CN109259151B

CN109259151B - 一种利用复合菌剂制备萝卜干的方法

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Publication number: CN109259151B
Application number: CN201811181379.5A
Authority: CN
Inventors: 唐垚; 张其圣; 陈功; 李恒; 汪冬冬; 明建英; 蔡地烽
Original assignee: SICHUAN DONGPO CHINESE KIMCHI INDUSTRIAL TECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: SICHUAN DONGPO CHINESE KIMCHI INDUSTRIAL TECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2018-10-11
Filing date: 2018-10-11
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2038-10-11
Also published as: CN109259151A

Abstract

本发明属于食品领域，具体为一种利用复合菌剂制备萝卜干的方法。该方法包括步骤1）将肠膜明串珠菌、赫伦魏斯氏菌、汉逊德巴利酵母和粘红酵母的菌株分别进行高密度培养，然后制备成菌粉，按比例4.8‑5.2：1.8‑2.4：0.8‑1.2:0.8‑1.2混合，即为复合菌剂。采用真空浸渍方式将复合菌剂注入萝卜中，快速启动发酵形成前体物质，再晾晒脱水，后熟保藏，避免发酵受环境因子的影响。本发明缩短了萝卜干成熟周期，能抑制萝卜干表面附带的大肠菌群、假单胞菌等革兰氏阴性菌的生长，降低亚硝酸盐和生物胺的含量，提高了产品的稳定性和安全性，制备的萝卜干，酸爽可口，自然风味较好，不需人工拌料调味即可食用。

Description

一种利用复合菌剂制备萝卜干的方法

技术领域

本发明属于食品领域，具体为一种利用复合菌剂制备萝卜干的方法。

背景技术

萝卜是我国种植面积较大的重要蔬菜，因其适应性强、易栽培、产量高、价格低廉等优点因此广泛的被人们用来制作成各种佳肴，是一道非常理想的食材。萝卜具有很高的营养价值和保健功能。白萝卜中含有酵素淀粉酶、粗纤维、蛋白质、木质素、糖、族维生素和大量维生素以及铁、两、磷、纤维、芥子油等，这些微量元素和功能性物质使得白萝卜具有促进消化，增强食欲，加快胃肠蠕动和止咳化痰的作用。尤其是白萝卜中的木质素，能提高巨噬细胞的活力，吞噬癌细胞；以及萝卜所含的多种酶，能分解致癌的亚硝胺，使得白萝卜具有抗癌防癌作用。但是鲜萝卜的含水量高达95％以上，萝卜在收获后很容易发生糠心、萎焉和霉变等问题。因此，人们通常会将萝卜晾晒脱水后制成萝卜干，其含水量可降到20％以下，非常有利于贮藏。并且萝卜干加工方便、腌制条件要求不高、易操作，吃起来味道鲜美、脆嫩爽口、风味独特，逐渐成为人们加工萝卜的一种主要产品。

目前国内基本采用自然发酵方法来腌制萝卜干，先是对处理好的新鲜萝卜进行脱水，再将萝卜干与食盐、香辛料按照一定比例混合，装入容器里隔绝氧气密封发酵后熟而成。萝卜干成熟时间为90天以上，品质也不稳定，口味主要靠人工调配，缺乏其自然风味。虽然发酵方法简单、利于操作、成本低。但是自然发酵的萝卜干成熟周期长，微生物群落结构不可控而导致品质不稳定，由于萝卜干成熟较慢，一些大肠菌群、假单胞菌等革兰氏阴性菌长期存在于萝卜干中，已有研究证明该类菌与亚硝酸盐和生物胺的形成有关，可见自然发酵的萝卜干还存在安全隐患。

传统萝卜干的微生物多样性很多，许多微生物在这种条件下以低含量、低丰度共存，这些微生物各自代谢或相互作用形成了萝卜干特有的风味。通过传统强化某一类菌种可能打破这种平衡，但是强化的效果不佳。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术问题，提供一种利用复合菌剂制备萝卜干的方法。该方法中利用复合菌剂有效调控萝卜干发酵，由于是固态发酵，强化发酵的效果往往受到水分活度等环境因素的制约，为进一步加快反应，通过真空浸渍方式快速将特定微生物注入萝卜中，快速启动发酵形成前体物质，然后再经过简单晾晒处理后，大大缩短了发酵周期，保证了安全性。

为了实现上述目的，本发明的具体技术方案为：

一种利用复合菌剂制备萝卜干的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将菌种Leuconostoc mesenteroides的菌株进行高密度培养，然后于3-5℃离心取菌泥，加入保护剂，真空冷冻干燥得到菌粉，冷冻干燥后制成粉剂A；

将菌种Weissella hellenica的菌株进行高密度培养，然后于3-5℃离心取菌泥，加入保护剂，真空冷冻干燥得到菌粉，冷冻干燥后制成粉剂B；

将菌种Debaryomyces hansenii的菌株进行高密度培养，然后于3-5℃离心取菌泥，加入保护剂，真空冷冻干燥得到菌粉，冷冻干燥后制成粉剂C；

将菌种Rhodotorula glutinis的菌株进行高密度培养，然后于3-5℃离心取菌泥，加入保护剂，真空冷冻干燥得到菌粉，冷冻干燥后制成粉剂D；

将粉剂A、粉剂B、粉剂C和粉剂D按质量比4.8-5.2：1.8-2.4：0.8-1.2:0.8-1.2的比例混合，得复合菌剂；

(2)新鲜萝卜清洗，将表皮有疤点的地方挖掉，先切段，再切片，装入真空浸渍罐中，用3％-5％浓度的食盐溶液作为浸渍液，浸渍液与新鲜萝卜的质量比为2:1，加入0.01％-0.05％的复合菌剂，混合均匀，保持温度25-28℃发酵3-5天；

(3)将步骤(2)中发酵形成前体风味的萝卜捞出，装入另一个真空浸渍罐中进行二次真空浸渍，用8％-12％浓度的食盐溶液作为浸渍液，浸渍液与新鲜萝卜的质量比为1:1,保持温度25-28℃发酵8-10天；

(4)将步骤(3)中的萝卜进行晾晒脱水，待脱水50％时，装入泡菜坛中，用煮过的竹条压紧并拼成网状，将泡菜坛倒置于盛满水的大碗中进行发酵，发酵8-10d即得成熟可食用的萝卜干。

作为优选，步骤(1)中，离心转速均为10000rpm，以质量计，保护剂与每一种菌种的菌泥的比例关系均为1∶2.5-3.5。高密度培养，菌泥的制备，保护剂的加入以及真空冷冻干燥均为现有技术。

作为优选，步骤(1)中，每一种菌种冷冻干燥的温度均为-60至-50℃，真空度1Pa，时间30-35h。

作为优选，复合菌剂中，每一种菌剂中的活菌数为8×10¹⁰-1×10¹¹cfu/g。本发明的积极效果体现在：

(一)本发明改变了传统工艺，采用“先发酵，再脱水”的理念，不仅缩短成熟周期至30天左右，而且以复合菌剂调控萝卜干发酵，品质稳定，风味独特。

(二)本方法中采用真空浸渍方式将复合菌剂注入萝卜中，快速启动发酵形成前体物质，再晾晒脱水，后熟保藏，避免发酵受环境因子的影响。

(三)本发明采用的乳酸菌复合菌剂包括肠膜明串珠菌、植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、短乳杆菌，其中肠膜明串珠菌能快速生长，启动萝卜干发酵，导致萝卜干pH迅速下降，能抑制萝卜干表面附带的大肠菌群、假单胞菌等革兰氏阴性菌的生长，降低亚硝酸盐和生物胺的含量；植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、短乳杆菌在发酵后期能长久存在，保持菌群结构稳定，这样不仅提升品质稳定，还提高了萝卜干食用安全性。

(四)制备的萝卜干，酸爽可口，自然风味较好，不需人工拌料调味即可食用。

附图说明：

图1为本发明中所述萝卜干的制备工艺流程图。

图2为自然发酵与接菌发酵萝卜干的pH变化图

图3自然发酵与接菌发酵萝卜干的氨基酸含量变化图

图4自然发酵与接菌发酵萝卜干的亚硝酸盐含量变化图

图5自然发酵与接菌发酵萝卜干的生物胺含量变化图

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。

本申请文件中，％如无特殊说明，均表示wt％，比例关系均为质量比，份也都表示重量份；所采用的原料，如无特殊说明外，均为市售产品。复合菌剂所包含菌种都从自然发酵萝卜干中分离筛选，经细菌16S rDNA和真菌26S rDNA同源性分析鉴定为：肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides、赫伦魏斯氏菌Weissella hellenica、汉逊德巴利酵母Debaryomyces hansenii、粘红酵母Rhodotorula glutinis。也可采用市售的肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides、赫伦魏斯氏菌Weissella hellenica、汉逊德巴利酵母Debaryomyces hansenii和粘红酵母Rhodotorula glutinis菌种。

菌种的具体筛选方法：

称取25mL泡菜发酵液置于盛有225mL灭菌生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。按此操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。根据对样品状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液，吸取0.1mL样品匀液于MRS培养基和PDA培养基中进行涂布，每个稀释度做两个平行。涂布后的MRS培养基置于37℃培养箱培养48h，PDA培养基置于28℃培养箱培养48h-72h。

培养后进行微生物计数，挑取菌落形态有差距的微生物进行分离纯化，同时记录原始平板中挑取菌株在相应平板相似数和挑取单菌落形态描述(大小、颜色、形状、表面干湿、高度、透明度、边缘结构)。平板划线进行5次纯化后进行镜检观察(细胞形态、菌体颜色、排列方式)，纯化后进行单菌落形态描述，转接于对应的液体培养基中，进行干油管保藏。

将待鉴定乳酸菌从甘油管中以2％的接种量接入MRS液体培养基进行活化，在37℃恒温箱中过夜培养24-48h，用以进行DNA提取。菌株活化后参照Bacterial DNA IsolationKit进行总DNA的提取。总DNA经过16SrDNA扩增，PCR反应体系：25uL 2×PCR Mix(LoadingBuffer、Taq DNA Polymerase、dNTPs、Tris-HCl、KCl、MgCl₂)，1.5uL DNA模板，引物27F和1492R各2uL，19.5uL ddH₂O。反应条件为：95℃预变性10min，93℃ 30s，65℃ 30s，72℃1min，10个循环；93℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min，10个循环；93℃ 30s，55℃ 30s，72℃1min，10个循环；72℃保持5min。扩增反应完毕后，利用2.0％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

将待鉴定酵母菌从甘油管中以2％的接种量接入高盐PDA液体培养基进行活化，在28℃恒温箱中过夜培养48-72h，用以进行DNA提取。菌株活化后参照Ezup柱式真菌基因组酶解破壁法进行DNA抽提。总DNA经过26SrDNA扩增，PCR反应体系：25uL 2×PCR Mix(LoadingBuffer、Taq DNA Polymerase、dNTPs、Tris-HCl、KCl、MgCl₂)，3uL DNA模板，引物NL1和NL4各1uL，20uL ddH₂O。反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性1min，55℃退火40s，72℃延伸90S，35个循环；72℃保持10min。扩增反应完毕后，利用2.0％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。将PCR扩增产物送往上海生工生物技术有限公司进行测序，利用BLAST软件将测定的各菌株16SrDNA和26SrDNA序列与GenBank数据库中已知的16S rDNA和26SrDNA基因序列进行比对。经细菌16S rDNA和真菌26S rDNA同源性分析鉴定为：肠膜明串珠菌Leuconostocmesenteroides、赫伦魏斯氏菌Weissella hellenica、汉逊德巴利酵母Debaryomyceshansenii、粘红酵母Rhodotorula glutinis。

实施例1：

一种利用复合菌剂制备萝卜干的方法，包括以下步骤：

(1)将四种菌种的菌株分别进行高密度培养，然后于3-5℃离心取菌泥，加入保护剂，真空冷冻干燥得到菌粉，干燥温度-60至-50℃，真空度1Pa，时间30h，离心转速为10000rpm，冷冻干燥后分别制成粉剂，菌种Leuconostoc mesenteroides为菌剂A，菌种Weissella hellenica为菌剂B，菌种Debaryomyces hansenii为菌剂C，Rhodotorulaglutinis为菌剂D，每一种菌剂中的活菌数约为8×10¹⁰-1×10¹¹cfu/g；再将菌粉A、菌粉B、菌粉C和菌粉D按质量比5：2：1:1混合，即为复合菌剂。以质量计，保护剂与菌泥的比例关系为1∶2.5。

(2)新鲜萝卜清洗，将表皮有疤点的地方挖掉，先切段，再切片，装入真空浸渍罐中，用5％浓度的食盐溶液作为浸渍液，浸渍液与新鲜萝卜的质量比为2:1，加入0.02％的复合菌剂，混合均匀，保持温度25℃发酵5天。

(3)将步骤(2)中发酵形成前体风味的萝卜捞出，装入另一个真空浸渍罐中进行二次真空浸渍，用质量浓度为10％的食盐溶液作为浸渍液，浸渍液与新鲜萝卜的质量比为1:1,保持温度25℃发酵10天。

(4)将步骤(3)中的进行晾晒脱水，待脱水50％左右时，装入泡菜坛中，用煮过的竹条压紧并拼成网状，将泡菜坛倒置于盛满水的大碗中进行发酵，发酵10d即可成熟食用。

实施例2：

一种利用复合菌剂制备萝卜干的方法，包括以下步骤：

(1)将四种菌种的菌株分别进行高密度培养，然后于3-5℃离心取菌泥，加入保护剂，真空冷冻干燥得到菌粉，干燥温度-60至-50℃，真空度1Pa，时间30h，离心转速为10000rpm，冷冻干燥后分别制成粉剂，菌种Leuconostoc mesenteroides为菌剂A，菌种Weissella hellenica为菌剂B，菌种Debaryomyces hansenii为菌剂C，Rhodotorulaglutinis为菌剂D，每一种菌剂中的活菌数约为8×10¹⁰-1×10¹¹cfu/g；再将菌粉A、菌粉B、菌粉C和菌粉D按质量比5.1：2.3：0.8:0.8混合，即为复合菌剂。以质量计，保护剂与菌泥的比例关系为1∶2.5。

(2)新鲜萝卜清洗，将表皮有疤点的地方挖掉，先切段，再切片，装入真空浸渍罐中，用4％浓度的食盐溶液作为浸渍液，浸渍液与新鲜萝卜的质量比为2:1，加入0.01％的复合菌剂，混合均匀，保持温度25℃发酵5天。

(3)将步骤(2)中发酵形成前体风味的萝卜捞出，装入另一个真空浸渍罐中进行二次真空浸渍，用质量浓度为11％的食盐溶液作为浸渍液，浸渍液与新鲜萝卜的质量比为1:1,保持温度25℃发酵10天。

实施例1和实施例2中制备得到的萝卜干风味独特，品质稳定。

实验1：

将实施例1或实施例2中采用复合菌剂制备萝卜干与自然发酵制备萝卜干进行发酵过程中pH值比较，具体结果见图2，从图中可以看出，采用复合菌剂发酵萝卜干的pH下降迅速，在发酵第5天就下降至4.5左右，之后趋于平缓，而自然发酵萝卜干在发酵第60天时，pH才下降至5.0左右，说明采用复合菌剂发酵萝卜干能加快发酵，缩短成熟周期。图3为发酵过程中氨基酸含量的变化图，由图3可以看出，添加菌剂发酵后的萝卜干，氨基酸含量丰富，说明复合菌剂发酵萝卜干能增加其风味。

实验2：

将实施例1或实施例2中采用复合菌剂制备萝卜干与自然发酵制备萝卜干进行发酵过程中亚硝酸含量和生物含量的变化，具体见图4和图5，从图中可以看出，自然发酵的萝卜干亚硝酸盐含量随着发酵时间的增加而不断上升，在发酵第10天时达到最大值34.85mg/kg，已经高于国家规定的不高于20mg/kg，发酵10天后亚硝酸盐含量开始下降，但是比较缓慢，在发酵90天时含量仍然高于国家标准。菌剂发酵的萝卜干在发酵整个过程亚硝酸盐含量都没超过国家限量标准，且生物胺整体含量也较低，食用安全性高。

实验3：

邀请20位具有一定品尝经验的专业人员，从色泽、香气、形态、质地滋味4个方面打分，各项25分，总分100分，取平均值为最后得分。将实施例1中采用复合菌剂和二次浸渍(组14)制备得到的萝卜干与实验组：包括传统工艺制备萝卜干(组1)以及其它采用同实施例1中方法步骤完全一致方法制备萝卜干进行感官评定，但是或改变复合菌剂组分，或改变浸渍方法，分别为实验组2-13，具体评分标准如表1：

表1感官评定标准

具体结果见表2：

表2实验分组及评定结果

由上表可知，组1～组3分别采用传统工艺、一次真空浸渍和二次真空浸渍工艺制备萝卜干，采用传统工艺制备萝卜干成熟周期较长，一次真空浸渍工艺制备的萝卜干货架期较短，而二次真空浸渍工艺采用第一次低盐快速发酵，第二次高盐储藏的发酵技术，缩短了发酵周期，延长了产品的货架期，且在后期高盐储藏的过程中不断后熟形成风味物质，感官评分较高。组4～组7采用接相同量的单菌二次浸渍制备萝卜干，不仅没有缩短发酵周期，感官评分较低，尤其是组5和组6出现了腐败现象，说明萝卜干采用单菌接种发酵效果不好。组8～组11采用接任意三种菌的二次浸渍工艺制备萝卜干，接种比列分别为5：2：1，5：1:1，5：2：1，2：1:1，虽然缩短了发酵周期，但感官评分较较低。组12～组14按照5：2：1:1的比列接种4种菌，分别进行自然发酵、一次真空浸渍、二次真空浸渍工艺制备萝卜干，可见发酵时间都缩短至30天左右，而采用二次真空浸渍工艺的萝卜干风味更好，感官评分最高。

以上所述实例仅是本专利的优选实施方式，但本专利的保护范围并不局限于此。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利原理的前提下，根据本专利的技术方案及其专利构思，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本专利的保护范围之内。

Claims

1.一种利用复合菌剂制备萝卜干的方法，其特征在于包括以下步骤：

(4)将步骤(3)中的萝卜进行晾晒脱水，待脱水50％时，装入泡菜坛中，用煮过的竹条压紧并拼成网状，将泡菜坛倒置于盛满水的大碗中进行发酵，发酵8-10d即得。

2.如权利要求1所述利用复合菌剂制备萝卜干的方法，其特征在于：步骤(1)中，离心转速均为10000rpm，以质量计，保护剂与每一种菌种的菌泥的比例关系均为1∶2.5-3.5。

3.如权利要求1所述利用复合菌剂制备萝卜干的方法，其特征在于：步骤(1)中，每一种菌种冷冻干燥的温度均为-60至-50℃，真空度1Pa，时间30-35h。

4.如权利要求1所述利用复合菌剂制备萝卜干的方法，其特征在于：复合菌剂中，每一种菌剂中的活菌数为8×10¹⁰-1×10¹¹cfu/g。