 23 81 RO 123431 Β1 ATGTBWSATA CTAATAAAAT TTATGAAATA AGTAATTATG CTAATGOATT ACATGCAGCA 60 ACTTAtTTAA GTTTAGATGA. TTCAGGTGTT AGTTTAATGA ATAAAAA.TGA. TGATGATATT 1*0

GftTGACTATA ftTTTAAGGTG GTTTI'TATTT CCTATTGATG ATAATCAATA TATTATTACA 180 AGCTACGCAQ cgaataattg TAAOGTTTGG aatgttaata atqataaaat AAATGTTTCA 240 .ACT'ÎATTCTt CMCAAACTC GAŢACAGAAA TGGCAAATAA AAGCTAATGC TTCTTCGTAT 300

GT^ŢACAAArqŞRATAATQG SAAAGTTCXA ACA6CAGSAĂ QPŞGŢCAATC ΤβΓΤββλΤΤΑ SfiO ατΑϊβτγταα. mamemac memjmm cccaatcaac mammrrs «erceîGm .ia CAAACAATTC' AACTCCCSCC «AACCmei ATAGATACAA AOSTSIWSAGft «ACCCCAAA «O, tattcacaaa cttcGCAAîAT agasam®» agagctcctc mrmsmss. atmacatia mo:

AmCCTTGTA TXftTCGTIUm TSARCAAAT AfAGAfAAAA· «ACTţ»®® :CJW»CTACT 600 CCKTATTATA TTTTWUmAA ATATCAÂTAT TOGCAACAJMG CAOŢASSAAG :fâA«ÎIApCT 660 TTACGTCCGC ATGAAAAAAA ATCATATGCT XAXGAGÎBGa: GTACAGAAAT AGATCAAAAĂ 720 ACAACTATCA TTAAXACATT AGGATTTCftG ATlMfATAG' ATTCGGGAAT GMATTTGA* 7.8.0 ATACCAGAAG TAGSTGGAGG TACAGAÎGAA AfASSiAiCAd; ARTTAAACGA AGAATTAAAA 840 ATAGAATATA αααατβΑΑΑΟ CAAAATAATG GAAAAATATC: ACGAACAATC AGAGATAGAT 900 AATCCAACTG ATCAATCAAT GaATTCXAXA ,ΟΘΑΤΤΟΟΤΟί, EÎATTACTÎ& TTTAGAATTA 960 TATCGATATA ATGGTTCGGft. J»TXAOfeŢA: ATGftAftATfC: AAACTTCAGA TAATGATACT 1020 TACAATGTGA CCTCTmtCC :MAXCAtGRA·,'CAAGCTCXAT TACTTCTTAC AAATCATTCA 1080. TATGAAGAAG TAGAAGAAAÎ AACAAATATT CCCAAAAXAT CACTGAAAAA ATTAAAAAAA 1140 ΤΑΤΤΛΤΤΤΤΤ AA lila <210> 38 <211 >383 <212> PR1 <213> Baciilus thurîngiensii.. <400 38"

Met Leu Asp Thr 'Leu: $ϊ·: Aia, Ala 20;Met. :km. Lys Asn ' m.'LâW: Phe pro Ile 50 Asn Asn Cys Lys 65

Asn Lys Ile Tyr Glu Ile Ser Asn Tyr Ala Asn Gly 5 10 15

Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly 25

Val Ser Leu 30 Aşp ^şp Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu 40 45 Asp Asp Asn Gin Tyr Ile Ile Thr Ser 55 60 Val Trp Asn Val Asn Asn Asp Lys Ile 70 75

Arg Trp Phe Tyr Kim Ala Asn Val Ser 80 82 RO 123431 Β1

Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Ile Gin Lys Trp Gin Ile Lys Ala Asn 1 85 90 95 3 Ala Ser Ser Tyr Vel li» Gin Ser Asn Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala 100 105 110 5 Gly Thr Gly Gin' Ser Leu Gly 'tmu, 11« Arg Lea Thr Asp Glu Ser Pro 115 120 125 7 Asp ASn Pro Asn Gin Gin Trp ASh, :Jteu Thr Pi o val Gin Thr Ile Gin 130 13 S 140 9 Leu Pro Pro Lys Pro Thr Ile Asp Thr Lys Leu Lys Asp Tyr Pro Lys 14S ISO 155 160 11 Tyr Ser Gin Thr Gly 155 Ash Xle SSf Lys Gly 170 Thr Pro Pro Gin Leu 175 Met 13 Gly Trp Thr Leu Ile Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Pro Asn Ile Asp 15 180 185 190 Lys Asn Thr Gin Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Leu Lys Lys Tyr 17 195 200 205 Gin Tyr Trp Gin Gin Ala Val Gly Ser Asn Val Ala Leu Arg Pro His 19 210 215 220 Glu Lys Lys Ser Tyr Ala Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Ile Asp Gin Lys 21 225 230 235 240 Thr Thr Ile Ile Asn Thr Leu Gly Phe Gin Ile Asn îie Asp Ser Gly 23 245 250 255 '"Mit: Lys' Phe Asp, Ile .'BKO: Glii: Val Gly 'Φίν'1· Gly '•îhî ASp Glu Ile Lys 25 '2S0v: .255 270 Thr Gin Leu :Asn .'GÎu/'Glu Leu: Lys Ile Glu Tyr Ser Ar o Glu Thr Lys 27 275 280 '285 Ile Met Glu Lys Tyr Gin Glu Gin Ser Glu: ASp •IV e? Ateii Pro Thr Asp 29 230 295 300 31 Gin Ser Met Ash Ser Ile Gly Phe Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Leu 3 OS 310 315 320 33 Tyr Arg Tyr Asn Gly Ser Glu Ile Ser Val Met Lys Ile Gin Thr Ser 325 330 335 35 Asp Asn Asp Thr Tyr Asn Val Thr Ser Tyr Pro Asp His Gin Gin Ala ;34ό:·' 345 350 37 Leu Leu·· Leu •.Leu Thr Ash «is Ser Tyr Glu Glu .Val Glu Glu ile "Thr 355 35:0 365 39 Asn Ile 37«r Prcj Lys Ile 'Ser leu 375 'Lys Lys Leu Lys Lys 330 Tyi. Tyr phe 41 <210> 39 43 2132 <212> ADN 45 83 RO 123431 B1 :«2i 3> iâ;dlius:|huringieniis <40Q>39

GTATTTCAGG GGGTGAAGAT TCAAGTAAGT TTATTGATGT ATATTATCCT TTTGAAGATA ^ATTTTAA ATATTATCAA TTTATAAAAG TAGCAATTGA TTTTGATATÎ AATGAAGATT TTATTAATTT TAATAATCAT GACAATATAG GGATATTTAA TTTTGTTACA CGAAATTTTT TATTAAATAA TGAAAATGAT GAATAAAAAA TTTAATTTGT TTATTATGTT TATTTTTTGA AAATTGAATfJ (inH TCGASTAtCT ATAATAAATT'' ϊ’ΐΑΑΪΙΤβ'ΑΤ 0GAGGTTGAT mtmmcA. 'mmmmm:: Tkcmmmb

ATTAGAAGAT AAAAt . iAAAC i Λ ATGGXV i: : A; ;' G 0: :;3A ACAT." ACt A CAAATGTTGC TAATGATC Λ Λ ATTAA AACAT " "T f! TAGCAr A λ 'Γ~ ; /·,- Π ΤΓ TTTA TO ACA Ί GTACAGAAGG TACTATAXAT ·ΡΑ*Α6ΈΑΪ»Α /.'."ÂiSAGAAC·ΑΠΑΛΑ".'TA-3T TTA1ΛTTT': G ACAATCCTTT

atgctaatgg actatatgca TGAATAAAAA TGATGAXGAT A^SPGATCft J^pTATTATT AXAASGATAA AMGAAATGT® TAAAAGCTAA TGGTTCTTCA GAACCGGTCA AGCTCTTGGA AACAATGGAA TTTAACTTCT CAAĂATTAÂA AGATTATCCC CTCRATTAAT (3GGATGGACA AAAATACTCA AATTAAA&CT TGCAfiOrrcX ααταααϊαομ atggacattc caataaatct caatatgaaa ttattaccca .ASSACEAfCA GQIAAfCAAT CTCATGTTAC GTATACTATT CAAACCACAT CCTCACGATA fGGGCATAAA TCATAACftftA TAATTtTTTA CGAAAATACC ΆΑΆΜ&ΤΆΑΑ ΤΑΤΓΓΤΤΙΏΟ îirrrTCTAA tataaaUpac aaatatatta ataataaaat tataagaaaa ggtgataaag letaiKirae AG«IAfGAAlAl»Ae(SM!C‘

GCAACTTATT TAAQTTTAGA TGATTCAGGT GTTAGTTTAA ATTGATGATT ATAACTTAAA ATGGTTTTTA TTTCCTArTG ACAAGCTATG CAGCAAATAA TTGTAAAGTT TGGAATGTTA TCGACTTATT CTTCAACAAA TTCAATACAA AAATGGCAAA TATGTAATAC AAAGTGATAA TGGAAAAGTC TTAACAGCAG TTGATACGTT .TAACTGATGA ATCCTCAAAT aatcccaatc GlACAAAGAS. 'ÎTCAACTTCC ACAAKAACCT ATAATAGATA AAAÎAl’Î’eAe: CAACTGGAAA TATAGASAT GOĂACAfCTC ΪΪΑΒΤΑόαίΓΐ ...OTATTATGGT AAATGAfCCA AATAÎMOATA 84 RO 123431 Β1 ACTCCATATT ATATTTTAAA AAAATATCAA TATTGGCAAC GAGCAGTAGG AAGTAATGTA 1440 GCTTTAOGTC CACATGAAAA AAAATCATATiâCTTATSAAT GGGGCACAGA AATAGATCAA 1500 AAAACAACAA TTATAAATAC ATTAGGATTT CAAATCAATA TAGATTCAGG AATOAAATTT 1560 GATATACCAG AAGTAGGTGG AGGTACAGAT GAAATAAAAA CACAACTAAA TGAAGAATTA 162 0 AAftATASAAŢ ATAGTCATGA AACTAAAATA ATGGAAAAAT ATCAAGAACA ATCTGAAATA 1680 GATASSCCSA CTGATCAATC AATGAATTCT ATAGGATTTC TTACTATTAC TTCCTTAGAA 1740 TTATATAGAT ATAATGGCTC AOMAOTCOT ATAATGCAAA ttcmacctc AGATAJWGAT. 1ΘΟΟ .ΑβΤΑ'ΪΑΑ'Μ TrAGÎTCTOA/tfCAM'îCAl! CARCAAGCTT TATTACTTCt TACAAATCAT 1860 TCATATi^G':/AAg'rAGAftGA':.»ÎAACAAAT ATTCCXAAAA GTACACTAAA AAAATTAAAA 1?2 0 AAATATTAlT,':':':TTTAAATA'rT'':GAAATTAGAA ATTATCTAAA ACAAAACGAA AGATAATTIA 19B0 MTEŞTAAGA Τ7ΰΏ®θ!ΓΪ£1ίΓ TTATTTGTAT TAATTTTTAT ACAATATAAA 2040 gtaatatctg tacgtcaaat TGGTTTCGCT tcaatatcta ATCTCATCTC ATGTATTACA 2100 TGCGTAATAC CTTCTTG3*rG ÎGCŢrCTAGR AG 2132 <210> 40 <211> 372

<212> ADN <213> Baciilus thuring.;ensi^: «G'Mi' ATGTCAGCAC .ΟΤ0»*0!τ^ JU^MIWftAGA CAGGTCATAC ΑΤΤΑΟΑΑΤΤΑ 60

GjyySAÎAMA TQaeOMCftT CICGÎACÎAAA TGÎWCTAAT Iii; GATCAAATTA AAACATTWT ACCAGAAtCA ΑΑΜΘΪΙΓΪΑ TCRCAG9TAC AGAASGTACT 180 ΑΤΛΤΑΤΤΑΤΑ GTATAAATGG AGAAGCAGAA ATTAlSTTTAT ΛΓΕΜΜΖΑΑ TCCKTPTaCA 240 GGTTCTAATA AATATGATGG ACATTCCAAT AAATCTCAAT ATGAAATTÂT TACCCAAGGA 300 GGATCAGGAA ATCAATCTCA TGTTACGTAT ACTATTCAAA CCACATCCTC ACGATATGGG 360 .GftSWKTCAT AA 37l

<210> 41 <211> 123 <212> PRT <213> Organism necunoscut <220> 40 <223> Descrierea organismului necunoscut: proteină 85 RO 123431 Β1 <400 41

Met Ser Ala;. Arg Glu val Hie Ile Asp Val Am :%s Thr Gly' Ή4.β 1 5 10 l.Ş

Thr ί<β:» Qlniî :li$u Glu Asp T#yŞ:: Thr Lys/''i.eu Asp Gly Oly Arg Trp Arg 20. 25 30

Thr Ser Pro Thr Asn val Ala Asn Asp Gin Ile Lys Thr Phe Val Ala 35 40 45

Glu Ser Asn Gly Phe Met Thr Gly Thr Glu Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser 50 5S m

Ile Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Phe Ala 6S 70 7S 'm

Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His Ser Asn Lys Ser Gln:Ţ^r Slu Ile

85 90 M

Ile Thr Gin Gly Gly ser Gly Asn Gin Ser His Val thî'î Tyr 'Thr IIP 100 105 iio

Gin Thr Thr Ser Ser Arg Tyr Gly His Lys Ser 115 120

<210 42 <211> 124128 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis <220> <221 > caracteristici diverse <212> (53) <213> orice nucleotidă <220> <221> caracteristici diverse <212> (61) <213> orice nucleotidă <220 <22i> caracteristici diverse <212> (68) <213> orice nucleotidă <221 > caracteristici diverse <212> (73) <213> orice nucleotidă <220 <221> caracteristici diverse 86 RO 123431 Β1 <212> (81) <213> orice nuCleotldă <220> <221 > caracteristici diverse <212> (18) <213'· orice nucleotidâ ΑΤΟΤΓΑβΑΤΛ CTAATAAAGT TTATOARATA AGCAATCATG CTftATOGACT ATATGCAjOCft 60 ACTTATTTAA OrTTAOAWA TTCA«îffiKSTT AGTTTfiÂîGA ATAAAAATGA «ΐΑΤβΑΤΑΪΤ :120 βΑΤΟΑΤΤΑΤΑ ACTTAAAAtO GTTTTTATTT CCTATTGATG ATGATCAATA TATTATTACA ·:1*0: ,, A0CTATGCA3 CAAATAATIQ TAAAGTTTtK} MTG1TAATA ATGATAAAAT AAATOTTTCG ::2;4®(( MTCATTCTT C&M3AKTÎC AATACAAAAA TGGCAAATAA AACJCTAATGG TTCTOCATA.T :.300 GTAATACAAA CTCATftAWQ AAAAGTCTTA ACAGCAOGAA CCG6TCAAGC TCTTGGATTS 360 ATAOGTTTAA CÎGATGAATC CTCAAATAAT CCCAATCAAC AATGGAATTT AACTTCTGTA 420 CAMCAATTC AACTTCCACA AAAACCTATfi ATA3ATACAA AATTAAAAGft TÎATCCCAAA 48» TATTCACCAA CTGGAAATAT AGATAATGGR ACATCÎCCTC AATÎAftTGQO ATGGACATTA 540 GTACCTTGTA TTATGGTÂAA TGATCCAAAT ATAGATAAAA ATACTCAAAT TAAAACTACT 600 CCATATTATA ΤΤΤΓΑΛΑΑΑΑ ATATCAATAT TGGCAACOAG CAGTAGQAAG TAATGTAGCT 660 TÎACâTCCae ATGAAAAAAA ATCSSATACT mfOAAWSSG GCACAGAAAT AGATCAAAAA 720 ASSJWyWOTft TAAATACATT ACGATTTCAA AfGAAtÎSfAG ATTCAGGAAT GAAATTTGAT 780 AÎACeăGA» TAGGTGGAGG mOSGMGftft ATAAAAiACAC AACTAAATGA AGAATTAAAA 840 mmmmm :eiţ>®eiiASC <srm&imm aagaacaatc tgaaatagat 900 '.AATCCttCTG. AfCttTeAAT GARÎTCTAT» ,.eGATTTC«A:.-C^TTACn,C CTTAGAATTA 960 TATAOATATA ATGGCTCAGA AATTCGTATA *ΤβΜ*«© AAACCTCAGA TAATGATACT 1020 xmmwtth cttcttjwgc mmcTstm':'-mmcakc aaatcattca ιοβο TMŞAIW3AAG: iTAGAAGAAAT ΑΑΕΑΑΑτΑΤΤ CCTAAAAGTA CACTAAAAAA ATTAAAAAAA 1140 "TftTmsrrtîT: J» 1152

<210> 43 <211> 383 <212> PRT <213> BacillusthuringienSis «40Q> 43

Wftţ,.';ţjeu,::A8|» :®&r t>ys Val,''Tyr «lu lle ser Asn His Ala Asn Gly X. 1: 10 ÎS

LaitlTyri.'Ala Ala Tfcjt: Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu Ştjl·' 25 30

Met Asn Lya Ain Asp Asp lle Aep Asp Tyr Asn Leu :Lys Trp Phe 35 40 45

Leu Phe Pro "II* A*p Asp Asp Gin Tyr lle lle Thr Ser (Tyr Ala Ala SO Bl 60

Asn Asn. Cys Lyi" Val τιρ Aen'Val Aşn A an Asp Lys lle Asn Val Şer 6$ 70 75 80 87 RO 123431 Β1 «pr:"Tyr ;'Şer Thr Asn Ser Ile 85

Gly;":Ser 3:<Sr Tyr Val Ile Gin Ser 10»

Gly Thr Gly Glw Ala Leu Gly teu 120

Asn Asn 'Pro Asn Gin Gin Trp Asn 130 135

Leu Pro Gin Ly8 Pro Ile Ile Aap 145 150

Tyr Si* Pro Thr Gly Asn Ile Asp 165

Giyvjjirji; Thr Leu Val Pro Cys Ile ISO

Lys .;Af n The Gin Tle Lys Thr Thr 195 200

Gin Ţyr Trp Gin Al# Ala Val Gly 210 215

Glu Lys Lys Ser ''Tyr Thr Tyr Glu 225 230

Gin Lys Trp, Clh, Ile "Ly# *ÎA:Asn 9.. 3S:

Asp Asn Gly Lys;: Val Leu· Thr AIA 105 110,:

Ile Arg: LgueTtir: Asp Glu Ser Ser :135

Leu Thr Ser Val Gin Thr Ile Gin 140

Thr Lys Leu Lys Asp Tyr 155 1β®

Asn Gly The'Aer j»ra el o, Leu Met 170 175

Met ValeAşirAsp Pro Asn Île Asp 135 100 " "

Pro Tyr'Tyrelle Leu Lys Lys -Tyr' 205

Ser As a' Vil Ala' Leu Arg Pro His 220

Trp Gly Thr Glu Ile Asp Gin Lys 235 240

Thr Thr Ila Ile Asn Thr Leu Gly Phe Gin Ile Asn Ile Asp Ser Gly 245 250 255

Met Lys Phe Asp Ile Pro Glu Val* Gly Gly Gly Thr Asp Glu Ile Lys 260 26S 270

Thr Gin Leu Asn Glu Glu Leu Lys Ile Glu Tyr Ser His Glu Thr Lys 275 280 285

Ile Met Glu Lys Tyr Gin Glu Gin Ser Glu ile Asp Asn Pro Thr Asp 250 295 300

Gin Ser Met Asn Ser Ile Gly Phe 305 310

Tyr Arg Tyr Asn, Gly Ser Olu Ile 32 5 ASp.ASn Asp Thr :Tyr Asn Val Ţhr 34 0

Leu::yîieu Leu Leu Thr Asn His Ser 355 360

Asn liiş Pro i.ys: :,ier Thr-y.Aeu Lys 3TS 3TS

Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Leu 315 320

Arg IIA Met Gin Ile Gin Thr Ser 330 335

Ser Tyr Pro Asn His Gin Gin.Ala 345 350

Tyr Glu Glp val Glu Glu Ile Thr 365

Lys Leu Lys- Lys Tyr Tyr Phe 380 ϊ\> ro

<210> 44 <211 >360 12> ADN 13> Bacillus thuringiensis 88 RO 123431 Β1 <4G0» 44 ATGTCCGCCC GCGAGGTGCA CATC5AGATC AACAACAAGA CCCGCCACAC CCTCCAOCTe 6$ţ GAOGACAAGÂ CCAAGCTCTC CGGCGGCAGG TGGCGCACCT CCCCGACCAA CGTGGCCCGC 120 "BACACCATCA Agacgttcgt ggcggagtcc cacggcttca toaccggcgt CGAGGGCATC 180 Atc^acttct CCGTG/ACGG cgacgccgag ATCTCCCTCC ACTTCGACAA CCCGTACATC 240 GGCTCCAACA AGTGCQACGG CTCCTCCGAC AAGCCCGAGT ACGAGGTGAT CACCCAGTCC 300 «eefeGSCG ACHASTCCCA. C«ft»CCÎ AC ACCATCCAGA CCGTCTCCCT CCGCCTCÎGA 360

<210> 45 <211> 115a <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis <400>45:: <400 52

Met Ger Gly Arg Glu Val Bl» 11« <3lu Ile Asn Asn Lya Thr Arg His 1 5 10 15

Thr Leu Gin Leu Glu ftsp: :Lys Thr Lys Leu Ser Gly Gly Arg Trp Arg 2 0 25 30 'Tfer' Ser "frp Tlpr Asn W1 Ala Arg Asp Thr Ile Lys Thr Phe Val Ala .........ÎS ..... 10: 45

•Gin 'S^r :lis Gly Phe Met Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Tyr Phe Ser 50 55 SO

Val ASM. Gly Asp. Ala Glu Ile .Ser Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ile 65 70 75 80 6% Set Asn Lys Cys» Asp Gly Ser Ser Asp Lys Pro Glu Tyr Glu Val 85 90 95 11« Thr Gin Ser Gly Ier Gly Asp Lys Ser His Vai Thr Tyr Thr Ile 100 105 110 •Gin

<210 53 <211>1103 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis: .'.<400>:53 89 RO 123431 Β1 JOTCTBCACA CCallCftftGST: TCCAACXTTCe CCAACSOCeT .'CfâCACCÎfiC 6® ACCTACCTCT CCCTCGACGA CTCCGGCGTG TCCCTCATGT CCAAGAAGGA CSSâSACSlÎC >120

GACGACTACA ACCTCAAGTG GTTCCTCTTC CCGATCGACA ACAACCAGTA CATCATCACC ISO TCCTACGGCG CCAACAACTG CAAGGTGTGG AACGTGAAGA ACGACAAGAT CAACGTGTCC 240 ACCTACTCCT CCACCAACTC CGTGCAGAAG TGGCAGATCA AGGCCAAGGA CTCCTCCTAC 300 ATCATCCAGT CCGACAACGG CAAGGTGCTC ACCGCGGGCG TGGGCCAGTC CCTCGGCATC 360 GTGCGCCTCA CCGACGAGT? CCCGGAGAAC TCCAACCAGC AATGGAACCT CACCCCGGTG 4 2« GASACCAtCe AGGTCCCGCA GAA ··—GAAG STCGACGAGA AGCTCAAGGA CCACCCGGAG 430 TACTCCGAGA: CCGGCAACAT CAACCCGAAG ACCAEfiţSGC .A6C:ieAP3eS':‘^GACCG!IC: ,540

GTGCCGTGCA TCATGCTGAA CGACTCCAAG AT«»C«A<3A ACSGOCAOA*'«AAGACCACC ."«OO costactaca TCTOOAAGAA ATACAAGTAC TGGAACCTCG ce«»0GG£*ci Waebîgtcc 660*

CrrCTCOCGG ACCftSAAGCC CAGCTACGAC TACGAGTGGC GCACCGAGAA GAACCAGAAG 220 AOCACCATCA TCAACACCGT GGGCCTGCAG ATCAACATCG ΑΓΓΘΒΘβΜΤ ΟΑΑβΜΘ» 7β0 GTGCCGOAGG TGdOCGGetSiâ'. CACCGAGGAC ATCAAOACGC AGCTCACCGA GeAGGtîGAftfl' 040* GTGC»GTACT CGACCGSGAC CfkAGATCATG ACCAAOTACC AGQAGCACTC ceAGAÎCqAC 900 AACCCGACCA ăeCftGCG»T" GAACTCCATC GSCCTCCTGA TCTACACCTC CCTCeftGGIW "S# o TACCGCTACA fteeecACiSSA' GATCAAGATC ATGGACAT0G AOACCTCCGA CCACeAOACC 1020 TACACCCTCA CCJCCTftGCC GAACCACAAO GACGCGCTeC TOCTGCTGAC CAACCACTCC 1000* TACGAG3AGG ÎGGAGâAGAT eftCEftAGAÎŞ ECGAĂGCACA CCCTCATCAA GCTCAAGAAG 1140

CACTACTTCA AefiMlîGA USB <210> 46;

<211> 24 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis <4Q0> 46 aacaagaagg tatt 24

<210> 47 <211 >25 <212> ADN <213> BacBfus thuringiensis <400> 47 90 RO 123431 Β1

atgtcagqwer gygaagfcŞea yattg 2S

<210> 48 <211 >238 <212> ADN <213> Badlh#thurlngiensis <400> 48 gtytgaathg tatahgthac atg 23

<210> 49 <211> 25 <212> ADN <213> BacâlUp thu fingienşis <400> 49 atgttagata cwaataaart vrtatg 25

<210> 50 <211 >29 <212> ADN <213> BaMl^ tiuringrerisiş <400> 50 gtwattfcctt cwaaltcttc afcahgaatgf' 29

<210> 51 <211 >341 <212> ADN <213> Bacillus thurîngiensîs <400> 51 atgtcaggtc gagaagtaca tattgaaata aacaataaaa caegtcatac attacaatta 60 gaggataaaa ctaaacttag cggcggtaga tggesgaaeat caeetacaaa tgttgctagt. 120 gataeaatta aaacatttgt agoagaatca catggtttta tgacaggagt agaaggţatt 180 atatatttta gtgtaaacgg agacgcagaa attagttcac attttgacaa tccttatata 240 ggttctaata aafcgfcgatgg ttcttctgat aaacotgaat afcgaagtfcat fcacteaaagc 300 ggatcaggag ataaatctca fcgtaacatat actattcaga c 341

<210> 52 <211> 113 <212> PRT <213> Organism necunoscut 91 RO 123431 Β1 atgttagata caaataaagt ttatgaaata acttatttaa gtcttgatga ttcaggtgtt gatgattaca atttaaaatg gtttttattt agctatggag ctaataattg taaagfcttgg acttattctt caacaaactc tgtacaaaaa ataatacaaa gtgataatgg aaaggtctta gtacgcctaa ctgatgaatt; tccagagaat caaacaattc aactcccaca aaaacctaaa tattcagaaa ccggaaatat aaatcctaaa gtaccttgta ttatggtaaa tgattcaaaa ocafeattata tttttaaaaa atataaatac ttacttccac atcaaaaaag atcatatgat aca«ctatta ttaatacagt aggattgcaa gtaccagaag taggaggagg tacagaagac gttgaatata gcactgaaac ceaaataatg aatcoaacta atcaaccaat gaattctata tatcgatata acggtacaga aattaagata tacactctta cttcttatce aaatcataaa

Eafegaâgaag tagaagaaat a%c

<210> 54 <211 >367 <212> PRT <213> Organism necunoscut <220> <221 > NESIGUR <212> (242) <213> Nedeterminat,!n secvenţad© amil agcaaCcttg ctaatggatt atatacatcm #0 agtttaatga gtaaaaagga tgaagatatt 420 cctattgata ataatcaata tattattaca 180: aatgttaaaa atgataaaat aaatgtttca 240 tggcaaataa aagctaaaga ttcttcatat 300 acagcaggag taggtcaatc tcttggaata 360 tctaaccaac aatggaattt aactcctgta 420 atagatgaaa aattaaaaga tcatcctgaa 480 acaactcctc aattaatggg atggacatta 540 atagataaaa acactcaaat taaaactact 600 Lggaatctag caaaaggaag taatgtatct 660 tatgaatggg gtacagaaaa aaatcaaaaa 720 attaatatag actcaggaat gaaatttgaa 780 ataaaaacac aattaactga agaattaaaa 840 acgaaatatc aagaacactc agagatagat 900 ggactfcctta tttacacttc tttagaatta 960 atggacafcag aaacttcaga tcatgatact 1020 gaagcattat cacttctcac aaaccattca 1080 1103 •izi dedusă <400> 54 92 RO 123431 Β1

Met 1 Leu ftjgp . Λ m * A» AU» :5 Lys Val Tvr . Jp...m— Glu Leu Tyar ŞŞ* gay 20: w* Tyr Leu ser" Leu 25 Met 0*-*<·ρ* <5Pt5-JLi :iiiye is Lys Asj> Glu Asp t*T '.fu JL ,Αθ·:·. 40 Αβρ Leu Phe 5 0 Pro Ile Asn Asn 55 Gllţ .Tyr Asn m .Aen cye Lye: Val Trp 70 Asn. Val Lys Thr '::Tyr S©2r Ser Thr 85 Asn Ger Val Gin Asp Ser Ser Tyr 100 Ile; Ile Gin Ser Asp 105 Gly Val Gly Gin 115 Ser Leu Gly Ile 120 Val Glu Asn 130 Ser Asn Gin Gin Tip 135 Asn Leu Leu 145 Pro Glit Ly« PlSO Lys ISO Ile Aep Glu Tyr' Ser Thr Gly A*n 165 ile Ă0tt Pro·. Gly Trp Ihr Leu 180 * Tw Ί yS* Pro Cys Ile Met 185 Jjys Asn Thr 195 Gin Ile Lys Thr Thr 200 ,f»ro: :hye Tyr 210 Trp Asn Leu Ala Lys 215 Giy Ser 1 Ile Ser: Asn Leu Asn Gly 10 15 3 Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu 30 5 ASp rv·· JL &m· JR e»î-| Leu Lys Trp Phe 7 45 «Jl «1^(2· ile Thr Ser Tyr Gly ' Al fi 9 Asn Asp 60 Lys Ile Asn Val Ser 11 75 80 13 Lys 90 Trp Gin Ile Lys Ala 95 Lys 15 Asn Gly Lys val Leu 110 Thr Ala 17 Arej Leu Thr Asp 1 *5i£ Glu ®he Pro 19 21 Thr Pro Val Gin Thr Ile Gin 140 23 Lys Leu Lys Asp His Pro Glu 155 160 25 Ly» 17© Thr Thr Pro Gin Leu 175 Met 27 Vel Asn ASp: Ser Lys Ile ASp 29 190 31 Tyr "Tyr. "li* Phe: Lys: Lye Tyr 205 33 Asn Va 1 'V JCLJif "Ser "220 Lf:U: Leu PrO" Hi* 35 93 RO 123431 Β1

Gin Lys Arg Ser Tyr Asp Tyr Glu Trp Gly Thr Glia ,.X»yfe g»h; Gin Ly3 225 230 "'IŞS 240

Thr:· Xaa iile 11© Αβίi "Thr Val Gly Leu Gin lle Asm 11©:: Asp Ser· Gly 245 250 255

Mefe l*ys ';;H» Glu Val ®:rp; Glu "Val.. Gly Gly "Gly Thr Glu Asp iile Uf a 260 265 270

Thr·· Gin Leu.. Thr Glu Glu Leu .%*·. Val Glu, Tyr Ser Thr Glu Thr· Lys.· 215 iiO·:· 285" 11 e Met Thr·· Lys Tyr Gl®: SI® 'Bi«: fer Glu, Iii·' Aip Mm·· *«# Thr As®: 290 ,2:15 300

Gin ®e© Met. Asn fer· lle Gly· Leu. Leu ιΐ», Tyr Thr ser Leu Glu Leu 305 310 115 320

Tyr Arg Tyr Asn Gly' TjKfâţi Glii 53S lle· Lyp ne·· Met Αερ île SI®. ''Thr: Ser 330·’ 3’35’ ...Asp Bis Asp Thr

Thr· Leu. Thr Sei 345 §ro. Aen His Lys Glu Ala 350

Leu Leii Leu Leu 'Thr as® sip: ser· Tyr 355 35®

Val Glu Glu lle 365 <210> 55 <211> 341 <212> ADN <213> Baciiius thuringiensis <400> 55 atgtcagctc gtgaagtaca gaagataaaa caaaacttga gatcaaatta aaacatttgt atatattata gtataaatgg ggttctaata aatatgatgg ggatcaggaa atcaatctca tattgatgta aataataaga tggtggtaga tggcgaacat agcagaatca catggtttta agaagcagaa attagtttat ggattccaat aaacctcaat tgtaacatat acgattcaaa caggtcatac attacaatta 60 caccfcacaaă tgttgctaat 120 tgacaggtac agaaggtcat ISO attttgataa tccttattca 240 atgaagttac taeecaagga 300 c 341 94 RO 123431 Β1

<210> 56 <211> 113 <212> PRT <213> Organism necunoscut <400> 56

Met Ser Aia Arg Glu Val His Ile Asp Val As» Asn Lys Thr Gly His 1 5 10 15

Thr Leu Gin Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg 20 25 30

Thr" Ser. Tire» Thr Asn Val .Ala·' Asn Asp Gin ile Lys Thr Phe Val Ala 35 40 45

Glu Şer Hlş fly Phe Met Thr Gly Thr Glu Glf His Ile Tyr Tyr Ser 51 55. 60

Ile·'Aş» Gly · Glu; Ala el», jle·. Ser Leu Tyr'The. Asp Asn Pro "Tyr Se». 65 70 75 Μ

Gly ser As»;· Lye' Tyr Asp; Gly Asp Ser Asn ;Lyft.. Pro Gin Tyr Gin Val 85 90 " :«

Thr Tftr Gl»; Gly Gly ser Gly Asn Gin Ser HÎ*· 'Val Thr Tyr :Tht Ile 100 105 110 61».

<210> 57 <211> 1103 <212> ADN <213> Bacilius thuririgiensis <40Q>57 atgttagaea ctaaiaaagt ttatgaaata agtaatcatg ctaatggact atatgeagea 60 aettatttaa gtttagatga ttcaggtgtt agtttaatga ataaaaatgâ tgatgatatt 120 gatgattaca acttaaaatg gtttttattt cctattgatg atgatcaata tattattaca 180 agetatgeag eaaataattg taaagtttgg aatgttaata atgataaaat aaatgtttcg 240 acttattctt taacaaattc aatacaaaaa tggcaaataa aagctaatgg ttcttcatat 300 gtaaţacaaa gtgataatgg aaaagtctta acagcaggaa ccggtcaagc tcttggattg 360 atacgtttaa ctgatgaatc tteaaataat cccaatcaac aatggaattt aacttctgta 420 oaaacaattc aacttccaca aaaacctata atagaracaa aattaaaaga ttatcccaaa 480 tattcaccaa ctggaaatat agataatgga acatctcctc aattaatggg atggacatta 540 gtaocttgfca ttatggtaaa tgatccaaat atagataaaa atacteaaat taaaactact 600 ccatattata ttttaaaaaa atatcaatat tggcaacgag cagtaggaag taatgtagct 660 ttaegţccac atgaaaaaaa atcatatact ţatgaatggg gaacagaaat agatcaaaaa 720 acaacaatca taaatacatt aggatttcaa atcaatatag attcaggaat gaaatttgat 7B0 ataccagaag taggtggagg tacagatgaa ataaaaacac aactaaatga agaattaaaa 840 atagaatata gtcgtgaaac taaaataatg gaaaaatatc aagaacaatc tgaaatagat 900 aatccaactg atcaaccaat gaattctata ggatttctta ctattacttc tfctagaatta 960 tatagatata atggctcaga aattcgtata atgcaaattc aaacctcaga taatgatact 1020 tataatgnta cttcttatcc agatcatcaa caagctttat tacttcttac aaatcattca 1080 tatgaagaac tagaagaaat aac 1103

<210> 58 <211 >367 <212> PRT <213> Badllus thuringiesis <400> 58

Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu ile Ser Asn Hi* Ala Asn Gly 15 10 15 95 RO 123431 Β1

Leu Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Oly Val Ser Leu 20 35 30

Set AB.i»,::35ye ftsa Asp Asp Asp Ţie .Asp Asp Tyr Asp, Le»; Lys Trp. Phe 35 40 45

Leu Phe Pro Ţie |wp Asp Asp Gin Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Ala 50 55 60 /Asn, /Ren/Ciye I*yş Val Trp vAen VSl „Asn Asn Asp> Lys:. Ile Asir VAI Ser /65: 70 75 80

Thr Tyr Ser Leu Thr Asn Ser Ile Gin Lys Trp Gin Ţie Lys Ala Asn 85 50 95

Gly Ser Sar Tyr Val Ţie Gin, Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala 100 105 MO

Sly Tlur:Gly Gin Ala Leu·,Oly Lau ŢŢe Arg Leu Thr Asp 01« Ger Ser· 115 120: 125

Asn Asn P»p Asn Gin Gin Trp Asn Leu Thr Ser Val Gin Thr Ţie Gin 130 135 140

Leu Pro:, Gin. Ly% Prp ile Ţ/ls Asfe: Ţîir ::Lys Leu Lys/ Aip-Tyr/ Pro Lys 145 150 ............... 155 160 /Ţyr'Se/f'Pro Thr Gly Asn Ile Asp: Asn Gly Thr Ser .Sro,··:.?!». Leu. Met 165 170 175

Gly Trp Thr Leu Val Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Pro Asn Ile Asp 180 185 190

Lye ZAsh Thr Gin Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Leu Lys Lys Tyr 195 200 205

Gin Tyr Trp Gin Arg Ala Val Gly Ser Asn Val Ala .Lett Arg Pro Hla 210 215 220:

Glu Lya Lys Ser :Tfit Thr Tyr Gin Trp Gly /fi*»;· Glu /îl® Asp Gin Lys 225 "" 230 :335: 240

Thr Thr Ile ile Asn.. Thr Leu Gly/Phe Gin Ii* Asn, 11«:. Asp Ser Gly 245- 25$ 255

Met Lys Phe Asp Ile Pro »01« Val Gly Gly Gly Thr Asp 61« Ile Lys 260 265 270

Thr Gin Leu Asn Glu Glu LeU Lys Ile Glu Tyr Ser Arg Glu Thr Lys 275 280 285

Ile Met Glu Sy® Tyr Gin Glu Gin Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asp ..... /390· 295 ..... 300 96 1 RO 123431 Β1 1 Gin Pro Mefc. Α*0 Ser Ile ®ly Mierea 'Thr île 305 310 3:15 Tyr Mg; Tyr Asn Gly Ser Glu Ile Arg Ile Met 325 330 AB&: AM Asp Thr .Tyr. Asn -&te Thr Ser Tyr Pro 340 3:45

Ţt»r Ser Leu: Sîs Leu >310 Plft Ile Gin Thr Ser 335 Asp His Gin Gin Ala "3;5C

LeU; .işti,: Leu Leu Thr Asn His Ser 355 360 piu,;. Glu Leu Glu Qlu II© 365 <210> 59 <211 >340 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis 3 5 7 9 11 13 15 atgtcagcag gtgaagtacs tattgatgca aataataaga caggtcatac attacaatta 60 gaagataaaa caaaacttga tggtggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctaat 12u gatcaaatta aaacatttgt agqagaatca catggtttta tgaeaggr.ac agaaggtcat 180 atatattata gtataaatgg agaâgeagaa attagtttat attttgattaa tcctfcattca 240 ggtfcctaata aatatgatgg ggattccaat aaacctcaat afcgaagttac tacccaagga 300 ggatcaggaa atcaatctca tgfctacttat acaattcaaa 340

<210> 60 <211> 113 <212> PRT <213> Bacillus thuringiesis <400> 60 17 19 21 23 25 27 29 97 RO 123431 Β1

Met ser Al,â Sly: Glu Vil His Ile Asp Ala Asn Asn Lys Thr Gly His 1 S 10 15

Thr Le» el» Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Ârg Trp Arg 20 25 30

Thr Ser "Pro: Thr As» Val Ala Asn Asp Gin Ile Lys Thr Pbe Val Ala 35:· 40 45

Glt, Ser Me Gly Phe Met Thr Gly Thr Glu Gly His Ile Tyr Tyr Ser 50 55 60

Ile :ftB» Gly Gl» Aii Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Tyr Ser 65 70 75 80

Gly 'Ser ăsa .lys ':Tyr Asp Gly Asp Ser Asn Lys Pro Gin Tyr Glu Val li 90 95

Tby 'Thr Gl» Gly "Gly Ser Gly Asn Gin Ser His Val Thr Tyr Thr Ile 1® 105 110

<210> 61 <211 >340 <212> ADN <213> BaciSlus thuringiensis <400> 61 acgtcataca ttacaattag so acctacaaat gttgctcgtg 120 gacaggagta gaaggtatta 180 Ifcttgacaat ccttatatag 240 tgaagttatt actcaaagcg 300 340 tgtcagcacg aggataaaac atacaattaa tatatfcttag gttctaataa gatcaggaga tgaagtacat itttegaaataa acaataaaec taaacttago ggeggtagat ggcgaacatc aacatttgt» gcagaatcac atggttttat tgtaaacgga gacfgeiagaaa ttagfcttaca atgtgatggt fcctsfcctgata aacctgaata taaatctcat gtgacatata egattcagac

<210> 62 <211> 112 <212> PRT <213> Bacillus lliuiingiesis <400>'.S2 98 RO 123431 Β1

Ser Ala Aj :g Glu Val His Ile Glu Ile ten Asn Lys Thr Arg His Thr 1 1 5 10 15 3 Leu Gin Lc m aiu Asp Lys Thr L’ fs Leu Ser Gly Gly Arg Trp Arg Thr 20 25 30 5 Ser Pro Ti ir ten Val Ala Arg Ai 3p Thr Ile Lys Thr Phe Val Ala Glu 7 15 40 i 45 Ser Hi s Gly Ffte Hefc Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile T yr Phe Ser Val 9 50 55 60 11 Asn Gly As ψ Ala Gin Ile Ser Leu His Phe ASp Asn P ro Tyr Ile Qiy 65 70 75 80 13 Ser Asn L3 m Cys Asp Gly Ser Ser Asp Lys Pro Glu T yr Glu Val Ile 15 :8S 90 95 Thr Gin 5* m Gly Ser Gly Asp Lys Ser His Val Thr T m Thr Ile Gin 17 100 105 110 19 <210> 63 <211 > 1114 <212> ADN 21 <213> Bacillus thuringiensis 23 <40O> 6.3. 25 atgttagata ctaataaaat ttatgaaata agcaatcfctg ctaatggatt atatacâdcâ 60 acttatttaa gtcttqatga ttcaggtgtt agtttaatga gtaaaaagga tgaagatatt 120 27 gacgattaca atttaaaatg gtttddattt cctattgata ataatcaata tattattaca 180 agctatggag ctaat&attg taaagtttgg aatgttaaaa atgataaaat aaatgtttca 240 acfctattctC caacaaactc tgtacaaaaa tggcaaataa aagctaaaga ttcttcatat 300 29 ataatacaaa gtgataatgg aaaggtctta acagcaggag taggtcaatc tcttggaata 360 gtacgcctaa ctgatgaatt tccagagaafc tctaaccaac aatggaattt aactcctgta 420 31 caaacaattc ase î: cc caca aaaacctaaa atagatgaaa aattaaaaga tcatcctgaa 480 tattcagaaa ccggaaatat aaatcctaaa acaactcctc aattaatggg atggacatta 540 gtacdttgta ttatggtaaa tgattcaaaa atagataaaa acactcaaat taaaactact 600 33 ccatattata tttttaaaaa atataaatac tggaatctag caaaaggaag taatgtatct 660 ttacfctccac atcaaaaaag- atcatatgat tatgaatggg gtacagaaaa aaatcaaaaa 720 35 acaactatta ttaataeagh aggattgcaa attaatatag attcaggaat gaaatttgaa 780 gtacoagaag taggaggagg; tacagaagac ataaaaacac aattaactga agaattaaaa 840 gttgaatata ycactgaaac caaaataatg acgaaatatc aagaacactc agagatagat 900 37 aatocaacta a t caaccaat gaattctata ggacttctta tttatacttc tttagaatta 960 tatcgatata acggtacaga aattaagata atggacatag aaacttcaga tcatgatact 1020 39 tacactctta cttcttatcc aaatcataaa gaagcattat tacttctcac aaaccattct 1080 tatgaagaac tagaacaaat tacaagggcg aatt 1114 99 RO 123431 Β1

<210> 64 <211> 371 <212> PRT <213> Bacillus thuringiesis <220 <221 > NESIGUR <212> (242) <213> Nedeterminatîn secvenţa de amlnoacizi dedusă <400 64

Met Leu Asp Thr Asn Lys Ile Tyr Glu Ile Ser .As» Leu Ala Asn -Giy 1 5. 10 15 "ieft 'Tyr Thr Ser Thr Tyr .:;Ser' Lei· .Asp Asp Ser' :Gly Val Set Leu 20 25 30 .Ifeh Ier Lys Lys Asp Gli* Asp Ile Aşp Asp Tyr Asm. ,Le« Lys· :£rp ftie 35 45

Leii· .The Pro IlerJtep Asm Asn 'Glit Tyr Ţie ;lle Thr ser· Tyr Gly Ala 50 55 €0'

Asn Asn Cys Ly#· Vel ',;Trp Asn Bl. .Asn. Asp Lys Ile·' As» Val Ier 65 70 75 80

Thr Tyr Ser Ser Thr Asm Ser Val Gin Ly® Trp Gin Ile Lys Ala Lys 85 m ............ 95 ASp Ser Ser Tyr Ile Ile Gin Ser Asp Asm Gly Lys Val Leu Thr Ala 100 105 no 100 RO 123431 Β1

Gly Val Gly Gin Bei·': Lan Gly ile Val 11S 120

Glu Astt Ser Asm Gin Gin Trp Asm Leu 130 135

Leu Pro Gin Lys Pro Lys ile Asp Glu 145 150

Tyr Ser Glu Thr Gly Asn Ile Asn Pro 165

Gly :'--frp'ÎSr'Leu :'V*i Pro Cysi ile Met lit 185

Lys Aa|î Thr Gin Ile Lys Thr Thr Pro 195 200

Lys Ty:r Asn :ΙΛΐ Ala Lys Gly Ser 21.0 215

Gin Lys Arg .Ser ^fyr Asp Tyr Glu Trp: 225 230

Thr mr ile ile Asn Thr val: Gly Lee; 24 5

Met Lys Phe Glu val Pro Glu Val Gly 260 265

Thr Sin Leu Thr Glu Glu Leu Lys Val 275 280

Ile Met Thr Lys Tyr Gin Glh Blş Ser 290 295

Gin Pro Met Asn Ser Ile Gly Leu Leu 305 310

Tyr Arg Tyr Asn Gly Thr Glu Ile Lys 325

Asp His Asp Thr Tyr Thr Leu Thr Ser 340 345

Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr 355 360

Arg Ala Asn 370 1 Arg Leu Thr Asp Glu 125 Phe Pro 3 Thr Pro Val im Gin Thr Ile Gin 5 Lys Leu 155 Lys Asp His Pro GlU 160 7 9 Lys Thr Thr Pro Gin Leu Met 170 175 11 vai Asn Asp B*r '1îye îvS'O Ile Ai*· Jr 13 Tyr Tyr Ile Phe Lys uys Tyr 15 205 17 Asn Val Ser Leu Leu Pro Hlf: 220 19 Gly Thr Glu Lys Asn Gin Lys 21 235 240 Gin Ile Asn ile: Asp;: Ser Gly 23 250 251 25 Gly Gly Thr Glu Asp Ile Lys 270 27 Glu Tyr Ger Thr Glu Thr Lys 29 285 Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asn 31 300 33 ile Tyr 315 Thr Ser Leu Glu leu 320 35 Ile Met Asp Ile Glu Thr . ser 37 330 335 Tyr Pro Asn His Lys Glu Ala 39 350 41 Glu Glu Leu Glu Gin Ile Thr 365 43 45 101 RO 123431 Β1

<212> ADN <213> Bacillus thuringiensis <400> 67 atgttaga^* acttatttaa gatgattaoa agctatggag aO'tî'ta'tfciOfe'fc" ataatacaaa gtacgccta.1 caaacaattc tattcagasa gtaccttgta ccatattata ttaettccac acaactatta gcaccagaag gfctgaatata aatccaacta tatcgatata tacactctta tatgaagaag cattatttta atatacatca 60 tgaagatatt 120 tattattaca 180 aaatgtttca 240 ttcttcatat 300 ctaataaagt ttatgaaata agcaatcttg ctaatggatt gtcttgatga ttcaggtgtt agtttaatga gtaaaaagga atttaaaatg gtttttattt cctattgata ataatcaata ctaataattg taaagtttgg aatgttaaaa atgataaaat caacaaactc tgtacaaaaa tggcaaataa aagctaaaga gtgataatgg aaaggtgtta acagcaggag taggtcaatc tcttggaata 360 ctgatgaatt tccagagaau rxtaaccaac aatggaattt aactcctgta 420 aactcccaca aaaaccCaaa atagatgaaa aattaaaaga tcatcctgaa 4B0 ccggaaatat aaatcctaaa acsactcctc aattaatggg atggacatta 540 itatggtaaa tgattcaaaa atagaraaaa acactcaaat taaaactact 600 tttttaaaaa atataaatac tggaa-ctag caaaaggaag taatgtatct 660 atcaaaaaag atcatatgat tatgaatggg gtacagaaaa aaatcaaaaa 720 !·.taatacagt aggattgcaa attaat.at.ag attcaggsar gaaatttgaa 780 taggaggaqg taeagaagac ataaaaacac aattaact-.ga agaatLasaa 840 goaetgasac eaaaataatg acgaaatatc aagaaoactc agogatagat 900 atcaaeeaat gaattctata gg&cttctca tttatacttc tttagaatta 960 moggtacaga aattaagatâ atggacatag aaacttcaga tcatgatact 1020 cttcttatcc aaatcataaa gaagcattat tacttctcac eaaccaitcg 1080 tagaagaaat aacaaaaata cctaagcata cacttataaa attgaaaaaa 1140 aaaaAfcaa: 1158

<210> 68 <211> 385 <212> PRT <213> Bacillus thuringiesis <400> 68 <210» 65; <211» 360 «2:123* ADN' «2:1:.3» B'acHlil»;th'Uringîensis <400» 65 atgteagete gegaagtaca eattg^aata aâcaataasa cacgtcatae attaeaarta 60 gaggataaaa ctaaacttag cggcggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctcgt x20 gatacaatfcp aaaeacttgt agcagaatca 'cetggtttta tgacaggagt aga.aggta.tt ISO atatattfct* gtgtaaacgg agacgcag*· .attagtttac attttgacaa tcefcfcatafca 240 ggttctaata aafcgtgatgg fctcttctgat aaacctgaat atgaagttat tactcaaagc 300 ggafccaggag ataft»tctca tgtgacatat *ct»tccaga cagtatottt acgattafcaa 360 <210» 66 <211> 119 <212> PRT <213> Bacillus thuringissiş. «400» 66 Met Ser ala Arg Glu Val His Ile 1 5 Thr Leu Gin Leu Glu Asp Lys Thr 20 Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Arg 35 40 Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly 50 55 Val Asn Gly Asp Ala Glu Ile Ser 65 70 Gly Ser Asn Lys Cye Asp Gly Ser 8S Ile Thr Gin Ser Gly Ser Gly Asp 100 Gli».: Th.r 'Val SSr Leu Arg Leu; 115

Glu- Ile Asn Asn "'LyS' Thr Arg' HÎe io 15 Lys Leu Ser Gly Gly Arg Trp Arg 25 30 Asp Thr Ile Lys Thr Phe Val Ala 45 Val Glu Gly Ile Ile Tyr Phe Ser 60 Leu Hi s Phe Asp Asn Pro Tyr Ile 75 80 Ser Asp Lys Pro Glu Tyr Clu: Val 90 95 Lys Ser His Val Thr Tyr Thr Ile 105 110 <21Q»'::67 <2ΐ;ΐ:»"«58:: 102 1 RO 123431 Β1

Met L4tM: Asp Thr Asii: Lys Văl :Tyr ·δΙΐ' Ile Ser Asn Leu Ala Asn Gly 1 5 10 15

Leu Tyr Thr «pe TUr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu 20 25 30

Met Ser Lys Lys Asp Glu Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe 35 40 45

Leu Phe Pro Ile Asp Asn Asn Gin Tyr Ile Ile Thr ;8®r Tyr Gly Ala 50 " '51 m

Asm Asii Cys; lys Val Trp Asn Val Lys Asn Asp Lys TTft,,Asa lai Ser 55 Vi; 75 1®

Thr Tyr .Ser Ser ThrASS-Ser Val.. Gin Lys'Trp Gin Ile Lys Ala Lys 85 ......fO ' ...........95...........

Asp. Ier Ser Tyr Ile Ile Gin Ser Asp Asn Gly Lys val Leu Thr Ala 100 10:5· 110

Gly·'" Val "Gly· G In Ser" .Leu Gly ile val Arg L»u Thr ;AŞp:: Glu Phe Pro 115 120 .......125

Glu Asn Ser Asn Gin Sin Trp Asn ..Leu Thr Pro Val Gin Thr Ile Gin 130 135 140

LeV Pro Gin Lys Pro Lys Ile Asp Glu Lys Leu Lys Asp His Pro Glu 145 150 155 160 3 5 7 9 11 13 15 17 19 25 27 103 RO 123431 Β1 atgtcagctc gcgaagtwca tattgaaata gaggataaaa ctaaacttag cggeggtaga gatacaatta aaacâtttgt agcagaatea atatatttta gtgtaaacgg agacgcagaa ggttctaata aatgtgatgg ţtcttctgat ggatcaggag ataaatotca fcgtgacatat aacaataaaa cacgtcatac attacaatta 60 tggcgaacat cacctacaaa tgttgctcgt 120 catggtttta tgacaggagt agaaggtatt 180 attagtttac attttgacaa tcctcatata 240 aaacctgaat atgaagttat tactcaaagc 300 accattcaaa 340

<210> 74 <211> 113 <212> PRT <213> Bacillus thuringiesis <400> 74

Met Ser Ala ftrg Ιΐϋ Val Hi a Ile Glu Ile Asn Asn Thr Arg 1 5 10 ÎS

Thr Leu Gin Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Ser Gly Gly Arg Trp Arar 20 25 30

Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Arg Asp Thr Ile Lys Thr Phe val Ala 35 40 45

Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Tyr Phe Ser 50 55 60

Val Asn Gly Asp Ala Glu Ile Ser toi His Phe Asp Asn.. Pro Tyr Ile 65 m 75 80

Gly Ser Asn Lya: Cys Asp- Gly «e* ..Ser Asp Lys.. Pro Glu Tyr Glu Val 85 fi 95 ile Thr Gin Ser Gly Sef GlfASp Lys Ser ‘His: Val .fhr Tyr TAr Ile 100 105 110:

Gin

<210> 75 <211> 341 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis <400> 75 104 1 RO 123431 Β1

Tyr Ser Glu Thr Gly Ăsa Ile Asn Pro Lys Thr Thr Pro Gin Leu Met 170 175

Gly Trp Thr Leu Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Ger Lys Ile Asp 180 185 190

Lys Asn Thr Gin Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile:: Phe Lys Lys Tyr 1.95 200 205

Ly» Tyr Trp Asn Leu Ala Lys·, Gly Ser Asn :Val Ser" Le» Leu Pro Hls 210 aii. 22f

Gin Lys .Arg Ser Tyr Asp Tyr·· Glu Trp Gly. Thr Glu Lye Asn Gin Lys 225 230 "" ' :23¾ 240

Thr Thr Ile Ile Asn Thr "'Vii. Gly Leu Gin Tle Asn Ile Asp Ser Gly 245 250 255

Met: :hys Phe Glu Val Pro Glu: Gly Gly Gly Thr Gl» Asp Ile Lys :lfO 265 270

Tht Gin Leu Thîr Gltt, Gl» Leu" Lys Val Glu Tyr Ser Thr Glu Thr Lys 275 280 2:8:5:

Ile Met Shr 'Lys Tyr'Gin.. Glu .Bis Ser Glu. Tle:· Asp .Asn Pro Thr Asn 290 295 300

Gin Pro·. Met: ..Asn.. Ser· "Ile Gly Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Leu Glu Leu 305 310 315 320

Tyr .**.rg Tyr Asn Gly Thr Glu Ile Lys Ile Met Asp Ile Glu Thr Ser 325 330 335

Asp His Asp Thr Tyr Thr Leu Thr Ser Tyr Pro Asn His Lys Glu Ala 340 345 350

Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Glu Glu Val Glu Glu ile Thr 355 360 365

Lys Ile Pro Lys His Thr Leu Ile Lys Leu Lys Lys His Tyr Phe Lys 370 375 380 i.ys 85 <21:0». 69: 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 105 RO 123431 Β1 <211> 341 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis <400> ea atgtcagcac gagaagtaca cattgatgta aataataaga caggtcatae attacaatta 60 gaagataaaa caaaacttga tggtggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctaat 120 gatcaaatta aaacacctgc agcagaatca aatggtttta tgacaggtac agaaggtact 180 atatattata gtataaatgg agaagcagaa attagtttat attttgacaa tccttttgca 240 ggttctaata aatatgatgg acattccaat aaatctcaat atgaaattat tacccaagga 300 ggatcaggaa atqaafcefcea tgttacttat acaattcaga c 341 <210> 70 <211> 113 <212> PRT <213> Bacillus thuringiesis <400> 70 Met Ser Ala Arg Glu Val 'His Ile Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His 1 5 10 15

Thr lihh Gl»· l*eu G1U Asp tye Thx hy*.·. Leu Asp Gly Gly Arg Trp .Arg ;.20 25 30 "Str Ser iro Thr Asn Val ala; Asn Asp Gin Ile Lys Thr Ser Val Ala 35 40 45

Glu Ser As» "Gly Phe "Meh Thr" Gly Thr Glu Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser 50 "55 60

Ile As» Gly ..Glu Ala Glu Ile Ser hm Tyr Phe Asp Asn Pro Phe Ala 6.5 VO 75 80

Gly Gir Asn Lys; Tyr Ah* Gly' Bis Ser Asn Lys Ser Gin Tyr Glu Ile B5 90 95

Ile: Thr Gin Gly Gîf· Ser "Gly As» Gin Ser His Val- Thr Tyr Thr Ile 100 105 110

Gin <21Q> 71 <211> 340 <212> ADN <213> Bacillus thurîngierţsis 106 RO 123431 Β1 <400 71 atgtcagcag gcgaagttca tattgatgta aataataaga caggtcatac attacaatta 60 gaagataaaa caaaaottga tggtggtaga tggcgaacat eacctaoaaa tgttgctaat 120 gatcaaatta aaacatttgt âgc&gaatca aatggtttta fcgacaggtac agaaggtact 180 atatattata gtataaatgg agaagcagaa attagtttat attttgacaa tccttttgca 240 ggttctaata aatatgatgg acattccaat aaatctcaat atgaaattat tacccaagga 300, ggatcaggaa atCaatctca tgtaacgtat acaattcaaa 340:

<210> 72 <211> 113 <212> PRT <213> Bacillus thurîngifşis <40Q> 72

Met Seaf Ala Gly Giu Val His lift; Asp Val JKsn Asn Lys Thr Gly Hi a ΐ 5 10 II"

Thr Be» Gin Bea: Gl» ,Aep Ly:i: :Tfer .Bea,.: mp Gly Gly Arg Trp Arg m 25 30 "Thr Ser «r© Thr Asn Val Ala" Asn Asp Gin lift Lys Thr Phe Val Ala 35 40 45 Gl» Ser Aen ""Gly· «fee Tfer Gly.· Thr Ga» Gly: Thr Ile Tyr Tyr Ser 50 55 SG Ile Αβή· Glf Glm·· Ala Glu ne set Bea Tyr «fee :AS§"· mm Pro Phe Ala 65 70 75 80 Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His Ser Asn Lys ier· Gin Tyr: Glu ile 85 90 95 Tle: Thr Gin Gly Gly ser" Gly .Mm: Gin ,Ser: hi® Val Tfet W Thr Ile 100 TOS" li©·

Gl»

":<2:10:73 <211 >340 <212> Af)N <213> Bacillus thuringiensis "«400 73 107 RO 123431 Β1 atgtcagctc gcgaagttca tattgaaata aataataaaa caegteafca© stfcasaaitea #6 gaggataaaa ctaaacttac cagtggţage tggcgaacat cacctacaaa tgttgctcgt 120 gatacaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggaat agaaggtatt 188 atatatttta gcgtaaacgg agaagcagaa attagtttac attttgacaa tecttatgta 240 ggttctaata aatatgatgg ttcttctgat aaagctgcat acgaagttat tgctcaaggt 300 ggatcagggg atatatctca tgtaacttat acaattcaaa c 3431

<210> 76 <211> 113 <212> PRT <213> Bacillus thuringiesis <400> 76

Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile asu Asn Lys Thr Arg His 1 5 10 15 Tbr Leu Gin Leu Glu Asp Lys Thr Lyş Leu Thr Ser Gly Arg Trp Arg 20 25 30 Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Arg ABp Thr Ile Lys Thr Phe Val Ala 35 40 45 Glu ser" His Gly Phe Met Thr Giy ile Glu Gly Ile Ile Tyr Phe Ser ISO 55 60 Val Aer Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Val 65 70 75 80 Gly· 'Ser Asn Lys Tyr Asp Gly Ser Ser Asp Lys Ala Ala Tyr Glu Val '85. 90 95 :Il:e: Ale, Gin Gly Gly Ser Gly Asp Ile Ser His Val Thr Tyr Thr Ile 100 105 110 .Qltt

<21Q> 77 <211> 1175 <212-* ADN <213> Bacillus thuringiensis <4G0> 77 108 RO 123431 Β1 atgttagata ctaataaagt ttatgaaata agcaatcatg ctaatefgatt afeatacataca. §0 acctatctaa gtctggatga tteaggtgtt agtttaatgg gtcaaaatga tgaggatata 120 gatgaatmca atttaaagtg gttcttattt ccaatagata ataatcaat» tattattaca ISO agctatggag cgaataattg taaagtttgg aafcgfcfcaaaa atgataaagt aaatgfcttpa 240 acgtattcdc caacaaactc agtaeaaaaa tggcaaataa aagctaaaaa ttcttcatat 300 ataataeaaa gtgagaatgg aaaagtctta aeagdaggaa taggtcaate tcctggaata 360 gtacgcttsa ccgatgaatc atcagagagt tctaftOCaac aatggaattt aatccctgta 420 caaacaattt cactcdcaca aaaacctaaa atagataaaa aattaaaaga tcatcctgaa 480 tattcagaaa ccggaaatat agctactgga acaatfccctc aattaatggg atggacatfca 540 gtaccttgta ttatggfcaaa tgatecaaaa atagataaaa acactcaaat taaaactact 600 ccatattata tttttaaaaa atatcaatac tggaaacgag caataggaag taatgtatct 660 ttacfcfcdcac atcaaaaaaa atcatatgat tatgagtggg gtacagaaga aaatcaaaaa 720 acaactatta ttaatacagt aggatttcaa attaatgtag attcaggaat gaagtttgag 780 gtaccagaag taggaggagg tacagaagaa ataaaaacac aattaaatga agaattaaaa 640 gttgaatata gcactgacac caaaataatg aaaaaatatc aagaacactc agagatagat 900 aatccaacta atcaaacaat gaattctata ggatttctta cttttacttc tttagaatta 960 tatcgatata acggttcgga aattcgtata atgagaatgg aaacttcaga taatgatact 1020 tatactccga cctcttatcc aaatcataga gaagcattat tacttctcac aaatcattca 1080 tatcaagaag tacmagaaat tacaagggcg aattcttgca gatatccatc acactggcgg 1140 gccggtcgag ccttgcatct agaggggccc caatt 1175

<210> 78 <211 >391 <212> PRT <213> Bacillus thuringiesis <*22Q> <211> NtiSiGUR <212> (242)

<213> Nedeterminat In secvenţa' de amindaciii dedusă <40.0>7S

Met:·: tiew :Asp fte Asn Lys Val, tEfi? :Glp. Ile -Mjţr Asn :lls ·Α14: âsa Gly "i s io Μ

Jitm, şyt Seat Tyr IA». i«r ÎA» Aep ,Asp Ser" Gly·· Val Ser Leu

20 "2S: SO 109 RO 123431 Β1 u Xaa :%şp $eu Lys Trp :Phe

Met: Gly Gin Αβη Asp Glii Asp Ile Asp G' 35 40

Leu Phe Pro Ile Asp Asn Asn Gin. 50 55

Asn Asn Cys Lys-"'Vel Trp Asn Val 65·: 70

Tltr Tyr Ser Pro.; Thr' ASa Ser Val Pf :Ae», Sar per Tyr lle Tle Gla ..sar .oo

Gly ile Gly Gin Ger pro Gly Ile 115 120

Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Gly Ala 60'"

Lys Asn Asp Lys Val Aii* Val ::Ser 75 :f(L

Gin Lys T*p Gin Ilei/Pys' Ăla Lys 90 95

Gltt Asn Sly Lys Val Leu Thr Ala 105 110 val Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ser 125

Glu Ser Ser Aen. Gli* ::Gln Trp Asn Leu Ile Pro Val Gin Thr Ile:· Ser 130 135 ..... 140

Leu Pro Gin Lys Pro Lys 116 ·::Α$ρ Lys· Lys Leu -Lys - Asp- His Pro Glu MS"' 150 155 160

Tyr: 'Ser Glu Thr Gly Aen Ile .Ala Thi Gly Thr Ile Pro Gin Leu Met 165 170 175 ,Gly T:rp Thr Leu Val #r© Cys :.lle Met val Asn Asp Pro: Lys Ile Asp 180 185 190

Ly®: Asn Thr Gin Tle "Ly» Thr Thr Pro Tyr Tyr ile Phe Lys Lys Tyr 19S 200" 205

Glh' Tyr Trp Lys Arg Ala Ile Gly Per Asn Val Ser Leu Leu Pro His 210 215 220

Gltt iiye Lys ser "Tyr''Asp. ..Tyr Glu Tip Gly· Thr Glu Glu Asn Gin Lys 225 230 ' 3:35 240

Thr Tip?" Ile: ile ASP/Thr Val Gly Phe Gin Tle Asn Val Asp Ser Gly 2*5 250 255

Met Lys·"phe: Glu Val Pro; Glu val f&y Gly Gly Thr ilp Glu Ile Lys 260 '265 2 70 :Thr Gin Leu Ase Glu.:·;: Glu l»eu Lys .Val Glu Tyr Ser Thr Asp Thr ftys 275 280 285 116 'Met Lys 'LyS Tyr.' Gin Glu His Pir Glu lle Asp Asn Pro Thr Asn. 290 2.95 300

Gin Thr Met ftpti Ser Ile Gly Phe Leu Thr Phe Thr Ser Leu Glu Leu 305 310 315 320 110 RO 123431 Β1 Ţyt fttg Tyş Aş» Gly .Ser Glu Ile Arg Ile Met Arg Met Glu Thr Ser 325 330 335 A$p fte» Asp Thr ::Tyr Thr: :î»eu, Thr Ser Tyr Pro Asn His Arg Glu Ala 340 1:45 " 350

Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Gin Glu Val Xaa Glu Ile Thr 355 360 365

Arg Ala Asn Ser Cys Arg Tyr Pro ser His Trp Arg Ala 'Gly Arg Ala 370 375 380

Leu Hi s Leu Glu Gly Pro "Gin, 315 390

<210 79 <211 > 341 <212> AON <213> Bacillus thuringiensis <400 79 atgtcagcag gtgaagttca tattgaaata aetaatasaa cacgtcatac attacaafcfca 60 gaggataaaa ctaaacttac cagtgjgtaga tggcgaaeat cacctacaaa tgttgctcgt 120 gatacaatta aaacatttgt agcagaatca catggttfcta tgacaggaat agaaggtatt 180 atatatttta gcgtaaacgg agaagcagaa attagtttac attttgacaa tcctfcatgta 240 ggfctctaata aatatgatgg ttattotgat aaagctgcat acgaagttat tgcteaaggt 300 ggatcagggg atatatctca tctaacatat acaattcaaa e 341 <210> 80 <211> 113

«212> PRT <213> Bacillus thuringiesîs <400> 80 111 RO 123431 Β1 «et Ser Ala Gly Glu Val His ile Glu Ile Awu Asn Lys Thr Arg His 1 5 10 15

Thr Leu Gin Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Thr Ser Gly Arg Trp Arg 20 25 30

Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Arg Asp Thr Ile Lys Thr Phe Val Ala 35 40 45

Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Ile Glu Gly Ile Ile Tyr Phe Ser 50 55 60

Val Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu His Phe Asp Asiţ Tyr Val 65 70 75 80

Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly Ser Ser Asp Lys Ala Ala Tyr Glu Val 85 90 95 ile Ala Gin Gly Gly Ser Gly Asp Ile Ser His Leu Thr Tyr Thr Ile 100 105 110 'Gin

<210> 81 <211> 1410 <212> ADN <213- Baciiius thuringiensis <400> 81 112 RO 123431 Β1 atgttagata ctaataaaat ttatgaaata agcaatcatg ctaatggatt atatacatca 60 scttatttaa gtctggatga ttcaggtgtt agtttaatgg gtcaaaatga tgaggatata 120 gatgaataca atttaaagtg gttcttattt ccaatagata ataatcaata tattattaca 180 agctatggag cgaataattg taaagtttgg aatgttaaaa atgataaagt aaatgtttca 240 scgtattetc caacaaactc agtacaaaaa tggcaaataa aagctaaaaa ttcttcatat 300 ataatacaaa gtgagaatgg aaaagtctta acagcaggaa taggtcaatc tcttggaata 360 gtacgcttaa ccgatgaatc atcagagagt tctaaccaac aatggaattt aatccctgta 420 caaacaattt cactcccaca aaaacctaaa atagataaaa aattaaaaga tcar.cctgaa 48C tattcagaaa ccggaaatat agctactgga acaattcctc aasr.taatggg atggaeatta 54c gtaccttgta ttatggtaaa tgatccaaaa ataggtaaaa acactcaaat taaaactact 600 ccatattata tttttaaaaa mtatcaatac tggaaacgag caataggaag taatgtatct 660 ttacttccac atcaaaaaaa atcatatgat tatgagtggg gtacagaaga aaatcaaaaa 720 acaactatta ttaatacagt aggatttcaa attaatgtag attcaggaat gaagtttgag 780 gtaccagaag taggaggagg tacagaagaa ataaaaacac aattaaatga agaattaaaa 840 gttgaatata gcactgacac caaaataatg aaaaaatatc aagaacactc agagatagat 900 aatccaacta atcaaacaac gaattctata ggatttctta cttttacttc tttagaatta 960 tatcgatata acggttcgga aattcgtata afcgagaatgg aaacfctoaga taatgatact 1020 tatactetga cctcttatcc aaatcataga gaagcattat tacttctcac aaatcattct 1080 tatcaagaag taagccgaat Cccagcacac tggcggccgt tactagtgga tccgagctcg 1140 gtaccaagct tggcgtaatc afcggtcatag atgttteetg tgtgaaattg ttatcegetc 1200 acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga 1260 gtgagcfcaac tcacattaat tgqgttgcgc tcaetgcccg ctttccagtc gggaaacctg 1320 tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg 1380 dgefcetfcceg cttcctcgcfc '.uactgactcg 1410 <210> 82

<211 >462 <212> PRT <213> Bacillus thuringreşiş <400> 82

Met Leu Asp Thr Asn Lys Ile Tyr Glu Ile Ser Αβπ His Ala Asn Gly 1 5 10 15

Leu Tyr Thr Ser Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu 20 25 30

Met Gly Gin Asn Asp Glu Asp Ile Asp Glu Tyr Asn Leu Lys Trp Phe 35 40 45 113 RO 123431 Β1 '.Leu Phe iii® Ϊ1· Asp Αβη Asn Gin Tyr 'Jlte îl* Ţhr Ser Tyr Gly Ala. 50 55 60

Asn Asn" "Ciys :':Lys'. Val Trp Αβη Val Lys ‘Aiu Asp Lys Val Asn Val S*f 65 70 "|1 ;«0

Thr Tyr Ser Pro Thr Asn Ser Val Gin Lys Trp Gin Ile Lys Ala Lys $5 90 95

Asn Ser Ser Tyr Ile Ile Gin Ser Glu Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala • 100 105 110

Gly Ile Gly Gin Ser Leu Gly Ile Val Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ser 115 120 125

Glu Ser Ssr'l» Gin Gin Trp Asn Leu Ile Pro Val Gin Thr Ile Ser 130 135 140

Leu Pro Gin Lys Pro Lys Ile Asp Lys Lys Leu Lys Asp His Pro Glu 145 150 155 160

Tyr Ser Glu Thr Gly Asn Ile Ala Thr Gly Thr Ile Pro Gin Leu Met 165 170 175

Gly Trp Thr Leu Val Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Pro Lys Ile Gly 130 185 190

Lys Asii Thr Gin Tle Lysî/:Tht Thr Pro Tyr Tyr Ile Phe Lys Lys Tyr 195 Ϊ200 ,205

Glu Tyr T^^Ay* Arg Ala Ile Gly Jet: Afn Val ser Leu Leu pro His 210 215 220

Gin LyS Lys Ser :Tyr ‘A*p Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Glu Asn Gin Lys 225 ..... :230 235 240

Thr Tir Ile II* Aih Thr val Gly Phe Gin Ile Asn Val Asp Ser 2*5 250 255 M*t: Lys Phe Glu Val PrO: Clu Val Gly Gly Gly Thr Glu Glu Ile L| 260 265 270 :#hr Gl» Leu Asn Glu Glu Leu Lys Val Glu Tyr S*r Thr Asp Thr l*ys 275 280 235 '31*, Met .':Lye:': Lys Tyr Gin Glu His Ser Glu Ile ASp Asn Pro Thr Apţii 290 "" 2 9S: 300

Gin Thr ;Thr Asn Ser Ile GlŞr Phe Leu Tir Phe Thr Ster Leu Glu Leu 305 310 315 320 ‘Tyr Arg ::Tyr âteh Gly Ser Glu :île Arg Ile Met Arg Met Glu Thr Ser 325 330 335 114 RO 123431 Β1

Asp Αβη. ftip Thr Tyr Thr Leu Tli* :#er' Tyr Pro Άβή 'Ms Arg Glu Ala 340 ' :34P 350

Leu Leu Leu leu Thr Asn Ris Ser Tyr Gin Glu .Val Ser Arg Ile Pro 355 360 365 11# Trp Arg: gr# leu Leu Val Asp Pro Ser Ser Val Pro Ser Leu " W'O: " 375 ....... 380

Ala Ser Trp Ser Xaa Phe Pro Val Asn Cys Tyr Pro Leu Thr Ile Pro 385 390 395 400

His Asn Ile Arg Ala Gly Ser Ile Lys Cys Lys Ala Trp Qly Ala Val 405 410 415 6*r:/l*«u, 'Thr::;.Leu ile Ala Leu Arg Ser Leu Pro Ala Phe Gin Ser Gly *20 425 *30

Aen,,;i»eU:.: Ser Cys Gin Leu His Ile Gly Gin Arg Ala Gly Arg Gly Gly 43S 440 445

Leu Arg Ile ©ly Arg Ser Ser Ala Ser Ser Leu Thr Asp Ser 450 455 460

<210> 83 <211 >340 <212> ADN <213> Bacitlus thuringiensis <400> 83 tgtcagcacg tgaagtacat attgatgtaa ataataagac aggtcataca ttacaattag 60 aagafcaaAAc aaaact'tgat ggtggtagat :ggogaacatc acctacaaat gttgctaatg 120 atcaaattaa aacattfcgta gcagaatcaa atggtcttat gacaggtaca gaaggtacta 180 tatattatag tataaaegga gaagcagaaa :fetagtttata ttttgacaat ccttttgcag 240 gttctaataa atatgatgga cattccaata .aatctcaata tgaaattafct acocaaggag 300 gatoaggaaa fccaatctcat gtgacatata ctattcaaac 340 <240>;B4 <211> 112

<212> PRT <213> Bacillus tholingiesis <400> 84 115 RO 123431 Β1

Ser Ala Arg Glu Val His Ile Asp Val Asn Asn Lys Tir (3¾ HXe Thr 1 5 10 15 leu Gin Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg Thr 20 15 30

Ser Pro Thr Asn Val Ala Asn Asp Gin Ile Lys- '%* Phe Val Ala Glu 35 40 4£

Ser Ass slyiRlie Thr "€ly Thr Glu Gly-Ar Ile Tyr: :ţyr Ser Ile 50 51 €0 âeii Gty G§M:. Ala 'Glu; II# Ser Leu Tyr Phe Asp Asja- Pro Pie Ala -Gly S5- 70 75 80

Ser::Asn, Ly® Tyr ..Asp Gly: 1:1® Ser Asn Lys Ser Gin, Tyr Glu Ile Ile

II: 90 :M

Thr :Qlh: Gly Gly''sex; Gly Asm Gin ser His Val Thr 'Tyr 'fhXiXle Gin 100 105 1,1Q

<210> 85 <211> 1114 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis "<40S>'-l5 agcaatcatg ctaatggact atatgcagca 60 agtttaatga ataaaaatga tgatgatatt 120 cctattgatg atgatcaata tattattaca 180 aatgttaata atgataaaat aaatgtttcg 240 tggcaaataa aagctaatgg ttcttcatat 300 acagcaggaa ccggtcaagc tcttggattg 360 cccaatcaac aatggaattt aacttctgta 420 atagatacaa aattaaaaga ttatcccaaa 480 acatctcctc aattaatggg atggacatta 540 stagataaaa atactcaaat taaaactact 600 tggcaacgag cagtaggaag taatgtagct 660 tatgaatggg gcacagaaat agatcaaaaa 720 atcaatatag attcaggaat gaeatttgat 780' ataaaaacac aactaaatga agaattaaaa 840: gaaaaatatc aagaacaatc tgaaatagat 900 ggatitXotta ctatfcadfcc cttagaatta 960 atgcaaattc aaacetcaga taatgatact 1020 caagctttat tacttcttac aaatcatttca 1080 aafcfc: 1114 atgttagata acttatttaa gatgattata agctatgcag acttattctt gtaatacaaa atacgtttaa caaacaactc tatfccaccaa gtaccttgta ceatattata ttacgtccac acaacaatta ataccagaag atagaatata aatccaactg tatagatata tataatgtta tatgaagaag ctaataaagt gtttagatga PV 1^, l"- caaataattg caacaaattc gtgataatgg ctgatgaatc aacttccacg ctggaaatafc ttatggtaaa ttttaaaaaa atgaaaaaaa taaatacatt taqgtggagg gtcatgaaac atcaat oaafc atggctcaga cttcttatcc ttgaagaaat ttacgaaata 11: caggtgtt gtttttattt •caaagtttgg aatacaaaaa aaaagtctta ctcaaataat aaaacctata aqataatgga tgatecaaat atatcaatat atcatatacc aggatttcaa tacagatgaa taaaataatg gaattctata aattcgtata aaatcatcaa aacaagggcg <210> 86

<211 >371 <212> PRT '<213> Bacillus- thuringiesîs <4QC> 86 116 1 RO 123431 Β1

Met Leu Asp flit mii Val .fyt Glu Ile Ser .Ai®. His Ala Asn·; Gly 1 5: 10 '10.

Leu Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu.Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leii 20 25 30

Met Asii: Lys Asn Asp Asp Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe 35 40 45

Leu Phe Pro Ile Asp Asp Asp Gin Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Ala Ala 50 55 60

Asn Asn Cys Lys Val Trp Asn Val Asn Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser 65 70 75 B0

Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Ile Gin Lys Trp Gin ile Lys Ala Asn 85 90 95

Gly Ser Ser Tyr Văl Ile Gin Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala 100 105 110

Gly Thr Gly Gin Ala Leu Gly Leu Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ser 115 120 125 ASn Asn Pro Asn Gin Gin Trp Asm Leu Thr Ser Val Gin Thr Ile Gin 130 135 140 •Leu: lira 11¾ Lys Preţ: ile ite: Asp Thr Lys Leu Lys Asp Tyr Pro Lys T45': ISO: 155 160

Tyr Ser Pro fhr Gly Asn Ile Asp Asn Gly Thr ServPro Qiiţ;Leu Met 165 ' 170 175 .'Gly ®rp Thr Leu Val Pro Cys ile Met Val Asn Asp Pro A*n, ile Asp: 180 185 190:

Lys; Aşn Thr Gin ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Leu Lys Lys Tyr 195 200 205 03,01 Tyr Trp: Gin Arg Ala val Gly ser Asn Val Ala/ Leu Arg Pro His ...... :210 215 220

Glu Lys Lys Ger Tyr 'Thr Tyr Glu Trp Gly Thr 01» Ile Asp 31n Lys 225 aăO joi: " 240

Thr Thr Ile Ile As» Thr Leu Gly. Phe Gin:: TIS jj&h, Tle ftap: Ser Gly 245 250 255

Met Lys Phe Asp Ile Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Asp Glu Ile Lyf 260 265 270

Thr Gin Leu Asii Glu Glu Leu Lys Xle Glu Tyr Ser His GELu Thr Lys 275 280 285

Ile Met Glu Lys Tyr Gin Glu Gin Ser Glu Ile Asp Aşa Pro Thr ASp 290 295 300

Gin ser'-IJf0.: Asn ser ile Gly -Sţie· Leu Thr ile Thr fer Le»· Glu Leu 305 010 315 320 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 117 47 RO 123431 Β1

Tyr Arg Tyr Asn Gly Ser Glu Ile Arg Ile Met Gin Ile Gin Thr Ser 325 330 335

Aep As» Aep: Tfo:r Tyr Asn Val· ^Tfar Ser· .Tyr. Bre»; As» His. .Gin. Gin Ala MS " 345^ ' 550 :Iieu :'L6ti M îeu 'Thr Asn ΒΪΙ' "Ser TyE: Glii Gtu. Va' Glu 'Sili.. Ile TJi» .355' 31.0 365

Afg: Ala Asn 370

<210> 87 <211 >341 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis <400> 87 atgtcagctg gcgaagttca tattgaaata aacaataaaa caegtcatac attacaatta 60 gaggataaaa ctaaacttag cggcggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctcgt 120 gatacaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggagt agaaggtatt ISO atatatttta gtgtaaacgg agacgcagaa attagtttae attttgacaa tcettatata 240 ggttctaata aatgtgatgg ttcttctgat aaacctgaat atgaagttat tactcaaagc 300 ggateaggag ataaatctca tgtcacttat acaattcaaa c 341

<210 88 <211> 113 <212> PRT <213> Bacillus thuringiesis <400 88i

Met Ser Ala'Gly Glu val Hls îl©;· el» ile; AS» Asn Lys Thr Arg His 1 5 10 15

Thr Leu G!» iiea Glu Asp iye Thr Şy# Ae»; Sar 'Gly Gly Arg Trp Arg 20 25' 30

Thr Ger·· "ikm. :'Thr " Asn Val Ala Arg.. Asp Ţh» ile: .Lys Thr Phe Val Ala.· 3:5 '<#' 45

Glu Ser His ''Gly »he Met Thr Gly. Val 'Gin Gly Ile Ile Tyr Phe Ser; 50 55 6"0

Val Asn Gly Asp Ala Glu Ile .Ser Leu 'Bis.· Phe Aap Asn iro" Tyr Ile 65 70 :75 80

Gly fer Asn Iye Cyş Asp Gly Ser Ser Asp: Lys Pro Glu Tyr Glu Val 85 9$ 95

Ile Thr sin ser GlySer Gly Aap 'lys Ser His Val Thr Tyr Thr Ile 100 105 110 lin

<210 89 <211> 1186 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis <40089 118 RO 123431 Β1 atgttagata caaafcaaagt ttatgaaata agcaatcttg ctaatggatt atatacatca 60 acttatttaa gtctCgatga ttcaggtgtt agtttaatga gtaaaaagga tgaagatatt 120 gatgattaca atttaaaatg gtttttattt cctattgata ataatcaata tattattaca 180 agctatggag ctaataattg taaagtttgg aatgttaaaa atgataaaat aaatgtttca 240 acttattctt caacaaactc tgtacaaaaa tggcaaataa aagctaaaga ttcttcatat 300 ataatacaaa gtgataatgg aaaggtctta acagcaggag taggtcaatc tcttggaata 360 gtacgcctaa ctgatgaatt tccagagaat tctaaccaac aatggaattt aactcctgta 420 caaacaattc aactcccaca aaaacctaaa atagatgaaa aattaaaaga tcatcctgaa 480 tattcagaaa ccggaaatat aaatcctaaa acaactccteaattaatggg atggacatta 540 gtaccttgta ttatggtaaa tgattcaaaa atagataaaa acactcaaat taaaactact 600 ccatattata tttttaaaaa atataaatac tggaatctag caaaaggaag taatgtatct 660 ttacttccac atcaaaaaag atcatatgat tatgaatggg gtacagaaaa aaatcaaaaa 720 acaactatta ttaatacagt aggatbgcaa attaatatag atteaggaat gaaatttgaa 780 gtaccagaag taggaggagg tacagaagac ataaaaacac aattaactga agaattaaaa 840 gtfcgaatata gcactgaaac caaaataatg acgaaatatc aagaacactc agagatagat 900 aatccaactâ atcaaccaat gaattctata ggacttctta tttatacttc tttagaatta 960 tatcgatata acggrcagaa attaagataa tggacataga aaettcagat eatgatactt 1020 acactcttac ttcttatcca aatcataaag aagcattatt acttctcaca aaccattctt 1090 atgaagaagt agaagaaatt acaagggcga attccagcac actggcggcc gttactagtg 1140 gatccgagct cggtaccaag cttggcgtgt caggtcaaag ggttca 1186

<210> 90 <211> 392 <212> PRT <213> Bacillus thuringiesis

Met Leu Aeg: Tlar Asn Lys Val Tyx Glu Ile Ser :Asn Leu Ala Asn Gly I 5 10 II 'ietl :ΪΙΪΙ·'' :Ιϋ Thf; Tyr Leu Ser Leu Aip. Asp' Ser Gly Val SSr Leu m. as io:

Met Ser Lys Lys ·Αβρ ;Glu Asp Ile ASp Asp.:: :Tyr Asn Leu Lys T*p Phe 35 40 45

Leu ίφ®. Im Ile .Asp:A.sn ftsa Gla ifyi: Ile Ile Thr Ser Tyr Gly Ala 51 II 60

Asn Asn iei Trp Asii:"Val: Lys Asn Asp· Lys Ile Ae*î, Val (Seif 65 ?0 ti Si 119 RO 123431 Β1

Ger Ser·: Thr :':Asîi, Se.r'%tl 85

Asp Ser Ser Tyr Ile Ile Gin Ser 100

Gly Val Gly Gin Ser Leu Gly Ile 115 120

Glu Asn Ser Aon Gin Gin Trp Asn 130 135

Leu,trp, Gin Lys Pro Lys Ile ftsp 145 ISO

Tyr'G^* Glu The Gly Asn Ile Asn 165

Gly Trp:· Thr Leu Val Pro Cys Ile 180

Lyo Aon Thr Gin ile Lye fttr Thr 195 200

Lys Tyr Trp Asa Leu Ala Lys Gly 210 215

Gin Lys Arg Ser Tyr Asp Tyr Glu 225 230 Tîir Thr He Ile Asn Thr Val Gly 245

Me? Lys Phe Glu Val Pro Glu Val 260 'Thr Gin Leu Thr Glu Glu Leu Lys 2*75 280

Ile Mec Thr Lys Tyr Gin Glu His 290 29®··

Gin Prp Jiet Ser Ile Gly Leu 305 310

Tyr Arg 'Tyr Asn Gly Gin Lye Leh 325 Île Leu :Thr Leu Leu Leu Leu Ile 340 :ifte ser Gin Thr ţie, Lee 'Met Lys 355 3#0

Gin,':;'Lys; Trp Gin Ile Lys Ala Lys 90 95

Asp Asn Gly Lys val Leu Thr Ala 105 110 val Arg Leu Thr Asp Glu Phe Pro 125 -Leu Thr· Pro val Gin·; Thr ile Gin .140

Glu Lys Leu Lys Asp Ei:S; Pro·, Glu Ti;. ISO

Pro Lys Thr Thr Pro Gin 'Leii Weh,. 170 '1:7 5'

Met Val Asn Asp Ser Lys Ile Asp' T85" 190 pro· fy* :‘Tyr Ile •Phe·:: Lys Lys Tyr .:205.,

Ger: Aon Val Ser Leu Leu Pro His 220

Trp Gly Thr Glu Lys Asn Gin Lys 235 240

Leu Gin Ile Asn Ile Asp Ser Gly 250 255

Gly Gly Gly Thr Glu Asp ile Lys 265 270

Val Glu Tyr Ser Thr Glu Thr Lys 285

Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asn 300

Leu Ile Tyr Th#.·; Ser Leu Glu Leu 315 320

Arg Trp Thr Lys Leu Gin Ile Met 330 335

Gin Ile Ile Lys Lys His; .Tyr Tyr 345 :350:

Lys Lys Lys Leu Gin Gly Arg Ile 365 120 RO 123431 Β1

Pro Ala .Hls ,5p.*p·· Arp ΒϊΟ:. :.;ϊιβ*ι.: Val Asp pro Ser Ser val· 'Pro·' ser 370 3ff:' 380 I*St* Ala Cys Gin Val iya 'My* :'ibe 385 390 5 <210 91 7 <211 >341 <212> ADN 9 <213> Bacillus thuringiensis <400 91 11 atgtcagcag ccgaagtaca tattgaaata ataaatcata caggtcatac cttacaaatg 60 13 gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa tgttccaaat 120 aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaggaata 180 15 ataatttata etataaatgg agaaatagaa attaccttac attttgacaa tccttatgca 240 ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat aactgaagca 300 agagcagaac atagagctaa taatcatgat catgtaactt a 341 ^7 <210> 92 19 <211> 113 <212> PRT 21 <213> Bacillus fhuringieste <400> 92 23 121 RO 123431 Β1

Mmt Ser Ala Ala: olu v«l Ils ile Glia ile ile lia pis' Thr Gly His a 5 10 15 Î&r Leu Sin.Met Asp Lyp Aîf. Leu Ala Sie Gly Glu Trp Ile 2 b; ii 30 11« "'flir Pro Val Mn Vil Pro: Agn. Aei* Ser 'Ser Asp Leu Phe Gin Ala 35 40 45

Gly Ser Mp Gly Val Leu Thr Gly Val' SI»; Sly Ile 11« Ile :Tyr 1½ 50 55 60

Ile Asn Gly Glu ile Glu 11« Thr Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ala 65 70 75 80

Gly Ser Asn Lys Tyr Ser Gly Arg Ser Ser Asp Asp Asp Tyr Lys Val 85 90 95

Ile Thr Glu Ala Arg Ala Glu His Arg Ala Asn Asn His Asp His Val 100 105 110

Thr

<210> 93 <211 >341 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis <40Q:>''9ă:' cttacaaatg 6o ţgltccaaat 120 agaaggaata 180 tccttatgca 240 aactgaagca 300 341 atgtcagatc gcgaagtaca gataaaagae ctagacttgc aafctcrtctq atttatttca ataatttata cfcataaatgg ggttctaata aatattctgg agagcagaac atagagetaa tattgaaata ataaatcata caggtcatac acatggtgaa tggafctatta cacccgtgaa ageaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaatagaa attaccttac attttgacaa acgttctagr, gatgatgatt ataaagttat taatcatgat catgtaactt a

<210> 94 <211> 113 <212> PRT <213> Bacillus tfoVringiesis <220 <211> NESIGUR <212> (242) <213> Nedeterminat în secvenţa de aminoacizi dedusă <400 94 122 1 1 35 45 RO 123431 Β1

Met Ser: Asp Arg Glu Val His 1.1© Glu· 11» '.Se Asii :fiis :®ir Gly His 1 5 ... 10; 15

Thr Leu Glm Met Aii»· LylArg Thr Arg |i»ţ| Ala Hi 8 Gly Glu Txp Ile 20 25 30

Ile Thr; ;Pro Val Asm. Val Pro Asm Asm:. Ser Ser Asp Leu Pfee Gin Ala :(1.0

Gly Ser' Asp Gly Vil Leii Thr Gly "V#l G1:U Gly Ile Ile Ile Tyr ::Tht

St 55 60

Gly ser Asm Lys Tyr Ser Gly Arf Ser Ser Asp Asp Asp Tyr fiys: Val 85 90 95 "Ile Tfar ilm.Ala Ara Ala- G3» Ss*. „tef Ala Asm Asn His Asp Hi a ; Val: lio tis no

Thr <210> 95

<211> 353 <212> ADN <213> Bacilius thuringiensis «4» S5 .atgtsageac gtgaagtaca fcattgaaata ataaatcata caggtcatac cttacaaatg 60 gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta eacccgtgaa tgttccaaat 120 aattcttcrg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaggaata 180 ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attaccttac attttgacaa tccttatgca 240 ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat aactgaagca 300 âg^cagaae atagegetaa taatcatgat catgtaacat atacgattca aac 353 <210> 96 <211>117 <212> PRŢ <213> Bacilius thuringiesis <4Q0> m 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 123 RO 123431 Β1

Mefc 1 Ser Ala Arg Glu 5 Val His Ile Glu Ile 10 Tle Asn His Thr Gly His 15 Thr Leu Gin Met Asp 20 Lys Arg Thr Arg 25 Leu Ala His Gly Glu Trp Ile 30 Ile Thr Pro Val Asn 35 Vhl Pro Asn 40 Am Ser Ser Asp Leu 45 Phe Gin Ala Gly Ser Asp Gly Val 50 Leu Thr Gly Val 55 Glu Gly Ile 60 Ile Ile Tyr Thr ile 65 Asn Gly Glu Ile Glu Ile Thr 70 Leu His Phe Asp 75 A&l Pro Tyr Ala 80 Gly Ser Asn Lys Tyr 85 Ser Gly Arg Ser ser 90 Asp Asp Asp Tyr Lys Val 95 Ile Thr Glu Ala Arg 100 Ala Glu His Arg 105 Ala Asn Asn His Asp Ma Val 110

Th:r Tyr Thr Ile Gin 115 <210 97

<211 >353 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis <400> 97 cttacaaatg 60 tgttccaaat 120 agaaggaata 180 teettatgca 240 aactgaagca 300 ase 353 atgtcagctc gfcgaagtaca tattgaaata ataaatcata caggtcatac gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attaccttac attttgacaa ggttctaata aatattctgg âcgţtctagt gatgatgatt atiaagttat agagcagaac atagagctaa taafcpatgat catgtgacat atacaattca

<210> 93 <211> 117 <212> PRT <213> Baoîllus thUringiesis <400» 98 124 RO 123431 Β1

Met Ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Ile Asn His Thr Gly His 1 X 5 10 15 3

Thr Leu Glii i'llet ftsp Xytf. Arg Thr Arg Leu Ala His Gly Glu Trp.- Ile

Mo 25 3t 5

Gly Ser Gly Vil leii Thr Gly Vil 'Glu Gly Ile ;Xle Ile =Tyr Thr 9 50 55 m. 11

Ile Asn Gly'Glu îie Glu Ile Thr'· leiţi His Phe ftep Asn Pro Tyr Ala 65 70 75 80 13

Gly Ser hsn/%şe fyr Ser Gly ,AffLSer Ser Asp ftsp AspTyr Lys: 'Val 15 85 90 95· 17

Ile Thr eitAl* «*g Ala' Glh:'Iîti, Arg Ala :Asb Asn »âe Asp Hi,*: :v*l 100 105 110 19

Thr Tyr Thr Ile Gfti: 115 21 <210 99 23 <211 > 353 <212> ADN 25 <213> Bacillus thurîngiensis <400> 99 27 atgtcaggtc gcgaagttca tattgaaata ataaatcata caggtcatac cttacaaatg 60 29 gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa tgttccaaat 120 aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaggaata 180 ^ ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attaccttac attttgacaa tccttatgca 240 ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat aactgaagca 300 agagcagaac atagagctaa taatcatgat catgtaacat atacgattca aac 353 33 <210> 100 35 <211>117 <212> PRT 37 <213> Baeîlia&lliurîrigiesis <400100 39 125 RO 123431 Β1

Met. ®β·γ· Gly". Arg Qlu. ,ΗΙβ fie iplu lle Ile Asn Hi». Ihr Gly Hi* 1 I 10 15

Thr Met Asp Lys Arg-Thr' Arp Leu Ala His Gly Glii Tfp II*:· 20 25 30

Ile Thr Pro Val ASn Val Pro Asn Asn Ser Ser Asp Leu Phe Gin Ala 35 40 45

G'ty· Ser; A*p Gly Val Leu ·Ήιγ Gly 'Val. Glu Gly Ile Ile Ile Tyr Thr St 55 IV

Ile Asn Gly Glu Ile Glu Ile Thr I®u. 'Ή1* Phe Asp Asn Pro 65 70 75

Ser Aen.Lys Tyr Ser Gly Arg Set ;S«r'· Asp Asp Asp; fyf Lys ''Vel:. 85 't»' 95

Ile Thr Glu Ala Arg Ala Glu His Arg Ala Asn Asn His Asp His Val 100 105 110

Thr Tyr Thr Ile Gin 115

<21 (»101 <211> 353 <212> ADN <213> Bacillimţhuh^ieftşls <400> 101 cttacaaatg 60 tgttccaaat 1Ξ0 agaaggaata isq tccttatgca 240 aactgaagea 300 aac 353 atgtcagcfcc gataaaagaa sattcttctg staattcata ggttctaata agagcagaac gtgaagtaca ctagacttgc atttatttca ctataaatgg aatattctgg atagagctaa tattgaaata acatggtgaa agcaggttct agaaacagaa acgttctagt caatcatgat ataaatcata tggattatta gatggagttt attaccttac gatgatgatt cacgttacgt eaggtcatac eacccgtgaa tgacaggagt attttgacaa ataaagttat atâcaattca

<210> 102 <211> 117 <212> PRT <213> Bacilius thuringiesis <220> <211> NESIGUR <212> (242) <213> Nedeterminat în secvenţa h**mlnfafÎz'Î dedusă 126 RO 123431 Β1 <400 102

Met -Ser Ala Arg GIm. Val 'His Ile Glu Ile Ile Asm His Thr Gly Ei a 1 5 10 15'

Thr Leu Gin Met Asp Lys Arg Thr Arg Leu Ala His Gly Glu Trp Ile 20 25 30

Ile Thr Pro Val Asii. Val Pro Asn A#» Ser Ser Asp Leu Phe Gin Ala 35 40 45

Gly Ser Asp Gly Val Leu Thr Gly Val Glu Gly Ile Ile Ile Tyr Thr 50 55 60

Ile Asn Gly Glu Ile Glu Ile Thr Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ala 65 m 75 ao

Gly Ser Asn Lys Tyr Ser Gly Arg Ser Ser Asp Asp Asp Tyr Lys Val 85 90 95

Ile Thr Glu Ala Arg Ala Glu His Arg Ala Asn Asn His Asp His Val 100 105 110

Thr Tyr -TAr Ile Gin ΙΪΕ

<210 103 <211> 353 <212> ADN <213> Baciiius thuringiensis <4iO 103 atgtcaggtc gcgaagtaga tattgaaata ataaafccata caggtcatac cttacaaatg 60 gataaaagaa ctagacttgc achtggtgaa eggattafc.fca: cacccgtgaa tflttceaaat 120 aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagb agaaggaata 130 utaatttata ctataaalua agaaatagaa attaccttac attttgacaa tccttatgca 240 qgttctaata aatattcLgy acgttctagt gatgatgatt ataaagttat aactgaageg 300 agagcagaae atagagctaa taatcatgat catgtaacat atactattea gae 353

<210 104 <211> 117 <212> PRT <213> Baciiius thuringiesis <400 104..· 127 RO 123431 Β1

Met Ser Gly Arg Glu Val Asp Ile Glu IXe 1 5 IO

Thr Leu Gin Met Asp Lys Arg Thr Arg Leu 20 25

Ile Thr Pro val Asn val Pro Asn Aen Ser 35 40

Gly ser Asp Gly Val Leu Thr Gly Val Glu 50 ' 55

Ile Asn Gly Glu Ile Glu Ile Thr Leu His 65 70

Gly Ser Asn Lys Tyr Ser Gly Arg Ser Ser 85 90

Ile Aen His Thr Gly His 15 Ala His Gly Glu Trp Ile 30 Ser Asp Leu Phe Gin Ala 45 Gly Ile Ile Ile Tyr Thr 60 Phe Asp Asn Pro Tyr Ala 75 80 Asp Asp Aşp Tyr Lys Val 95

Thr Glu Ala 100

Ala Glu His Arg Ala 105

Asn Asn His Asp His Val 110

Thr Tyr Thr 1.1» Gin 115

<210> 105 <211> 353 <212> ADN <213> Bacilluş thpnngîfnsii: caggtcatac cttacaaatg 60 cacccgtgaa tgttccaaat 120 tgacaggagt agaaggaata 180 attttgacaa tccttatgca 240 ataaagttat aactgaagca 300 ataccattca aac 353 atgtcagcac gataaaagaa aattattctg ataatttata ggttctaata agagcagaac gtgaagtaca ctagacttgc atttatttca ctataaatgg aatattctgg atagagctar. tattgaaata acatggtgaa agcaggttct agaaatagaa acgttctagt taatcatgat ataaatcata tggattatta gatggagttt actaccttae gatgatgattcatgtaacat

<210> 106 <211> 117 <212> PRT <213> baciilus thuringiesis <400:> 106;. 128 RO 123431 Β1 jMfâfc- Ser Ala Arg Glu Val Hi® iile Glu Ile 13 e Asn His Thr Gly His 1 5: 10 15

Thar Lfctt, eitt IWf'fe :ASp Lys vArg Tfefc Arg Leu Ala His Gly Glu Trp Ile :2¾ 25 30

Ile Thr Pro Ual ,ΛβΟ" Val Pro· Asn .Ăsa Ser Ser Asp Leu Phe Gin Ala 35 40 45

Gly Ser lep "Sly"Val Le« Thr Gly Val Glu Gly Ile iile Ile Tyr Thr 50 55 60

Ile Asn Gly Glu Ile Gin Ile Thr·' leu His Phe Asp, Asn Pro Tyr Ala 65 70 75 80

Gly Ser Αβά Lys Tyr Ser Gly Arg Ser Ser Asp A ap· Aipi Tyr Lys Val 85 90 95

Jle Thr Gin. Ala Axg Ala Glu His. Arg; Ala Asn Asn, Hi® Asp His Val: 10 o MS':. 110

Thr: Tyr Thr Ile "Gin. 115

<210> 107 <211> 341 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensls <400> 107 atgtcsggts gcgaagttca tattgatgta aataataaga caggtcatac attacaatta 60 gaagataaaa caagacttga tggtggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctaat 120 gatcaaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggtac agaaggtact 180 atatattata gtataaatgg agaagcagaa attagtttat attttgacaa tccttattca 240 ggttccaata aatatgatgg gcattccaat aaaaaccaat atgaagttat tacccaagga 300 ggatcaggaa atcaatctca tctgacgtat acaattcaaa c 341

<210> 108 <211> 113 <212> PRT <213> Bacillus thuringiesis <400> 108 129 RO 123431 Β1

Met Ser ,Gly ftrg Glu/Val: Mis ile lip:: Val ftsii: ftan ;|iys Thr Gly li#' 1 S. 10 15

Thr fcei Gin Leu Gla.ftsp lifs Thr" ârg: i«eu âap Gly ''Gly Arg Trp ftrg: 20 |# 30

Thr Ser Pro TÎlr Se#. v|l 'ala fts&. aSP ;:Gla ţie ;Iiy# Thr Phe Val ai# 35 40 45 •Glu. Ser Hi# Gly :®he Met >fhr ely T&r-Glii Gly :1¾¾ Ile Tyr Tyr Ser' 50·' 55 60

Ile Asn ::Qly Glu Ala Glu Ile Ser' Teu 'tyr Kt» Asp Asm Pro Tyr Ser 65 70 76 80

Gly ser »#h Lys Tyr Aip Gly His Ser Αεη Lys Άβ», Gin Tyr Glu Val 85 ' ..... 60 95 II#:: Thr Gin Gly Gly Ser Gly Asn Sli*: 'Ser Hi# ;?i:eu, Thr Tyr Thr Ile 100 TOS 110 :®Îir

«210» 109 <211> 1114 <212> ADN < 213> Bacillus thuringfensis «40Q>109 atgttagata ctaataaagt atatgaast* agtaattatg ctaatggatt acatgcagca 60 acttatttaa gtttagatga ttcaggtgtt: agtttaatga ataaaaatga tgatgatatt 120 gatgactata atttaaggtg gtttttattt agctacgcag cgaataattg taaggtttgg acttattctt caacaaactc gatacagaaa gtaatacaaa gtaataafcgg gaaagttcta atacgtttaa cggatgaatc accagataat caaacaattc aactcccacc aaaacctaca tattcacaaa ctggcaatat agacaaggga ataccttgta ttatggtaaa tgatccaaat ccatattata ttttaaaaaa atatcaatat ttaegtccgc atgaaaaaaa atcatatgct acaactatca ttaatacatt aggatttcag ataccagaag taggtggagg tacagatgaa atagaatata gccgtgaaac caaaataatg aatccaactg atcaatcaat gaattctata tatcgatata atggttcgga aattagtgta tacaatgtga cctcttatcc agatcatcaa tatgaacaag tacaagaaat aacaagggcg cctattgatg ataatcaata aatgttaata atgataaaat tggcaaataa aagctaatgc acagcaggaa ccggtcaatc cceaatcaac aatggaattt atagatacaa agttaaaaga acaectcctc aattaatggg atagataaaa acactcaaat tggcaaeaag cagtaggaag tatgagtggg gfeacagaaat attaatatag attcgggaat ataaaaacac aattaaacga gaaaaatatc aggaacaatc ggattcctca ctattacttc atgaaaattc aaacttcaga caagctctat tacttcttac aatt tattattaca aaatgtttca ttcttcgtat tcttgjgatta aactcctgta ttaccceaaa atggacatta caaaactact taatgtagct agatcaaaaa ggaatttgat agaattaaaa agagatagat tttagaatta taatgatact aaatcattca 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1114

<210> 110 <211 >371 <212> PRT <213> Bacillus thuringiesis <400»" 110. 130 1 RO 123431 Β1 .fief· îieu ASjp Tlii Asn. Lys Val "Tyr 010. Ile «Ssir Asn Tyr Aia Asn Gly· 1 5' 10 15 3 Leu Hrs Alei Al a 20 Thr Tyr Leu Ser Leii:. 9* H.S£> Asp Ser Gly val m ser /Leu 5 Met Asn Lys Asn Asp Asp Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Arg Trp Phe 7 35 46 45 9 Leu. Phe Pro Ile Asp Asp Ăsn Gin Tyr Ilo Ile .Ştir: Sfâir Tyr Ala Ala 50 55 :#0 11 Asn Asn Oys ^ Val Trp Asn Val Asn Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser 13 65 70 75 80 Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Ile Gin Lys Trp Gin Ile Lys Ala Asn 15 85 .io 05 17 ;Alft 'Ser Ser Val: Ile Gin Ser Asn ASII Gly ,Lye Vil Leu ;Ttpr JPikiJL'C^L 100 105 110 19 Gly Thr Gly Si», Ser Leh Gly Leu Ile Arg Leu Thr Asp 3* xii "Ser " Pro 21 115 120 125 23 Asp Asn pro ăsh Gin Gin Trp Asn. ţiUU: Thr Pro val Gin Thr Ile Gin 130 135 140 25 Leu Pro Pro^fcyS' Pro Thr Ile Asp Thr Lys Leu Lys Asp Tyr Pro Lys 27 145 150 155 160 131 RO 123431 Β1

Tyr Ser Gin Thr Gly Asm Ile Asp Ly» Gly Thr Pro Pro Gin leu met 165 170 Ϊ75

Gly Tip Tir Leu Ile ,®ro" Gys ile Met Val'Asn.Aşgl· Pro Asn Ile Asp 180 185 190 ly»'. Asn Thr Gin·; Ile :¾¾ Thr Tlsr Pro Tyr Tyr II*·· leu Lys Lys Tyr 1#5 200 205

Gin Tyr Trp Gin Gin Ala Val Gly Ser Asn Val Ala Leu Arg Pro His 210 215 220

Glu Lys Lys Ser Tyr Ala Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Ile Asp Gin Lys 225 230 235 240

Thr Tir 11«" Ile Asn :Sir Lin •Gir ®he Gin Ile· Asn ile Asp ser Gly 245 250 255 iet; Glu Phe hap· Ile Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Asp Glu Ile Lys 2:SG: 265 2 70

Thr Gin Leu Asn Glu Glu ;'.Ι»ύ. Lyş Ile Gin Tyr Ser Arg Glu ;Thr Lys 275 2f0·· 285

Iii Met Glu Lys Tyr Gin Glu Gin Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asp 290 295 300

Gin ;Ser Met Apa fer Ile 'Gly·· fiţi:: Lin :Thf: Ile Thr Ser Leu Glu Leu 305 310 315 320

Tyr Atg-'Tyr Asn Gly 'fer Glu Ile;. Ser Val Met Lys Ile Gin Thr Ser 325 330 335

Asp Asn Asp Thr Tyr Asn Val, Thr' Ser Tyr Pro Asp His Gin Gin Ala 340 345 350

Leu Leu.Lati·· Leu Thr ':jj*n,tfl#'· Ser Tyr Glu Gin Val. Gin Glu Ile Thr 355 3 60' 365

Arg Ala Asn 370

<210 111 -211> 341 <212> ADN <213> Baciiius thuringiensis 132 "<4005* 111 je'tc gaggataaaa gatacaatta atatatttta ggttctaata RO 123431 Β1 gtgeagtaess tattgaaata aacaataaaa cacgtcatac attacaatta 60 ctaaacttag cggcggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctcgt 120 aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggagt agaaggtatt 180 gtgtaaacgg agacgcagaa attagtttac attttgacaa tccttatata 240 aatgtgatgg ttcttctgat aaacctgaat afcgaagttat tactcaaagc 300 ggatcaggag ataaatcfcca tgttacatat acaattcaga c 341 <210> 112 <211> 113 <212> PRŢ «213> Bacillus thurin <400> 112 Met Ser Ala 1

Glu val His Ile Glu Ile Asn Asn Lys Thr Arg His 5 10 15

Thr Leu Gin Leu Glu Aap Lys Thr Lys Leu Ser Gly Gly Arg Trp Arg 20 25 30 Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Arg Asp Thr Ile Lys Thr Phe Val Ala 35 40 45 :01«: Ser His Gly· Phe Met Thr 10. 55

Val Glu Gly Ile Ile Tyr Wkm Ser 60

Val Asii ''Gly' Ajap..· AIA Glu Ile Ser Leu. His Phe 65 10 75'

Asn Pro Tyr Ile 80

Ser .As» Lys Cye Asp Gly Ser Ser ftep 85 90

Pro Glu Tyr Glu Val 95 ;Î1:Ş ^hr Gl» Sfr Gly Set: Gly ft»p Lys Ser His Val Thr Tyr Thr Ile 105 110 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 <210 113 <211> 360 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis <4QD> 113 35 37 39 133 41 RO 123431 Β1 atgtcagctc gaggataaaa gatacaatta atatatttta ggttctaata ggatcaggag gcgaagtaca ctaaacttag aaacatttgt gtgtaaacgg aatgtgatgg ataaatctca cattgaaata cggcggtaga agcagaatca agacgcagaa ttcttctgat aacaataaaa tggcgaacat catggtttta attagtttac aaacctgaat actattcaga cacgrcatac cacctacaaa tgacaggagt attttgacaa atgaagttat cagtatcttt attacaatta 60 tgttgctcgt. 120 agaaggtatt 180 tccttatata 240 tactcaaagc 300 acgattataa 360

<210> 114 <211> 119 <212> PRT <213> Bacillus thuringiesis <400> 114 Met Ser Aia 1

Glu Val His ne GŢU Ile Asn Asn Lys TÎWP Ai® Ms 5 10 15

Thr Leu 01n Leu Glu Asp 20

Lys Thr Lys Leu Ser Gly Gly Arg 25 30

Glu Ser His 50

Phe Met Thr Gly val Glu Gly Ile Ile TyrPhe Ser 55 60

Val Asii Gly .AiŞ :.Aia. eiu Ile Ser Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ile 65 :7'0 75 80

Gly Ser Asn Lys Cys Asp Gly Ser Ser Asp Lys Pro Glu Tyr; Glu Val 85 90 m

Ile Thr Gin Ser Gly Ser ^aly Asp Lys Ser His Val Thr Tyr :T»x Ile 100 105 110

Gin Thr Val Ser Leu Arg Leu 115

<f1G>'!:15 <211> T1-58 <212> APN <213> Bacitlus thuringiensis 134 RO 123431 Β1 afcgtfcaşata ctaataaagt ttatgaaata agcaatcttf1 ctaatggatt atatacafcea 60 1 acttatttaa gtcttgatga ttcaggtgtt agtttaatga..gtaaaaagga tgaagatatfe 120 gatgattaca atttasaatg gtttttattt cctattgata ataatcaata tattattaca 18© 3 agctatggag ctaataattg taaagtttgg aatgttaaaa atgataaaat aaatgtttca 240 acttattctt caacaaactc tgtacaaaaa tggcaaataa aagctaaaga ttcttcatat 300 ataatacaaa gtgataatgg aaaggtctta acagcaggag taggtgaatc tcttggaata 360 gtacgcciaa ctgatgaatt tccagagaat tctaaccaac aatggaattt aactcctgta 42© caaacaatztc aactcccaca aaaacctaaa atagatgaaa aattaaaaga tcatcctgaa 480 7 tattcagaaa ccggaaatat aaatectaaa acaactcctc aattaatggg atggacatta 540 gtaecttgta ttatggtaaa tgafctcagga atagataaaa acactcaaat taaaacaact 600 g ccatattata tttttaaaaa atataaatac tggaatctag caaaaggaag taatgtatct 660 ttacttccac ateaaaaa&g atcatatgat tatgaatggg geaeagaaaa aaatcaaaaa 720 acatctatta ttaatacagt aggattgcaa attaatatag attcaggaat gaaatttgaa 760 gtaccagaag taggaggagg tacagaagac ataaaaacac aattaactga agaattaaaa 840 gttgaatata gcactgaaac eaaaataatg acgaaatatc aagaacactc agagatagafc 900 13 aatecaacfca atcaaccaat gaatfcetata ggacttctta tttatacttc tttagaatta 960 tatcgatata aeggtacaga aattaagata atggacatag aaacttcaga tcatgatact 1020 ^ tacacfcctta cttcttatce aaatcataaa gaagcattat tactttotcac aaaccattcg 1080 tatgaagaag tagaagaaat aacaaâaata cGtaagcata cacttataaa afctgaaaaaa 1140 cattatttta aaaaataa lisa 17 <210> 116 19 <211 >385 <212> PRT 21 <213> Bacillus ttertagiesis *4QQ>-11B 23 135 RO 123431 Β1

Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile fier Asn Leu Ala Asn Gly 1 5 10 15

Leu Tyr Thr Ser Ar Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser Leu 20 25 30

Met Ser Lys Lys Asp Glu Asp Ile Asp Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Phe 35 40 45

Leu Phe Pro Ile Asp Asn Asn Gin Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Gly Ala 50 55 60 Aşn Asp Cys Lys Val Trp Asn Val Lys Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser 65 70 75 80

Thr Tyr Ser Ser Thr Asn Ser Val Gin Lys Trp Gin Ile Lys Ala Lys 85 90 95

Asp Bear Ser Tyr Ile Ile Gin Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala 100 105 110

Gly 'Văl Gly Glu Ser Leu Gly Ile Val Arg Leu Thr Asp Glu Phe Pro 115 120 125

Glu Asn Ser Asn Gin Gl® Trp Asn Leu Thr Pro Val Gin Thr Ile Gin 130 135 140

Leu. Iro.: β|η Lys Pro Lys Ile Asp Glu Lys Leu Lys Asp His Pro Glu 145 150 155 160

Tyr·''"Ser·" Glii. 'Thr' Gly fteu Ile Asn Pro Lys Thr Thr Pro Gin Leu Met 165 170 175

Qiy· Trp Thr Leu Val Pro CyS Ile Mefe. Val Asn Asp Ser Gly Ile Asp 130 :ii5 190

Lys Asn Thr Gin ile Lya :Ttir Ar Pro Tyr :Tyr ile Phe Lys Lys Tyr 195 2 0& 205

Lys Tyr Trp" Asn Leu Ala Lye Gly Ser; Asn Văl Ser Leu Leu Pro His 210 215 220

Gin Lys Arg; SeŢ·' Tyr Asp. Tyr Glu; Tip; Gly Thr Şlu Lys Asn Gin Lys 225 230 235 240

Tir Ser Ile Ile Asn Ar :Val Gly· Leu Gin Ile"Asn Ile:'Asp Ser Gly 245 250 " 255' 136 RO 123431 Β1 ΜφΙ ;Ly§· Phe Glu Val Pr0 Gll* Val Gly Gly" Gly Thr Glu Asp Ile Lyg 260 265 270

Thr Gin Leu Thr· Glu Glu Le» Lys Val Glu Tyr Ser Thr Glu Thr Lys 275 280 285

Ile Met Thr Lya Tyr Gin Glu His Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asn 290 295 300

Gin Pro Met Asn Ser Ile Gly leu Leu Ile Tyr Thr Ser Leu Glu Leu 305 310 315 320

Tyr Arg Tyr Asn Gly Thr Glu Ile Lys Ile Met Asp Ile Glu Thr Ser 325 330 335

Asp .Hi#· Asp Thr Tyr '.Thr Leu Thr· Ser "Tyr· pro. ^ftsiLMis Lys Glu .Ale 340 Ş4f 350

Lee Leu Leu Leu ihr :âsn His Ser Tyr Glu Glu Val Glu Glu Ile Thr 355 360 365

Uys Ile Pro Ly# Hi» Thr Leu Ile I*y#: ,Le»·· Lyş Lys Hi»: "Tyr Phe· «Ly» 370 375 380

Lys 385

<211 >341 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis <400> 117 atgtcagcac gceaacttea tattgatgta aataataaga eaggtcatac attacaatta 60 gaagataaaa caaaacttga tggtggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctaat 120 gatcaaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggtac agaaggtact 180 atatattata gtataaatgg agaagcagaa attagtttat attttgacaa tccttattca 240 ggttctaata aatatgatgg gcattctaat aaaaatcaat atgaagttat tacccaagga 300 ggatcaggaa atcaatctca tgtgaettat acgattcaca c 341

<210> 118 <211> 113 <212> PRT <213> Bacillus thuringiesis 137 RO 123431 Β1 <220 <211> NESIGUR <212> (242) <213> Nedeterminat în secvenţa de aminoacizi dedusă <400 118

Met Ser Ai# Arg Gin Leu His Ile Asp Val Asia Asn Lys Thr Gly His 1 5 10 15

Thr Leu Gin Leu, Glu Asp Lys Thr Lys Le»..,Asp Ο&γ rGly' Arg Trp ,Arg:; 2Qi 25 30 'T&iar Ser; Pro Thr:' Asn val Ala Asn Asp GÎ**·.· Ile Lys :':Thr ffae V#1 Aii; 35 40 45;

GlU:; Ser His Gly Phe Met Thr Gly Thr Glu Gly Thr Ile Tyr Îyr: $er 50 55 60

M 70 7:S; SO "Gly' Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His ser ton, Lys; As» Gin; ;Tyr Gi#: Val. 85 tO 95

Ile: Thr Gin Gly Gly Ser Gly Asn Gin Ser His Val Thr Tyr Thr Ile 100 105 110

Hi# <210 119 <211> 341 <212> PR ! <213> Bacillus thuringîesis <40d»ii® atgtcaggtc gtgaagitca tattgatgta aataataaga caggtcatac attacaatta 60 gaagataaaa oaaaacttga tggtggtaga tggcgaacat caeotacaaa tegttgctaat 120 gatcaaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgaeaggtae agaaggtact ιβο atatattata gtataaatgg agaagcagaa attagtttat attttgataa tacbtattoa 240 ggttctaata aatatgatgg gcattccsat aaacctcaat atgaagttac tacccaagga 300 ggatoaggaa atcaatetca tgtaacgtafc actattcaaa e 341 <21:0> 120 <2it* 1:13 138 RO 123431 Β1

<212> PRT <213> Baciilus thuringiesis <400> 120

Met Ser Gly Arg Slu Val His Ile 1 fcsp Val Asn Asn Lys Thî ' Gly His 1 5 10 15 Thr Leu Gin Leu Slu Asp Lys Thr 1 jys Leu 5c Asp Gly Gly Arc f Trp Arg Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Asn î ysp Gin Ile Lys Thr Phc Val Ala 35 40 45 Giu Ser His Gly î >he Met Thr Gly T hr Glu 31y Thr Ile Tyr Tyr Ser 50 55 60 Ile Asn Gly Glu * Ja Glu Ile Ser L eu Tyr Phe Asp Asn Pro Tyr Ser m 70 75 80 Gly S#r Asn Lys 1 yr Asp Gly His S er Asn Lys Pro Gin Tyr Glu Val 85 90 95 Tlaf: Thr Gin Gly Gly Ser Gly Asn G In Ser His Val Thr Tyr Thr Ile 100 1 05 110 GIh <210> 121

<211 >341 <212> ADM <213> Baciilus îhîiiîngfensis <400> 121 atgtcaggtc gcgaagttga cattgatgta aataataaga caggtcatac attacaatta 60 gaagataaaa caaaaettga tggtggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctaat 120 gatcaaatca aaacatttgc. agcagaatca catggtttta tgacaggtac agaaggtact 180 atafcattata gfcafeaaatgg agaagcagaa attagtttat attttgataa tccttattca 240 ggttctaata aatatgatgg gcactccaat aaacctcaat atgaagttac tacccaagga 300 ggatcaggaa ateaatetca tgtcaeatat acgattcaaa c 341

<210> 122 <211 > 113 <212> PRT <213> Baciilus thuringiesis <400> 122 139 RO 123431 Β1

Met Ser 1% Arg Glu Val As® Tle Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His 1 5 10 15

Thr Leu Gin Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg 20 25 30

Thr Ser Pro 'Thr Asn Val Ala Asn Asp Gin Ile Lys Thr Phe Val Ala 35 m- 45

Glu ser His Gly Phe Mefc..lhr Gly Thr Glu Gly· Thr :lie" Tyr Tyr Ger 50 55 €0

Ile Asn Gly Glu Ala Glu.· Tle Ser Leu Tyr Phe; Asp: .Asn Pro Tyr: Ser 65 70; 15, '10

Gly ier Asn Lys Tyr Asp Glf His Ser Asn liyu Pro Gin Tyr Glu :V1*1 85 90 "" 15 '"Thr fhr Gin Gly Gly Ser Gly Asn Glh Ser/¾¾ Val Thr Tyr Thr Ile 100 105 110

Gin

<210> 123 <211> 341 <212> ADN <?13> Baeillus thuringienşjs <400> 123 atgtcagcac gtgaagtaga tattgatgta aataataaga caggtcatac attacaatta 60 gaagataaaa caaaacttga tggtggtaga tggcgaacat cacetacaaa tgttgctaat 120 gatcaaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggtac agaaggtact 180 atatattata gtataaatgg agaagcagaa attagtttat attttgataa ţccttattca 240 ggttctaata aatatgatgg gcattccaat aaacctcaat atgaagttac tacccaagga 300 ggatcaggaa atcaatctca tgtaacgtat acgattcaaa c 341 <210> 124 <211> 113

<212> GRT <213> Baeillus thuriftgiesis <40.D> 1:24 140 RO 123431 Β1 mt Ser Ala Arf Glu Val Ile Asp Val Asn Asn Lys Thr Gly His 1 5 10 15 Thr Leu Gin Leu Glu Asp tm Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg 20 25 30 Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Asn Asp Gin Ile Lys Thr Phe Val Ala 35 40 45 Glii Ser His Gly Fhe Met Thr Gly Thr Glu Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser 50 55 60 Ile Asn Gly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Tyr Ser 65 T0 75 80 Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His Ser Asn Lys Pro Gin Tyr Glu val 85 90 m Thr. Gin Gly Gly Ser Gly Asn Gin Ser His Val Thr Tyr Thr ile 100 105 110

Sin

<210 125 <211 > 1103 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis «400» 125 atgttagata ctaataaagt ttatgaaatn agtaatcatg ctaatggact atatgcagca 50 acttatttaa gtttagafcga ttcaggtgtt agtfctaatga ataaaaafcga tgatgatatt 120 gatgattata acfctaaaafcg gfcttttattt cctattgatg atgatcaaţa tattattaca 180 agctatgcag caaataattg taaagtfc.fc.gy aatgttaata atgataaaat aaatgtttcg 240 âcttattctt caacaaattC aatacaaaaa tggeasafcaa' aagqtaalgg'· ttCttcatat 300 gtaatacaaa gtgataatgg aaaagtctta acagcaggaa ccggtcaagc tcttggattg 350 atacgtttaa ctgatgaatc ctcaaataat cccaatcaac aatggaattt aaottctgta 420 caaacaattc aacttccaca aaaacctata atagatacaa aattaaaaga ttatcccaaa 480 tattcaccaa ctggaaatat agataatgga acatctcctc aatcaatggg atggacatta 540 gtaccttgta ttatggtaaa fcgatccaaat atagataaaa atactcaaat taaaactacfc 600 ccatattata fctttaaaaaa atateaatat tggcaacgag cagtaggaag taatgtagct 660 ttacgtocac ategaagaaaa ftfccatatact tatgaatggg gaacagaaat agatcaaaaa 720 acaacaatqa fcaaatacatt aggatttcaa atcaatatag attcaggaat gaaatttgat 780 ataceaga&g taggtggagg tacagatgaa ataaaaacac aaofcaaafcga agaattaaaa 840 atagaatata gtcgtgaaac taaaataafcg gaaaaatatc aag&acaate tgaaatagat 900 aatccaactg atcaaccaat gaattctata ggattfcctfca cfcafcfcactfcc tttagaatta 960 tatagatata atggctcaga aattcgtata atgcaaattc aaacctoaga taatgatact 1020 tataatgtta cttcttatcc agatcato&a caagctttat tacfctcttac aaatcattca 1080 tatgaagaac ttgaagaaat tag 1103;

<210> 126 <211 >367 <212> PRT <213> Bacillus thyri.ngiesis <4Ρβ> 126 141 RO 123431 Β1

Met Leu Asp Thr Asn Lys Val Tyr Glu Ile Ser Asn. His Ala Asn Gly 1 5 10 15

Seu fyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Leu, Aeg ,Asp" Ser Gly ;Val Ser Leu, 20 25 30

Met .Αβά Lys Asn Asp Aap leg: lle- ,Αβρ·· Asp ':fyr Asn Leii Lys Trp Phe;· :ISl· 40 45

Leu Phe tea Ile Asp Asp Asp Gin Tyr lle lle Thr Ser Tyr Ala Ha 50 55 50

Asn Asn Cys Lys val Trp Asn Val Asn Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser 65 70 75 80

Thr Tyr Ser Ser Thr A»n Ser Ile Gin Lys Trp Gin Ile Lys Ala Asn 85 90 95

Gly Ser Ser Tyr Val lle Gin Ser Asp Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala 100 105 110

Gly îhî* .Gly Gin Ala Leu Gly Leu Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ser 115 120 125 142 1 RO 123431 Β1 3 5 7 9

Asn Avn Pro Asn Gin Gin Trp Asn Leu Thr Ger Val G|h:. Thr Ile Gin 130 13 5 140 leu Pi#. Gin :Jiyş Pro Ile Ile Asp Thr Lys ,Leu î*ys Asp Tyr Pro Lys 145 150 |5:5 . 160

Gly Trp·:· Thr Leu Val Pro Cys ile Met Val Asn Asp pro;: Asii Ile Asp 110 185 IfO

Gin Tyr Trp: G$n,ftr§: :A1& Val Gly Ser 210.: 215

Glu Glw, iys; Get" Tyr "Tir Tyr Glu Trp 725 '210

Thr Thr Ile ti»; *ϋη 'Thr Leu Gly Phe 245

Met Lys Phe ASp, 11%' ::?ro Glu Val Gly .2 m· 2€5. 11

Tyr Tyr Ile Leu Lys 205 Lys Tyr 13 Asn val. Ala Lili Arg '«s 15 ο.θύ 17 Gly Thr :2'3:.S:' Gtm ile Asp, .Gin Lys 240': 19 Gin Tlfe Asn ile Asp" Ser Gly 21 250 255 23 Gly Gly Thr Asp Glu 270 Ile Lys 25 27 29 31 33 35 37 39

Thr Gin Leu Asn Glu Glu Leu Lys Ile Glu Tyr Ser Arg Glu Thr 275 280

Ile Met Glu Lys 290

Tyr Gin Glu Gin Ser Glu Ile Asp Asn Pro Thr Asp 295 300

Gin Pro Met Asn Ser Ile Gly Phe Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Leu 305 310 315 320

Tyr Arg Tyr Asn Gly Ser Glu Ile Arg Ile Mit Gin Ile Gin Thr Ser 3m 330 335

Asp Asn Asp Thr Tyr Asn Val Thr Ser Tyr Pro Asp His Gin Gin Ala 340 345 350

Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Glu Glu Leu Glu Glu Ile 355 360 365 143 41 RO 123431 Β1

<210 127 <211 >369 <212> ADM <213> Bacillus thuringiensis <400 127 atgtccgccc gcgaggtgca catcgaegtg aacaaeaaga ccggccacac cctccagctg 60 gaggacaaga ceaagctcga cggcggcagg tggcgcacct occcgaoeaa cgtggccaac 120 gaccagatca agaccttcgt ggccgaatcc aaeggcfetca tgaccggcac cgagggcacc ISO atctactact ccatcaacgg cgaggccgag atcagcctct acttcgacaa cccgttcgcc 2*0 ggctccaaca aatacgacgg ccactccaac aagtcccagt acgagatcat cacccagggc 300 ggctccggca accagtccca cgtgacctac accatccaga ccacctcctc ecgqtacggc 360 cacaagtcc 369

<210 128 <211> 1149 <212> PRT <213> Bacillus thuringiesis <400 128 agcaaccacg ccaacggcct ctacgccgcc 60 tccctcatga acaagaacga cgacgacatc 120 ccgatcgacg acgaccagta catcatcacc 180 aacgtgaaca acgacaagat caacgtgtcc 240 tggcagatca aggccaacgg ctcctcctac 300 accgccggca ccggccaggc cctcggcctc 360 ccgaaccagc aatggaacct gacgtccgtg 420 atcgacacca agctcaagga ctacccgaag 480 acctccccgc agctcatggg ctggaccctc S40 atcgacaaga acacccagat caagaccacc 600 tggcagaggg ccgtgggctc caacgtcgcg 660 tacgagtggg gcaccgagat cgaccagaag ?20 atcaacatcg acagcggcat gaagttcgac 780 atcaagaccc agctcaacga ggagctcaag 840 gagaagtacc aggagcagtc cgagatcgac 900 ggcttcctca ccatcacctc cctggagctc 960 atgcagatec agacctccga caacgacacc 1020 caggccctgc tgctgctgac caaccactcc 1080 cegaagtcca ccctcaagaa gctcaagaag 1140 1149 atgctcgaca ccaacaaggt gtacgagatc acctacctct ccctcgacga ctccggcgtg gacgactaca acctcaagtg gttcctcttc tcctacgccg ccaacaactg caaggtgtgg acctactcct ccaccaactc catccagaag gtgatccagt ccgacaacgg caaggtgctc atncgnctrca ccgacgagtc ctccaacaac cagaccatcc agctcccgca gaagccgatc tactccccga ccggcaaeat cgacaacggc gtgccgtgca tcatggtgaa cgacccgaac cegtactaca tcctcaagaa gtaccagtac ctccgcccgc acgagaagaa gtcctacacc accaccatca tcaacaccct cggcttccag atcccggagg tgggcggcgg taccgacgag atcgagtact cccacgagac gaagatcatg aacecgaccg accagtccat gaactccatc taccgctaca acggctccga gatccgcatc tacaacgtga cctcctaccc gaaccaccag tacgaggagg tggaggagat caccaacatc tactacttc

<210 129 <211> 357 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis 144 RO 123431 Β1 <4I30> ίΜ atgtccgccc gcgaggtgca catcgagatc aacaacaaga cccgccacac cctccagctc 60 gaggacaaga ccaagctctc cggcggcagg tggcgcacct ccccgaccaa cgtggcccgc 120 gacaccatca agacgttcgt ggcggagtcc cacggcttca tgaccggcgt cgagggcatc 180 atctacttct ccgtgaacgg cgacgccgag atctccctcc acttcgacaa cccgtacatc 240 ggctccaaca agtccgacgg ctccteegac aagcccgagt acgaggtgat cacccagtcc 360 ggctcoggeg acaagtccca cgtgacctac accatccaga ccgtgtccct cegcctc 317

<210> 130 <211>119 <212 > PRT <213> Bacitlus thuringiesis <400> 130

Met ser Ala Arg Glu Val His Ile Glu Ile Asn Asn Lys Thr Arg His 1 5 10 15

Thr Leu Gin Leu Glu Asp Lys Thr Lys Leu Ser Gly Gly Arg Trp Arg 20 25 30

Thr Ser Pro Thr Asii Val Ala Arg Asp Thr Ile Lys Thr Phe Val Ala 35 40 45 :MLU; Ser His Gly Phe Met Thr Gly Val Glu Gly: Ile Ile Tyr Phe Ser 56 55 60

Val Asn Gly Asp Ala Glu Tle Ser Leu His Phe Asp Asn Pro Tyr Ile SS '?0:: 75 80

Gly· Ser Asii. Lys ':fer Asp: Gly· Ser- Ser Asp Lys Pro Glu Tyr Glu Val. 85 90 95

Ile Thr Gin ser Gly Ser Gly Asp Lys Ser His Val Thr Tyr Thr Ile 100 105 110

Gin Thr Val Ser Leu Arg Leu 115

<210> 131 <211 >21 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis <400 131 145 RO 123431 Β1

JL afcffcâfctc gogilgiaca c

<210> 132 <211> 22 <212> ADN <213> Baciltus thuringiensis *400* 132 gfcccat cotea Îfcaattgagg ag 22^

<210> 133 <211 >399 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis <4QQ> 133 atgtcagcac gtgaagtaca cattgaaata ataaatcata caggtcatac cttacaaatg 60 gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa tgttccaaat 120 aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaggaata 180 ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attcccttac attttgacaa tccttatgca 240 ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat aactgaagca 300 agagcagaac atagagctaa taatcatgat catgtaacat atacagttca aagaaacata 360 tcacgatata ccaataaatt atgttctaat aactcctaa 399

<210> 134 <211>132 <212> PRT <213> Bacillus thuringiesis <40Θ> 134 146 RO 123431 Β1

Met Ser· Ala Arp: GI« Val lie: Ile Glw: ile iile: As®·/;!!»'' ®br Gly His 1 5 10 15 11* .'leu Gin Met; Afp lys Arg. "Ti* .Arg' ;!»*«. Ala* His Gly' Glu Trp Ile 20 m 30 11*: îhr Pro Val. Îsn Val·. Bre* : Asii,.. As®' Ger ier Asp Leu Phe Glii: Ala 35 #0 45 Gîy Ser Asp Gly Vil li*® :5¾¾. Gly Val :;Glu Gly ile ile Ile Tyr Thr 5i:.................i®........ 60

Ile Aa&Gly Glii. 11* Gl®· Ile Bre*: le®' Bis Phe Asp Asn Pro Tyr Ala 65 '7:#.; V5 80

Gly Ser Asn Îpft: 'Tyr Se* Gly ,A*i: Ser Ser ft#p Asp ftsp Tyr Lys Val II 90 95

Ile Tli* .Glu Ala: Arg Ala Glu His Arg Ala Asn Asn His Asp·- His Val :100: 105 110

Ti* Tyr Thr Val. Gin Arg: Asn Ile Ser Arg Tyr Thr Ase Lys Leu Cys 115 120 125 .ser fte® Aen ser 1:10 <210 135

<211>1134 <212> ADN <213» Bacillus thurtnglens® <400» 1::35 atgatagaaa ctaataagat atatgaaata agcaataaag ctaatggatt atatgcaact 60 acttatttaa gttttgataa ttcaggtgtt agtttattaa ataaaaatga atctgatatt 120 aatgattata atttgaaatg gtttttattt cctattgata ataatcagta tattattaca 180 agttatggag taaataasaa taaggtttgg actgctaatg gtaataaaat aaatgttaca 240 acatattccg cagaaaattc agcacaacaa tggcaaataa gaaacagttc ttctggatat 300 ataatagaaa ataataatgg gaaaatttta acggcaggaa caggccaatc attaggttta 360 ttatatttaa ctgatgaaat acctgaagat tctaatcaac aatggaattt aacttcaata 420 caaacaattţ cacttccttc acaaccaata attgatacaa cattagtaga ttaccctaaa 480 tattcaacga ccggtagtat aaattataat ggtacagcac ttcaattaat gggatggaca 540 ctcataccat gtattatggt atacgataaa acgatagctt ctacacacac tcaaattaca 600 147 RO 123431 Β1 acaaccectt attatatttt gaaaaaatat caacgttggg tacttgcaac aggaagtggt 660 ctatctgtac ctgcacatgt caaatcaact ttcgaatacg aatggggaac agacacagat 720 caaaaaacca gtgtaataaa tacattaggt tttcaaatta atacagatac aaaattaaaa 780 gctactgtac cagaagtagg tggaggtaca acagatataa gaacacaaat cactgaagaa 840 cttaaagtag aatatagtag tgaaaataaa gaaatgcgaa aatataaaca aagctttgac 900 gtagacaact taaattatga tgaagcacta aatgctgtag gatttattgt tgaaacttca 960 ttcgaattat atcgaatgaa tggaaatgtc cttataacaa gtataaaaac tacaaataaa 1020 gacacctata atacagttac ttatccaaat cataaagaag ttttattact tcttacaaat 1080 cattcttatg aagaagtaac ageactaact ggcatttcea aagaaagact tcaaaatctc 1140 aaaaacaatt "ggaaaaaasg ataa 1164

<210> 136 <211> 387 <212> PRT <213> Bacillus thuringîesis <400> 136

Met Xle Glu Thr A»A-.%» ;IIe Tyr Glu Ile Ser Asn Lys Alft,A«n,:1|ly 1 3 10 15

Leu Tyr Ala Thr Th# #yr ,i*w.. Ser Phe Asp Asn Ser Gly Val Ser1'leu, 20 25 . 30 :leu Asn Lys Asn Glu Se* Asp ile Asn Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Ste 35 40 45

Leu Phe Pro Ile Aip,!»# Asn Gin Tyr Ile Ile Thr Ser- Tyr Gly Val S'Oi 55 -60

Asn Lys :,J§#î! ţ»ys Val Trp Thr Ala Asn Gly Asn Lys Ile Asn Val Thr 65 70 75 80

Thr Tyr Se# Ala Glu Aeh Ser Ala Gin Gin Trp Gin Ile Arg Asn Ser 85 90 95 &a$ Mer Gly Tyr 11# Ile Glu Asn Asn Asn Gly Lys Ile Leu Thr Ala 100 105 110

Gly Thr Gly Gin Ser Leu Gly Leu Leu Tyr Leu Thr Asp Glu Ile Pro 115 120 125

Glu Asp Se# Asn Gin Gin Trp Asn Leu Thr Ser Ile Gin Thr Ile Ser 130 135 140

Leu Pro Ser Gin Pro Ile Ile Asp Thr· Thr Leu Val Asp Tyr Pro Lys 14S 150 ........ 155 160 vfyr ser Thr Thr Gly se# ile Asn Tyr Asn, Gly Tfa# Ala Leu Gin îmm' 165 IfO' 175 .'Met Gly Trp Thr Leu Ile Pro Cys Ile Met Val Tyr Asp Lys Thr Tle Ί8Ό 185 190 148 1 RO 123431 Β1 .Ala.. :Sir Thr lis Thr Gin Ile Thr. :TJif Thr Pro Tyr Tyr Ile· Leu Lys. 195 20© 205

Ala Hi» ;Val l»ys Ser Thr ihe 01«' Tyr Gin Trp "Qîy·· Mir Asp Tîir :'Asf 225 230 S3f 24:i

Thr Lys Leu Lys Ala Thr Val Pro Glu Val Gly 'Gly Gly Thr: 'Tir Αβρ. 260 365 270·:

Ile Jteg Thr: Gin Ile Thr Glu Glu Leu LyS: Val Glu Tyr Ser SesrOlu "" 2:7.5·' 280:: 285 J%U'LyS Glumitei Arg Lye Tyr Lys; Gin, Ser Phe Asp V&I AspAe» Leu; 290 " 2 95 300

Asn Tyr Asp Glu Ala L«U Asn. Al* Val Gly Phe Ile Val Glu Thr Ser 3.05 310 315 320

She Glu Leu Tyr· Arg Met Asn. Gly Asn Val Leu Ile 'Thr'· Ser tle. Lys 321 330: 335

Thr Thr Asn Lys Asp Thr Tyr Asn Thr Val Thr Tyr Pro Asn His Lys 340 345 350

Glu Val Leii Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Glu Glu Val Thr Ala 355 360 365

Leu Thr Gly Ile Ser Lys Glu Arg Leu Gin Asn Leu Lys Asn Asn Trp 370 375 380

Lys Lys Arg 385

<210137 <211> 341 <212->ADN <213> Baciiluslhucingiensis <400 137 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 149 41 RO 123431 Β1 atgtcagcag gtgaagfcfcca tattgaaata aataataaaa cacgtcatac attacaatta 60 gaggataaaa ctaaacttac cagtggtaga tggcgaacat cacctac&aa tgttgcccgt izo gatacaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggaat agaaggtatt 180 atatatttta gcgtaaaogg agaagcagaa attagtttac attttgacaa tccttatgta 240 ggttctaata aatatgatgg ttcttctgat aaagctgcat acgaagttat tgctcaaggt 300 ggatcagggg atatatctca tctaacatat acaattcaatt c 341

<210> 138 <211> 113 <212> PRT <213> Bacillus thuringiesis ·#00>'·:ί38

Met Ser Ala Gly Glu Val His Ile Glu: 11¾ Asn:. Asn Lys Thr Arg '.lls: 1 5: 10 Μ :Thr Leu Glii :.l»eu 61a Asp·: ΐγ» Thr %ye Leu 'Ttiif fer 'Gly ftrg 'Tip· Aii" * :30 25 3¾

Thr Ser im %r Aia :Val Ala Arg Aep Thr Ile Lye Thr :E4» 'Val Ala if .40 45 iltt srnt; Iii :'§!τ· iii: ifti fii :My:· ile Gli* -elr Ile 11¾ fp ;ifee Ser 50 55 60

Val .Asn Gly GUr Ala 01*1 Ile·: #eţ l*em Hia Phe Asp Asn Pro Tyr Val 65 IM 75 fiO

Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly Ser Ser Asp Lys Ala Ala Tyr Glu Val 85 90 95

Ile Ala Gin Gly Gly Ser Gly Asp ile Ser His Leu Thr Tyr Thr Ile 100 105 110

Gin

<210> 139 <211> 1158 <212> ADN <213> Bacilius thuringiensis <40:Q>:1i9 150 RO 123431 Β1 atgttagata ctaataaaat tfcatgaoata agcaateatg ctaafcggatt atâtaeatea 60 acttatttaa gtctggatga ttcaggtgtt agtttaatgg gtcaaaatga tgaggatata 120 gatgaataca atttaaagtg gttcttattt ccaatagata ataatcaata tattattaca 180 agctatggag cgaataattg taaagtttgg aatgttaaaa atgataaagt aaatgtttca 240 acgtattctc caacaaactc agtacaaaaa tggcaaataa aagctaaaaa ttcttcatat 300 ataatacaaa. gtgagaatgg aaaagtctta acagcaggaa taggtcaatc tcttggaata 360 gtacgcttM» ccgatgaacc atcagagagt tctaaccaac aatggaattt aatecctgta 420 caaacaatit:·' cactcccaca aaaacctaaa atagataaaa aattaaaaga tcatgctgaa 4.80 tattcagaa* ccggaaa~at agctactgga acaaLtcctc aattaatggg atggacatta 540 gtaccttgta ttatggtaaa tgatccaaaa ataggtaaaa acactcaaat taaaactact 600 ccatattata tttttaaaaa atatcaatac tggaaacgag caataggaag taatgtatct 660 ttacttccac atcaaaaaaa atcatatgafc tatgagtggg gtacagaaga aaatcaaaaa 720 acaactatta ttaatacagt aggatttcaa attaatgtag attcaggaat gaagtttgag 780 gtaccagaag taggaggagg tacagaagaa ataaaaacac aattaaatga agaattaaaa 840 gţtgaatata gcactgacac eaaaataatg aaaaaatatc aagaacactc agagatagat 900 aatccaacta atcaaacaac gaattctata ggatttctta cttttacttc tttagaatta 960 tatcgatata acggttcgga aattcgtata atgagaatgg aaacttcaga taatgatact 1020 tatactctga cctcttatcc aaatcataga gaagcattat tacttctcac aaatcattct 1080 tatcaagaag taagccgaat tccagcacac tggcggccgt tactagtgga tccgagctcg 1140 gtaceaaget tggcgtaa 1158 <210> 140 <211 >385 <212>l»ir <213> Bacillus thuringiesis <4GQ> 140 151 RO 123431 Β1

Met Leu: Αβρ Shr Asn Ly® TI®: Tyr Glu Ile Ser' AkSîi His Âlă AsU'.:· 61y i ς io îs

Leu Tyr Thr Ser Thr Tyr Leu Ser Leu Asp Asp Ser Gly Val Ser: Leu 20 25 30

Mefe:: '§ly ::Gls, Asn Asp Glu .Asp: IÎ«: .Asp Glu Tyr Asm Leu Lys Trp;·. Phe 31 io; 45 ;Len, ,®h® ;®ro Ile Asp Asn :.Α®ρ; Glft Tyr Ile Ile Thr Ser Tyr Gly Ala 10' ,'55· 60 .Jap:: ftsp Cys ijiyg: Val Trp Asn Val Lys Asm Asp Lys Val Asm V1.1, Ser #1' 70' ti eo

Thr: Tyr Ser Pt®· Thr Asn Ser: Val •'Gin Lys '"Tip Gin Ile 1¾¾ -.Ala Lys 85 90 95

Asm Ser Ser Tyr Ile Ile Gin Ser Glu Asp Gly Lys Val Leu Thr Ala 100 105 110

Gly Ile Gly Gin Ger Leu Gly· Ti® 'Val Ar§: Leu. Thr Asp Glu Ser Ser 115 120 125

Leu, :lr® Gin: Î*ye Pr®; Ly® 1,1® Asp Lyi Lys ::Le«i :¾¾ Aăf*: His Pro Glu 14.5.: :i|:o 155:· i60

Tyr Ser Glu Thr Gly Asp. îl® Ala Thr Gly ""'Tir Sie Pro Gin.· Leu :Met 165 170 17Ϊ

Gly Trp Thr Leu '"Val Pro Cys Ile Met Val Asn Asp Pro Lys II®: Gly ISO 185 190

Lys Asn Thr Gin Ile ::gys Thr Thr Pro Tyr ':Tyr Ile Phe Lys Lys· 'Tyr 195 ::'.200 205

Gin Tyr Trp Lys Arg: Ala TI®: Gly Ser Asn Val Ser Leu Leu,. Pro pis 210 2:1'5': 220

Gla Lys Lys Ser 'Tyr: Asp Tyr Glu Trp Gly Thr Glu Glu Asp· Gin;' Lys iis- :2:30 ' "'235 "240 152 1RO 123431 Β1

Thr Thr Ile îl* 'MS& Thr Val Gly Phe Gin Ile Asn Val Asp Ser Gly 245 2S0 ( 255 Met Lys Phe Glu Val Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr 01«.. 01« Ile Lys 260 265 270 Thr Gin Leu Asn :f 1« ..01«: Leu Lys Val Glu Tyr Ser Thr Asp Thr Lys 275 .2,30 235 Ile Met Lys Lys Tyr Gin Glu His Ser Glu Ile Asp Asii Pro, Ttir Asn. 290 295 300 Glu Thr Thr Asm Ger Ile: Gly PI» Leu: Thr ;fhe Ar ier 'Leu Glu Leu 305 flO: 315 320 Tyr Arg Tyr Asa Gly"" Ser Glu Ile Arf" Ile Met Arg Met'· Glu Thr fier Gâs 330 3.05.'.

Asp Asn Asp Thr Tyr· ®hr Leu Thr Sfr Tyr Pro Ase Bis Arg alţi·. Ala 340 345

Leu Leu Leu Leu Thr Asn His Ser Tyr Glu Glu Val Ser Arg Ile Pro 355 360 36.5; :Ala Hi». Trp Arg Pro Leu Leu. "Val Asp .pro .fier Ser" Val Pro Ser Leu 300 3.0f 380 :Aia 38S c210> 141 <211 >399 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis <40Q>i41 atgtcagatc gataaaagaa aattcttctg ataatttata ggttctaata agagcagaac tcacgatata <210> 142 gcgaagtaca ctagacttgc atttatttca ctataaatgg aatattctgg atagagctaa ccaataaatt tattgaaata acatggtgaa agcaggttct agaaatagaa acgttctagt taatcatgat atgttctaat ataaatcata tggattatta gatggagttt attacattac gatgatgatt eatgtaacat aactnrraa caggtcatac cacccgtgaa tgacaggagt atfcttgacaa· at aaagttat atacagttca cttacaaatg 60 tgttccaaat 120 agaaggaata 180 tccttatgca 240 aactgaagca 300 aagaaacata 360 399 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 153 RO 123431 Β1

<211> 132 <212> PRT '213> Bacillus thufinitesis <4QQ>142

Met Ser Asp Arg: Glu v*i His 11« 01«. lle lle Aih aia Bir 0ly Hls' 1 5 10- 11 Thr Leu Gin Met Asp Lys Arg Thr Arg Leu Ala .Hls fijLy Glu· Trp îl a 20 25 30 lle Thr Pro val Asn Val Pro Asn Asn Ser Ser Asp Leu Phe Gin Ala 35 40 45 Gly Ser Asp Gly Val Leu Thr Gly Val Glu Gly lle lle lle Tyr: Thr 50 55 "60 lle· Asn .Giy Gi« lle Gl« lle Thr Leu Ht» -SI» Asp Asn Pro Tyr Ala 6S 70 75 80 Gly fer Lys Tyr Ser Gly ftrg Ser Ser Ăip Asp Tyr Lys val 83 90 95 lle Thr GlU Ala Arg Ala Glu His Arg Ala Asn Asn His Asp His Val 100 105 110 Thr Tyr Thr Val din Arg Asn lle Ser Arg Tyr Thr Asn Lys Leu Cyi 115:- 120 125

Ser Asn Asn Ser 130

<210> 143 <211 >871 <212> ADN <213> Bacilius thurinqiensis <400> 143 itgatagaaa ctaataagat atatgaaata agcaataaag etaatggatfc atatgeaact 60 aettattfcaa gttttgatae ttcaggtgfct agtttattaa ataaeaatga atotgatatt 120 aatgattata atttgaaatg"gtttttattt cctattqata ataatcagta tattattaca 180 agttatggag taaataaaaa taaggtttgg actgctaatg gtaafcâaaat aaatgttaca 240 acatattccg cagaaaatto agOacaacaa tggcaaataa gaaacagttc ttctggatat 300 ataatagaaa ataataatgg gaaaatttta acggcaggaa caggceaatc attaggttta 360 ttatatttaa etgatgaaat acctgaagat tctaatcaac aatggaattt aaettcaata 420 caaacaattt cacttecttc acaaccaata attgatacaa cattagtaga ttaccctaaa 480 tattcaacga ccggtagtat aaattataat ggtacagcac ttcaattaat gggatggana "40 ctcataccat gtattatggt atacgataaa acgatagctt ctacacacac tcaaattaca 600 acaacccctt attatatttt gaaaaaatat caacgttggg tacttgcaac aggaagtggt 660 ctatctgtac ctgcacatgt caaatcaact ttcgaatacg aatggggaac agacacagat 720 caaaaaacea gtgtaataaa tacattaggt tttcaaatta atacagatac aaaattaaaa 780 gctactgtac cagaagtagg tggaggtaca acagatataa gaacacaaat cactgaagaa 840 cttaaagtag aatatagtag tgaaaataaa g 871

<210 144 <211 >290 <212> PRT <213> Bacillus thuringiesis <400> 144 154 RO 123431 Β1

Met ,tle Glu Tta .&S:H: Lys Ile Tyr Glu Ile ier vton Lys Ala Asn Gly 1 1 5: '30 15 3 ten Tyr Ala Thr Tfer; Tyr Leu Ser Phe Asp Asn Ser Gly Val Ser Leu. 20 25 30 5 Leu Asn Lys Asn Glu Ier Asp Ile Asn Asp 'Tyr. ten. Leu Lys Trp Phe :.ţ5. 40 45 7 Leu Phe Pro ile Asp Asn Asn Gin iyr Ile Ile Thr Ser Tyr Gly Val g 50 55 60 Asn Lye Asn Lys val Trp ajhr Ala ton Gly ton Lys Ile Asn Val Thr 11 65 70 75 80 13 Thr Tyr Ser Ala Glu Asn Ser Ala Gin Gin Trp Gin Ile Arg Asn Ser 85 90 95 15 Ser Ser Gly Tyr Ile Ile Glu ton ton ton Gly Lys Ile teu Thr Ala 100 105 110 17 Slr TOr Gly Gin Ser Leu Gly Leu Leu Tyr Leu Thr top Glu Ile Pro 19 115 120 125 Glu Asp Ser Asn Gin Gin Trp Asn Leu Thr Ser Ile Gin Thr Ile Ser 21 130:· 135 140 23 Leu Pro Ser PIS Ile Ile top Thr Thr Leu Val Asp Tyr Pro Lys 145 :1.150 155 160 25 Tyr Ser Thr Thr Gly !' Ile ton1: Tyr ton Gly Mir Ala Leu Gin Lna 165 170 175 27 Met Gly Trp Thr Leu ile Pro Cys Ile tot Val Tyr Asp Lys Thr ile 29 180 185 190 Ala Ser Thr HÎS %* 3.111. GlO; Ile Thr Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Leu Lys 31 195 2 DCX 205 33 Lys Tyr Gin Arg Trp val Leu Ala Thr Gly Ser Gly Leu Ser Val Pro 210 215 220 35 Ala His Val Ly» Ger Thr Phe Glu- Tyr Glu Mp Gly Thr top flte Asp 225 230 235 240 37 Gin Lys Thr Ger vai Ile ton Thr Leu Gly Phe Gin Ile ton Thr Asp 39 345 250 355 Thr Lys Leu Lys Ala Thr val Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Thr top 41 260 265 270 43 Ile Arg Thr Gin Ile Thr Glu Glu Leu Lys Val Glu Tyr Ser Ser Glu 275 280 285 45 155 RO 123431 Β1

Asn Xiys 290

<210 145 <211 - 372 <212> ADN <213> Baciiius thurîngiens:is: <400 145 atgtcagcac gtgaagtaca cattgatgta aataataaga caggteatac afctacaatta :i'0 gaagataaaa caaaacttga tggtggtaga tggcgaacat cacctacaaa tgttgctaafc 120 gatcaaatta aaacatttgt agcagaatca catggtttta tgacaggtac agaaggtact .180 atatâttata gtataaatgg agaagcagaa attagtttat attttgataa tccttattca 240 ggttctaata aatatgatgg gcattccaat aaacctcaat atgaagttac taceeaagga 300. ggaţcaggaa atcaatctca tgttacgtat actattcaaa ctgcatcttc acgatatggg 360 aataactcat aa 372

<210> 146 <211> 123 <212> PRT <213> Baciiius tfariOilesiş <400'146

Met Ser Ala iasg: Glu 'Val His ile ftgp Val Asn: Asn Lys Thr Giy Ui» 1 S =10 15

Thr: Leu Mir Leu Glu Asp: Lys Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg 20 25 30

Thr Ser Pro Thr Asn Val Ala Asn Asp Gin Ile Lys Thr Phe Val Ala 35 40 45

Glu Ser His Gly Phe Met Thr Gly Thr Glu Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser 50 55 60

Ile Asn Sly Glu Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Tyr Ser 65 70 75 30

Gly Ser Asn Lys Tyr Asp Gly His Ser Asn Lys Pro 01nt Tyr Glu Val 85 90 95

Thr Thr Sin Gly Gly Ser Gly Asn Gin Ser His Val Thr Tyr Thr Ile 100 105 110

Gin Thr Ala Ser Ser ftrg Tyr Gly Asn Asn Ser 115 120 <210>147 <211 > 1152

<212> ADN <213> Baciiius thuiingiensis <400> 147 156 RO 123431 Β1 atgttagata ctaataaagt ttatgaaata agtaatcatg ctaatggact atatgcagca 60 -j acttatttaa gtttagatga ttcaggtgtt agtttaatga ataaaaatga tgatgatatt 120 gatgattata aettaaaatg gtttttattt cctattgatg atgatcaata tattattaca 180 agctatgcag caaataattg taaagtttgg aatgttaata atgataaaat aaatgtttcg 240 3 acttattctt caacaaattc aatacaaaaa tggcaaataa aagctaatgg ttcttcatae 300 gtaatacaaa gtgataatgg aaaagtctta acagcaggaa ccggtcaagc tcttggattg 360 5 atacgtttaa etgatgaate ctcaaataat cccaatcaac aatggaattt aacttctgta 420 caaacaattc aacttccaca aaaacctata atagatacaa aattaaaaga ttatcccaaa 480 tattcaccaa ctggaaatat agataatgga acatctcctc aattaatggg atggacatta 540 7 gtaccttgta ttatggtaaa tgatccaaat atagataaaa ataetcaaat taaaactact 600 ccatattata ttttaaaaaa atatcaatat tggcaacgag cagtaggaag taatgtagct 660 g ttacgtccac atgaaaaaaa atcatatact tatgaatggg gaacagaaat agatcaaaaa 720 acaacaatca taaatacatt aggatttcaa atcaatatag attcaggaat gaaatttgat 780

ataccagaag taggtggagg tacagatgaa ataaaaacac aactaaatga agaattaaaa 840 H atagaatata gtcgtgaaac taaaataatg gaaaaatatc aagaacaatc tgaaatagat 900 aatccaactg atcaaccaat gaattctata ggatttctta ctattacttc tttagaatta 960 -13 tatagatata atggctcaga aaCtcgtata atgcaaattc aaacctcaga taatgatact 1020 taeaatitta cttcttateoagatcatcaa caagctttat tacttcttac aaatcattoa 1080 tatgaagaag tagaagaaat aacaaatatt cctaaaagta cactaaaaaa attaaaaaaa 1140 ^ tattattttt aa

<210> 148 <211> 383 <212> PRT <213¾1 Bacillus thuringiesis 1g8; .Met: Lem ,Αβρ' Thr. Asn, Lys vai ryr

1 I

Lem Tyr Ala. Ala Bir Tyf Leu 'Se*·; Leu .....20 25

Met.. leu Lys Αβη Asp Asp Aep îl® ..Αβρ* ;35 ':Leg Mie ::®r5 li* .Asp Asp Asp Gin 'ifîr 50 55

Asn Asn Cye Iys: ygl îrp Aen Val Asn 65 70

Thr Tyr: :Ser Ser Thr Asn Ser Ile Gin 85 #iy Ser Ser Tyr Val Ii® Gin Ser Asp 100 105 :01y· ThrGly Gin .Ala Leg. Gly Leu Ile 115 120 1152 17 19 21 23 ,11« Ser· Asn His Ale Asn Gly 25 10 15 27 Asp Asp Ser Gly Val Sex Leu 30 29 Asp Tyr Asn Leu Lys T£p phs 31 45 Ile Ile Thr Ser Tyr Ale Aii 33 60 35 Asn Asp Lys Ile Asn Val Ser 37 75 80 Lys Trp Gin Ile Lys Ala Asn 39 90 m 41 Asn Gly Lys Val Leu Thr Ala 110 43 Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ser·· 45 .1:25 157 RO 123431 Β1

Leu Pro· Sin Lya Pro Ile. Ile :A®p Thr ly®: Leu Lys Aap "Tyr· Pro Lys 111' 15# 155 160

Gly Trp Thr Leu Val Pro Cys Ile Het ml Asm Asp Pro A®U. Ile A®g> 180 185 190

Lys Asn Thr Gin El» Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr fi» Leu Lys Lys Tyr 195 200 205

Gin Tyr Trp Gin Arg Ala Val Gly Ser Asn Val ala Leu Arg Pro His 210 215 220

Glu Lys Lys Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Gly Thr Gin Ile Asp Gin Lys 225 230 235 240

Thr Thr Ile Ile Asn Thr Leu Gly Phe Gin Ile Asn Ile Asp Ser Gly 245 250 255

Met Lys Phe Asp Ile Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Asp Glu Ile Lys 260 265 270

Thr ·:β!:ϊΐ: Leu Asn ::61% Glu :'Leu Lys Ile Glu Tyr Ser Arg Glu Thr Lys 275 280 285

Ile Itefc Glu Lys Tyr Gin Glu Gln'Sir Glu ΙΙ»; Asp Asn Pro Thr Asp 290: 295 ' 800:'

Gin Pro Met ftsn.Ser Oft C .rfUD·· II» Gly Oii·· Leii Thr II».· ..Thr Ser Leu Glu Leu 310 .315-: 320 fyr Asn Gly Ser ;Glu El»:· 325

Ile :l»t·:· 330 fie Gin Thr Ser 335

His Gin Gin Al<

Asn Asp Thr 340

Tyr Asn Val

Ser Tyr .pro: 8:45

Leu 'Leu.· Leu Leu^Tîir Asn His .•S»r 'Tyr Glu Giu.. V»1 Glu Glu 11» Thr 355 ISO" 365

Lys Tyr Tyr Phe 380

Asn Ile Pro Lys S»r Thr Leu LyS::. Lys Leii..::Ly!>.·'· 370 375 158 RO 123431 Β1

<210> 149 <211> 354 <212> ADN <213> Bacillus thuiinglensis <400> 149 atgtcagctc gcgaagttea tattgaaata ataaatcata caggtcatac cttacaaatg 60 gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa tgttccaaat 120 aattcttctg atttattfcea agcaggttct gatggagttt tgacaggagt agaaggaata 180 ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attaccttac attttgacaa tccttatgca 240 ggttctaata aatattctgg aegfcţctagt gatgatgatt aCaaagttat aactgaagca 300 agagcagaac atagagctaa taâteatgat catgtgacat atacaattca aaca 3S4

<210> 150 <211> 113 <212> PRT

<213> Bacillus.IhuringfegiS '<400>:i50 ilfc: llr Ala Arg OM '¥il: His îl# Olu ile ile Asn His Thr Gly His X 10' 15 Thr teii Gin Met Aep- lyt Arg; Tir Arg 'teu Ala His Gly Glu Trp Ile 20 m 30 îi» Tir ir»· »1. As». ¥al Prs':. Asm Asn Ser :Ser Asp itieu Phe Gin Ala 35 40 45 Gly Ser .Asp Gly ¥1:1 Leu Thr Gly Val Glu Gly Ile ile 11«· fm Thr 50: 55 60 Ϊ1#; Ase iif'" «Jiu 11# Gl» Ile Tir ."Leu His Phe Asp Asn pro Tyr Alt «f 70 75 8# 'Ser A»®:· 'tys Tyr Ser Gly Arg Ser Ser Asp Asp Asp ryr Lys ¥t! 85 90 95 fi# Gl® Alt .Ăîf Ala OM: Mit Arg Ala Asn Asn His Asp His »1 iol IC 5 110 fii

<2:1 fe. iSl <211 >353 <212> ADN 159 RO 123431 Β1 <213> Bacillus thuringiensis <400> 151 cttacaaatg 60 tgttcttaaat 120 agaaggaata 180 tcottatgcas 240 aactgaagca 300 aac 353 atgteagctc gtgaagttca tactgaaata ataaaccata caggtcatac gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa aattettctg atttatttca agcaggttet gatggagttt tgacaggagt ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attaccttac attttgacaa ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat agagcagaac atagagctaa taatcatgat catgtaacat atacaattca

<210> 152 <211> 113 <212> PRT <213> Bacillus thuringiesis <400> 152

Met Ser Ăla Arg Glu Val His Ile Glu Ile Ile Aşu His Thr Gly His 1 5 10 15

Thr Leu Gin Met Asp 20

Arg Thr Arg Leu Ala His Gly Glu Trp Ile 25 30

Leu Phe Gin Ala 45

Ile Thr Pro Val Asn Val Pro Asn Asn Ser Ser 35 40

Gly'Her Asp .Gly "Vâl Leu Thr''Gly Val. Glu Gly Ile Ile Ile Tyr Thr 50 15 60

Ile Asn Gly Glu îi#. Glu île Thr Leu: Hle Phe Asp Asn, Pro Tyr Ala 65 TO 75 80

Gly ser Asn Lys Tyr Ser Gly Arg Ser:· Ser /Asp Asp Asp: '.Tyr Ly»·· Val 85 ' so: ' Sf:

Ile Thr Glu Ala. Arg Ala Glu His Arg Ala .Asn Asn His: Asp His Val

lift® 1.0 5 TIO

Thr

:<210> 153 <211> 353 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis <400> 153 160 RO 123431 Β1 ettacaaâtg 60 tgttcoaaafc 120 agaaggaata 180 tccttatgca 240 aactgaagca 300 aac Ş53 atgtcagcac gcgaagtaga tatfcgaaata ataaatcata caggtcatac gataaaagaa ctagacttgc acatggtgaa tggattatta cacccgtgaa aattcttctg atttatttca agcaggttct gatggagttt tgacaggagt ataatttata ctataaatgg agaaatagaa attaccttac attttgacaa ggttctaata aatattctgg acgttctagt gatgatgatt ataaagttat agagcagaac! afcagagctaa taatcatgat catgtgactt atacaattca

<210> 154 <211> 113 <212> PRT <213> Bacillus thuringiesis <m> 154

Met Ser Ala Arg: Glii vai Asp: iile ..Glu Ile Ile Asn l*» Mir Gly · Bii 1 Ş 10 vis Mur Leu Gltt Met· Asp Lys Arg vMir: Arg Leu Ala His Gly Glu· Tip 11«:·: 10 25 I0: îl© 'Mur Pro: i:val: mm '"Văl pro Asn Asn Ser Ser Asp Leu·· iBe·; Gin.. Ala· 3f ''*0" 4:5 m Y Ger Pm oiy y» ..Leu Tim «Ir mi Glu Gly Ile ile:· lli·. ::Tyr" Mir: •Sf S'5: 60 Ile ASII Gly :îl€ :''G1U iii .'.Leii His Phe Asp Asn Pro Tyr Ala 65 70: 75 80 Gly Ser Asn Lys Tyr Ser Gly Arg; Ser ser Asp Asp Asp Tyr Lys yai 85 90 95 Ile Thr Glu Ala :AtS .'ΜΑ; Glu Bis Aii Ala Asn Asn Bis Asp His mi 100 105 110

<210> 155 <211> 37 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis <400> 155 37 aaatattatt ttatgtcagc acgtgaagta cacattg RO 123431 Β1 <210 156

<211 >40 <212> ADN <213> Bacillus thuringiesis <400> 156 tctctggtac cttattatga tttatgccca tatcgtgagg <210> 157

<211 >45 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis <400> 157 agagaactag taaaaaggag ataaccatgt tagatactaa taaag

<210> 158 <211 >46 <212> PRT <213> Bacillus thuringiesis <400 158 cgtgctgaca taaaataata tttttttaat ttttttagtg tacttt <210> 159

<211 >506 <212> PRT <213> Bacillus thuringiesis <400> 159 162 1 1 Tlir· Gty: Gin Ai»·. Leu ni:

Gly .'Leu Ile: Arg RO 123431 Β1 'Mefc: Leu Ăsp Thr JlŞii, Lys V«l. :Ty!c Glu I Ie Ser Aşii: ®|Ş Al::» Aş» Gly i ;s io :ş5:

Leu Tyr Ala Ăl» 'Tit Tyr Leu Set Leu Asp Asp :S»f Gîy'' Val Ser Leu m 25 30

Met Asn Lys Aşn :Asp Asp Aap ile Asp Asp Tyr :J4sn Leu Lys Trp Ph» 35 *0 45

Leu Mie::: pro:. Ile 'Asp Asp Asp Gin Tyr |ie Ile Thr Ser Tyr iAl» SI» 5"0'·'. 5:5 60 •As», a»».: Sy#:· îpi 'Veli Trp hm, Ί»! as», asu Asp :%« îi»:: Ssa ’ial .Ser"' 51··: 70 .7:5 ;:80

Tlsr Tyr ier: ier Tir Asn ier îie (3lm, Lys Trp. .:G1îî Ile: ·ΐφ* Ala Asn 85 ’ 90 95 'Siy Ser Ser Tyr "Vai Ile Sin ,"3er Asp Asn Gly Lys Val, Leu Thr Ala 100 105 110

Leu Thr Asp Glu Ser Ser 125

Asn Asn PTO" ,ASU Gir Gin Trp Asn, Leit :Thr- Ser Val Sin: Thr Ile Gin 130 135 140

Le»: Pro.:· Sin Lys Pro Ile Ile Asp Thr Lys Leu Lys Asp Tyr Pro Lys 145 150 155 160

Tyr Set ItO Thr Gly Asn Ile Asp Asn Gly Thr Ser Pro Gin Leu Met 165 170 175

Gly Trp· Thr 'Leu "lai, Pro Gys Ile. Met Val Asn Asp Pro Asn Ile Asp ISO 185 190

Lys Asn Thr 0¾ Ile Lys Thr Thr Pro Tyr Tyr Ile Leu Lys Lys Tyr 195 200 205

Gin Tyr Trp:: Glr.Arg Ala val Gly Ser Asn Val Ala Leu Arg Pro His 210 fis 220

Glu Lys Lys: .Ser ':Tyr Thr Tyr 'Glu Trp: Gly Thr: Glu Ile Asp Gin Lys 225 230 235 240 3 5 7 9 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 163 41 RO 123431 Β1

Thr Thr Ile Ile Asn Thr Leu Gly Phe Gin Ile Asn ile Asp Ser Gly 245 250 255

Met Lys Phe Asp Ile Pro Glu Val Gly Gly Gly Thr Asp Glu Ile Lys 260 265 270

Thr Gin Leu Asn Glu Glu Leu Ip lli Olu tp Ser His Glu Thr Lys 275 280 285

Ile Met Glu Lys Tyr Gin Glu Gin Sac Glu Ile Asp Aon Pro Thr Asp 290 295 300

Gin Ser Met Asn toc Ile Gly ihe Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Leu 305 Ϊ10 ăii 320 fyrAri 'Tyr Asn Gly Ser Glu ;î,l# :Arg:; Ile Met Gin Ile Gin Thr Ser -32-5 " 330 335

Asp'.Apn ',Asp Thr Tyr .Asn Vil Thr Ser Tyr Pro Ai» His Gin Gin Ala 340 345 350

Leu Leu Leu Leu Thr Adh 51¾ Ser Tyr Glu Sini Văl Glu Glu Ile Thr 355 360 365 ASP He Prp Lys Ser Thr- Leu Lys Lys Leu Lys Lys Tyr Tyr Phe Met 370 375 '360

Ser Ala Arg Glu "Val iHt» Ile Asp Vil Asn Asn Lys Tlir Gly His Thr 385 390 395 400

Leu Gin Leu Glu Asp '".ţyi- Thr Lys Leu Asp Gly Gly Arg Trp Arg Thr 405 410 415

Ser Pro Thr Asn val Ala Asn Asp Gin Ile lys Thr Phe Val Ala Glu 420 421 420

Ser Asn Gly ihe Met Thr Gly Thr Glu Gly Thr Ile Tyr Tyr Ser Ile 435 440 441

Asn Gly 61a Ala Glu Ile Ser Leu Tyr Phe Asp Asn Pro Phe Ala Gly 410 411 460

Ser Asn lys Tyr Asp Gly His Ser Asn Lys Ser Gin Tyr Glu Ile Ile 461 470 475 480

Thr Sin Gly Gly Ser Gly Asn Gin. Ser His Val Thr Tyr Thr Ile Gin: 466 4 90 iii

Thr Pir- fer:· Ser Arg Tyr Gly Bin Lys ser 500- 505 164 RO 123431 Β1

<210> 160 <211> 1521 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis <400> 160 atgttagata ctaataaagt ttatgaaata agcaatcatg ctaatggact atatgcagca 60 aofctatttaa gtttagatga ttcaggtgtt agtttaatga ataaaaatg* tgatgatatfc 120 gafegattata acttaaaatg gtttttattt cctattgafcg atgatcaâtâ tattattaca 180 agotatgcag caaataattg taaagtttgg aatgttaata atgataaaat aaatgtttcg 240 acttattctt caacaaattc aatacaaaaa tggcaaataa aagctaatgg ttcttcatat 300 gtaatacaaa gtgataatgg aaaagtctta acagcaggaa ccggtcaagc tCCtggattg 360 atacgtttaa ctgatgaatc ctcaaataat cccaatcaac aatggaattt aaet'tetgta 420 caaacaattc aacttccaoa aaaacctata atagatacaa aattaaaaga ttttCCCâŞft 480 tattcaccaa ctggaaatat agataatgga aeatctcotc aatfcaatggg atggacatta 540 gtaccttgta ttatggtaaa tgatccaaat atagataaaa atactcaaat taaaa'Otaet 600 gcatattata ttttaaaaaa atatcaatat tggcaacgag cagtaggaag taetgfcagot 660 ::ttacgtccac atgaaaaaaa atcatatact tatgaatggg gcacagaaat agatcaaâaa 720 acaacaatta taaatacatt aggatttcaa atcaatatag attcaggaat gaaatttgat 780 ataccagaag taggtggagg tacagatgaa ataaaaacac aactaaatga agaattaaaa Θ40 atagaatâta gtcatgaaac taaaataatg gaaaaatatc aagaacaatc tgaaatagat 900 aatccaactg atcaateaat gaattctata ggatttctta ctattacttc cttagaatta 960 tatugatata atggetcaga aattcgtata atgcaaattc aaacctcaga taatgatact 1020 tatâatgtta Gttettafccc aaatcatcaa caagctttat tacttcttac aaatcattca 1080 tatgaagaag tagaagaaat eacaaatatt cctaaaagta cactaaaaaa attaaaaaaa 1140 fcattatttta tgtcagceeg fcgaagtacaa âttgatgtaa ataataagac aggtcataca 1200 ttacaatt-ig aagataaaac aaaacltcat ggtggtagat ggcgaacatc acctacaaat 1260 gttgctaatg atcaaattaa aacatttgta gcagaatcaa atggtttCat gaeaggtaca 1320 gaaggtacta tataetatag Cataaatgga gaagcagaaa ttagtttata ttttgacaat 1380 ccttttgcag gttctaataa atatgatgga cattccaata aatctcaata tgaaattatt 1440 acccaaggag gatcaggaaa tcaatctcat gttacgtata ctattcaaac cacatcctca 1500 cgatatgggc ataaatcata a 1521

<210> 161 <211 >23 <212> PRT <213> Bacillus thuringiesis <400> 161 gatrattatc aatatattat tac 13 <210> 162

<211 >20 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis <400 162 165 RO 123431 Β1 caaggtarta atgtccatcc

<210> 163 <211 > 24 <212> ADN <213> Bacillus thuringiesis <400> 163 gatgatgrtm rakwwattat trca

<210> 164 <211 >24 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis <400> 164 gatgatgrtm ratatattat trca <210> 165

<211> 23 <212> PRT <213> Bacillus thuringiesis <400 165 ggawgkrcdy twdtmccwtg tat

<210> 166 <211> 23 <212> ADN <213> Bacillus thuringiensis <400> 166 ggawgkacry tadtaccttg tat 166

Claims

RO 123431 Β1 Revendicări 1 1. Polinucleotidă izolată care codifică o proteină de fuziune care cuprinde o primă 3 secvenţă de aminoacizi care codifică o polipeptidă de aproximativ 45 kDa şi o a doua secvenţă de aminoacizi care codifică o polipeptidă de 15 kDa, în care polipeptidele 5 menţionate sunt toxice pentru dăunătorul, viermele rădăcinilor porumbului, care ingerează respectivele polipeptide, în care secvenţa de nucleotide care codifică prima secvenţă de 7 aminoacizi hibridizează cu complementul unei secvenţe de acizi nucleici selectată dintre SECV. ID. NR. 10, SECV ID Nr. 42 şi SECV. ID NR. 45 şi în care secvenţa de nucleotide 9 care codifică a doua secvenţă de aminoacizi hibridizează, în prezenţa sau absenţa condiţiilor stringente, cu complementul unei secvenţe de acizi nucleici selectate dintre SECV. ID. NR. 11 31, SECV ID Nr. 40 şi SECV. ID NR. 44.
2. Polinucleotidă izolată conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că aceasta 13 codifică o proteină de fuziune care cuprinde o primă secvenţă de aminoacizi care codifică o polipeptidă de aproximativ 45 kDa şi o a doua secvenţă de aminoacizi care codifică o 15 polipeptidă de 15 kDa, în care polipeptidele menţionate sunt toxice pentru dăunătorul, viermele rădăcinilor porumbului, care ingerează respectivele polipeptide, în care secvenţa 17 de nucleotide care codifică prima secvenţă de aminoacizi hibridizează cu complementul unei secvenţe de acizi nucleici selectată dintre SECV. ID. NR. 10, şi în care secvenţa de 19 nucleotide care codifică a doua secvenţă de aminoacizi hibridizează cu complementul unei secvenţe de acid nucleic cu SECV. ID. NR. 31. 21
3. Polinucleotidă conform revendicării 1, în care polinucleotidă menţionată codifică o proteină de fuziune ce cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV. ID. Nr. 159. 23
4. Polinucleotidă conform revendicării 1, care cuprinde un prim segment şi un al doilea segment, în care primul segment care codifică prima secvenţă de aminoacizi şi al 25 doilea segment codifică al doilea segment de aminoacizi şi în care al doilea segment este în poziţie 5’ faţă de primul segment. 27
5. Polinucleotidă conform revendicării 1, în care a doua secvenţă de aminoacizi este la capătul carboxi al respectivei proteine, iar prima secvenţă de aminoacizi este la capătul 29 amino al respectivei proteinei.
6. Proteină de fuziune care cuprinde o primă secvenţă de aminoacizi care este 31 secvenţa unei polipeptide aproximativ 45 kDa şi o a doua secvenţă de aminoacizi este secvenţa unei polipeptide aproximativ 15 kDa, în care polipeptidele menţionate sunt toxice 33 pentru dăunătorul, viermele rădăcinilor porumbului, care ingerează respectivele polipeptide, în care secvenţa de nucleotide care codifică prima secvenţă de aminoacizi hibridizează, în 35 prezenţa condiţiilor stringente, cu complementul unei secvenţe de acizi nucleici selectată dintre SECV. ID. NR. 10, SECV ID Nr. 37, SECV ID Nr. 42 şi SECV. ID NR. 45 şi în care 37 secvenţa de nucleotide care codifică a doua secvenţă de aminoacizi hibridizează, în prezenţa condiţiilor stringente, cu complementul unei secvenţe de acizi nucleici selectate 39 dintre SECV. ID. NR. 31, SECV ID Nr. 35, SECV ID Nr. 40 şi SECV. ID NR. 44.
7. Proteină de fuziune, conform revendicării 6, care cuprinde o primă secvenţă de 41 aminoacizi care este secvenţa unei polipeptide aproximativ 45 kDa şi o a doua secvenţă de aminoacizi este secvenţa unei polipeptide aproximativ 15 kDa, în care polipeptidele 43 menţionate sunt toxice pentru dăunătorul, viermele rădăcinilor porumbului, care ingerează respectivele polipeptide, în care secvenţa de nucleotide care codifică prima secvenţă de 45 aminoacizi hibridizează, în prezenţa condiţiilor stringente, cu complementul unei secvenţe de acid nucleic SECV. ID. NR. 10 şi în care secvenţa de nucleotide care codifică a doua 47 secvenţă de aminoacizi hibridizează, în prezenţa condiţiilor stringente, cu complementul unei secvenţe de acizi nucleici cu SECV. ID. NR. 31. 49 167 RO 123431 Β1
8. Proteină conform revendicării 6, în care proteina de fuziune menţionată cuprinde secvenţa de aminoacizi din SECV. ID. Nr. 159.
9. Proteină conform revendicării 6, care cuprinde un prim segment şi un al doilea segment, în care primul segment care codifică prima secvenţă de aminoacizi şi al doilea 5 segment care codifică al doilea segment de aminoacizi şi în care al doilea segment este în poziţie 5’ faţă de primul segment.
10. Proteină conform revendicării 6, în care a doua secvenţă de aminoacizi este la capătul carboxi al respectivei proteine, iar prima secvenţă de aminoacizi este la capătul 9 amino al respectivei proteinei.
11. Celulă gazdă transgenică care cuprinde polinucleotida definită în revendicarea 11 1, în care respectiva celulă gazdă este selectată din grupul alcătuit dintr-o celulă de plantă şi o celulă bacteriană. 168