MXPA00001151A - Toxinas cry6 de bacillus thuringiensis con actividad mejorada - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a toxinas de B. t. activas contra plagas;más específicamente, la invención se refiere a toxinas Cry6A truncadas;estas toxinas activadas son particularmente efectivas para el control de plagas de coleópteros como el gusano de las raíces del maíz y el gorgojo de la alfalfa;además, la solicitud describe toxinas Cry6A de longitud total, asícomo toxinas Cry6A truncadas optimizadas en plantas y toxinas híbridas entre Cry6A y Cry6B.

Description

TOXINAS CRYG DE BACILLUS THURINGIENSIS CON ACTIVIDAD MEJORADA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los insectos y otras plagas cuestan a los agricultores miles de millones de dólares anualmente en pérdidas de cultivo y a costa de mantener estas plagas bajo control. Las pérdidas causadas por las plagas en ambientes de producción agrícola incluyen disminución en el rendimiento del cultivo, calidad reducida del cultivo y costos de cosecha incrementados. Los coleópteros son un grupo importante de plagas agrícolas que causan una cantidad rrluy grande de daños cada año. Ejemplos de plagas de coleópteros incluyen el gorgojo de la alfalfa y el gusano de la raíz del maíz. El gorgojo de la alfalfa, Hypera postica, y el gorgojo egipcio de la alfalfa estrechamente relacionado, Hypera brunneipennis, son las plagas de insectos más importantes de la alfalfa que se cultiva en los Estados Unidos, con 2.9 millones de acres infestados en 1984. Una suma anual de 20 millones de dólares se gasta para el control de estas plagas. El gorgojo egipcio de la alfalfa es la especie predominante en el sudeste de los Estados Unidos, donde sufre estivación (es decir, hibernación) durante los cálidos meses del verano. En todos los demás respectos, es idéntico al gorgojo de la alfalfa, el cual predomina a lo largo del resto de los Estados Unidos.

La etapa larvaria es la más perjudicial en el ciclo de vida del gorgojo. Alimentándose en los ápices de crecimiento de plantas de alfalfa, las larvas causan esqueletonización de las hojas, achaparramiento, crecimiento reducido de la planta y, finalmente, reducciones en el rendimiento. Varias infestaciones pueden arruinar a una corta entera de heno. Los adultos, también consumidores foliares, causan daño adicional, pero menos significativo. Aproximadamente 9.3 millones de acres del maíz de los Estados Unidos son infestados cada año por el complejo de especies del gusano de la raíz del maíz. El complejo de especies del gusano de la raíz del maíz incluye el gusano de la raíz del norte del maíz, Diabrotica barben, el gusano de la raíz del sur del maíz, D. undecimp?nctata howardi, y el gusano de la raíz del oeste del maíz, D. Virgifera virgifera. Las larvas de estas especies de Diabrotica que habitan en el suelo se alimentan de la raíz de las plantas de maíz, causando alojamiento. El alojamiento reduce finalmente el rendimiento del maíz y con frecuencia da como resultado la muerte de la planta. Alimentándose de las barbas del maíz, los escarabajos adultos reducen la polinización y, por lo tanto, afectan perjudicialmente el rendimiento del maíz por planta. Además, los miembros del género Diabrotica atacan a cultivos de cucurbitáceas (pepinos, melones, calabaza, etc.) y muchos cultivos de hortalizas y del campo en la producción comercial, así como también los que son cultivados en jardines domésticos. El control del gusano de la raíz del maíz se ha logrado parcialmente mediante métodos de cultivo, tales como la rotación de cultivos y la aplicación de altos niveles de fosfato para estimular el crecimiento de un sistema de raíces adventicias. Además, una característica de diapausa emergente de dos años (o invernación) de los gusanos de la raíz del norte del maíz, está interrumpiendo la rotación de cultivos en algunas áreas. Sin embargo, se está dependiendo más intensamente de los insecticidas químicos para garantizar el nivel de control deseado. Los insecticidas son congregados o incorporados en el suelo. El principal problema asociado con el uso de insecticidas químicos es el desarrollo de resistencia entre las poblaciones de insectos tratadas. Insecticidas con un valor de más de 250 millones de dólares se aplican anualmente para el control de los gusanos de la raíz de maíz sólo en los Estados Unidos. Incluso con el uso de insecticidas, los gusanos de la raíz causan más de 750 millones dé dólares en pérdidas de cultivos cada año, haciéndolos la plaga de insectos del maíz más importante en el oeste medio. El daño que causan los nemátodos a las plantas es también un problema económico prevalente y serio. Los nemátodos causan daños serios y extendidos en muchas especies de plantas. Se conocen muchos géneros de nemátodos que causan dicho daño. Los nemátodos fitoparásitos incluyen miembros del Phylum Nematoda, Ordenes Tylenchida y Dorylaimide. En el Orden Tylenchida, los nemátidos fitoparásitos se encuentran en dos superfamilias: Tylenchoidea y Criconematoidea. Existen más de 100,000 especies de nemátodos descritas. Los plaguicidas químicos han provisto un método efectivo de control de plagas; sin embargo, el público se ha interesado sobre la cantidad de compuestos químicos residuales que podrían encontrarse en el agua, agua subterránea y el ambiente. Nuevas restricciones estrictas sobre el uso de plaguicidas y la eliminación de algunos plaguicidas efectivos, forman el mundo mercantil que podría limitar las opciones económicas y efectivas para controlar plagas costosas. De esta manera, existe la necesidad urgente de identificar métodos de control de plagas y composiciones que no sean nocivas para el medio ambiente. Nematicidas que se usan habitualmente para el control de nemátodos fitoparásitos están siendo extraídos rápidamente del mercado en cuando a incremento de seguridad ambiental. En el año 2001 , el bromuro de metilo, un soporte en el control de dichos parásitos, dejará de ser comercializado en los Estados Unidos. Por lo tanto, claramente se necesitan agentes de control menos nocivos. El uso de plaguicidas químicos para el control del gusano de la raíz del maíz y otras plagas de coleópteros, así como también de nemátodos, tiene varios inconvenientes. El uso de plaguicidas con frecuencia produce problemas ambientales tales como contaminación del suelo y de la superficie y de los suministros de agua subterráneos. Trabajar con plaguicidas puede representar también riesgos para las personas que los aplican. El uso regular de plaguicidas químicos para el control de organismos no deseados puede seleccionar para cepas resistentes a los compuestos químicos. La resistencia química ocurre en muchas especies de insectos económicamente importantes, y ha ocurrido también en nemátodos de ovejas, cabras y caballos. El uso regular de toxinas químicas para el control de organismos no deseados puede seleccionar para cepas resistentes a fármacos. Esto ha ocurrido en muchas especies de insectos económicamente importantes, y ha ocurrido también en nemátodos de ovejas, cabras y caballos. Por ejemplo, una metodología aceptada para el control de nemátodos se ha centrado alrededor del fármaco bencimidazol y sus congéneres. El uso de estos fármacos sobre una amplia escala ha conducido a muchos casos de resistencia entre poblaciones de nemátodos (Prichard, R. K. et al. [1980] "The problem of anthelmintic resistance in nematodes", Austr. Vet. J. 56:239-251 ; Coles, G. C. [1986] "Anthelmintic resistance in sheep", en Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice, Vol 2:423-432 [Herd, R. P., eds.] W. B. Saunders, New York). Existen más de 100,000 especies de nemátodos descritas. El desarrollo de resistencia a plaguicidas requiere una investigación continua para nuevos agentes de control que tengan diferentes modos de acción. En la actualidad, existe la necesidad de contar con medios más efectivos para el control de los muchos coleópteros y nemátodos que causan daños considerables a hospederos y cultivos susceptibles. En forma ventajosa, dichos medios efectivos utilizarían agentes biológicos específicos. El microbio del suelo, Bacillus thuringiensis (B. t.), es una bacteria gram positiva formadora de esporas que se caracteriza por inclusiones parasporales de proteína cristalina. Estas inclusiones aparecen con frecuencia microscópicamente como cristales de formas distintas. Las proteínas pueden ser altamente tóxicas para plagas y específicas en su actividad tóxica. Ciertos genes de toxina de B. t. han sido aislados y secuenciados, y se han producido y aprobado para su uso productos de ß. t. a base de ADN recombinante. Además, €$* mediante el uso de técnicas de ingeniería genética, nuevos procedimientos para suministrar estas endotoxinas de B. t. a ambientes agrícolas están bajo 5 desarrollo, incluyendo el uso de plantas manipuladas genéticamente con genes de endotoxina para resistencia a insectos, y el uso de células microbianas intactas estabilizadas como vehículos de suministro de endotoxina de B. t. (Gaertner, F. H., L. Kim [1988] TIBTECH 6:S4-S7). De esta manera, los genes de endotoxina de ß. r. aislados están siendo comercialmente valiosos. 10 Hasta hace poco, el uso comercial de plaguicidas de ß. t. se ha restringido principalmente a una escala amplia de plagas de lepidópteros (orugas). Se han usado preparaciones de las esporas y cristales de ß. thuringiensis subespecie kurstaki durante muchos años como insecticidas comerciales para plagas de lepidópteros. Por ejemplo, HD-1 de B. thuringiensis var. kurstaki produce una endotoxina delta cristalina la cual es tóxica para las larvas de numerosos insectos lepidópteros. Sin embargo, en años recientes, los investigadores han descubierto plaguicidas de ß. t. con carácter específico para una gama de plagas mucho más amplia. Por ejemplo, otras especies de B. t., a saber, israelensis y morrisoni (conocidas también como tenebrionis, conocidas también como M-7 de ß. t., conocidas también como B. t. san diego), se han usado comercialmente para el control de insectos de los Ordenes Díptera y Coleóptera, respectivamente (Gaertner, F. H. [1989] "Cellular Delivery Systems for Insecticidal Proteins: Living and Non-Living Microorganisms", en Controlled Delivery of Crop Protection Agents, R. M. Wilkins, ed., Taylor y Francis, New York and London, 1990, pp. 245-255). Véase también Couch, T. L. (1980) "Mosquito Pathogenicity of Bacillus thuringiensis var. israelensis", Developments in Industrial Microbiology 22:61-76; y Beegle, C. C. (1978), "Use of Entomogenous Bacteria in Agroecosystems", Developments in industrial Microbiology 20:97-104. Krieg, A., A. M. Huger, G. A. Langenbruch, W. Schnetter (1983) Z. ang. Ent. 96:500-508, describe Bacillus thuringiensis var. tenebrionis, la cual se ha reportado es activa contra dos escarabajos del orden Coleóptera. Estos son el escarabajo de la papa de Colorado, Leptinotarsa decemlineata y Agelastica alni. Más recientemente, se han identificado nuevas subespecies de ß. t., y se han aislado los genes responsables de las proteínas de endotoxina-d activa (Hofte, H., H. R. Whiteley [1989] Microbiological Reviews 52(2):242-255). Hófte y Whiteley clasificaron los genes de proteína cristalina de B. t. en cuatro clases principales. Las clases eran Cryl (específica de lepidópteros), Cryll (específica de lepidópteros y dípteros), Crylll (específica de coleópteros) y CrylV (específica de dípteros). Se ha reportado el descubrimiento de cepas específicamente tóxicas para otras plagas (Feitelson, J. S., J. Payne, L. Kim [1992] Bio/Technology 10:271-275). Se propuso a CryV para designar a una clase de genes de toxina que son específicos de nemátodos. Se han identificado ahora otras clases de genes de B. t. La nomenclatura de 1989 y el esquema de clasificación de Hofte y Whiteley para las proteínas cristalinas, se basaron en una secuencia deducida de aminoácidos y el rango de hospederos de la toxina. Dicho sistema fue adaptado para abarcar 14 tipos diferentes de genes de toxina que fueron divididos en cinco clases principales. Conforme se descubrieron más genes de toxina, dicho sistema comenzó a ser inexplotable, ya que se encontró que genes con secuencias similares exhiben un carácter específico insecticida significativamente diferente. El número de genes secuenciados de proteína cristalina de Bacillus thuringiensis es actualmente de aproximadamente 50. Se ha propuesto un esquema de nomenclatura revisado el cual se basa únicamente en la identidad de aminoácidos (Crickmore et al. [1996] Society for Invertebrate Pathology, Vigésimo noveno Encuentro Anual, Tercer Coloquio Internacional sobre Bacillus thuringiensis, Universidad de Córdoba, Córdoba, España, Septiembre 1 a 6, resumen). El mnemóniéo "cry" ha sido retenido para todos los genes de toxina, excepto cytA y cytB, los cuales continúan siendo una clase separada. Los números romanos han sido intercambiados por números arábigos en la clasificación primaria, y se han eliminado los paréntesis en la clasificación terciaria. Muchos de los nombres originales han sido retenidos con las excepciones señaladas, aunque se han vuelto a clasificar varios de ellos. La clonación y expresión de un gen de proteína cristalina de ß. t. en Escherichia coli se ha descrito en la literatura publicada (Schnepf, H. E., H. R. Whiteley (1981 ) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:2893-2897). La patente de E.U.A. 4,448,885 y la patente de E.U.A. 4,467,036 describen la expresión de la proteína cristalina de ß. t. en E. coli. Las patentes de E.U.A. 4,990,332; 5,039,523; 5,126,133; 5,164,180; 5,169,629 y 5,286,485 están entre aquellas patentes que describen toxinas de ß. t. que tienen actividad contra lepidópteros. Las patentes de E.U.A. 4,797,276 y 4,853,331 describen la cepa de ß. thuringiensis tenebrionis la cual se puede usar para el control de plagas de coleópteros en varios ambientes. La patente de E.U.A. No. 4,918, 006 describe toxinas de ß. t. que tienen actividad contra dípteros. Se ha publicado un pequeño número de artículos de investigación sobre los efectos de las endotoxinas-d de las especies de ß. thuringiensis sobre la viabilidad de huevos de nemátodos. Bottjer, Bone y Gilí ([1985] Experimental Parasitology 60:239-244) han reportado que B. t. kurstaki y B. t. israelensis eran tóxicos in vitro a huevos del nemátodo Trichostrongylus colubriformis. Además, otras 28 cepas de ß. t. se pusieron a prueba con toxicidades ampliamente variables. Ignoffo y Dropkin ([1977] J. Kans. Entomol. Soc. 50:394-398) han reportado que la toxina termoestable de Bacillus thuringiensis (exotoxina-ß) era activa contra un nemátodo de vida libre, Panagrellus redivivus (Goodey); un nemátodo fitoparásito, Meloidogyne incógnita (Chitwood); y un nemátodo que se alimenta de hongos, Aphelenchus avena (Bastien). La exotoxina-ß es un agente citotóxico generalizado con poco o ningún carácter específico. Asimismo, Ciordia y Bizzell ([1961] Jour. of Parasitology 47:41 [resumen]) dieron un reporte preliminar sobre los efectos de ß. thuringiensis sobre algunos nemátodos del ganado. La patente de E.U.A. No. 5,151 ,363 y la patente de E.U.A. No. 4,948,734 describen ciertos aislados de B. t. que tienen actividad con ra nemátodos. Otras patentes de E.U.A. que describen actividad contra nemátodos incluyen 5,093,120; 5,236,843; 5,262,399; 5,270,448; 5,281 ,530; 5,322,932; 5,350,577; 5,426,049; y 5,439,881. Como resultado de investigación extensa e inversión de recursos, se han expedido otras patentes para nuevos aislados de ß. r. y nuevos usos de aislados de ß. t. Véase Feitelson et al., citado anteriormente, para una revisión. Sin embargo, el descubrimiento de nuevos aislados de B. t. y nuevos usos de aislados conocidos de B. t, continúa siendo una técnica empírica impredecible. Se conocen ahora algunas toxinas de Bacillus thuringiensis que son activas contra el gusano de la raíz del maíz y otros coleópteros. Por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,849,217 describe varios aislados, incluyendo PS52A1 y PS86A1 , los cuales tienen actividad contra los gorgojos de la alfalfa. La patente de E.U.A. 5,208,017 describe a PS86A1 , que tiene actividad contra el gusano de la raíz del oeste del maíz. Las patentes de E.U.A. Nos. 5,427,786 y 5,186,934 describen cada una aislados y toxinas de B. t. activas contra coleópteros. Descrito específicamente en estas patentes, es el aislado conocido como PS86A1 y una toxina activa contra coleópteros obtenible del mismo, conocida como 86A1. La toxina 86A1 se conoce ahora también como Cry6A (CryVIA). La toxina Cry6A de tipo silvestre es de aproximadamente 54-58 kDa. Se conoce también una toxina CrydB. Esta toxina se puede obtener del aislado PS69D1. Se sabe que las toxinas Cry6A y Cry6B de longitud total tienen actividad contra nemátodos. Las siguientes patentes de E.U.A. describen, en parte, el aislado PS69D1 que tiene actividad contra nemátodos: 4,948,734; 5,093,120; 5,262, 399 y 5,439,881.

Una fórmula genérica para la secuencia de aminoácidos de toxinas CryVI ha sido descrita en el documento WO 92/19739, el cual describe también que la toxina de longitud total tiene actividad contra nemátodos. Los aislados PS52A1 y PS69D1 se describen en dicho documento. Las patentes de E.U.A. Nos. 5,262,159 y 5,468,636 describen también una fórmula genérica para toxinas que tienen actividad contra áfidos. Aunque se sabía que la toxina Cry6A inhibe el crecimiento de ciertos coleópteros, no se sabía anteriormente que esta toxina podría ser activada mediante truncamiento para producir una toxina que es letal para coleópteros, tal como el gusano de la raíz del oeste del maíz. Además, no se sugirió que la toxina CryßA truncada sería activa contra nemátodos. Algunos ejemplos previos de truncamientos para otras toxinas de ß. r. son conocidos en la técnica. Por ejemplo, las toxinas P2 (Cry2) (Nicholles, E. N., W. Ahmad, D. J. Ellar [1989] J. Bact. 171 :5141-5147) existen como proteínas de 61-63 kDa. La proteólisis corta aproximadamente 5 kDa, dejando proteínas de 56-58 kDa. Sin embargo, la toxicidad permaneció sin cambios, o empeoró por un factor de 10. Además, estas proteínas no comparten homología significativa con las toxinas Cry6. Otros artículos que destacan ciertos aspectos de la actividad y/o función de porciones de toxinas de ß. t. incluyen Adang, M. J., M. J. Staver, T. A. Rocheleau et al. (1985) Gene 36:289-300; Wabiko, H., K. C. Raymond, L. A. Bulla, Jr. (1986) DNA 5:305-314 (Medline 863000920); Schnepf, H. E, H. R. Whiteley (1985) J. Biol Chem. 260:6273-6280; patente de E.U.A. No. 5,468,636; patente de E.U.A. No. 5,236,843; y documento EP 0462721.

El uso de truncamiento para obtener toxinas Cry6A activadas como se describe a continuación, es completamente nuevo para la técnica aplicada a B. t.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a materiales y métodos útiles en el control de plagas y, en particular, a plagas de plantas. En forma específica, la presente invención provee nuevas toxinas de ß. t. truncadas útiles para el control de plagas de coleópteros, incluyendo el gusano de la raíz del maíz. La presente invención provee también toxinas útiles para el control de nemátodos. La presente invención provee además secuencias de nucleótidos que codifican para estas toxinas. En una modalidad preferida de la presente invención, se ha encontrado que las formas truncadas de las toxinas cry6A de ß. f. son particularmente activas contra el gusano de la raíz del maíz. Las toxinas truncadas descritas en la presente se pueden usar también para el control de nemátodos. Ejemplificada específicamente en la presente es una toxina cryßA truncada, la cual tiene aminoácidos removidos del N-terminal y el C-terminal, y es de aproximadamente 40-50 kDa. En una modalidad preferida, las toxinas de la presente invención son producidas por genes que codifican para las proteínas truncadas altamente activas. Como se describe en la presente, las toxinas truncadas de la presente invención se pueden obtener también mediante tratamiento de sobrenadantes de cultivo de ß. , y/o desarrollando cultivos de B. t. bajo condiciones apropiadas que resulten en la producción de toxinas activas como resultado de los efectos ventajosos de las proteasas. En forma similar, se puede tratar la proteína expresada por un hospedero recombinante para obtener la toxina truncada. En una modalidad preferida, los genes descritos en la presente que codifican para toxinas plaguicidas se usan para transformar plantas para conferir resistencia a plagas en dichas plantas. Dicha transformación de plantas se puede lograr usando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia, e incluirían típicamente modificación del gen para optimizar la expresión de la toxina truncada en plantas. La preseríte invención se refiere también al uso de toxinas truncadas y genes completos, o parte de los mismos, en la producción de proteínas de fusión y genes de fusión.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO La figura 1 es un aminoácido por comparación de aminoácidos de 86A1 y 69D1.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS SEQ ID NO. 1 es la secuencia de nucleótidos de un gen cryßA de longitud total. SEQ ID NO. 2 es la secuencia de aminoácidos de una toxina Cry6A de longitud total. SEQ ID NO. 3 es una secuencia de genes de longitud total optimizada en plantas para el gen cry6A/86A1. SEQ ID NO. 4 es la secuencia de aminoácidos dé longitud total codificada por SEQ ID NO. 3. SEQ ID NO. 5 es la secuencia del gen truncado R443. SEQ ID NO. 6 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO. 5. SEQ ID NO. 7 es la secuencia del gen R390 truncado optimizada en plantas. SEQ ID NO. 8 es la secuencia de proteína truncada codificada por SEQ ID NO. 7. SEQ ID NO. 9 es la secuencia de nucleótidos de un gen cry6B/69D1 de longitud total. SEQ ID NO. 10 es la secuencia de aminoácidos de una toxina Cry6B/69D1 de longitud total.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a materiales y métodos para el control de plagas. En modalidades específicas, la presente invención pertenece a toxinas de B. t. truncadas que tienen actividad contra plagas de coleópteros. La presente invención provee también toxinas útiles en el control de nemátodos. La presente invención se refiere además a genes novedosos que codifican para estas toxinas plaguicidas. En una modalidad particularmente preferida, los materiales y métodos descritos en la presente se pueden usar en el control del gusano de la raíz del maíz. Aislados útiles de conformidad con la presente invención están disponibles para los expertos en la técnica en virtud de depósitos descritos en varia patentes de E.U.A., incluyendo patentes de E.U.A. No. 5,427,786; 5,186,934; y 5,273,746. Véase también solicitud internacional de PCT número WO 93/04587. El aislado PS86A1 (B-18400 de NRRL, depositado el 16 de agosto de 1988) y microbios MR506, se describen en estas patentes. El aislado PS69D1 (B-18247 de NRRL, depositado el 28 de julio de 1987) ha sido descrito en varias patentes de E.U.A incluyendo: 4,948,734; 5,093,120; 5,262,399 y 5,439,881. El aislado PS86A1 de B. t. produce una toxina de aproximadamente 55 kDa referida como la toxina 86A1 u 86A1 (a). Esta toxina es una toxina Cry6A. El gen que codifica para esta toxina ha sido clonado en el aislado MR506 de Bacillus thuringiensis, el cual expresa también la toxina CryßA.

En una modalidad preferida de la presente invención, la toxina Cry6A de aproximadamente 55 kDa expresada por los aislados PS86A1 y MR506 de ß. t, es truncada para producir una toxina de aproximadamente 45 kDa que tiene alta actividad biológica contra coleópteros. Este tipo de toxina truncada es referido en la presente como la toxina Cry6A truncada. En forma ventajosa, se ha encontrado que esta toxina truncada es particularmente activa contra el gusano de la raíz del maíz. De preferencia, esta toxina truncada tiene aminoácidos removidos del N-terminal y el C-terminal para producir las formas truncadas activas. Sin embargo, toxinas truncadas activadas de conformidad con la presente invención se pueden obtener también removiendo aminoácidos del N-terminal, únicamente, o el C-terminal, únicamente. Como se describe en la presente, la remoción de aminoácidos para producir la forma activa truncada se puede llevar a cabo usando varias técnicas. En una modalidad preferida, el gen es modificado para codificar para la forma truncada activa de la toxina. En forma alternativa, las toxinas truncadas de la presente invención se pueden obtener mediante tratamiento de cultivos de B. t., o desarrollando los cultivos bajo condiciones apropiadas de modo que proteasas endógenas corten la proteína hasta su forma altamente activa. Se encontró que la remoción de porciones del N-terminal y el C-terminal de la toxina 86A1 de 55 kDa da como resultado una activación ventajosa de esta toxina que aumentó la potencia de su actividad. La remoción de aminoácidos se puede lograr mediante tratamiento con tripsina, de preferencia, o con otra enzima apropiada, - o mezclas de enzimas, tales como Pronase, quimotripsina, o proteasas endógenas en caldos de cultivo de B. t. La concentración de tripsina, el tiempo de incubación y la temperatura son condiciones interdependientes, y los expertos en la técnica pueden hacer que varíen para obtener el producto final deseado de la digestión. Otros fragmentos biológicamente activos pueden ser obtenidos por los expertos en la técnica usando las enseñanzas provistas en la presente. Los fragmentos que tengan extremos amino y/o carboxilo similares a los identificados anteriormente, mostrarían también actividad insecticida mejorada. Como lo reconocerían fácilmente los expertos en la técnica que cuentan con el beneficio de esta descripción, los medios específicos usados para desarrollar el cultivo de B. t. se pueden modificar para lograr la activación óptima de la toxina de ß. r. Por ejemplo, la densidad de células se puede modular ajustando o cambiando el medio de cultivo. También, medios que tengan proteasas de la presente se pueden usar para incrementar la activación de las toxinas de ß. t. Las toxinas de B. t. de longitud total de aproximadamente 55 kDa pueden ser expresadas y convertidas entonces a formas altamente activas mediante la adición de reactivos apropiados, y/o desarrollando los cultivos bajo condiciones que den como resultado el truncamiento de las proteínas a través de la acción fortuita de proteasas endógenas. En una modalidad alternativa, la toxina de longitud total puede sufrir otras modificaciones para producir la forma activa de la toxina. El ajuste de la solubilización de la toxina, así como también otras condiciones de reacción tales como el pH, resistencia iónica o potencial redox, se pueden usar para efectuar la modificación deseada de la toxina de longitud total para producir una forma activa. Un hospedero recombinante que se puede usar para obtener la toxina truncada de la presente invención es MR506. La toxina truncada de la presente invención se puede obtener tratando la endotoxína d cristalina de la cepa de MR506 de Bacillus thuringiensis, con una serina proteasa tal como tripsina de bovino a un pH alcalino, y de preferencia en ausencia de ß-mercaptoetanol. La presente invención se refiere también al uso de las toxinas truncadas y genes o partes de los mismos en la producción de proteínas de fusión y genes de fusión.

Genes y toxinas Los genes y toxinas útiles de conformidad con la presente invención incluyen no únicamente las secuencias ejemplificadas específicamente, sino también secuencias más cortas, y variantes, mutantes y proteínas de fusión que retengan la actividad plaguicida característica de las toxinas ejemplificadas en forma específica en la presente. Como se usa en la presente, los términos "variantes" o "variaciones" de genes se refieren a secuencias de nucleótidos que codifican para las mismas toxinas o que codifican para toxinas equivalentes que tengan actividad plaguicida. Como se usa en la presente, el término "toxinas equivalentes" se refiere a toxinas que tienen la misma o esencialmente la misma actividad biológica contra las plagas objetivo como las toxinas ejemplificadas.

Debe ser evidente para los expertos en la técnica que genes que codifican para toxinas activas pueden ser identificados y obtenidos a través de varios medios. Los genes específicos ejemplificados en la presente se pueden obtener de los aislados depositados en un depósito de cultivo como se describió anteriormente. Estos genes, o porciones o variantes de los mismos, se pueden construir también sintéticamente, por ejemplo, mediante el uso de un sintetízador de genes. Se pueden construir fácilmente variaciones de genes usando técnicas estándar para obtener mutaciones de punto. Asimismo, se pueden obtener fragmentos de estos genes usando exonucleasas o endonucleasas comercialmente disponibles de conformidad con procedimientos estándar. Por ejemplo, se pueden usar enzimas tales como ßa/31 o mutagénesis dirigida a sitio para cortar sistemáticamente nucleótidos de los extremos de estos genes. Asimismo, se pueden obtener genes que codifiquen para fragmentos activos usando varias enzimas de restricción. Se pueden usar proteasas para obtener directamente fragmentos activos de estas toxinas. Se pueden derivar toxinas equivalentes y/o genes que codifiquen para estas toxinas equivalentes de aislados de B. t. y/o genotecas de ADN usando las enseñanzas provistas en la presente. Existen numerosos métodos para obtener las toxinas plaguicidas de la presente invención. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos para las toxinas plaguicidas descritas y reclamadas en la presente para identificar y aislar otras toxinas de una mezcla de proteínas. En forma específica, se pueden producir anticuerpos para las porciones de las toxinas que sean más constantes y más distintas de otras toxinas de ß. t. Estos anticuerpos se pueden usar entonces para identificar específicamente toxinas equivalentes con la actividad característica mediante inmunoprecipitación, prueba de ¡nmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) o Western blotting. Anticuerpos para las toxinas descritas en la presente, o para toxinas equivalentes, o fragmentos de estas toxinas, se pueden preparar fácilmente usando procedimientos estándar en esta técnica. Los genes que codifican para estas toxinas se pueden obtener del microorganismo. Los fragmentos y equivalentes que retengan la actividad plaguicida de las toxinas ejemplificas estarían dentro del alcance de la presente invención. También, debido a la redundancia del código genético, varias secuencias de ADN diferentes pueden codificar para las secuencias de aminoácidos descritas en la presente. Está bien dentro de la capacidad del experto en la técnica crear estas secuencias de ADN alternativas que codifiquen para las mismas toxinas o esencialmente las mismas toxinas. Estas secuencias de ADN variante están dentro del alcance de la presente invención. Como se usa en la presente, la referencia a "esencialmente la misma" secuencia se refiere a secuencias que tienen sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de aminoácidos que no afectan materialmente la actividad plaguicida. Los fragmentos que retengan la actividad plaguicida, se incluyen también en esta definición. Un método más para identificar las toxinas y genes de la presente invención es mediante el uso de sondas de oligonucleótidos. Estas sondas son secuencias de nucleótidos detectables. Las sondas proveen un método rápido para identificar los genes que codifican para las toxinas de la presente invención.

Los segmentos de nucleótidos que se usan como sondas de conformidad con la invención se pueden sintetizar usando un sintetizador de ADN o ARN y procedimientos estándar. La sonda tendrá normalmente por lo menos aproximadamente 10 bases, más usualmente por lo menos aproximadamente 18 bases, y puede tener hasta aproximadamente 50 bases o más, usualmente no teniendo más de aproximadamente 200 bases si la sonda se hace en forma sintética. Sin embargo, se pueden utilizar fácilmente sondas más grandes, y dichas sondas pueden ser, por ejemplo, de varios kilobases de longitud. La secuencia de ia sonda está diseñada para ser por lo menos sustancialmente complementaria a un gen que codifica para una toxina de interés. La sonda no necesita tener complementariedad perfecta para la secuencia con la cual híbrida. Las sondas se pueden rnarcar utilizando técnicas que son bien conocidas por los expertos en la materia. Dicho análisis con sonda provee un método rápido para identificar genes de endotoxina insecticida potencialmente valiosos desde el punto de vista comercial dentro de las diversas subespecies de ß. f. Se pueden utilizar varios grados de astringencia de hibridación. Cuanto más astringentes sean las condiciones, mayor será la complementariedad que se requiere para la formación del dúplex. La severidad se puede controlar mediante temperatura, concentración de la sonda, longitud de la sonda, resistencia iónica, tiempo, y similares. De preferencia, la hibridación se lleva a cabo bajo condiciones astringentes mediante técnicas bien conocidas en la materia como se describe, por ejemplo, en Keller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, NY., pp. 169-170. La hibridación de baja astringencia es el método preferido cuando se usa un fragmento de gen más largo. Como se usa en la presente, condiciones "astringentes" para hibridación se refieren a condiciones que permitan lograr el mismo, o aproximadamente el mismo, grado de carácter específico de hibridación que las condiciones utilizadas por los solicitantes actuales. En forma específica, la hibridación de ADN inmovilizado en Southern blots con sondas específicas de genes marcados con 32P, se llevó a cabo mediante métodos estándar (Maniatis, T., E. F. Fritsch, J. Sambrook [1982] Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). En general, la hibridación y los lavados subsecuentes se llevaron a cabo bajo condiciones astringentes que permitieron la detección de secuencias objetivo con homología con los genes de toxina ejemplificados. Para sondas de genes de ADN de doble cadena, la hibridación se llevó a cabo durante la noche de 20 a 25°C abajo de la temperatura de fusión (Tm) del híbrido de ADN en 6X SSPE, 5X solución de Denhardt, SDS a 0.1 % y 0.1 mg/ml de ADN desnaturalizado. La temperatura de fusión se describe mediante la siguiente fórmula (Beltz, G. A., K. A. Jabobs, T. H. Eickbush, P. T. Cherbas y F. C. Kafatos [1983] Methods of Enzymology, R. Wu, L. Grossman y K. Moldave [eds.] Academic Press, New York 100:266-285). Tm= 81.5°C + 16.6 Log [Na+] + 0.41 (% de G + C) - 0.61 (% de formamida) - 600/longitud del dúplex en pares de bases. Los lavados se llevan a cabo típicamente de la manera siguiente: 1 ) Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en 1X SSPE y SDS a 0.1 % (lavado de baja astringencia). 2) Una vez a Tm de -20°C durante 15 minutos en 0.2X SSPE y SDS a 0.1% (lavado de astringencia moderada). Para sondas de oligonucleótidos, la hibridación se llevó a cabo durante la noche de 10 a 20°C abajo de la temperatura de fusión (Tm) del híbrido en 6X SSPE, 5X solución de Denhardt, SDS a 0.1 % y 0.1 mg/ml de ADN desnaturalizado. La Tm para las sondas de oligonucleótidos se puede determinar mediante el método del "vecino más próximo". Véase Breslauer et al., "Predicting DNA dúplex stability from the base sequence", Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 83 (11 ): 3746-3750 (Junio de 1986); Rychlik y Rhoads, "A computer program for choosing optimal oligoriucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA", Nucleic Acids Res., 17 (21 ): 8543-8551 (Nov. 11 de 1989); SantaLucía er al., "Improved nearest-neighbor parameters for predicting DNA dúplex stability", Biochemistry 35 (11 ): 3555-3562 (Marzo 19 de 1996); Doktcz er al., "Optical melting of 128 octamer DNA duplexes. Effeets of base pair location and nearest neighbors on thermal stability", J. Biol. Chem., 270 (15): 8439-8445 (Abril 14 de 1995). En forma alternativa, la Tm se puede determinar mediante la siguiente fórmula: Tm (°C) = 2 (número de pares de bases T/A) + 4 (número de pares de bases G/C) (Suggs, S. V., T. Miyake, E. H. Kawashime, M. J. Johnson, K. Itakura y R. B. Wallace [1981] ICN-UCLA Symp. Dev. Biol. Using Purified Genes, D. D. Brown [ed.], Academic Press, New York, 23:683-693).

Los lavados se llevaron a cabo típicamente de la manera siguiente: 1 ) Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en 1X SSPE y SDS a 0.1 % (lavado de baja astringencia). 2) Una vez a la temperatura de hibridación durante 15 minutos en 1X SSPE y SDS a 0.1 % (lavado de astringencia moderada). Las secuencias de ADN de la presente invención se pueden usar también como iniciadores para amplificación mediante PCR. La reacción en cadena de polimerasa (PCR) es una síntesis repetitiva, enzimática y cebada de una secuencia de ácido nucleico. Este procedimiento es bien conocido y es usado comúnmente por los expertos en la técnica (véase Mullís, patente de E.U.A. Nos. 4,683,195, 4,683,202 y 4,800,159; Saiki, Randall K., Stephen Scharf, Fred Faloona, Kary B Mullís, Glenn T. Horn, Henry A. Erlich, Norman Arnheim [1985] "Enzymatic Amplification of ß-Globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia", Science 230:1350-1354). La PCR se basa en la amplificación enzimática de un fragmento de ADN de interés que es flanqueado por dos oligonucleótidos iniciadores que hibridan con cadenas opuestas de la secuencia objetivo. Los iniciadores se orientan con los extremos 3' señalando uno hacia el otro. Los ciclos repetidos de desnaturalización del molde con calor, unión de los iniciadores a sus secuencias complementarias, y extensión de los iniciadores unidos con una ADN polimerasa, dan como resultado la amplificación del segmento definido por los extremos 5' de los iniciadores de PCR. Puesto que el producto de extensión de cada iniciador puede servir como molde para el otro iniciador, cada ciclo duplica esencialmente la cantidad del fragmento de ADN producido en el ciclo anterior. Esto da como resultado la acumulación exponencial del fragmento objetivo específico, hasta de varios millones de veces en pocas horas. Usando una ADN polimerasa termoestable tal como la Taq polimerasa, la cual es aislada de la bacteria termófila Thermus aquaticus, el proceso de amplificación puede ser automatizado completamente. Se han ejemplificado específicamente en la presente ciertas toxinas de la presente invención. Puesto que estas toxinas son solamente ejemplares de las toxinas de la presente invención, debe ser fácilmente evidente que la presente invención comprende toxinas variantes o equivalentes (y secuencias de nucleótidos que codifican para toxinas equivalentes) que tienen la misma actividad plaguicida o una actividad plaguicida similar a la de la toxina ejemplificada. Las toxirías equivalentes tendrán alta homología de aminoácidos con la toxina ejemplificada. Esta identidad de aminoácidos será típicamente mayor de 60%, de preferencia mayor de 75%, más preferiblemente mayor de 80%, muy preferiblemente mayor de 90%, y puede ser mayor de 95%. Estas identidades son como se determinan usando técnicas de alineación estándar. La homología de aminoácidos será mayor en regiones críticas de la toxina que determinan la actividad biológica o que intervienen en la determinación de la configuración tridimensional que finalmente determina la actividad biológica. A este respecto, ciertas sustituciones de aminoácidos son aceptables y se pueden esperar si estas sustituciones están en regiones que no son críticas para la actividad o son sustituciones conservativas de aminoácidos que no afectan la configuración tridimensional de la molécula. Por ejemplo, los aminoácidos se pueden agrupar en las siguientes clases: no polares, polares sin carga, básicos y ácidos. Las sustituciones conservativas, mediante las cuales un aminoácido de una clase es reemplazado con otro aminoácido del mismo tipo, están dentro del alcance de la presente invención en tanto la sustitución no altere materialmente la actividad biológica del compuesto. El cuadro 1 provee un listado de ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase.

CUADRO 1 Clase de aminoácido Ejemplos de aminoácidos No polar Ala, Val, Leu, lie, Pro, Met, Phe, Trp Polar sin carga Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, GIn Acido Asp, Glu Básipo Lys, Arg, His En algunos casos, también se pueden hacer sustituciones no conservativas. El factor crítico es que estas sustituciones no se deben apartar significativamente de la actividad biológica de la toxina.

Como se usa en la presente, la referencia a polinucleótidos "aislados" y/o "toxinas purificadas" se refiere a estas moléculas cuando no están asociadas con las otras moléculas con las cuales se encontrarían en la naturaleza. De esta manera, la referencia a "aislado y purificado" significa la intervención de la "mano del hombre" como se describe en la presente.

Hospederos recombinantes Los genes que codifican para la toxina de la presente invención pueden ser introducidos en una amplia variedad de microbios o plantas hospederos. La expresión del gen de toxina da como resultado, directa o indirectamente, la producción intracelular y el mantenimiento del plaguicida. Con microbios hospederos adecuados, por ejemplo, Pseudomonas, los microbios pueden ser aplicados al sitio de la plaga, donde proliferarán y serán ingeridos. El resultado es el control de la plaga. En forma alternativa, el microbio que aloja al gen de toxina puede ser tratado bajo condiciones que prolonguen la actividad de la toxina y estabilicen a la célula. La célula tratada, la cual retiene la actividad tóxica, puede ser aplicada entonces al ambiente de la plaga objetivo. En los castos donde el gen de toxina de B. t. es introducido medíante un vector adecuado en un microbio hospedero, y dicho hospedero es aplicado al ambiente en un estado vivo, es esencial que se usen ciertos microbios hospederos. Se seleccionan microorganismos hospederos que se sabe ocupan la "fitósfera" (filoplano, filósfera, rizósfera y/o rizoplano) de uno o más cultivos de interés. Estos microorganismos que se seleccionan para que sean capaces de competir exitosamente en el ambiente particular (el cultivo y otros hábitats de insectos) con los microorganismos de tipo silvestre, proveen un mantenimiento y expresión estables del gen que expresa el polipéptido plaguicida y, deseablemente, proveen protección mejorada del plaguicida ante la degradación e inactivación por el medio ambiente.

Se conoce un gran número de microorganismos que habitan el filoplano (la superficie de las hojas de la planta) y/o la rizósfera (el suelo en torno a las raíces de la planta) de una amplia variedad de cultivos importantes. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. De particular interés son microorganismos tales como bacterias, por ejemplo, géneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilus, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc y Alcaligenes; hongos, particularmente levaduras, por ejemplo, géneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula y Aureobasidium. De particular interés son las especies bacterianas de la fitósfera tales como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluore?cens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium meliloti, Alcaligenes eutrophus y Azotobacter vinlandii; y especies de levaduras de la fitósfera, tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae y Aureobasidium pullulans. De particular interés son los microorganismos pigmentados. Existe un número importante de métodos para introducir un gen de ß. t. que codifique para una toxina en un microorganismo hospedero bajo condiciones que permitan el mantenimiento y la expresión estables del gen. Estos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 5,135,867, la cual se incorpora en la presente como referencia. El control de coleópteros, incluyendo el gusano de la raíz del maíz, así como también de nemátodos, usando los aislados, toxinas y genes de la presente invención, se puede lograr mediante varios métodos conocidos por los expertos en la técnica. Estos métodos incluyen, por ejemplo, la aplicación de aislados de B. t. a las plagas (o su ubicación), la aplicación de microbios recombinantes a las plagas (o sus ubicaciones) y la transformación de plantas con genes que codifiquen para las toxinas plaguicidas de la presente invención. Los microbios recombinantes pueden ser, por ejemplo, ß. t, E. coli o Pseudomonas. Las transformaciones pueden ser llevadas a cabo por los expertos en la técnica Usando técnicas estándar. Los materiales necesarios para estas transformaciones se describen en la presente, o son fácilmente disponibles para el experto en la técnica. También se pueden usar para transformar hospederos genes sintéticos que sean funcionalmente equivalentes a los genes ejemplificados en la presente. Los métodos para la producción de genes sintéticos se pueden encontrar, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 5,380,831.

Tratamiento de las células Como se mencionó anteriormente, se puede tratar a ß. .. o células recombinantes que expresen una toxina de ß. L, para prolongar la actividad de toxina y estabilizar a la célula. La mícrocápsula de plaguicida que se forma comprende la toxina de ß. t. dentro de una estructura celular que ha sido estabilizada, y protegerá a la toxina cuando la microcápsula sea aplicada al medio ambiente de la plaga objetivo. Las células hospederas adecuadas pueden incluir procariontes o eucariontes, siendo normalmente limitadas a las células que no producen sustancias tóxicas para organismos superiores, tales como mamíferos. Sin embargo, se podrían usar organismos que produzcan sustancias tóxicas para organismos superiores, en donde las sustancias tóxicas sean inestables, o el nivel de aplicación sea suficientemente bajo para evitar cualquier posibilidad de toxicidad para un mamífero hospedero. Como hospederos, de interés particular serán los procariontes y los eucariontes inferiores tales como los hongos. La célula 'estará usualmente intacta y sustancialmente en forma proliferativa cuando sea tratada, más que en forma de una espora, aunque en algunos casos se pueden utilizar esporas. El tratamiento de la célula microbiana, por ejemplo, un microbio que contiene al gen de toxina de ß. t., puede ser mediante medios químicos o físicos, o mediante una combinación de medios químicos y/o físicos, en tanto la técnica no afecte negativamente las propiedades de la toxina, ni disminuya la capacidad de la célula para proteger a la toxina. Ejemplos de reactivos químicos son agentes halogenantes, particularmente halógenos de número atómico 17 a 80. Más particularmente, se puede usar yodo bajo condiciones moderadas y durante un tiempo suficiente hasta lograr los resultados deseados. Otras técnicas adecuadas incluyen tratamiento con aldehidos, tal como glutaraldehído; agentes antiinfecciosos tales como cloruro de zefirán y cloruro de cetilpiridinio; alcoholes tales alcohol isopropílíco y etanol; varios fijadores histológicos tales como yodo <". de Lugol, fijador de Bouin, varios ácidos y fijador de Helly (véase: Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967); o 5 una combinación de agentes físicos (calor) y químicos que preserven y prolonguen la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula es administrada al ambiente del hospedero. Ejemplos de medios físicos son radiación de longitud de onda corta tal como radiación gamma y radiación X, congelación, irradiación UV, liofilización, y similares. Métodos para el tratamiento de células microbianas se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 4,695,455 y 4,695,462, las cuales se incorporan en la presente como referencia. Las colillas tendrán generalmente estabilidad estructural incrementada lo cual incrementará la resistencia a las condiciones ambientales. En los casos donde el plaguicida está en una proforma, se debe seleccionar el método de tratamiento de la célula a fin de que el patógeno objetivo no inhiba el procesamiento de la proforma hasta la forma madura del plaguicida. Por ejemplo, el formaldehído entrelazará las proteínas y puede inhibir el procesamiento de la proforma de un polipéptido plaguicida. El método de tratamiento debe retener por lo menos una porción sustancial de la biodisponibilidad o bioactividad de la toxina. Las características de interés particular al seleccionar una célula hospedera para los propósitos de producción, incluyen facilidad para introducir el gen de B. t. en el hospedero, disponibilidad de sistemas de expresión, eficiencia de la expresión, estabilidad del plaguicida en el hospedero, y la presencia de capacidades genéticas auxiliares. Las características de interés para usarse como una microcápsula de plaguicida incluyen capacidades protectoras del plaguicida, tales como paredes celulares gruesas, pigmentación y formación o empacamiento intracelular de cuerpos de inclusión; supervivencia en ambientes acuosos; falta de toxicidad para mamíferos; atracción de las plagas para su ingestión; facilidad de destrucción y fijación sin daño a la toxina; y similares. Otras consideraciones incluyen facilidad de formulación y manejo, economía, estabilidad en almacenamiento, y similares.

Crecimiento de las células El hospedero celular que contiene al gen insecticida de ß. t. se puede desarrollar en cualquier medio nutritivo conveniente, en donde la construcción de ADN provee una ventaja selectiva, proveyendo un medio selectivo de modo que sustancialmente todas las células retengan el gen de ß. t.. Estas células se pueden cosechar entonces de conformidad con medios convencionales. En forma alternativa, las células pueden ser tratadas antes de cosecharlas. Las células de B. t. de la invención se pueden cultivar usando técnicas de fermentación y medios estándar conocidos en la materia. Después del término del ciclo de fermentación, las bacterias pueden ser cosechadas separando primero las esporas y cristales de B. t. del caldo de fermentación mediante medios bien conocidos en la técnica. Las esporas y cristales de ß. t. recuperados se pueden formular en un polvo humectable, concentrado líquido, granulos u otras formulaciones mediante la adición de agentes tensioactivos, dispersantes, vehículos inertes y otros componentes para facilitar el manejo y la aplicación a plagas objetivo particulares. Estas formulaciones y procedimientos de aplicación son bien conocidos en la materia.

Métodos y formulaciones para el control de plagas El control de coleópteros usando las toxinas y los genes de la presente invención se puede lograr mediante varios métodos conocidos por los expertos en la técnica. Estos métodos incluyen, por ejemplo, la aplicación de aislados de B. t. a las plagas (o su ubicación), la aplicación de microbios recombinantes a las plagas (o sus ubicaciones), y la trasformación de plantas con genes que codifiquen para las toxinas plaguicidas de la presente invención. Los microbios recombinantes pueden ser, por ejemplo, ß. t., E. coli o Pseudomonas. Las transformaciones pueden ser llevadas a cabo por los expertos en la técnica usando técnicas estándar. Los materiales necesarios para estas transformaciones se describen en la presente, o están fácilmente disponibles para el experto en la técnica. Se pueden aplicar al suelo granulos de cebo formulados que contengan un atrayente, y esporas y cristales de los aislados de B. t., o microbios recombinantes que comprendan los genes obtenibles de los aislados de ß. t. descritos en la presente. El producto formulado se puede aplicar también como un tratamiento de la raíz o recubrimiento de la semilla o tratamiento total de la planta en etapas posteriores del ciclo de cultivo. Los tratamientos de células de ß. f. de la planta y el suelo se pueden utilizar como polvos humectables, granulos o polvos, mediante mezcla con varios materiales inertes tales como minerales inorgánicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, y similares) o materiales botánicos (mazorcas de maíz pulverizadas, cascarillas de arroz, cascaras de nuez, y similares). Las formulaciones pueden incluir adyuvantes de esparcidor-adhesivo, agentes estabilizantes, otros aditivos de plaguicidas o agentes tensioactivos. Las formulaciones líquidas pueden ser de base acuosa o no acuosa y utilizarse como espumas, geles, suspensiones, concentrados emulsificables, o similares. Los ingredientes pueden incluir agentes reológicos, agentes tensioactivos, emulsificantes, dispersantes o polímeros. Como sería apreciado por el experto en la técnica, la concentración del plaguicida variará ampliamente, dependiendo de la naturaleza de la formulación en particular, particularmente si es un concentrado o si se usará directamente. El plaguicida estará presente en por lo menos 1 % en peso y puede estar a 100% en peso. Las formulaciones secas tendrán aproximadamente 1 a 95% en peso del plaguicida, mientras que las formulaciones líquidas tendrán por lo general aproximadamente de 1 a 60% en peso de los sólidos en la fase líquida. Las formulaciones tendrán generalmente de alrededor de 102 a aproximadamente 104 células/mg. Estas formulaciones se administrarán de aproximadamente 50 mg (en forma líquida o seca) a 1 kg o más por hectárea.

Las formulaciones se pueden aplicar al ambiente de la plaga, por ejemplo, suelo y follaje, mediante aspersión, espolvoreo, salpicadura, o su similar. Todas las patentes de E.U.A. referidas en la presente se incorporan en la misma como referencia. A continuación se dan ejemplos que ilustran los procedimientos para poner en práctica la presente invención. Estos ejemplos no deben ser considerados como limitantes. Todos los porcentajes son en peso, y todas las proporciones de mezcla en solvente son en volumen, a menos que se especifique otra cosa.

' EJEMPL0 1 Cultivo de aislados de B. t.

Se puede usar un subcultivo del aislado de B. t. para inocular el siguiente medio, un medio de peptona, glucosa y sales.

Bacto Peptona 7.5 g/l Glucosa 1.0 g/l KH2P04 3.4 g/l K2HP04 4.35 g/l Solución salina 5.0 ml/l Solución de CaCI2 5.0 ml/l Solución salina (100 ml) MgS04-7H20 2.46 g MnS04 H20 0.04 g ZnS04-7H20 0.28 g FeS04-7H20 0.40 g Solución de CaCI2 (100 ml) CaCI2-2H20 3.66 g pH 7.2 La solución salina y la solución de CaCI2 se esterilizan mediante filtración, y se añaden para ser esterilizadas en autoclave y al caldo cocinado al momento de hacer la' inoculación. Los matraces se incuban a 30°C en un agitador giratorio a 200 rpm durante 64 horas. El procedimiento anterior se puede extrapolar fácilmente a fermentadores grandes mediante procedimientos bien conocidos en la materia. Las esporas y cristales de ß. L, obtenidas en el procedimiento de fermentación anterior, pueden ser aisladas mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Un procedimiento que se usa con frecuencia es someter el caldo de fermentación cosechado a técnicas de separación, por ejemplo, centrifugación.

EJEMPLO 2 Expresión y purificación de la toxina CryßA recombinante de la cepa PS86A1 Se preparó cultivo de partida que consistía de 50 ml de medio LB sometido a autoclave contenido en un matraz de cultivo de 250 ml con con derivación, y se inoculó con 50 µl de PS86A1. El matraz se cerró y se incubó a 30°C sobre un agitador giratorio a 225 rpm durante 4 a 6 horas. Se usaron entonces 5 ml del cultivo de partida para inocular 300 ml de medio de crecimiento sometido a autoclave en un matraz de cultivo de 2 litros con con derivación y con tapones de espuma. El medio de crecimiento es designado como NYS-CAA, y consiste de: Caldo nutritivo (Difco) 3.75 g Triptona 3.75 g Casaminoácidos 6.00 g Extracto de levadura 1.50 g Sales de ß. f. 30 ml La solución de abastecimiento de sales de B. t. consiste de: CaCI2-2H20 10.30 g MgCI2-6H20 20.35 g MnCI2-4H20 1.00 g FeS04-7H20 0.02 g ZnS04-7H20 0.02 g (NH4)2S0 0.02 g HCI (7N) 1.00 ml El cultivo inoculado se desarrolló sobre un agitador giratorio grande a 30°C durante hasta 65 horas o más (hasta que la lisis sea sustancialmente completa). Las partículas se cosecharon mediante centrifugación a 4°C y 8,000 rpm en un rotor GS-3 Sorvall. La pella resultante se lavó tres veces con aproximadamente 5 volúmenes de agua destilada, resuspendiendo el material transformado a pellas y mediante centrifugación como se describió anteriormente. Los cristales de la toxina se purificaron usando centrifugación (100 minutos a 6,500 rpm en un rotor HS-4 Sorval a 4°C) sobre gradientes graduales de bromuro de sodio consistiendo de 15 ml de NaBr a 50%, 7 ml de NaBr a 45% y 7 ml de NaBr a 40%. Los cristales se removieron de los gradientes, se diluyeron aproximadamente 50% con agua destilada, y se concentraron mediante centrifugación a 14,000 rpm a 4°C en un rotor SS-34 Sorvall. La pella de la proteína cristalina se suspendió en una cantidad mínima de agua destilada, se congeló rápidamente en un baño de hielo seco/isopropanol, y se almacenó a - 80°C. El análisis de los productos de este procedimiento mediante SDS-PAGE revela una banda dominante de 54 kDa con tinción de Coomassie. El análisis mediante espectroscopia de masas (tiempo de desorción de vuelo de láser asistido por matriz, MALDITOF) de la proteína detecta un valor máximo dominante a 54,080 daltons. El peso molecular calculado a partir de la secuencia de aminoácidos de la toxina 86A1 intacta es de 54,080 daltons.

EJEMPLO 3 Digestión proteolítica de la toxina CryßA Las proteínas cristalinas obtenidas como se describió anteriormente fueron digeridas proteólíticamente usando tripsina de bovino. La mezcla de digestión contenía base de Tris a 133 mM, urea a 1 M, 5 mg de proteína de toxina 86A1 y 50 µg de tripsina (por ejemplo, tipo XIII de Sigma o grado de secuenciación de Boehringer-Mannheim), en un volumen final de 2.0 ml. La mezcla anterior menos tripsina fue incubada a 37°C durante 15 minutos. La tripsina, como una solución de 1 mg/ml en acetato de sodio a 10 mM, pH 4.5, se añadió entonces y se dejó incubar durante otras dos horas a 37°C. Al término de la incubación, la mezcla de reacción se centrifugó durante 15 minutos en una centrífuga Eppendorf a 4°C. El sobrenadante se removió y se colocó en un Centricon 30 de 2 ml (Amicon), y se lavó tres veces con 2 ml de agua destilada. La muestra lavada se almacenó a 4°C o se congeló rápidamente en un baño de hielo seco/isopropanol, y se almacenó a -80°C.

El análisis de SDS-PAGE de la mezcla de digestión lavada revela una banda dominante con tinción de Coomassie a 45,000 daltons, con bandas menores detectables a 46,000 daltons y aproximadamente 34,000 daltons. MALDI-TOF revela una banda individual a 46,500 daltons. El análisis de la secuencia amino terminal usando degradación automatizada (ABI) Edman de la banda de SDS-PAGE sometida a blotting con una membrana de PVDF, revela una secuencia de 11 aminoácidos que corresponde a la secuencia conocida de la toxina 86A1 de longitud total (SEQ ID NO. 2) partiendo en el residuo de aminoácido número 11. La secuenciación carboxilo terminal automatizada (HP) de la banda de SDS-PAGE principal sometida a blotting con una membrana Zitex, reveló una secuencia que corresponde a la secuencia conocida de la toxina 86A1 que inicia en el residuo de aminoácido 441 , y que termina en el residuo de aminoácido 443 de SEQ ID NO. 2. La masa calculada del fragmento secuenciado (residuos 12-443) es de 48,725 daltons. Esta toxina truncada resultante es referida en la presente como R443, la toxina 86A1 truncada, o la toxina Cry6A truncada. Se determinó que la secuencia de esta toxina es la de SEQ ID No. 6. Véase también SEQ ID NO. 5. Además del método preferido anterior, se puede obtener un resultado similar en ausencia de urea a 1 M. Si se añade ß-mercaptoetanol a 140 mM, en presencia o ausencia de urea a 1 M, el rendimiento del producto es muy reducido. Esto se puede superar, hasta cierto grado, en ausencia de urea, incrementando 10 veces la cantidad de tripsina. Es probable que cualquier regulador de pH que tenga un pH entre 9 a 11 se comporte en forma similar.

EJEMPLO 4 Bioensavo del gusano de la raíz del oeste del maíz Las preparaciones de proteína truncada obtenidas como se describió anteriormente en el ejemplo 3, fueron sometidas a bioensayo contra el gusano de la raíz del oeste del maíz, y se encontró que tienen actividad de toxina significativa. Como se muestra en el cuadro 2, los niveles de actividad obtenidos mediante el uso de la proteína 86A1 truncada exceden inesperadamente los niveles de control obtenidos mediante el uso de la proteína 86A1 de longitud total. (µg/cm2) la prueba la prueba 1 /total 2/total Proteína 475 10/10 6/7 93 86A1 237 7/10 10/10 85 activada 118 6/10 9/11 71 truncada 59 0/10 5/11 23 29 6/16 2/16 25 Proteína 481 1/16 3/13 14 86A1 de 240 3/13 4/12 28 longitud total 120 4/24 1/12 12 60 1/13 0/10 3 30 6/24 2/16 18 Control de 1X 0/8 0/9 0 regulador de 0.5X 1/8 0/11 6 PH 0.25X 3/8 0/11 18 0.12X 0/11 0/10 0 0.06X 6/23 0/12 13 Se determinó la IC50 (µg/cm2) para la proteína 86A1 de longitud original (58 kDa) y para la forma truncada (45 kDa) de la proteína 86A1. Los resultados se dan en el cuadro 3.

CUADRO 3 Proteína Procedimiento Tamaño de la IC50 µg/crp^ proteína 86A1 Purificada solubilizada 58 kDa No letal 86A1 Purificada solubilizada 45 kDa 77 digerida con tripsina EJEMPLO 5 Construcción de genes y proteínas de fusión Se puede construir una proteína de fusión que consista de CryßB y Cry6A que tenga actividad contra el gusano de la raíz del oeste del maíz. Se debe observar que no se sabía anteriormente que la proteína Cry6B/69D1 era útil para el control del gusano de la raíz del maíz. La secuencia de la toxina C/y6B de longitud total obtenible de PS69D1 corresponde a SEQ ID NO. 10. Véase también SEQ ID NO. 9. La fusión consiste de un segmento de gen de CryßB unido a uno de Cry6A, de modo que se mantiene el marco de lectura abierto. Una modalidad consiste en unir a los aminoácidos 1 a 394 de Cry6B con los aminoácidos 386 a 443 de CryßA. Sería preferible hacer un entrecruzamiento entre los genes en un punto en donde exista homología sustancial, puesto que la homología sustancial infiere estructura tridimensional similar y la posibilidad de menos perturbaciones perjudiciales en la estructura tridimensional. La figura 1 es una alineación de Cry?A a CryßB que muestra regiones de homología para los entrecruzamientos. Otros ejemplos posibles de puntos de entrecruzamiento para fusiones de genes se muestran a continuación en el cuadro 2. El cuadro no deberá ser considerado como limitante.

CUADRO 4 Aminoácidos de Cry6B Aminoácidos de CryßA 1-394 386-443 1-248 241-443 1-264, 256-443 1-302 295-443 1-395 387-443 Además, las construcciones pueden ser truncadas en el amino terminal, de modo que puedan estar ausentes los primeros aproximadamente 10 a 25 aminoácidos.

EJEMPLO 6 Inserción de genes de toxina en plantas Un aspecto de la presente invención es la transformación de plantas con los presentes genes que codifican para la toxina insecticida. Las plantas transformadas son resistentes al ataque por la plaga objetivo. En modalidades preferidas, los genes truncados de la presente invención son optimizados para su uso en plantas. SEQ ID NOS. 3 y 4 proveen información de secuencia para las versiones optimizadas en plantas del gen cry6A de longitud total y la toxina. Los genes truncados pueden ser optimizados también para su uso en plantas. Por ejemplo, las secuencias del gen y de la toxina de SEQ ID NOS. 7 y 8, las cuales pueden ser referidas también como R390, son optimizadas para su uso en plantas. Los genes que codifican para toxinas plaguicidas, como se describe en la presente, pueden ser insertados en células vegetales usando varias técnicas que son bien conocidas en la materia. Por ejemplo, existe un gran número de vectores de clonación que comprenden un sistema de replicación en E. coli y un marcador que permite la selección de las células transformadas, para preparación para la inserción de genes introducidos en plantas superiores. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, serie pUC, serie M13mp, pACYC184, etc. Por consiguiente, la secuencia que codifica para la toxina de B. t. puede ser insertada en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante se usa para transformación en E. coli. Las células de E. coli se cultivan en un medio nutritivo adecuado, y entonces son cosechadas y usadas. El plásmido es recuperado. Las técnicas de análisis de secuencia, análisis de restricción, electroforesis y otros métodos bioquímicos y de biología molecular, se llevan a cabo generalmente como métodos de análisis. Después de cada manipulación, la secuencia de ADN usada puede ser cortada y unida a la siguiente secuencia de ADN. Cada secuencia de plásmido puede ser clonada en el mismo plásmido o en otros plásmidos. Dependiendo del método para insertar genes deseados en la planta, pueden ser necesarias otras secuencias de ADN. Si, por ejemplo, el plásmido Tí o R¡ se usa para la transformación de la célula vegetal, entonces por lo menos el borde derecho, pero con frecuencia los bordes derecho e izquierdo del ADN T del plásmido Ti o Ri, tienen que ser unidos como la región de flanqueo de los genes que serán insertados. El uso de ADN T para la transformación de células vegetales, ha sido investigado exhaustivamente y descrito en forma suficiente en el documento EP 120 516; Hoekema (1985) en: The Binary Plant Vector System, Offset-durkkerij Kanters B. V., Alblasserdam capítulo 5; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci. 4:1-46; y An et al. (1985) EMBO J. 4:277-287. Una vez que el ADN insertado ha sido integrado en el genoma, es relativamente estable en el mismo y, como regla, no sale de nuevo. Contiene normalmente un marcador de selección que confiere en las células de la planta transformada resistencia a un biocida o un antibiótico tal como kanamicina, G418, bleomicina, higromicina o clornfenicol, entre otras cosas. El marcador utilizado individualmente debe permitir por lo tanto la selección de células transformadas, más que de células que no contengan el ADN insertado. Existe un gran número de técnicas para insertar ADN en una célula vegetal hospedera. Dichas técnicas incluyen transformación con ADN T usando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación, fusión, inyección, biolística (bombardeo de micropartículas) o electroporación, así como también otros métodos posibles. Si se usan agrobacterias para la transformación, el ADN que será insertado tiene que ser clonado en plásmidos especiales, a saber, en un vector intermedio o en un vector binario. Los vectores intermedios pueden ser integrados en el plásmido Ti o Ri mediante recombinación homologa debido a secuencias que son homologas a las secuencias en el ADN T. El plásmido Ti o Ri comprende también la región vir necesaria para la transferencia del ADN T. Los vectores intermedios no pueden replicarse por sí mismos en agrobacterias. El vector intermedio puede ser transferido en Agrobacterium tumefaciens por medio de un plásmido auxiliar (conjugación). Los vectores binarios pueden replicarse por sí mismos en E. coli y en agrobacterias. Comprenden un gen marcador de selección y un enlazador o polienlazador los cuales' son construidos mediante las regiones de borde derecha e izquierda del ADN T. Pueden ser transformados directamente en las agrobacterias (Holsters et al. [1978] Mol. Gen. Genet. 163:181-187). El Agrobacterium usado como célula hospedera comprenderá un plásmido que posee una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del ADN T en la célula vegetal. Puede estar contenido ADN T adicional. La bacteria transformada de esta manera se usa para la transformación de células vegetales. Se pueden cultivar en forma ventajosa explantes de plantas con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN en la célula vegetal. Se pueden regenerar entonces plantas completas a partir del material vegetal infectado (por ejemplo, piezas de hoja, segmentos de tallo, raíces, pero también protoplastos o células cultivadas en suspensión) en un medio adecuado, el cual puede contener antibióticos o biocidas para selección. Las plantas obtenidas de esta manera se pueden poner a prueba entonces para determinar la presencia del ADN insertado. No se hace demanda especial alguna de los plásmidos en el caso de inyección y electroporación. Es posible usar plásmidos ordinarios tales como, por ejemplo, derivados de pUC. Las células transformadas crecen dentro de las plantas en la forma usual. Pueden formar células germinales y transmitir las características transformadas a las plantas de la progenie. Dichas plantas pueden ser cultivadas en forma normal y cruzadas con plantas que tengan los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes tienen las propiedades fenotípicas correspondientes. En una rríodalidad preferida de la presente invención, las plantas serán transformadas con genes, en donde el uso del codón ha sido optimizado para las plantas. Véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,380,831. Del mismo modo, en forma ventajosa, se usarán plantas que codifiquen para una toxina truncada. La toxina truncada codificará típicamente para aproximadamente 55% a aproximadamente 80% de la toxina de longitud total. Se conocen en la técnica métodos para crear genes sintéticos de ß. t. para su uso en plantas. Debe entenderse que los ejemplos y las modalidades descritos en la presente son únicamente con fines ilustrativos, y que varias modificaciones o cambios a la luz de los mismos serán sugeridos por los expertos en la técnica, y que deberán ser incluidos dentro del espíritu y el alcance de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (40)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una secuencia de polinucleótidos que codifica para una toxina cryßA de Bacillus thuringiensis para el control de coleópteros, caracterizada porque dicha toxina es truncada comparativamente con la toxina de longitud total como es expresada naturalmente.

2.- La secuencia de polinucleótidos de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la toxina es de aproximadamente 40-50 kDa.

3.- La secuencia de polinucleótidos de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la toxina es de aproximadamente 47-48 kDa.

4.- La secuencia de polinucleótidos de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la toxina tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 6.

5.- La secuencia de polinucleótidos de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la toxina tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 8.

6.- Un hospedero recombinante transformado con una secuencia de polinucleótidos de conformidad con la reivindicación 1.

7.- El hospedero recombínante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho hospedero transformado es un microbio.

8.- El hospedero recombinante de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicho microbio se selecciona del grupo que consiste de Escherichia coli y Pseudomonas.

9.- El hospedero recombinante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho hospedero transformado es una planta.

10.- Una secuencia de polinucleótidos que codifica para una toxina que tiene actividad contra insectos coleópteros, caracterizada porque dicha secuencia de polinucleótidos tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 3, o fragmentos de la misma.

11.- Un Vector de transferencia de ADN recombinante que comprende la secuencia de polinucleótídos de conformidad con la reivindicación 10.

12.- Una planta hospedera recombinante transformada con una secuencia de polinucleótidos de conformidad con la reivindicación 10.

13.- Una toxina Cry6A de Bacillus thuringiensis codificada por la secuencia de polinucleótidos de conformidad con la reivindicación 1.

14.- La toxina de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicha toxina truncada es de aproximadamente 40-50 kDa.

15.- La toxina de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicha toxina truncada es de aproximadamente 47-48 kDa.

16.- La toxina de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicha toxina truncada es truncada en el extremo amino terminal comparativamente con la toxina de longitud total.

17.- La toxina de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicha toxina truncada es truncada en el extremo carboxilo terminal comparativamente con la toxina de longitud total.

18.- La toxina de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicha toxina truncada es truncada en los extremos amino y carboxilo terminales comparativamente con la toxina de longitud total.

19.- La toxina de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicha toxina tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 6.

20.- La toxina de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicha toxina tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 8.

21.- La toxina de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque dicha toxina tiene de alrededor de 379 a aproximadamente 450 aminoácidos.

22.- La toxina de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque dicha toxina tiene aproximadamente 432 aminoácidos.

23.- La toxina de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque dicha toxina tiene aproximadamente 380 aminoácidos.

24.- La toxina de conformidad con la reivindicación 13, en donde aproximadamente 10 a 25 aminoácidos son removidos del extremo amino de la toxina de longitud total, y aproximadamente 10 a 100 aminoácidos son removidos del extremo carboxilo, comparativamente con la toxina de longitud total.

25.- Una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una toxina de Bacillus thuringiensis que comprende una porción de toxina N-terminal de Cry6B y una porción de protoxina C-terminal de Cry6A.

26.- La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque dicha secuencia de nucleótidos codifica para una toxina de Bacillus thuringiensis que tiene aproximadamente 443 aminoácidos, en donde dicha toxina comprende una secuencia N-terminal de Cry6B de aproximadamente 394 aminoácidos, y en donde la secuencia de aminoácidos del extremo de dicha secuencia N-terminal central respecto del C-terminal de la toxina quimérica, es una secuencia de Cry6A.

27.- La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque dicha secuencia de nucieótidos codifica para una toxina de Bacillus thuringiensis, en donde dicha secuencia N-terminal comprende aproximadamente los primeros 394 aminoácidos de una toxina de Cry6B, y en donde dicha porción C-terminal comprende los aminoácidos 386 a 443 de una toxina Cry6A.

28.- La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque dicha secuencia de nucleótidos codifica para una toxina de Bacillus thuringiensis, en donde la transición de la secuencia de Cry6B a la secuencia de Cry6A ocurre después del aminoácido 248 y antes del aminoácido 241 de la secuencia de aminoácidos de Cry6A.

29.- Un vector de transferencia de ADN recombinante que comprende una molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 25.

30.- Un hospedero recombinante transformado con una molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 25.

31. -Una toxina quimérica substancialmente pura de Bacillus thuringiensis codificada por el ADN de conformidad con la reivindicación 25.

32.- La toxina quimérica de B. t. de conformidad con la reivindicación 31 que tiene aproximadamente 443 aminoácidos, caracterizada además porque dicha toxina comprende una secuencia N-terminal de Cry6B de aproximadamente 394 aminoácidos, y en donde la secuencia de aminoácidos desde el extremo de dicha secuencia N-terminal central hasta el C-terminal de la toxina quimérica, es una secuencia de Cry6A.

33.- La toxina quimérica de ß. t. de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque dicha secuencia N-terminal comprende aproximadamente los primeros 394 aminoácidos de una toxina Cry6B, y en donde dicha porción C-terminal comprende los aminoácidos 386 a 443 de una toxina Cry6A.

34.- La toxina quimérica de B. t. de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque la transición de la secuencia de Cry6B a la secuencia de Cry6A ocurre después del aminoácido 248, y antes del aminoácido 241 de la secuencia de aminoácidos de Cry6A.

35.- Células tratadas sustancialmente intactas que contienen una toxina intracelular, cuya toxina es el resultado de la expresión de un gen de Bacillus thuringiensis que codifica para una toxina activa contra plagas de coleópteros, en donde dicha toxina es codificada por una molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dichas células son tratadas bajo condiciones que prolongan la actividad insecticida cuando dichas células se aplican al ambiente de un insecto objetivo.

36.- Las células de conformidad con la reivindicación 35, en donde las células son tratadas mediante medios químicos o físicos para prolongar la actividad insecticida en el ambiente.

37.- Un método para el control de coleópteros, caracterizado porque comprende poner en contacto dichos coleópteros con una toxina codificada por el ADN de conformidad con la reivindicación 1.

38.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque comprende poner en contacto dichos coleópteros con una toxina Cry6A de Bacillus thuringiensis, en donde dicha toxina es de aproximadamente 40-50 kDa.

39.- Un procedimiento para el control de plagas de coleópteros, caracterizado porque comprende poner en contacto dicha plaga con una cantidad efectiva para el control de coleópteros, de una toxina codificada por el ADN de conformidad con la reivindicación 25.

40.- El procedimiento para el control de plagas de coleópteros, caracterizado además porque comprende poner en contacto dicha planta con una toxina codificada por una secuencia de polinucleótidos de conformidad con la reivindicación 10. LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL (i) INFORMACIÓN DEL SOLICITANTE. Nombre(s) del Solicitante: MYCOGEN CORPORATION Dirección: 5501 Oberlin Drive Ciudad: San Diego Estado/Provincia: California País: Estados Unidos Código Postal/Zip: 92121 Número Telefónico: (619)453-8030 Número fax: / (619)453-6991 Número de telex: (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN Toxinas cryQ de Bacillus thunngiensis con actividad mejorada (iii) NUMERO DE SECUENCIAS 0 (iv) DIRECCIÓN POSTAL (A) DIRIGIDO A: Saliwanchik, Lloyd & Saliwanchik (B) CALLE: 2421 N. W. 41 st Street, Suite A-1 (C) CIUDAD: Gainesville (D) ESTADO: Florida (E) PAÍS: Estados Unidos de América (F) ZIP: 32606 v) FORMA DE LECTURA PARA COMPUTADORA A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible B) COMPUTADORA: IMB PC compatible C) SISTEMA OPERADOR: PC-DOS/MS-DOS D) SOFTWARE: Patentln vi) INFORMACIÓN DE SOLICITUD ACTUAL A) NUMERO DE SOLICITUD: US B) FECHA DE PRESENTACIÓN: C) CLASIFICACIÓN: viii) INFORMACIÓN DE APODERADO / AGENTE A) NOMBRE: Sanders, Jay M. B) NUMERO DE REGRISTO: 39,355 C) NUMERO DE REFERENCIA / CASO: MA-702 ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES A) TELEFONO: (352) 375-8100 B) TELEFAX: (352) 372-5800 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ.ID.NO: 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 1425 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTOSIDAD: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA; ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (iv) FUENTE ORIGINAL (A) ORGANISMO: Bacillus thuringiensis (C) AISLADO INDIVIDUAL: PS86A1 (vii) FUENTE INMEDIATA (A) GENOTECA: E. coli NM522 [pMYC2320] (ix) CARACTERÍSTICA (A) NOMBRE / CLAVE; mat_?éptido (B) UBICACIÓN: 1. 1425 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ.ID.NO: 1 : ATGATTATTG ATAGTAAAAC GACTTTACCT AGACATTCAC TTATTCATAC AATTAAATTA 60 AATTCTAATA AGAAATATGG TCCTGGTGAT ATGACTAATG GAAATCAATT TATTATTTCA 120 AAACAAGAAT GGGCTACGAT TGGAGCATAT ATTCAGACTG GATTAGGTTT ACCAGTAAAT 180 GAACAACAAT TAAGAACACA TGTTAATTTA AGTCAGGATA TATCAATACC TAGTGATTTT 240 TCTCAATTAT ATGATGTTTA TTGTTCTGAT AAAACTTCAG CAGAATGGTG GAATAAAAAT 300 TTATATCCTT TAATTATTAA ATCTGCTAAT GATATTGCTT CATATGGTTT TAAAGTTGCT 360 GGTGATCCTT CTATTAAGAA AGATGGATAT TTTAAAAAAT TGCAAGATGA ATTAGATAAT 420 ATTGTTGATA ATAATTCCGA TGATGATGCA ATAGCTAAAG CTATTAAAGA TTTTAAAGCG 480 CGATGTGGTA TTTTAATTAA AGAAGCTAAA CAATATGAAG AAGCTGCAAA AAATATTGTA 540 ACATCTTTAG ATCAATTTTT ACATGGTGAT CAGAAAAAAT TAGAAGGTGT TATCAATATT 600 CAAAAACGTT TAAAAGAAGT TCAAACAGCT CTTAATCAAG CCCATGGGGA AAGTAGTCCA 660 GCTCATAAAG AGTTATTAGA AAAAGTAAAA AATTTAAAAA CAACATTAGA AAGGACTATT 720 AAAGCTGAAC AAGATTTAGA GAAAAAAGTA GAATATAGTT TTCTATTAGG ACCATTGTTA 780 GGATTTGTTG TTTATGAAAT TCTTGAAAAT ACTGCTGTTC AGCATATAAA AAATCAAATT 840 GATGAGATAA AGAAACAATT AGATTCTGCT CAGCATGATT TGGATAGAGA TGTTAAAATT 900 ATAGGAATGT TAAATAGTAT TAATACAGAT ATTGATAATT TATATAGTCA AGGACAAGAA 960 GCAATTAAAG TTTTCCAAAA GTTACAAGGT ATTTGGGCTA CTATTGGAGC TCAAATAGAA 1020 AATCTTAGAA CAACGTCGTT ACAAGAAGTT CAAGATTCTG ATGATGCTGA TGAGATACAA 1080 ATTGAACTTG AGGACGCTTC TGATGCTTGG TTAGTTGTGG CTCAAGAAGC TCGTGATTTT 1140 ACACTAAATG CTTATTCAAC TAATAGTAGA CAAAATTTAC CGATTAATGT TATATCAGAT 1200 TCATGTAATT GTTCAACAAC AAATATGACA TCAAATCAAT ACAGTAATCC AACAACAAAT 1260 ATGACATCAA ATCAATATAT GATTTCACAT GAATATACAA GTTTACCAAA TAATTTTATG 1320 TTATCAAGAA ATAGTAATTT AGAATATAAA TGTCCTGAAA ATAATTTTAT GATATATTGG 1380 TATAATAATT CGGATTGGTA TAATAATTCG GATTGGTATA ATAAT 1425 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 475 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGÍA: lineal (iii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICO: Sl (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Bacillus thuringiensis (C) AISLADO INDIVIDUAL PS86A1 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE / CLAVE: Proteína (B) UBICACIÓN: 1 .475 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: Met He He Asp Ser Lys Thr Thr Leu Pro Arg His Ser Leu He His 1 5 10 15 Thr He Lys Leu Asn Ser Asn Lys Lys Tyr Gly Pro Gly Asp Met Thr 20 25 30 Asn Gly Asn Gln Phe He He Ser Lys Gln Glu Trp Ala 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Leu Leu Gly Phe Val Val Tyr Glu lie Leu Glu Asn Thr Ala 260 265 270 Val Gln His lie Lys Asn Gln He Asp Glu He Lys Lys Gln Leu Asp 275 280 285 Ser Ala Gln His Asp Leu Asp Arg Asp Val Lys He He Gly Met Leu 290 295 300 Asn Ser He Asn Thr Asp He Asp Asn Leu Tyr Ser Gln Gly Gln Glu 305 310 315 320 Ala He Lys Val Phe Gln Lys Leu Gln Gly He Trp Ala Thr He Gly 325 330 335 Ala Gln He Glu Asn Leu Arg Thr Thr Ser Leu Gln Glu Val Gln Asp 340 345 350 Ser Asp Asp Ala Asp Glu He Gln He Glu Leu Glu Asp Ala Ser Asp 355 360 365 Ala Trp Leu Val Val Ala Gln Glu Ala Arg Asp Phe Thr Leu Asn Ala 370 375 ' 380 Tyr Ser Thr Asn Ser Arg Gln Asn Leu Pro He Asn Val He Ser Asp 385 390 395 400 Ser Cys Asn Cys Ser Thr Thr Asn Met Thr Ser Asn Gln Tyr Ser Asn 405 410 415 Pro Thr Thr Asn Met Thr Ser Asn Gln Tyr Met He Ser Hís Glu Tyr 420 425 430 Thr Ser Leu Pro Asn Asn Phe Met Leu Ser Arg Asn Ser Asn Leu Glu 435 440 445 Tyr Lys Cys Pro Glu Asn Asn Phe Met lie Tyr Trp Tyr Asn Asn Ser 450 455 460 Asp Trp Tyr Asn Asn Ser Asp Trp Tyr Asn Asn 465 470 475 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1428 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTOSIDAD: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: ATGGTCATTG ACAGCAAGAC GACTCTACCA CGGCACTCAC TGATTCACAC AATCAAGCTG 60 AACTCTAACA AGAAGTATGG TCCTGGCGAT ATGACTAACG GGAACCAGTT CATCATATCC 120 AAGCAAGAAT GGGCCACGAT TGGCGCATAC ATTCAGACTG GACTCGGCTT ACCAGTGAAT180 GAGCAACAGC TGAGAACCCA CGTTAACCTT AGTCAAGACA TCAGCATACC ATCTGACTTT 240 TCTCAACTCT ACGATGTGTA TTGTTCTGAC AAGACTAGTG CAGAATGGTG GAACAAGAAT 300 CTCTATCCTT TGATCATCAA GTCTGCCAAT GACATTGCTT CATATGGTTT CAAAGTTGCT 360 GGTGATCCTT CGATCAAGAA AGATGGTTAC TTCAAGAAGC TTCAAGATGA ACTCGACAAC 420 ATTGTTGACA ACAACTCCGA CGACGATGCG ATAGCCAAAG CCATCAAGGA CTTCAAAGCA 480 AGATGTGGCA TTCTCATCAA GGAAGCCAAG CAGTATGAAG AAGCTGCCAA GAACATTGTA 540 ACATCATTGG ATCAGTTTCT CCATGGAGAC CAGAAGAAGC TCGAGGGTGT CATCAACATT 600 CAGAAACGTC TGAAAGAGGT TCAAACAGCT CTGAATCAAG CCCATGGGGA ATCCAGTCCA660 GCTCACAAAG AGCTTCTTGA GAAAGTGAAG AACTTGAAGA CCACACTTGA GAGGACCATC 720 AAAGCTGAAC AAGACTTGGA GAAGAAAGTA GAGTACAGCT TTCTACTTGG ACCCTTGTTA 780 GGCTTTGTTG TCTACGAGAT TCTTGAGAAC ACTGCTGTTC AACACATCAA GAATCAAATC 840 GATGAGATCA AGAAACAG T GGATTCTGCG CAACATGACT TGGATCGCGA TGTGAAGATC 900 ATTGGAATGC TCAACAGCAT CAACACTGAC ATTGACAACT TGTATAGTCA AGGACAAGAA 960 GCAATCAAAG TCTTTCAGAA GCTACAAGGG ATATGGGCCA CTATTGGAGC TCAGATAGAG 1020 AATCTTCGCA CCACGTCCCT TCAAGAAGTC CAAGACTCTG ATGATGCTGA TGAGATACAG 1080 ATTGAACTTG AGGACGCATC TGATGCATGG TTAGTTGTGG CTCAAGAAGC TCGTGACTTC 1140 ACACTGAATG CCTACTCAAC CAACAGTCGA CAGAATCTCC CGATCAATGT GATCTCAGAT 1200 TCATGCAATT GCTCCACCAC CAACATGACA TCCAATCAGT ACAGCAATCC AACAACCAAC 1260 ATGACTAGCA ATCAGTACAT GATTAGCCAT GAGTATACCA GCTTGCCCAA CAACTTCATG 1320 TTGTCAAGGA ATTCGAACCT GGAGTACAAG TGCCCTGAGA ACAACTTCAT GATCTACTGG 1380 TACAACAACT CCGATTGGTA CAACAATTCG GATTGGTACA ACAATTAA 1428 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 475 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTOSIDAD: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: Met Val He Asp Ser Lys Thr Thr Leu Pro Arg His Ser Leu He His 1 5 10 15 Thr He Lys Leu Asn Ser Asn Lys Lys Tyr Gly Pro Gly Asp Met Thr 20 25 30 Asn Gly Asn Gln Phe He He Ser Lys Gln Glu Trp Ala Thr He Gly 35 40 45 Ala Tyr He Gln Thr Gly Leu Gly Leu Pro Val Asn Glu Gln Gln Leu 50 55 60 Arg Thr His Val Asn Leu Ser Gln Asp lie Ser He Pro Ser Asp Phe 65 70 75 80 Ser Gln Leu Tyr Asp Val Tyr Cys Ser Asp Lys Thr Ser Ala Glu Trp 85 90 95 Trp Asn Lys Asn Leu Tyr Pro Leu He He Lys Ser Ala Asn Asp He 100 105 110 Ala Ser Tyr Gly Phe Lys Val Ala Gly Asp Pro Ser He Lys Lys Asp 115 120 125 Gly Tyr Phe Lys Lys Leu Gln Asp Glu Leu Asp Asn He Val Asp Asn 130 135 140 Asn Ser Asp Asp Asp Ala He Ala Lys Ala He Lys Asp Phe Lys Ala 145 150 155 160 Arg Cys Gly He Leu He Lys Glu Ala Lys 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ACTAGTGCAG AATGGTGGAA CAAGAATCTC TATCCTTTGA TCATCAAGTC TGCCAATGAC 300 ATTGCTTCAT ATGGTTTCAA AGTTGCTGGT GATCCTTCGA TCAAGAAAGA TGGTTACTTC 360 AAGAAGCTTC AAGATGAACT CGACAACATT GTTGACAACA ACTCCGACGA CGATGCGATA 420 GCCAAAGCCA TCAAGGACTT CAAAGCAAGA TGTGGCATTC TCATCAAGGA AGCCAAGCAG480 TATGAAGAAG CTGCCAAGAA CATTGTAACA TCATTGGATC AGTTTCTCCA TGGAGACCAG 540 AAGAAGCTCG AGGGTGTCAT CAACATTCAG AAACGTCTGA AAGAGGTTCA AACAGCTCTG 600 AATCAAGCCC ATGGGGAATC CAGTCCAGCT CACAAAGAGC TTCTTGAGAA AGTGAAGAAC660 TTGAAGACCA CACTTGAGAG GACCATCAAA GCTGAACAAG ACTTGGAGAA GAAAGTAGAG720 TACAGCTTTC TACTTGGACC CTTGTTAGGC TTTGTTGTCT ACGAGATTCT TGAGAACACT 780 GCTGTTCAAC ACATCAAGAA TCAAATCGAT GAGATCAAGA AACAGTTGGA TTCTGCGCAA 840 CATGACTTGG ATCGCGATGT GAAGATCATT GGAATGCTCA ACAGCATCAA CACTGACATT 900 GACAACTTGT ATAGTCAAGG ACAAGAAGCA ATCAAAGTCT TTCAGAAGCT ACAAGGGATA 960 TGGGCCACTA TTGGAGCTCA GATAGAGAAT CTTCGCACCA CGTCCCTTCA AGAAGTCCAA 1020 GACTCTGATG ATGCTGATGA GATACAGATT GAACTTGAGG ACGCATCTGA TGCATGGTTA 1080 GTTGTGGCTC AAGAAGCTCG 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He Lys Lys Asp Gly Tyr Phe Lys Lys Leu Gln Asp Glu Leu Asp 115 120 125 Asn lie Val Asp Asn Asn Ser Asp Asp Asp Ala He Ala Lys Ala He 130 135 140 Lys Asp Phe Lys Ala Arg Cys Gly He Leu He Lys Glu Ala Lys Gln 145 150 155 160 Tyr Glu Glu Ala Ala Lys Asn He Val Thr Ser Leu Asp Gln Phe Leu 165 170 175 His Gly Asp Gln Lys Lys Leu Glu Gly Val He Asn He Gln Lys Arg 180 185 190 Leu Lys Glu Val Gln Thr Ala Leu Asn Gln Ala His Gly Glu Ser Ser 195 200 205 Pro Ala His Lys Glu Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Leu Lys Thr Thr 210 215 220 Leu Glu Arg Thr He Lys Ala Glu Gln Asp Leu Glu Lys Lys Val Glu 225 230 235 240 Tyr Ser Phe Leu Leu Gly Pro Leu Leu Gly Phe Val Val Tyr Glu He 245 250 255 Leu Glu Asn Thr Ala Val Gln His He Lys Asn Gln He Asp Glu He 260 265 270 Lys Lys Gln Leu Asp Ser Ala Gln His Asp Leu Asp Arg Asp Val Lys 275 280 285 He He Gly Met Leu Asn Ser He Asn Thr Asp He Asp Asn Leu Tyr 290 295 300 Ser Gln Gly Gln Glu Ala He Lys Val Phe Gln Lys Leu Gln Gly He 305 310 315 320 Trp Ala Thr He Gly Ala 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140 Lys Asp Phe Lys Ala Arg Cys Gly He Leu He Lys Glu Ala Lys Gln 145 150 155 160 Tyr Glu Glu Ala Ala Lys Asn lie Val Thr Ser Leu Asp Gln Phe Leu 165 170 175 His Gly Asp Gln Lys Lys Leu Glu Gly Val He Asn He Gln Lys Arg 180 185 190 Leu Lys Glu Val Gln Thr Ala Leu Asn Gln Ala His Gly Glu Ser Ser 195 200 205 Pro Ala His Lys Glu Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Leu Lys Thr Thr 210 215 220 Leu Glu Arg Thr He Lys Ala Glu Gln Asp Leu Glu Lys Lys Val Glu 225 230 235 240 Tyr Ser Phe Leu Leu Gly Pro Leu Leu Gly Phe Val Val Tyr Glu He 245 250 255 Leu Glu Asn Thr Ala Val Gln His He Lys Asn Gln He Asp Glu He 260 265 270 Lys Lys Gln Leu Asp Ser Ala Gln His Asp Leu Asp Arg Asp Val Lys 275 280 285 lie He Gly Met Leu Asn Ser He Asn Thr Asp He Asp Asn Leu Tyr 290 295 300 Ser Gln Gly Gln Glu Ala He Lys Val Phe Gln Lys Leu Gln Gly He 305 310 315 320 Trp Ala Thr He Gly Ala Gln He Glu Asn Leu Arg Thr Thr Ser Leu 325 330 335 Gln Glu Val Gln Asp Ser Asp Asp Ala Asp Glu He Gln He Glu Leu 340 345 350 Glu Asp Ala Ser Asp Ala Trp Leu Val Val Ala Gln Glu Ala Arg Asp 355 360 365 Phe Thr Leu Asn Ala Tyr Ser Thr Asn Ser Arg Met 370 375 380 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1185 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTOSIDAD: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (gen?mico) (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Bacillus thuringiensis (C) AISLADO INDIVIDUAL: PS69D1 (vii) FUENTE INMEDIATA (B) CLON: E. coli NM522 [pMYC2317] NRRL B-18816 (ix) CARACTERÍSTICA (A) NOMBRE / CLAVE: mat_péptido (B) UBICACIÓN: 1...1185 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9: ATGATTTTAG GGAATGGAAA GACTTTACCA AAGCATATAA GATTAGCTCA TA I I I I I GCA 60 ACACAGAATT CTTCAGCTAA GAAAGACAAT CCTCTTGGAC CAGAGGGGAT GGTTACTAAA 120 GACGGTTTTA TAATCTCTAA GGAAGAATGG GCATTTGTGC AGGCCTATGT GACTACAGGC 180 ACTGGTTTAC CTATCAATGA CGATGAGATG CGTAGACATG TTGGGTTACC ATCACGCATT 240 CAAATTCCTG ATGATTTTAA TCAATTATAT AAGGTTTATA ATGAAGATAA ACATTTATGC 300 AGTTGGTGGA ATGGTTTCTT GTTTCCATTA GTTCTTAAAA CAGCTAATGA TATTTCCGCT 360 TACGGATTTA AATGTGCTGG AAAGGGTGCC ACTAAAGGAT ATTATGAGGT CATGCAAGAC 420 GATGTAGAAA ATATTTCAGA TAATGGTTAT GATAAAGTTG CACAAGAAAA AGCACATAAG 480 GATCTGCAGG CGCGTTGTAA AATCCTTATT AAGGAGGCTG ATCAATATAA AGCTGCAGCG 540 GATGATGTTT CAAAACATTT AAACACATTT CTTAAAGGCG GTCAAGATTC AGATGGCAAT 600 GATGTTATTG GCGTAGAGGC TGTTCAAGTA CAACTAGCAC AAGTAAAAGA TAATCTTGAT 660 GGCCTATATG GCGACAAAAG CCCAAGACAT GAAGAGTTAC TAAAGAAAGT AGACGACCTG720 AAAAAAGAGT TGGAAGCTGC TATTAAAGCA GAGAATGAAT TAGAAAAGAA AGTGAAAATG 780 AGTTTTGCTT TAGGACCATT ACTTGGATTT GTTGTATATG AAATCTTAGA GCTAACTGCG 840 GTCAAAAGTA TACACAAGAA AGTTGAGGCA CTACAAGCCG AGCTTGACAC TGCTAATGAT 900 GAACTCGACA GAGATGTAAA AATCTTAGGA ATGATGAATA GCATTGACAC TGATATTGAC 960 AACATGTTAG AGCAAGGTGA GCAAGCTCTT GTTGTATTTA GAAAAATTGC AGGCATTTGG 1020 AGTGTTATAA GTCTTAATAT CGGCAATCTT CGAGAAACAT CTTTAAAAGA GATAGAAGAA 1080 GAAAATGATG ACGATGCACT GTATATTGAG CTTGGTGATG CCGCTGGTCA 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