CN112608866B - 巨大芽孢杆菌及其活化方法、泡菜制作方法及泡菜 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于泡菜发酵剂的巨大芽孢杆菌，所述巨大芽孢杆菌从四川传统发酵泡菜中分离出来，经分子生物学、系统进化分析和形态学分析鉴定为巨大芽孢杆菌，命名为B.megaterium L222，其16S rRNA序列已存入NCBI数据库，GenBank登录号为MN749506。该菌种于2020年11月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，详细地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC M 2020775，分类命名为Bacillus megaterium L222。该芽孢杆菌活性较好且生长较快，能用于泡菜发酵。在整个泡菜发酵过程中泡菜中，亚硝酸盐含量始终低于2mg/kg，经药敏实验巨大芽孢杆菌菌株对于绝大多数抗生素高度敏感，对少数抗生素中度敏感且无耐药性抗生素。

Description

巨大芽孢杆菌及其活化方法、泡菜制作方法及泡菜
技术领域
本发明涉及食品中的泡菜领域，具体为：提供一种巨大芽孢杆菌作为泡菜发酵剂并应用于制作低亚硝酸盐泡菜的方法。
背景技术
泡菜是以新鲜蔬菜等为主要原料，添加或不添加辅料，经食用盐或食用盐水泡渍发酵，调味或不调味等工艺加工而成的蔬菜制品。泡菜不仅能够提高人们的食欲，还能在发酵的过程中产生对人体有益的乳酸菌，抑制肠道中腐败菌的生长，促进人体的消化作用。
但是，泡菜在腌制过程中会产生对人体健康不利的亚硝酸盐，他们主要来自于蔬菜中含量较高的硝酸盐。蔬菜吸收氮肥或土壤中的氮素，积累无毒的硝酸盐，在腌制过程中硝酸盐被一些亚硝酸盐还原细菌转变成亚硝酸盐，从而产生毒性。泡菜中亚硝酸盐的危害主要有：(1)亚硝酸盐进入血液后可与血红蛋白结合，使氧合血红蛋白变为高铁血红蛋白，从而失去携氧能力，导致组织缺氧；(2)亚硝酸盐极易与胺合成N-亚硝胺，亚硝胺是一种致癌物质。因此在泡菜的腌制过程中如果产生过多亚硝酸盐会不利于人们的健康，存在食品安全问题。所以找到一种有效降低泡菜中亚硝酸盐含量的方法至关重要。
伴随着现代生物技术的发展进步，自然发酵逐渐向现代纯种发酵转变已是趋势，纯种接种发酵的方式可以弥补自然发酵的诸多不足，如缩短发酵周期、确保产品一致性、提高食品安全性等等。
因此，在人们物质生活质量逐渐提高，对食品安全问题越来越重视的背景下，本领域需要提供一种泡菜发酵剂的菌种，以利用其接种至泡菜卤水中有效降低泡菜发酵过程中产生的亚硝酸盐含量，改善泡菜色泽和风味，缩短发酵时间，提高泡菜食用的安全性。
发明内容
本发明提供了一种巨大芽孢杆菌及其活化方法、泡菜制作方法及泡菜，以解决至少一个上述技术问题。
为解决上述问题，作为本发明的一个方面，提供了一种用于泡菜发酵剂的巨大芽孢杆菌，所述巨大芽孢杆菌从四川传统发酵泡菜中分离出来，经分子生物学、系统进化分析和形态学分析鉴定为巨大芽孢杆菌，命名为B.megaterium L222，其16S rRNA序列已存入NCBI数据库，GenBank登录号为MN749506，该菌种于2020年11月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，详细地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC M2020775，分类命名为Bacillus megaterium L222。该芽孢杆菌活性较好且生长较快，能用于泡菜发酵。
优选地，经药敏实验，所述巨大芽孢杆菌菌株对于抗生素高度敏感、或者为中度敏感且无耐药性抗生素。
本发明还提供了一种活化芽孢杆菌的方法，将上述巨大芽孢杆菌在营养琼脂固体培养基(NA)上采用划线法获得单菌落，37℃恒温培养箱培养24h后，接种在营养肉汤(NB)液体培养基中，37℃160r/min振荡培养16h后，接种至泡菜卤水中。
本发明还提供了一种低亚硝酸盐泡菜的制作方法，包括以下步骤：
步骤1，采用无病虫害的新鲜萝卜，将萝卜切成半圆片状；
步骤2，玻璃坛提前用沸水灭菌20min；
步骤3，将称量好的冰糖和泡菜盐提前加入开水中，待其彻底溶解后，加入红辣椒、生姜、大蒜、花椒等香料；
步骤4，在无菌超净工作台里，将活动活化好的上述的巨大芽孢杆菌的菌悬液按照预定添加量加到泡菜卤水中；
步骤5，将切片的萝卜块称量之后加入到配制的泡菜卤水中，放置于25℃的恒温培养箱中，连续发酵7天。
优选地，所述步骤4中的活化方法采用上述的方法。
优选地，发酵菌种菌液浓度及其接种量为：巨大芽孢杆菌菌液为108CFU/mL，接种量为1％体积分数。
本发明还提供了一种低亚硝酸盐泡菜，采用上述的低亚硝酸盐泡菜的制作方法制得，且在整个发酵过程中泡菜中亚硝酸盐含量始终低于2mg/kg，远远小于国标中规定腌渍蔬菜产品中最低的亚硝酸盐含量(20mg/kg)。
经药敏实验，本发明中的巨大芽孢杆菌菌株对于绝大多数抗生素高度敏感，对少数抗生素中度敏感且无耐药性抗生素。因此这株可降解亚硝酸盐的巨大芽孢杆菌是安全可适用于泡菜发酵的。
附图说明
图1为本发明实施例提供的巨大芽孢杆菌B.megaterium L222的16S rDNA系统发育树；
图2为本发明实施例提供的B.megaterium L222革兰氏染色示图；
图3为本发明实施例提供的B.megaterium L222油镜观察结果；
图4为本发明实施例提供的B.megaterium L222生理生化实验结果；
图5为本发明实施例提供的泡菜连续发酵七天的pH值变化；
图6为本发明实施例提供的泡菜连续发酵七天的总酸含量变化；
图7为本发明实施例提供的泡菜连续发酵七天的亚硝酸盐浓度。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
本发明涉及食品泡菜领域，其提供了一种巨大芽孢杆菌作为泡菜发酵剂并应用于制作低亚硝酸盐泡菜的方法。其中，加入的巨大芽孢杆菌是从四川传统发酵泡菜中分离出来，经鉴定分析确定为巨大芽孢杆菌，命名为S1581-1。经药敏实验，确定这株可降解亚硝酸盐的巨大芽孢杆菌是安全可适用于泡菜发酵的。泡菜制备的方法为：将含有上述巨大芽孢杆菌的菌悬液接种于四川泡菜中进行发酵。该方法能有效降低泡菜发酵过程中产生的亚硝酸盐含量，改善泡菜色泽和风味，缩短发酵时间，提高泡菜食用的安全性。
以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
(一)对该巨大芽孢杆菌进行分子生物学分析、形态学和生理生化特征鉴定：将一坛四川传统泡菜中分离筛选得到的芽孢杆菌进行16S rDNA测序构建16S rDNA系统发育树、形态学和生理生化特征分析鉴定。
鉴定结果见图1-3、表1。结果表明这株菌株为巨大芽孢杆菌，命名为S1581-1。
表1本发明实施例提供的S1581-1生理生化实验结果
Figure BDA0002850581110000041
巨大芽孢杆菌的药敏实验：采用纸片扩散法测定S1581-1和S1581-2对抗生素的敏感性，实验结果见表2。把巨大芽孢杆菌应用到泡菜的生产中需要研究其对于西药抗生素的敏感程度，以确保其安全性。经药敏实验，本发明中的巨大芽孢杆菌菌株对于绝大多数抗生素高度敏感，对少数抗生素中度敏感且无耐药性抗生素。因此这株可降解亚硝酸盐的巨大芽孢杆菌是安全可适用于泡菜发酵的。
表2本发明实施例提供的菌株B.megaterium L222对抗生素的药敏性结果
Figure BDA0002850581110000051
(二)活化巨大芽孢杆菌
将巨大芽孢杆菌在营养琼脂固体培养基(NA)上采用划线法获得单菌落，37℃恒温培养箱培养24h后，接种在营养肉汤(NB)液体培养基中，37℃160r/min振荡培养16h后，接种至泡菜卤水中。
(三)泡菜制备
采用无病虫害的新鲜萝卜，去除叶片，削皮洗净，使用果蔬切片机将萝卜切成8mm的半圆片状。玻璃坛提前用沸水灭菌20min。将20g的冰糖和120g泡菜盐加入装有2L开水的玻璃坛中，待其彻底溶解后，加入60g红辣椒、60g生姜、60g大蒜、2g花椒等香料。取20ml巨大芽孢杆菌菌悬液(108CFU/mL)离心，倒掉上清液，将沉淀菌液接种到泡菜卤水中。将1kg萝卜片加入到配制的泡菜卤水中，加盖水封，放置在25℃的恒温培养箱中，连续发酵7天，可得到风味良好、亚硝酸盐含量低的四川泡菜。同时以相同原料和方法，泡制一坛不接入巨大芽孢杆菌的、进行自然发酵的泡菜。
利用本发明制得的低亚硝酸盐泡菜在整个发酵过程中泡菜中亚硝酸盐含量始终低于2mg/kg，远远小于国标中规定腌渍蔬菜产品中最低的亚硝酸盐含量(20mg/kg)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川大学
<120> 巨大芽孢杆菌及其活化方法、泡菜制作方法及泡菜
<130> 20201216
<141> 2020-12-22
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1484
<212> DNA
<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)
<400> 1
tcaggatgaa cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc gagcgaactg attagaagct 60
tgcttctatg acgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggcaacctg cctgtaagac 120
tgggataact tcgggaaacc gaagctaata ccggatagga tcttctcctt catgggagat 180
gattgaaaga tggtttcggc tatcacttac agatgggccc gcggtgcatt agctagttgg 240
tgaggtaacg gctcaccaag gcaacgatgc atagccgacc tgagagggtg atcggccaca 300
ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat 360
ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggctttcggg tcgtaaaact 420
ctgttgttag ggaagaacaa gtacgagagt aactgctcgt accttgacgg tacctaacca 480
gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttatc 540
cggaattatt gggcgtaaag cgcgcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagcccac 600
ggctcaaccg tggagggtca ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga gaaaagcgga 660
attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcggc 720
tttttggtct gtaactgacg ctgaggcgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac 780
cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gagggtttcc gccctttagt 840
gctgcagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa 900
aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga 960
agaaccttac caggtcttga catcctctga caactctaga gatagagcgt tccccttcgg 1020
gggacagagt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1080
agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc atttagttgg gcactctaag 1140
gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta 1200
tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga tggtacaaag ggctgcaaga ccgcgaggtc 1260
aagccaatcc cataaaacca ttctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg cctacatgaa 1320
gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt 1380
acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg taacacccga agtcggtgga gtaaccgtaa 1440
ggagctagcc gcctaaggtg ggacagatga ttggggtgaa gtcg 1484

Claims (7)

1.一种用于泡菜发酵剂的巨大芽孢杆菌，其特征在于，所述巨大芽孢杆菌从四川传统发酵泡菜中分离出来，经分子生物学、系统进化分析和形态学分析鉴定为巨大芽孢杆菌，命名为B. megaterium L222，其16S rRNA序列已存入NCBI数据库，GenBank登录号为MN749506，该菌种于2020年11月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2020775。
2.根据权利要求1所述的巨大芽孢杆菌，其特征在于，经药敏实验，所述巨大芽孢杆菌菌株对于抗生素高度敏感、或者为中度敏感且无耐药性抗生素。
3.一种活化芽孢杆菌的方法，其特征在于，将权利要求1中的所述巨大芽孢杆菌在营养琼脂固体培养基上采用划线法获得单菌落，37℃恒温培养箱培养 24 h后，接种在营养肉汤液体培养基中，37℃ 160 r/min 振荡培养 16h 后，接种至泡菜卤水中。
4.一种低亚硝酸盐泡菜的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，采用无病虫害的新鲜萝卜，将萝卜切成半圆片状；
步骤2，玻璃坛提前用沸水灭菌20min；
步骤3，将称量好的冰糖和泡菜盐提前加入开水中，待其彻底溶解后，加入红辣椒、生姜、大蒜、花椒；
步骤4，在无菌超净工作台里，将活动活化好的权利要求1中所述的巨大芽孢杆菌的菌悬液按照预定添加量加到泡菜卤水中；
步骤5，将切片的萝卜块称量之后加入到配制的泡菜卤水中，放置于 25℃的恒温培养箱中，连续发酵7天。
5.根据权利要求4所述的低亚硝酸盐泡菜的制作方法，其特征在于，所述步骤4中的活化方法采用权利要求3中所述的方法。
6.根据权利要求4所述的低亚硝酸盐泡菜的制作方法，其特征在于，发酵菌种菌液浓度及其接种量为：巨大芽孢杆菌菌液为108CFU/mL，接种量为1%体积分数。
7.一种低亚硝酸盐泡菜，其特征在于，采用权利要求4-6中任一项所述的低亚硝酸盐泡菜的制作方法制得，且在整个发酵过程中泡菜中亚硝酸盐含量始终低于2mg/kg。
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