FR2849863A1 - Gene de resistance a aphis gossypii - Google Patents
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Abstract
La présente invention est relative au clonage du gène Vat intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, ainsi qu'à l'identification de nouveaux marqueurs de ce gène.
Description
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La présente invention est relative à de nouveaux moyens de lutte contre les insectes ravageurs, et notamment contre les pucerons.
Les insectes ravageurs constituent une des préoccupations majeures en agriculture. Outre les dégâts produits par les insectes eux-mêmes, l'attaque par ces insectes favorise très souvent la transmission et l'infection des plantes par des maladies bactériennes, virales ou fongiques.
Parmi les ravageurs, les pucerons (également dénommés aphides) sont les plus courants. Il en existe plus de 4000 espèces dont les plus répandues sont Myzus persicae et Aphis gossypii.
Chaque espèce possède un cycle de vie particulier et un ensemble d'hôtes privilégiés. Les aphides sont des organismes extrêmement dynamiques, qui s'adaptent rapidement aux conditions environnementales. Cette rapide adaptation est essentiellement due aux diverses stratégies reproductives développées par les aphides. Selon les conditions climatiques, les aphides se reproduisent par voie sexuée ou asexuée et sont ovipares ou vivipares. Ils peuvent ou non être ailés, facilitant ainsi leur passage d'une plante à une autre. Grâce à cette grande faculté d'adaptation et de reproduction, l'infestation totale d'une culture en plein champ et a fortiori en serre est extrêmement rapide. Un seul individu donne naissance à un nombre de larves compris entre 40 et 100.
Le puceron du cotonnier ou du melon Aphis gossypii est présent dans la plupart des régions du monde à l'exception des plus septentrionales. Il est capable d'effectuer un cycle complet de développement et de se reproduire en moins d'une semaine. Grâce à ses facultés d'adaptation et de reproduction, un grand nombre de générations peut être produit en une saison quelles qu'en soient les conditions climatiques. Le puceron du melon a un large spectre d'hôtes (environ 700 plantes cultivées ou sauvages dont une cinquantaine en France). Parmi celles-ci,
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les plus sensibles sont les cucurbitacées dont par exemple le melon, la courgette, le concombre, les malvacées comme le cotonnier ou l'hibiscus et dans une moindre mesure les solanacées et les rutacées comme les agrumes.
Le puceron du melon colonise principalement la face inférieure des feuilles, les bourgeons et jeunes pousses. En puisant dans le phloème ses éléments nutritifs, le puceron détourne les ressources de la plante et l'affaiblit. Les tissus colonisés deviennent chlorotiques, les feuilles s'enroulent sur elles même et le rendement de la photosynthèse diminue. Le puceron sécrète un miellat très riche en sucres servant de substrat à des champignons saprophytes comme la fumagine qui dépose un voile noir sur la feuille réduisant encore les capacités de photosynthèse de la plante et provoquant une forte dépréciation commerciale des légumes et des fruits atteints. De surcroît, le puceron est un vecteur de nombreux virus qu'il introduit directement dans le phloème de la plante lorsqu'il en pique les vaisseaux.
La lutte chimique est actuellement encore la plus répandue. Elle présente toutefois de nombreux inconvénients.
Les produits utilisés ont fréquemment un spectre d'action large, et détruisent en même temps que les pucerons les insectes bénéfiques. Les risques de pollution de l'environnement sont également importants : les aphicides font en effet partie des produits les plus toxiques pour l'homme, la faune utile et l'environnement (Recueil des effets non intentionnels des produits phytosanitaires, Acta 1998, 256p, BERGER et VAN HOLST, 2001, environ. Sci. Pollut.
Res. Int., 8,109-112). Par ailleurs, le puceron Aphis gossypii a développé dans certaines régions des résistances aux composés chimiques employés comme les organophosphates, les carbamates, les pyrethroïdes et organochlorés (LARRY et al. the Journal of Cotton Science, 5,22-29, 2001 ; DELORME Pesticide Science, 49,90-96, 1997).
La lutte biologique consiste à utiliser les prédateurs et parasites naturels d'Aphis gossypii comme par exemple les coccinelles, certains héminoptères ou les
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champignons pathogènes. Elle n'est toutefois utilisable que pour les cultures sous serre.
Une autre approche repose sur la recherche de variétés naturellement résistantes aux pucerons, et sur leur utilisation pour l'amélioration variétale et la création d'hybrides.
Des variétés résistantes aux pucerons ont ainsi été trouvées notamment chez le blé, le pommier, le pois fourrager, la laitue, la tomate, etc...
Chez le melon (Cucumis melo), l'existence d'un locus dominant conférant une résistance au puceron Aphis gossypii, a été découverte chez des lignées de melons originaires d'Extrême-Orient ou d'Inde. Ce locus, qui a été dénommé Ag (pour Aphis gossypii Resistance) ou Vat (pour Virus Aphid Transmission Resistance) confère un double phénotype de résistance : une résistance à l'infestation de la plante par Aphis gossypii, et une résistance à la transmission par ce puceron des virus dont il est le vecteur (KISHABA et al., J. Econ. Entomol., 64,935-937, 1971 ; BOHN et al., J. Amer. Soc. Hort. Science, 98,37-40, 1973 ; LECOQ et al., Phytopathology, 69,1223-1225, 1979 ; PITRAT et LECOQ, Phytopathology, 70,958-961, 1980).
Le locus Vat favorable à la résistance a été introduit par croisement dans différentes variétés de melon commercialisées ; cependant, la création de variétés de melon résistantes aux pucerons par les techniques usuelles d'amélioration variétale demeure longue et coûteuse.
Il apparaît donc souhaitable d'identifier précisément et de cloner le gène Vat, afin de permettre notamment : - de transférer l'allèle Vat favorable à la résistance, par transgenèse, à des variétés de melon sensibles à Aphis gossypii, et également à d'autres espèces sensibles à ce puceron et pour lesquelles aucune résistance naturelle n'a été détectée, telles que par exemple la courgette, le concombre ou le cotonnier ;
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- de rechercher des orthologues du gène Vat chez d'autres espèces que le melon ; - de définir de nouveaux marqueurs, utilisables notamment dans le cadre des techniques classiques de sélection variétale, pour faciliter l'identification de variétés résistantes, et/ou le suivi de l'introgression du caractère de résistance dans des variétés d'intérêt agronomique.
Le gène Vat a été localisé sur le chromosome V du melon en position sub-télomérique (PERIN et al., Theor Appl Genet, 104,1017-1034, 2002). Plusieurs séquences homologues à des gènes de résistance ont été cartographiées dans cette région (KLINGER et al., J. Amer. Soc. Hort. Sci., 126,56-63, 2001 ; BROTMAN et al., Theor. Apl. Genet., 104,1055-1063, 2002), ce qui permet de supposer que le gène Vat appartient à la superfamille des NBS-LRR, dont font partie un grand nombre de gènes de résistance actuellement clonés.
Cette superfamille regroupe des gènes contenant un site de liaison à un nucléotide (NBS pour nucleotide binding site) et des séquences répétées riches en leucine (LRR pour leucine-rich repeats). Il a été observé que des séquences homologues à des NBS-LRR étaient liées au locus Vat (KLINGLER et al., J. Amer. Soc. Hort. Sci., 126,56-63, 2001). Parmi ces homologues de gènes de résistance, NBS-2, NBS46-7, NBS5a et NBS5b ont été localisés respectivement à 4,75,7,5, 10 et 11 cM de Vat ; cependant, aucune d'entre elles ne coségrège avec le locus Vat (BROTMAN et al., Theor.
Appl. Genet., 104,1055-1063, 2002).
Les Inventeurs ont construit une banque BAC (bacterial artificial chromosome) à partir d'ADN génomique de melon homozygote pour l'allèle Vat favorable à la résistance à Aphis gossypii et à la résistance à la transmission virale par ce vecteur. Ils ont parallèlement défini des marqueurs encadrant plus précisément le locus Vat que les marqueurs connus dans l'art antérieur. Le criblage de la banque BAC à l'aide de ces marqueurs a permis d'identifier des clones portant la totalité du locus Vat.
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Le sous-clonage de l'un de ces clones a permis d'obtenir un fragment d'ADN génomique de 11000 pb environ contenant le gène Vat. La séquence de ce fragment est représentée sur la Figure 1 (les 4 exons sont surlignés en gris et les 3 introns sont soulignés), ainsi que dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1. La séquence de l'ADNc correspondant a également été obtenue et la séquence polypeptidique correspondante a été déterminée.
Ces séquences d'ADNc et polypeptidique sont respectivement représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 2 et SEQ ID NO: 3.
Un paralogue du gène Vat, ci-après dénommé Vatlike a également été isolé à partir de la banque BAC. La séquence de ce gène Vat-like est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 4. La séquence d'ADNc et la séquence polypeptidique déduite sont respectivement représentées en annexe sous les numéros SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 6.
La Figure 2 montre l'alignement de séquence entre l'ADNc de Va t et l'ADNc de Vat-like. L'ADNc de Vat comprend 4422 pb alors que l'ADNc de Vat-like ne comprend que 4233 pb du fait d'une délétion de 195 pb localisée entre les positions 3014 et 3210 de la séquence de Vat et d'une addition de 6 pb localisée entre les positions 3649 et 3656 de la séquence de Vat-like. Les séquences de Vat et Vat-like présentent 92,4% d'identité entre elles.
La Figure 3 montre l'alignement des séquences des protéines VAT et VAT-like déduites qui se composent respectivement de 1473 acides aminés et 1410 acides aminés.
Les séquences de VAT et VAT-like présentent environ 90% d'identité entre elles.
Le gène Vat et Vat-like sont liés génétiquement et physiquement (séparés de 17 kb). Des plantes recombinantes entre Vat et Vat-like ont été identifiées par analyse génétique. Les plantes portant uniquement le gène Vat-like sont sensibles à la colonisation et à la transmission des virus par A. gossypii. Au contraire, les plantes portant
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uniquement le gène Vat sont résistantes à la colonisation et à la transmission des virus par A. gossypii. Donc, le gène Vat est nécessaire et suffisant pour conférer le double phénotype décrit précédemment.
La présente invention a pour objet un polynucléotide isolé choisi parmi : a) un polynucléotide codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, lequel polypeptide possède au moins 80%, de préférence au moins
90% et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO: 3 ; b) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) ; c) un polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec le polynucléotide a) ; ou le polynucléotide b).
90% et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO: 3 ; b) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) ; c) un polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec le polynucléotide a) ; ou le polynucléotide b).
Sauf précision contraire, les pourcentages d'identité de séquence indiqués ici pour les séquences nucléotidiques ou peptidiques se réfèrent à la valeur obtenue, sur une fenêtre de comparaison constituée par la totalité de la séquence de référence, avec la suite logicielle BLAST (ALTSCHUL et al., Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402,1997) en utilisant les paramètres par défaut, sur une fenêtre de comparaison constituée par la totalité de la séquence de référence.
On définit comme polynucléotide codant pour un polypeptide donné, tout polynucléotide contenant l'information génétique permettant la synthèse dudit polypeptide.
Ainsi, des polynucléotides conformes à l'invention codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, comprennent notamment le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 1 et le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 2.
La présente invention inclut également tout fragment d'au moins 10 pb, de préférence au moins 20 pb, et
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de manière tout à fait préférée au moins 50 pb d'un polynucléotide a) ou b) ci-dessus, ou capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec un polynucléotide a) ou b) ci-dessus. Des fragments préférés sont ceux d'un quelconque des polynucléotides de séquence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 4 ou SEQ ID NO : 5 ou ceux capables de s'hybrider sélectivement en conditions stringentes avec l'un de ces polynucléotides ou son complémentaire. D'autres fragments préférés sont ceux de l'un quelconque des polynucléotides SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2, qui ne sont pas présents dans les polynucléotides SEQ ID NO : 4 ou SEQ ID NO : 5, ou des fragments qui sont capables de s'hybrider sélectivement avec l'un des polynucléotides SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2, sans s'hybrider avec les polynucléotides SEQ ID NO : 4 ou SEQ ID NO : 5.
Des conditions stringentes d'hybridation, pour un polynucléotide donné, peuvent être identifiées par l'homme du métier en fonction de la taille et de la composition en bases du polynucléotide concerné, ainsi que de la composition du mélange d'hybridation (notamment pH et force ionique).
Généralement, des conditions stringentes, pour un polynucléotide de taille et de séquence données, sont obtenues en opérant à une température inférieure d'environ 5 C à 10 C à la température de fusion (Tm) de l'hybride formé, dans le même mélange réactionnel, par ce polynucléotide et son complémentaire.
On définit ici comme polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement avec un polynucléotide a) ou b) conforme à l'invention tout polynucléotide qui lorsqu'il est hybridé en conditions stringentes avec une banque d'acide nucléique de melon (notamment une banque d'ADN génomique ou d'ADNc) produit un signal d'hybridation détectable (c'est-àdire au moins 2 fois supérieur, de préférence au moins 5 fois supérieur au bruit de fond) avec ledit polynucléotide, mais ne produit aucun signal détectable avec d'autres séquences de
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ladite banque, et notamment avec des séquences codant pour d'autres protéines de la famille NBS-LRR.
La présente invention a également pour objet des sondes polynucléotidiques ou des amorces d'amplification obtenues à partir de polynucléotides a) ou b) conformes à l'invention ou des fragments de ceux-ci.
La présente invention englobe également tout polynucléotide codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, et pouvant être obtenu à partir d'une banque d'ADN génomique ou d'ADNc de plante par criblage de ladite banque à l'aide de sondes ou d'amorces conformes à l'invention.
Ceci inclut notamment d'autres allèles du gène Vat de melon, et notamment d'autres allèles capables de conférer une résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, ainsi que des orthologues du gène Vat chez des plantes autres que le melon, notamment chez d'autres cucurbitacées telles que la courgette et le concombre, et de manière plus générale chez des plantes susceptibles d'être infectées par Aphis gossypii (par exemple le cotonnier).
La présente invention englobe également des marqueurs génétiques permettant la détection de la présence ou de l' absence chez une plante, et notamment chez le melon, d'un allèle du gène Vat favorable à la résistance à la colonisation par le puceron Aphis gossypii et/ou à la résistance à la transmission virale par ledit puceron.
Des marqueurs génétiques conformes à l'invention, comprennent notamment les marqueurs suivants : L273, L246, V681, V 1684, V432, GRP805, M8, marqueur E, marqueur D.
Les marqueurs E et D sont plus particulièrement utilisables pour différencier les gènes Vat et Vat-like chez PI161375.
Ces marqueurs sont utilisables notamment chez les cucurbitacées, en particulier le melon. Ils peuvent également
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être utilisés chez d'autres plantes, par exemple des malvacées telles que le cotonnier ou l'hibiscus.
Les marqueurs conformes à l'invention sont respectivement définis par les amorces suivantes : L273 :
F2-B2 : GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT (SEQ ID NO : 7)
F2-Br : TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC (SEQ ID NO : 8) L246 :
F2-B2 Eco : ATTGATGAATCTACACTCCTCGATCTCTTC (SEQ ID NO : 9)
F2 Eco : GAGTTCAATCCATTTCAATGATTTAAGATA (SEQ ID NO : 10) V681 :
V681 : GGAATCTTGTTGAGGCCGAGAGGG (SEQ ID NO : 11)
V681R : GTTGTATATGGCTTCCCTGTAGCC (SEQ ID NO : 12) V1684 :
V588 : CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG (SEQ ID NO : 13)
V551R : GAAGAAGGTGACGAGAGAGATGCC (SEQ ID NO : 14) V432 :
V432 : AACTTCTCCAACTCCCTCCACTGC (SEQ ID NO : 15)
V432R : TTAGAGTGGCAAAGGGAAGATGGG (SEQ ID NO : 16) GRP805 : GRP805 : ATCCCCTGTTTCCTTCAACAACCC (SEQ ID NO : 17) GRP805R : AACCCCCAAGAAGAAGAACAACCC (SEQ ID NO : 18) M8 : M8 : CCGACGCATCTCCCGACGCGTTGTTG (SEQ ID NO : 19) M8R : TCGTGAAGGGTTTTGGAGAGTGAGAAA (SEQ ID NO : 20) Marqueur E :
LRR1 : CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC (SEQ ID NO : 21)
LRR842R : CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC (SEQ ID NO : 22) Marqueur D : LRR915 : AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC (SEQ ID NO : 23) LRR1R : GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC (SEQ ID NO : 24)
D'autres marqueurs génétiques de résistance au puceron A. gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron peuvent également être définis à partir des séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2, en comparant ces séquences avec leurs homologues obtenus à partir de plantes sensibles à A. gossypii et/ou à la transmission virale par ce puceron,
F2-B2 : GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT (SEQ ID NO : 7)
F2-Br : TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC (SEQ ID NO : 8) L246 :
F2-B2 Eco : ATTGATGAATCTACACTCCTCGATCTCTTC (SEQ ID NO : 9)
F2 Eco : GAGTTCAATCCATTTCAATGATTTAAGATA (SEQ ID NO : 10) V681 :
V681 : GGAATCTTGTTGAGGCCGAGAGGG (SEQ ID NO : 11)
V681R : GTTGTATATGGCTTCCCTGTAGCC (SEQ ID NO : 12) V1684 :
V588 : CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG (SEQ ID NO : 13)
V551R : GAAGAAGGTGACGAGAGAGATGCC (SEQ ID NO : 14) V432 :
V432 : AACTTCTCCAACTCCCTCCACTGC (SEQ ID NO : 15)
V432R : TTAGAGTGGCAAAGGGAAGATGGG (SEQ ID NO : 16) GRP805 : GRP805 : ATCCCCTGTTTCCTTCAACAACCC (SEQ ID NO : 17) GRP805R : AACCCCCAAGAAGAAGAACAACCC (SEQ ID NO : 18) M8 : M8 : CCGACGCATCTCCCGACGCGTTGTTG (SEQ ID NO : 19) M8R : TCGTGAAGGGTTTTGGAGAGTGAGAAA (SEQ ID NO : 20) Marqueur E :
LRR1 : CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC (SEQ ID NO : 21)
LRR842R : CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC (SEQ ID NO : 22) Marqueur D : LRR915 : AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC (SEQ ID NO : 23) LRR1R : GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC (SEQ ID NO : 24)
D'autres marqueurs génétiques de résistance au puceron A. gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron peuvent également être définis à partir des séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2, en comparant ces séquences avec leurs homologues obtenus à partir de plantes sensibles à A. gossypii et/ou à la transmission virale par ce puceron,
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afin de détecter les polymorphismes existant entre ces séquences, et de déterminer la forme associée à la résistance et la forme associée à la sensibilité.
Ces polymorphismes peuvent être situés dans les régions codantes du gène Vat, et se traduire par des modifications de la séquence peptidique de la protéine VAT.
Il peut également s'agir de polymorphismes situés dans la région 5' non codante ou dans les introns du gène Vat, ou de polymorphismes situés dans les régions codantes mais ne se traduisant pas par une modification de séquence de la protéine VAT.
Lorsqu'un polymorphisme a été ainsi identifié, il est possible de l'utiliser comme marqueur génétique de résistance ou de sensibilité, et de définir des outils (sondes d'acide nucléique, amorces d'amplification, enzymes de restriction) permettant de distinguer ses différentes formes.
La présente invention englobe également l'utilisation d'au moins un polynucléotide ou d'au moins un marqueur génétique conforme à l'invention pour la détection de la présence, chez une plante, d'un allèle du gène Vat favorable à la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la résistance à la transmission virale par ledit puceron.
La présente invention a en particulier pour objet un procédé d'évaluation de la résistance ou de la sensibilité d'une plante au puceron Aphis gossypii, et/ou à la transmission virale par ledit puceron, caractérisé en ce qu'il comprend la détermination de la forme allélique du gène Vat présente chez ladite plante.
La présente invention a également pour objet des amorces oligonucléotidiques utilisables pour la mise en #uvre des méthodes de détection définies ci-dessus.
En particulier la présente invention a pour objet : tout couple d'amorces permettant l'amplification d'une région du gène Vat comprenant au moins un polymorphisme associé à la résistance ou la sensibilité à
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Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron ; tout couple d'amorces permettant l'amplification de l'un des marqueurs L273, L246, V681, V1684, V432, GRP805, M8, marqueur E, ou marqueur D, mentionnés ci-dessus.
La présente invention a également pour objet des kits pour la mise en #uvre d'un procédé conforme à l'invention. Ces kits comprennent au moins un couple d'amorces conforme à l'invention, éventuellement associé à des réactifs permettant la mise en #uvre d'une réaction d'amplification, à des moyens de détection du produit d'amplification, à une ou plusieurs enzymes de restriction, et/ou à des témoins positifs et/ou des témoins négatifs d'amplification.
La présente invention a aussi pour objet : - une cassette d'expression comprenant un polynucléotide conforme à l'invention, et notamment un polynucléotide codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ; - un vecteur recombinant résultant de l'insertion, dans un vecteur-hôte approprié, d'un polynucléotide ou d'une cassette d'expression conforme à l'invention.
La présente invention englobe également un procédé de production d'un polypeptide recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation d'une cellule hôte, procaryote ou eucaryote, par un polynucléotide conforme à l'invention codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, et la récupération dudit polypeptide produit par ladite cellule.
La présente invention a aussi pour objet un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron,
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lequel polypeptide possède au moins 80%, de préférence au moins 90% et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO: 3, ainsi que des fragments d'au moins 5, de préférence au moins 10, et de manière tout à fait préférée au moins 15 acides aminés consécutifs dudit polypeptide.
La présente invention englobe aussi des celluleshôtes génétiquement transformées par un polynucléotide ou une cassette d'expression conforme à l'invention.
Les cellules hôtes peuvent être des cellules eucaryotes ou procaryotes. A titre d'exemples on citera des bactéries, notamment E. coli ou Agrobacterium, des levures, par exemple Saccharomyces, des cellules animales ou, préférentiellement, des cellules végétales.
La présente invention englobe également des plantes transgéniques génétiquement transformées par un polynucléotide conforme à l'invention.
Les techniques classiques de construction de vecteurs recombinants, de transformation de cellules ou d'organismes hôte, et de production de protéines recombinantes, sont utilisables pour la mise en #uvre de la présente invention.
Le choix du vecteur-hôte, et des séquences de régulation de l'expression seront effectuées en fonction de la cellule hôte ou de l'organisme hôte choisi et de l'application envisagée.
La transformation génétique de plantes par un polynucléotide conforme à l'invention permet l'obtention de plantes transgéniques résistantes au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron.
La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation d'un polynucléotide conforme à l'invention, pour augmenter la résistance d'une plante au puceron Aphis gossypii.
La présente invention a ainsi plus particulièrement pour objet un procédé de production d'une plante transgénique résistante au puceron Aphis gossypii
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et/ou à la transmission virale par ledit puceron, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation génétique de ladite plante par un polynucléotide conforme à l'invention.
Ladite plante est avantageusement choisie parmi les espèces sensibles à Aphis gossypii, notamment parmi les cucurbitacées telles que le melon, le concombre ou la courgette, ou les malvacées telles que le cotonnier ou l'hibiscus, ou parmi les espèces sensibles aux virus transmis par A. gossypii, notamment parmi les solanacées telles que la tomate ou le piment.
En outre, la sur-expression du gène Vat à un niveau élevé peut conduire à une résistance constitutive de la plante contre des agents pathogènes plus variés chez le melon ou dans d'autres espèces végétales (cucurbitacées, solanacées ou malvacées). Par exemple, cette sur-expression peut permettre à la plante de reconnaître des pucerons phylogénétiquement éloignés de Aphis gossypii ou de conférer une résistance constitutive faible qui retardera le cycle infectieux des agents pathogènes en général. Pour cela, on peut produire des plantes transgéniques qui expriment le gène Vat sous contrôle d'un promoteur fort (35S) et donc qui l'exprimeront à un niveau supérieur à celui qu'il a lorsqu'il est sous contrôle de son propre promoteur. Cependant, il faudra nécessairement contrôler l'expression du gène à son plus juste niveau afin d'éviter des effets néfastes sur la biologie de la plante (mort cellulaire par exemple).
La transformation génétique des plantes peut être effectuée par les méthodes classiques connues en elles-mêmes de l'homme du métier.
A titre d'exemples non limitatifs, pour la transformation des cucurbitacées et notamment du melon, on pourra utiliser les techniques décrites par GUIS et al.
(Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 15,289-311, 1998 ; Scientia horticulturae, 84,91-99, 2000). Pour la transformation du cotonnier on pourra utiliser les techniques décrites par PANNETIER et al. (Euphytica, 96,163-166, 1997).
Pour la transformation de la tomate, il est possible
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d'utiliser les protocoles décrits par HAMZA et CHUPEAU (J.
Exp. Bot., 44,1837-1845, 1993).
Alternativement, des plantes possédant une résistance accrue au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, peuvent être obtenues par mutagenèse dirigée, afin d'introduire dans l'allèle du gène Vat présent chez lesdites plantes les modifications nécessaires pour conférer cette résistance.
Des méthodes de mutagenèse dirigée utilisables dans le cadre de la présente invention sont connues en ellesmêmes de l'homme du métier ; elles sont par exemples décrites dans l'ouvrage de D. TAGU (eds INRA 1999).
L'invention concerne également les plantes transformées obtenues par un procédé de transgenèse ou de mutagenèse dirigée conforme à l'invention, ainsi que les descendants de ces plantes. L'invention englobe également les produits obtenus à partir de ces plantes, tels qu'organes ou tissus végétaux, cellules, semences etc.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant la définition de marqueurs associés au gène Vat ainsi que le clonage de ce gène.
EXEMPLE 1 : IDENTIFICATION DU GENE VAT PAR UNE APPROCHE GENETIQUE : - Création de la banque BAC
Une banque BAC d'ADN génomique de melon (variété PI 161375 résistante à Aphis gossypii et à la transmission virale par ce puceron) représentant environ 29 équivalents génome a été construite. La première partie de la banque BAC comporte 66048 clones (ADN digéré par BamHI, HindIII), la seconde 56448 clones (ADN digéré par EcoRI) .
Une banque BAC d'ADN génomique de melon (variété PI 161375 résistante à Aphis gossypii et à la transmission virale par ce puceron) représentant environ 29 équivalents génome a été construite. La première partie de la banque BAC comporte 66048 clones (ADN digéré par BamHI, HindIII), la seconde 56448 clones (ADN digéré par EcoRI) .
- Criblage de la banque BAC et choix du clone BAC porteur du locus Vat
Afin d'identifier le clone porteur du gène Vat, la banque a été criblée à l'aide de marqueurs flanquant le
Afin d'identifier le clone porteur du gène Vat, la banque a été criblée à l'aide de marqueurs flanquant le
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locus Vat. Plusieurs clones BAC couvrant le locus Vat ont été identifiés et ordonnés. A partir de ces clones BAC de nouveaux marqueurs ont été générés. Le clone BAC 3. 18.9 porteur d'une insertion de 170 kb comprenant le locus Vat a été choisi pour l'identification du gène Vat et séquence. Ce clone comprend les marqueurs L273 et L246 encadrant le locus Vat. Dix plantes recombinantes sur 6000 plantes issues d'une population backcross [(Védrantais(sensible) x PI 161375 (résistant)) x Védrantais] ont été identifiées entre le marqueur L273 et le gène Vat, alors qu'une seule a été identifiée entre le marqueur L246 et le gène Vat.
Le marqueur L273 est défini par les amorces: F2-B2 : GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT (SEQ ID NO : 7) et F2-Br : TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC (SEQ ID NO : 8)
Le produit d'amplification obtenu à partir d'ADN génomique de la variété Védrantais (Vilmorin) (sensible à Aphis gossypii) ou de la variété PI 161375 (accession d'origine coréenne multipliée par l'INRA) (résistante à A. gossypii) a une longueur de 210 pb. Le produit d'amplification possède un site de restriction BsiWI dans la variété PI 161375 conduisant à l'obtention de deux fragments de 181 pb et 29 pb. En revanche, la digestion par l'enzyme BsrGI restreint l'amplifiat de Védrantais en trois fragments : 153 pb, 28 pb et 29 pb et celui de PI 161375 en deux fragments de 182 pb et 28 pb.
Le produit d'amplification obtenu à partir d'ADN génomique de la variété Védrantais (Vilmorin) (sensible à Aphis gossypii) ou de la variété PI 161375 (accession d'origine coréenne multipliée par l'INRA) (résistante à A. gossypii) a une longueur de 210 pb. Le produit d'amplification possède un site de restriction BsiWI dans la variété PI 161375 conduisant à l'obtention de deux fragments de 181 pb et 29 pb. En revanche, la digestion par l'enzyme BsrGI restreint l'amplifiat de Védrantais en trois fragments : 153 pb, 28 pb et 29 pb et celui de PI 161375 en deux fragments de 182 pb et 28 pb.
Le marqueur L246 est défini par les amorces: F2-B2 Eco: ATTGATGAATCTACACTCCTCGATCTCTTC (SEQ ID NO : 9) et F2 Eco: GAGTTCAATCCATTTCAATGATTTAAGATA (SEQ ID NO : 10)
Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la variété Védrantais ou de la variété PI 161375 a une longueur de 173 pb. Le produit d' amplification de la variété PI 161375 possède un site de restriction pour l'enzyme EcoRV conduisant à l'obtention de deux fragments respectivement de 144 pb et 29 pb.
Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la variété Védrantais ou de la variété PI 161375 a une longueur de 173 pb. Le produit d' amplification de la variété PI 161375 possède un site de restriction pour l'enzyme EcoRV conduisant à l'obtention de deux fragments respectivement de 144 pb et 29 pb.
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A partir du clone BAC 3-18-9 possédant les deux marqueurs L273 et L246, des oligonucléotides (Tableau 1) ont été désignés dans la région comprise entre ces deux marqueurs afin d'en réduire l'intervalle et de délimiter précisément le gène Vat.
Le marqueur V432 est défini par les amorces: V432 : AACTTCTCCAACTCCCTCCACTGC (SEQ ID NO: 15) et V432R: TTAGAGTGGCAAAGGGAAGATGGG (SEQ ID NO : 16)
Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la variété Védrantais ou de la variété PI 161375 a une longueur de 432pb. Le produit d'amplification de la variété PI 161375 possède un site de restriction pour l'enzyme HaeII conduisant à l'obtention de deux fragments respectivement de 223 pb et 209 pb.
Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la variété Védrantais ou de la variété PI 161375 a une longueur de 432pb. Le produit d'amplification de la variété PI 161375 possède un site de restriction pour l'enzyme HaeII conduisant à l'obtention de deux fragments respectivement de 223 pb et 209 pb.
Ce site de restriction est absent chez la variété Védrantais.
Le marqueur V681 est défini par les amorces : V681 : GGAATCTTGTTGAGGCCGAGAGGG (SEQ ID NO : 11) et V681R : GTTGTATATGGCTTCCCTGTAGCC (SEQ ID NO : 12)
Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la variété Védrantais ou de la variété PI 161375 a une longueur de 681 pb. Le produit d'amplification de la variété PI 161375 possède deux sites de restriction pour l'enzyme RsaI conduisant à l'obtention de trois fragments respectivement de 435 pb, 221 pb et 25 pb. Ces sites de restriction sont absents chez la variété Védrantais.
Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la variété Védrantais ou de la variété PI 161375 a une longueur de 681 pb. Le produit d'amplification de la variété PI 161375 possède deux sites de restriction pour l'enzyme RsaI conduisant à l'obtention de trois fragments respectivement de 435 pb, 221 pb et 25 pb. Ces sites de restriction sont absents chez la variété Védrantais.
Le marqueur V1684 est défini par les amorces : V588 : CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG (SEQ ID NO : 13) et V551R : GAAGAAGGTGACGAGAGAGATGCC (SEQ ID NO : 14)
Le fragment amplifié dans la variété Védrantais mesure environ 1300 pb tandis que dans la variété PI161375, l'amplifiat mesure 1684 pb. Il s'agit dans ce cas, d'un polymorphisme de taille.
Le fragment amplifié dans la variété Védrantais mesure environ 1300 pb tandis que dans la variété PI161375, l'amplifiat mesure 1684 pb. Il s'agit dans ce cas, d'un polymorphisme de taille.
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5 10
Ces marqueurs, ainsi que les marqueurs D, E, et M8 (cf. exemple 4 ci-dessous) et les oligonucléotides les définissant sont indiqués dans le Tableau 1 ci-après : Tableau 1
Ces marqueurs, ainsi que les marqueurs D, E, et M8 (cf. exemple 4 ci-dessous) et les oligonucléotides les définissant sont indiqués dans le Tableau 1 ci-après : Tableau 1
<tb>
<tb> Marqueurs <SEP> Oligonucléotides <SEP> 5' <SEP> Séquence <SEP> oligonucléotide <SEP> 3'
<tb> L273 <SEP> F2-B2 <SEP> GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 7)
<tb> F2-Br <SEP> TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 8)
<tb> L246 <SEP> F2-B2 <SEP> Eco <SEP> ATTGATGAATCTACACTCCTCGATCTCTTC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 9)
<tb> F2 <SEP> Eco <SEP> GAGTTCAATCCATTTCAATGATTTAAGATA <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 10)
<tb> V681 <SEP> V681 <SEP> GGAATCTTGTTGAGGCCGAGAGGG <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 11)
<tb> V681 <SEP> V681R <SEP> GTTGTATATGGCTTCCCTGTAGCC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 12)
<tb> V1684 <SEP> V588 <SEP> CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 13)
<tb> V1684 <SEP> V551R <SEP> GAAGAAGGTGACGAGAGAGATGCC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 14)
<tb> V432 <SEP> V432 <SEP> AACTTCTCCAACTCCCTCCACTGC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 15) <SEP>
<tb> V432R <SEP> TTAGAGTGGCAAAGGGAAGATGGG <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 16)
<tb> GRP805 <SEP> GRP805 <SEP> ATCCCCTGTTTCCTTCAACAACCC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 17)
<tb> GRP805R <SEP> AACCCCCAAGAAGAAGAACAACCC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 18)
<tb> M8 <SEP> M8 <SEP> CCGACGCATCTCCCGACGCGTTGTTG <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 19)
<tb> M8R <SEP> TCGTGAAGGGTTTTGGAGAGTGAGAAA <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 20)
<tb> Marqueur <SEP> LRR1 <SEP> CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 21 <SEP> ) <SEP>
<tb> Marqueur <SEP> LRR842R <SEP> CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 22)
<tb> Marqueur <SEP> LRR915 <SEP> AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 23)
<tb> Marqueur <SEP> D <SEP> LRR1R <SEP> GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 24)
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<tb> Marqueurs <SEP> Oligonucléotides <SEP> 5' <SEP> Séquence <SEP> oligonucléotide <SEP> 3'
<tb> L273 <SEP> F2-B2 <SEP> GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 7)
<tb> F2-Br <SEP> TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 8)
<tb> L246 <SEP> F2-B2 <SEP> Eco <SEP> ATTGATGAATCTACACTCCTCGATCTCTTC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 9)
<tb> F2 <SEP> Eco <SEP> GAGTTCAATCCATTTCAATGATTTAAGATA <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 10)
<tb> V681 <SEP> V681 <SEP> GGAATCTTGTTGAGGCCGAGAGGG <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 11)
<tb> V681 <SEP> V681R <SEP> GTTGTATATGGCTTCCCTGTAGCC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 12)
<tb> V1684 <SEP> V588 <SEP> CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 13)
<tb> V1684 <SEP> V551R <SEP> GAAGAAGGTGACGAGAGAGATGCC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 14)
<tb> V432 <SEP> V432 <SEP> AACTTCTCCAACTCCCTCCACTGC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 15) <SEP>
<tb> V432R <SEP> TTAGAGTGGCAAAGGGAAGATGGG <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 16)
<tb> GRP805 <SEP> GRP805 <SEP> ATCCCCTGTTTCCTTCAACAACCC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 17)
<tb> GRP805R <SEP> AACCCCCAAGAAGAAGAACAACCC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 18)
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<tb> Marqueur <SEP> LRR842R <SEP> CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 22)
<tb> Marqueur <SEP> LRR915 <SEP> AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 23)
<tb> Marqueur <SEP> D <SEP> LRR1R <SEP> GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> : <SEP> 24)
<tb>
Des combinaisons de ces oligonucléotides (Tableau 2) ont été utilisées pour amplifier l'ADN de plantes backcross issues du croisement [Fl(Védrantais x PI 161375) x Védrantais] et qui présentent des événements de recombinaison à proximité du locus Vat.
Les résultats sont illustrés par le Tableau 2 ciaprès, et la Figure 4.
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Tableau 2
<tb>
<tb> Marqueur <SEP> L273 <SEP> GRP805 <SEP> V432 <SEP> V1684 <SEP> Vat <SEP> V681 <SEP> L246 <SEP> M8
<tb> Oligo <SEP> 1 <SEP> F2-B2 <SEP> GRP805 <SEP> V432 <SEP> V588 <SEP> et <SEP> V681 <SEP> F2-B2Eco <SEP> M8
<tb> Oligo <SEP> 2 <SEP> F2-Br <SEP> GRP805R <SEP> V432R <SEP> V551 <SEP> R <SEP> ce <SEP> à <SEP> V681R <SEP> F2Eco <SEP> M8R
<tb> Digestion <SEP> BsrGI <SEP> Sapl <SEP> Haell <SEP> Pas <SEP> de <SEP> istan <SEP> Rsal <SEP> EcoRV <SEP> Aat <SEP> Il
<tb> apre
<tb> on <SEP> Védrantais <SEP> +28pb <SEP> 805 <SEP> pb <SEP> 432pb <SEP> env. <SEP> 1300pb <SEP> 681 <SEP> pb <SEP> 173 <SEP> pb <SEP> 228 <SEP> pb
<tb> icatio@
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805 435pb PI161375 182pb + 508 223pb 1684 +221 144pb 195 f P1161375 +28pb 508 pb +209pb 1684pb a o, 221pb +29pb +33pb 297 +25pb
<tb>
<tb> P20 <SEP> 82 <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> R <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> P6 <SEP> 93 <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> R <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> P1 <SEP> 47 <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> R <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 848- <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> S <SEP> - <SEP> +
<tb> P4 <SEP> 23 <SEP> ± <SEP> - <SEP> - <SEP> s <SEP> - <SEP> - <SEP> e
<tb> P1174 <SEP> ± <SEP> - <SEP> - <SEP> S <SEP> - <SEP> p <SEP> P35 <SEP> 35 <SEP> ± <SEP> - <SEP> - <SEP> S <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb> P35 <SEP> 53 <SEP> ± <SEP> - <SEP> - <SEP> S <SEP> - <SEP> -
<tb> 310 <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> S <SEP> P26 <SEP> 64 <SEP> + <SEP> + <SEP> ± <SEP> S <SEP> P1035 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> S
<tb> P49 <SEP> 40 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> R <SEP> + <SEP>
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Ces résultats montrent que :
La plante P26 64 présente un événement de recombinaison entre le marqueur V432 et le gène Vat.
La plante P26 64 présente un événement de recombinaison entre le marqueur V432 et le gène Vat.
La plante P49 40 présente un événement de recombinaison entre le marqueur L246 et le gène Vat.
La plante P10 35 présente un événement de recombinaison entre le marqueur V1684 et le gène Vat. Comme le marqueur V1684 comprend l'ATG du gène Vat, cette plante présente une recombinaison intragénique détruisant la fonction du gène.
Le marqueur V681 co-ségrège avec le gène Vat.
Ces données permettent donc d'identifier génétiquement le gène Vat.
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EXEMPLE 2 : SOUS-CLONAGE ET VERIFICATION DE LA SEQUENCE DU GENE VAT
Un sous clonage du gène Vat a été réalisé dans le vecteur pGEM3Zf+ (Promega). Pour ce faire, une digestion du clone BAC 3-18-9 avec l'enzyme de restriction Mscl a été réalisée. Chaque fragment ainsi généré a été ligué dans le vecteur pGEM3Zf+ (Promega) puis criblé avec les marqueurs flanquant le gène Vat ou internes à ce gène.
Un sous clonage du gène Vat a été réalisé dans le vecteur pGEM3Zf+ (Promega). Pour ce faire, une digestion du clone BAC 3-18-9 avec l'enzyme de restriction Mscl a été réalisée. Chaque fragment ainsi généré a été ligué dans le vecteur pGEM3Zf+ (Promega) puis criblé avec les marqueurs flanquant le gène Vat ou internes à ce gène.
Un clone de 18185 pb contenant le gène Vat a été identifié (Clone C7.1). Le séquençage des extrémités du clone C7. 1, des restrictions enzymatiques ainsi que le séquençage du gène Vat avec les oligonucléotides du Tableau 1 ont permis de vérifier qu'il s'agissait bien du gène Vat. La séquence d'une portion de 11097 pb de ce clone est représentée sur la Figure 1, ainsi que dans la liste de séquences en annexe (SEQ ID NO: 1).
EXEMPLE 3 : OBTENTION DE L' ADNc DU GENE VAT
L'ADNc a été obtenu en utilisant le kit MarathonTM cDNA clone kit, (Clontech). Cet ADNc est représenté sur la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 2.
L'ADNc a été obtenu en utilisant le kit MarathonTM cDNA clone kit, (Clontech). Cet ADNc est représenté sur la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 2.
Le gène Vat comporte 4 exons et 3 introns :
Le premier exon comporte 2367pb et s'étend de la base 1 du codon d'initiation ATG (correspondant à la position 2344 selon SEQ ID NO : 1) à la base 2367 (correspondant à la position 4710 selon SEQ ID NO : 1).
Le premier exon comporte 2367pb et s'étend de la base 1 du codon d'initiation ATG (correspondant à la position 2344 selon SEQ ID NO : 1) à la base 2367 (correspondant à la position 4710 selon SEQ ID NO : 1).
Le premier intron s'étend de la base 2368 à la base 2921 (4711 à 5264 selon SEQ ID NO : 1).
Le deuxième exon s'étend de la base 2922 à la base 4055 (5265 à 6398 selon SEQ ID NO : 1).
Le deuxième intron s'étend de la base 4056 à la base 4876 (6399 à 7219 selon SEQ ID NO : 1).
Le troisième exon s'étend de la base 4877 à la base 5734 (7220 à 8077 selon SEQ ID NO : 1).
Le troisième intron s'étend de la base 5735 à la base 5833 (8078 à 8176 selon SEQ ID NO : 1).
Le quatrième exon s'étend de la base 5834 à la base 5896 (8177 à 8239 selon SEQ ID NO : 1).
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EXEMPLE 4 : DISTINCTION ENTRE LE GENE VAT ET LE GENE VAT-LIKE
Lors du criblage précédent, un clone portant un homologue du gène Vat (Vat-like) a été identifié (93,8% d'identité au niveau nucléique et 89,9% au niveau protéique).
Lors du criblage précédent, un clone portant un homologue du gène Vat (Vat-like) a été identifié (93,8% d'identité au niveau nucléique et 89,9% au niveau protéique).
La séquence de Vat-like est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 4.
Les gènes Vat et Vat-like sont liés génétiquement et physiquement puisqu'ils sont séparés de 17 kb.
Deux marqueurs (marqueur D et marqueur E) permettent de distinguer le gène Vat du gène Vat-like chez PI 161375.
Le marqueur E est défini par les amorces : LRR1: CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC (SEQ ID NO : 21) et LRR842R : CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC (SEQ ID NO : 22)
Ce marqueur permet d'amplifier chez PI 161375 un fragment de 1722 pb correspondant au gène Vat, et un fragment de 1527 pb correspondant au gène Vat-like.
Ce marqueur permet d'amplifier chez PI 161375 un fragment de 1722 pb correspondant au gène Vat, et un fragment de 1527 pb correspondant au gène Vat-like.
Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la variété Védrantais a sur gel d'agarose une longueur d'environ 1,3 kb.
Le marqueur D est défini par les amorces : LRR915 : AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC (SEQ ID NO : 23) et LRR1R: GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC (SEQ ID NO : 24)
Ce marqueur permet d'amplifier chez PI161375 un fragment de 1549pb correspondant au gène Vat et un fragment de 1372 pb correspondant au gène Vat-like. Chez Védrantais, le marqueur permet d'amplifier 4 fragments d'ADN d'environ 750 pb, 900 pb, 1100 pb, 1300 pb.
Ce marqueur permet d'amplifier chez PI161375 un fragment de 1549pb correspondant au gène Vat et un fragment de 1372 pb correspondant au gène Vat-like. Chez Védrantais, le marqueur permet d'amplifier 4 fragments d'ADN d'environ 750 pb, 900 pb, 1100 pb, 1300 pb.
Les marqueurs L246 et M8 permettent de caractériser des recombinants entre le gène Vat et le gène Vat-like et de distinguer génétiquement ces deux gènes.
Le marqueur M8 est défini par les amorces : M8 : CCGACGCATCTCCCGACGCGTTGTTG (SEQ ID NO : 19) et M8R : TCGTGAAGGGTTTTGGAGAGTGAGAAA (SEQ ID NO : 20)
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Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la variété Védrantais et PI 161375 a une longueur de 228 pb. Le produit d'amplification de la variété PI 161375 possède un site de restriction pour l'enzyme AatII conduisant à l'obtention de deux fragments respectivement de 195 pb et 33 pb.
En effet, des plantes recombinantes entre les gènes Vat et Vat-like ont été identifiées au sein de la population backcross [Fl(Védrantais x PI 161375) x Védrantais]. Les plantes portant uniquement le gène Vat-like sont sensibles à Aphis gossypii, par exemple, la plante 848 (tableau 2). A l'inverse, les plantes ne possédant pas le gène Vat-like sont résistantes aux pucerons A. gossypii, par exemple la plante P4940 (Tableau 2).
EXEMPLE 5 : CONSTRUCTION D'UN VECTEUR D'EXPRESSION CONTENANT LE GENE VAT
L'ADN génomique du gène Vat sans son promoteur est introduit dans le vecteur binaire pGA643 (AN et al. Plant Molecular Biology Manual A3, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, p.119, 1988) contenant notamment le gène chimérique NOS/NPTII, le marqueur de sélection de résistance à la kanamycine et le promoteur p35S. Le gène Vat en orientation sens est introduit après le promoteur 35S. Le vecteur pGA643 est introduit dans la souche LBA4404 d' Agrobacterium tumefaciens.
L'ADN génomique du gène Vat sans son promoteur est introduit dans le vecteur binaire pGA643 (AN et al. Plant Molecular Biology Manual A3, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, p.119, 1988) contenant notamment le gène chimérique NOS/NPTII, le marqueur de sélection de résistance à la kanamycine et le promoteur p35S. Le gène Vat en orientation sens est introduit après le promoteur 35S. Le vecteur pGA643 est introduit dans la souche LBA4404 d' Agrobacterium tumefaciens.
Alternativement, l'ADN génomique complet, comprenant 2,5 kb environ en amont et en aval du gène Vat afin de s'assurer de la présence du promoteur et des séquences régulatrices, est introduit en bouts francs dans le vecteur SLJ7292 (JONES et al., Transgenic Research, 1,285- 297, 1992). Le vecteur binaire SLJ7292 contenant le gène Vat est introduit dans la souche C58 d' Agrobacterium tumefaciens (SCHWEITZER et al., Plasmid, 4 (2), 1980 ; et al., Science, 294 (5550), 2001).
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EXEMPLE 6 : VALIDATION FONCTIONNELLE CHEZ LE MELON - Transformation du melon
Le protocole suivi est celui décrit dans GUIS et al. (Scientia Horticulturae, 84,91-99, 2000).
Le protocole suivi est celui décrit dans GUIS et al. (Scientia Horticulturae, 84,91-99, 2000).
De jeunes explants de feuilles de melon sensible de variété Védrantais (VILMORIN) sont incubés sous agitation dans une suspension d'Agrobacterium tumefaciens (106 à 108 cellules/mL), pendant 30 minutes.
En fonction de la construction utilisée pour la transformation, la souche d'agrobactérie est soit C58 pour le construit avec l'ADN génomique (vecteur SLJ7292), soit LBA4404 si le construit comprend l'ADNc (vecteur pGA643). Les explants sont ensuite transférés sur du papier Whatman n 1 pendant 10 minutes, puis couchés sur le milieu de culture et incubés 3 jours à 27 C.
Au bout de 3 jours, les explants foliaires sont transférés dans le milieu de régénération contenant 100 mg.L- 1 de kanamycine et 500 mg.L-1 de carbenicilline.
- Régénération du melon
La régénération des explants foliaires est obtenue en utilisant les conditions décrites par KATHAL et al. (Plant Cell Reports, 7,449-451, 1988) avec quelques modifications.
La régénération des explants foliaires est obtenue en utilisant les conditions décrites par KATHAL et al. (Plant Cell Reports, 7,449-451, 1988) avec quelques modifications.
Les explants foliaires sont incubés dans le milieu MURASHIGE et SKOOG (MS) (Physiol. Plant, 15,473-497, 1962) supplémenté avec 1 M de 6-benzylaminopurine (BAP) et 1 M de 6-(y,y-diméthylallylamino)-purine (2iP) et solidifié dans l'agar 0,7g.L-1. Après 3 semaines de culture, les bourgeons formés de la partie basale des explants foliaires sont excisés et incubés sur milieu de développement constitué par le milieu MS supplémenté avec 1 M BAP et 0,2M d'acide gibbérélique (GA3) et 0,8g.L-1 d'agar. Les bourgeons sont ensuite placés dans le milieu d'enracinement constitué par le milieu MS sans régulateur de croissance. Dès que les racines apparaissent, les plantules sont acclimatées selon GUIS et al. (Scientia Horticulturae, 69,199-206, 1997) et
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transférées en serre suivant les pratiques culturales décrites par AYUB et al. (Nature Biotechnology, 14,862-866, 1996) .
L'analyse moléculaire ayant pour objet de vérifier la présence du gène Vat et son expression dans le génome des plantes régénérées est effectuée par PCR et RT PCR.
- Mesure de la résistance à la colonisation par A. gossypii
Le clone Nml collecté sur des melons (G. LABONNE, INRA , Montpellier) et décrit comme le clone 13 (LUPOLI et al., Entomologia Experimentalis et Applicata, 65,291-300, 1992) est utilisé. Les pucerons A. gossypii sont élevés sur melon Védrantais en chambre de culture (16 heures de jour à 24 C et 8 heures de nuit à 18 C).
Le clone Nml collecté sur des melons (G. LABONNE, INRA , Montpellier) et décrit comme le clone 13 (LUPOLI et al., Entomologia Experimentalis et Applicata, 65,291-300, 1992) est utilisé. Les pucerons A. gossypii sont élevés sur melon Védrantais en chambre de culture (16 heures de jour à 24 C et 8 heures de nuit à 18 C).
Le test de résistance à la colonisation par A. gossypii est adapté de PITRAT et LECOQ (Phytopathology, 70, 958-961, 1980). Les adultes aptères sont prélevés avec un pinceau fin et mis à jeûner pendant 1 heure dans une boîte de Pétri. Cinq pucerons sont déposés sur les feuilles de chaque plante à tester, soit maintenus dans une cage, soit en liberté. Sept jours après le dépôt des pucerons, les pucerons adultes et les larves présents sur les plantes sont comptés.
Sur les plantes sensibles, une nouvelle génération d'adultes est produite et de nombreuses larves sont présentes (en général plus de 100). Sur les plantes résistantes à la colonisation par A. gossypii, quelques adultes restent sur les plantes (moins de 5) et seules quelques larves sont présentes. Dans chaque test, les cultivars Védrantais et PI 161375 sont utilisés comme témoin sensible et résistant.
- Mesure de la résistance à la transmission des virus par A. gossypii.
Les tests de transmission virale sont réalisés essentiellement comme décrit par PITRAT et LECOQ (Phytopathology, 70,958-961, 1980). La souche E15HAT du ZYMV (Zucchini Yellow Mosaic Virus) fournie par H. LECOQ, est utilisée pour les tests de transmission par A. gossypii chez
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les plantes transformées et les lignées témoins Védrantais et PI 161375. Le virus est multiplié sur courgette par inoculation mécanique. Après 1 heure de jeûne, les pucerons adultes sont déposés pour 5 minutes d'acquisition sur les feuilles virosées placées en boîte de Pétri. Les pucerons sont ensuite transférés sur les plantes saines à tester. Environ 30 minutes après dépôt des pucerons virulifères, les plantes sont traitées avec un insecticide et mises en chambre de culture (12 heures de jour à 24 C et 12 heures de nuit à 18 C). Quinze jours après inoculation, les plantes sensibles à la transmission du ZYMV par A. gossypii développent des symptômes de mosaïque caractéristiques du ZYMV ; les plantes résistantes ne présentent aucun symptôme et le virus n'est pas détecté par ELISA dans ces plantes.
EXEMPLE 7 : VALIDATION FONCTIONNELLE CHEZ LA TOMATE - Transformation de la tomate
Le protocole de transformation est adapté de HAMZA et CHUPEAU (J. Exp. Bot., 44,1837-1845, 1993) à partir du génotype Férum (lignée INRA).
Le protocole de transformation est adapté de HAMZA et CHUPEAU (J. Exp. Bot., 44,1837-1845, 1993) à partir du génotype Férum (lignée INRA).
La souche C58 d'Agrobacterium tumefaciens est utilisée lorsque les transformations doivent être réalisées avec le vecteur SLJ7292 avec l'ADN génomique.
Lorsque les transformations sont effectuées avec l'ADNc, il est préférable d'utiliser un vecteur mieux adapté.
Ainsi, l'ADNc est introduit dans le vecteur PBI101 (Clontech@). Avec ce vecteur, la souche d'agrobactérie C58 peut également être utilisée.
L'analyse moléculaire ayant pour objet de vérifier la présence du gène Vat et son expression dans le génome des plantes régénérées est effectuée par PCR et RT PCR.
- Mesure de la transmission virale
Le protocole suivi est similaire à celui appliqué aux mesures de transmission virale chez le melon.
Le protocole suivi est similaire à celui appliqué aux mesures de transmission virale chez le melon.
La même souche d'A. gossypii (Nml) et le même protocole de transmission par A. gossypii que pour les tests
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de résistance à la transmission du virus sur melon sont utilisés. Le virus choisi est le CMV (virus de la mosaïque du concombre) souche I17F qui infecte le melon et la tomate.
Cette souche est efficacement transmise à la tomate, lorsqu'elle est inoculée mécaniquement ou transmise par Myzus persicae (JACQUEMOND et al., Molecular Breeding, 8(1), 85-94, 2001). Le virus est multiplié sur plantules de melon Védrantais. L'acquisition du CMV par A. gossypii est faite sur ces plantules de melon infectées. La transmission est faite sur des plantules de tomate au stade 2 feuilles (environ 5 semaines après semis) en déposant 10 pucerons virulifères sur chaque plante. Le taux de transmission sur chaque génotype (tomates témoins et transformées) est évalué sur au minimum 2 répétitions de 20 plantes. La variété témoin sensible est la variété Férum.
EXEMPLE 8 : VALIDATION FONCTIONNELLE CHEZ LE COTONNIER - Transformation du cotonnier
La transformation génétique du cotonnier Gossypium hirsutum L. est basée sur la régénération de transformants via un processus d'embryogenèse somatique publié par SHOEMAKER et al. (Plant Cell Reports, 3,178-181, 1986) et par TROLINDER et GOODIN (Plant Cell Reports, 6,231-234, 1987). Le procédé de transformation utilise la bactérie Agrobacterium tumefaciens comme vecteur de transformation selon UMBECK et al.
La transformation génétique du cotonnier Gossypium hirsutum L. est basée sur la régénération de transformants via un processus d'embryogenèse somatique publié par SHOEMAKER et al. (Plant Cell Reports, 3,178-181, 1986) et par TROLINDER et GOODIN (Plant Cell Reports, 6,231-234, 1987). Le procédé de transformation utilise la bactérie Agrobacterium tumefaciens comme vecteur de transformation selon UMBECK et al.
(Biotechnology, 5,263-266, 1987) et FIROOZABADY et al. (Plant Molecular Biology, 10,105-116, 1987) avec quelques modifications et adaptations par rapport aux publications mentionnées.
- Régénération du cotonnier
Des explants d'hypocotyles (variété Coker 310) prélevées sur des jeunes plantes cultivées en conditions aseptiques sont utilisés. Ils sont mis en présence de l'Agrobactérie pendant 20 minutes puis mis en culture 48 heures sur le milieu de culture de base MURASHIGE et SKOOG (MS) ne contenant ni agent de sélection ni antibiotique ayant pour but de stopper la croissance de la bactérie. Après cette
Des explants d'hypocotyles (variété Coker 310) prélevées sur des jeunes plantes cultivées en conditions aseptiques sont utilisés. Ils sont mis en présence de l'Agrobactérie pendant 20 minutes puis mis en culture 48 heures sur le milieu de culture de base MURASHIGE et SKOOG (MS) ne contenant ni agent de sélection ni antibiotique ayant pour but de stopper la croissance de la bactérie. Après cette
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période de co-culture, les explants sont repiqués sur le même milieu additionné de kanamycine à la concentration 25mg/L et de céfotaxime à la concentration 500mg/L et de substances de croissance (acide 2,4-dichlorophénoxy acétique et kinétine).
La concentration de ces deux phytohormones est de moitié celle préconisée dans les publications mentionnées. Les explants sont ensuite repiqués tous les 15 jours sur ce même milieu. Les cals issus de la prolifération des cellules transformées apparaissent après 3 à 5 semaines de culture.
Lorsque leur taille atteint environ 0,5 cm de diamètre, ils sont isolés et repiqués sur le même milieu dans lequel la concentration en céfotaxime a été réduite de moitié. Les repiquages interviennent ensuite toutes les 2 semaines jusqu'à l'apparition des tissus embryonnaires. Selon le comportement des cals, des séquences de milieux variant pour la concentration en substances de croissance peuvent être appliquées. Les tissus embryonnaires sont isolés sur le milieu de base sans ajout de substances de croissance. Sur ce milieu une certaine proportion des pro embryons se développent en plantules. Celles-ci sont transférées en tube sur un support de vermiculite arrosé par le milieu de base liquide. Lorsqu'elles atteignent une taille d'environ 4- 6 cm, elles sont directement transférées en serre de type S2.
L'analyse moléculaire ayant pour objet de vérifier la présence du gène Vat et son expression dans le génome des plantes régénérées est effectuée par PCR et RT PCR.
- Mesure de la résistance à l'infection par Aphis gossypii
Un clone d'A. gossypii prélevé sur cotonnier (originaire d'Afrique) est utilisé et maintenu sur cotonnier.
Un clone d'A. gossypii prélevé sur cotonnier (originaire d'Afrique) est utilisé et maintenu sur cotonnier.
En effet, il a été montré que les populations d'A. gossypii sont fortement structurées génétiquement en fonction de la plante hôte (VANLERBERGHE-MASUTTI et CHAVIGNY, Molecular Ecology, 7,905-914, 1998). Le test est réalisé selon le même protocole que sur melon mais avec des conditions de culture des plantes adaptées au cotonnier. Les cotonniers sont
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maintenus en serre de type S2 à une température de 28 C à 30 C, un éclairage d'appoint, en intensité et en durée, est apporté pour une photopériode de 12-12.
En plus de l'évaluation de la résistance réalisée comme pour le test melon, une évaluation plus précise de l'histoire de vie des pucerons sur les plantes transformées (durée des différents stades larvaires, durée de survie des adultes, taux d'accroissement intrinsèque,...) (XIA et al.
Entomologia Experimentalis et Applicata, 90,25-35, 1999) peut être également réalisée afin de détecter des effets éventuellement plus faibles du gène Vat sur A. gossypii en situation hétérologue.
Claims (18)
1) Polynucléotide isolé choisi parmi : a) un polynucléotide codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, lequel polypeptide possède au moins 80%, de préférence au moins 90% et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO: 3 ; b) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) ; c) un polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec le polynucléotide a) ; ou le polynucléotide b).
2) Polynucléotide selon la revendication 1, choisi parmi : a) le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 1 ; b) le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 2 ; c) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) ou du polynucléotide b) ; d) un polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec l'un quelconque des polynucléotides a), b) ou c).
3) Polynucléotide constitué par un fragment d'au moins 10 pb d'un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 ou 2.
4) Polynucléotide codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, et pouvant être obtenu par criblage d'une banque d'ADN génomique ou d'ADNc d'une plante à l'aide d'au moins une sonde d'acide nucléique et/ou d'au moins un couple d'amorces d'amplification obtenus à partir d'un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 à 3.
5) Marqueur génétique permettant la détection de la présence ou de l'absence d'un allèle du gène Vat favorable à la résistance à Aphis gossypii et/ou à la résistance à la transmission virale par ledit puceron, caractérisé en ce
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qu'il est choisi parmi les marqueurs suivants : L273, L246, V681, V1684, V432, GRP805, M8, marqueur E, marqueur D.
6) Couple d'amorces permettant l'amplification de l'un des marqueurs tel que défini dans la revendication 5, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8, - le couple d'amorces constitué par les polunucléotides SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10, - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12, - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 13 et SEQ ID NO : 14, - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 15 et SEQ ID NO : 16, le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 17 et SEQ ID NO : 18, - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 19 et SEQ ID NO : 20, - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 21 et SEQ ID NO : 22, et - le couple d'amorces constitué par les polynucléotides SEQ ID NO : 23 et SEQ ID NO : 24.
7) Kit pour détecter la présence, chez une plante, d'un allèle du gène Vat favorable à la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la résistance à la transmission virale par ledit puceron, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un couple d'amorces tel que défini dans la revendication 6.
8) Utilisation d'au moins un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 à 3 pour détecter la présence, chez une plante, d'un allèle du gène Vat favorable à la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la résistance à la transmission virale par ledit puceron.
9) Utilisation d'au moins un marqueur génétique selon la revendication 5 pour détecter la présence, chez une plante, d'un allèle du gène Vat favorable à la résistance au
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puceron Aphis gossypii et/ou à la résistance à la transmission virale par ledit puceron.
10) Utilisation selon une quelconque des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce que ladite plante est une cucurbitacée.
11) Procédé de détection de la résistance ou de la sensibilité d'une plante au puceron Aphis gossypii et/ou de la résistance à la transmission virale par ledit puceron, caractérisé en ce qu'il comprend la détermination de la forme allélique du gène Vat présente chez ladite plante.
12) Cassette d'expression comprenant un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 à 3, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
13) Vecteur recombinant comprenant un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 à 3 ou une cassette d'expression selon la revendication 12.
14) Cellule génétiquement transformée par un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 à 3.
15) Utilisation d'un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 ou 2 pour la production d'une plante transgénique résistante au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron.
16) Plante transgénique génétiquement transformée par un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 ou 2.
17) Plante transgénique selon la revendication 16, choisie parmi les cucurbitacées, les malvacées et les solanacées.
18) Polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron, caractérisé en ce qu'il possède au moins 80% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO : 3.
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108244059A (zh) * | 2018-03-13 | 2018-07-06 | 中国农业科学院棉花研究所 | 一种利用离体叶片饲养繁殖棉蚜的方法及棉蚜的鉴定方法 |
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|---|---|---|---|---|
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998030083A1 (fr) * | 1997-01-10 | 1998-07-16 | The Regents Of The University Of California | Acides nucleiques de gene de resistance destines a doter des plantes d'une resistance aux maladies |
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BROTMAN Y ET AL: "Resistance gene homologues in melon are linked to genetic loci conferring disease and pest resistance.", THEORETICAL AND APPLIED GENETICS, vol. 104, no. 6-7, May 2002 (2002-05-01), May, 2002, pages 1055 - 1063, XP002258059, ISSN: 0040-5752 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108244059A (zh) * | 2018-03-13 | 2018-07-06 | 中国农业科学院棉花研究所 | 一种利用离体叶片饲养繁殖棉蚜的方法及棉蚜的鉴定方法 |
| WO2021245135A1 (fr) | 2020-06-03 | 2021-12-09 | Vilmorin & Cie | Plants de melon résistants à la maladie de la gale, aux pucerons et au mildiou |
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