GENE DE RESISTANCE A SCLEROTINIA La présente invention est relative à de nouveaux polypeptides et polynucléotides utilisables pour lutter contre des champignons pathogènes des plantes, et notamment contre Sclerotinia. Sclerotinia sclerotiorum est un champignon phytopathogène qui peut infecter de nombreuses cultures (PURDY, Phytopathology, 69, 875-880, 1979) parmi lesquelles le tournesol, le colza, le chou, la laitue, le soja, le citronnier, la tomate, le melon, le concombre, ou encore le haricot de grande culture. Chez le tournesol, il est l'agent de la pourriture blanche aussi appelée sclérotiniose ou pourriture sclérotique, qui constitue une maladie majeure contre laquelle il n'existe pas de lutte chimique efficace. L'infection par Sclerotinia est visible depuis la formation du bouton floral jusqu'à la fin de floraison du tournesol. A partir de la floraison, sur feuille, pétiole et tige apparaissent une décoloration puis un ramollissement des organes atteints ; un mycélium blanc et dense les colonise, et est souvent observable à l'extérieur de la tige où il se condense en certains points avant de former des sclérotes ; du fait d'une moindre résistance des tissus, la tige peut casser et verser. A maturité, sur la face fleurie du capitule apparaissent des taches translucides ; le mycélium blanc et dense se condense ici en grille de sclérotes. L'intégralité des tissus du capitule est désagrégée par l'agent pathogène. Ne vont subsister que les fibres libéro-ligneuses du sommet de la tige donnant à celui-ci un aspect de fouet. La culture du tournesol connaît par conséquent des irrégularités de rendement dues aux pertes de production causées par ce champignon. Parmi les stratégies de lutte actuellement proposées, on citera notamment la sélection de variétés résistantes, afin de les utiliser pour l'amélioration variétale et la création d'hybrides. Le développement de nouvelles stratégies pour lutter contre l'infection à Sclerotinia est une des voies actuelles majeures dans la recherche sur les interactions plantes-pathogènes. Cela inclut par exemple l'identification de facteurs pathogènes essentiels dans la virulence et le développement des moyens pour les inhiber ou encore le transfert de gènes de résistance dans les plantes sensibles, afin d'augmenter leur résistance. Par exemple, le gène de Poxalate oxydase, qui est une enzyme capable de détruire les phytotoxines produites par Sclerotinia, a été utilisé et décrit dans la demande PCT WO 92/1568. Actuellement, les stratégies et outils de l'art antérieur ne sont pas suffisants pour lutter contre l'infection ravageuse de ce champignon pythopathogène et il existe un besoin réel d'isoler de nouveaux outils afin de permettre l'obtention d'une résistance à Sclerotinia dans les espèces qui en subissent l'infection, et notamment les espèces cultivées sensibles et d'intérêt industriel.
Il est donc important d'identifier d'autres gènes impliqués dans la résistance à Sclerotinia afin de pouvoir augmenter le niveau de résistance des plantes cultivées sensibles et améliorer le rendement des cultures d'intérêt. Les Inventeurs ont isolé, à partir àΗelianthus annuus un nouveau gène codant pour une protéine de la famille des kinases à serine et thréonine, et associé à la résistance du Tournesol à Sclerotinia. Ils ont aussi identifié chez le colza un orthologue de ce gène, et ont démontré qu'il intervenait également dans la résistance à Sclerotinia chez le colza. Ce gène, dénommé ci-après PK-P ou Ha-lecRK code pour une protéine de type lectine protéine-kinase. En comparant la séquence polypeptidique déduite de ce gène à celles de gènes connus, on révèle une homologie avec deux gènes, LRK-1
(SWARUP et al., Plant Physiol., 111, 347-347, 1996) et Lec-RKl (HERVE et al., Plant
Mol Biol., 39, 671-82, 1999) ά'Arabidopsis thaliana. Le gène At-LecRKl d'A. thaliana est activé au cours de la sénescence naturelle et en réponse aux blessures et aux oligogalacturonides ; il joue vraisemblablement un rôle dans le programme de développement et les processus adaptatifs (HERVE et al., 1999, précité). L'analyse comparative de séquences polypeptidiques déduites du gène PK-P (Ha-lecRK) sur des génotypes de tournesol présentant des niveaux de sensibilité variable à Sclerotinia a été réalisée. La Figure 1 représente les résultats de cette comparaison. Légende de la Figure 1 : Tournesols résistants sauvages : écotypes 101 et 103 (SEQ ID NO: 2 et SEQ ID NO: 9) ; tournesols cultivés (partiellement résistants) : lignées PAC1, PAC2, PSC8, et SD (SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 et SEQ ID NO: 13) ; tournesols cultivés sensibles : lignées CP73, XRQ, et GH (SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 et SEQ ID NO: 16) ; les acides aminés indiqués en gras et sur fond grisé dans les séquences des lignées partiellement résistantes PAC1, PAC2, PSC8, et SD correspondent aux principales mutations observées dans ces lignées par rapport aux plantes sauvages résistantes. Les positions du domaine lectine, du domaine transmembranaire, et du domaine kinase sont indiquées au dessus de l'alignement des séquences. Cette analyse met en évidence, chez les génotypes sensibles à Sclerotinia, une modification importante de la partie 'kinase' du gène : interruption ou décalage du cadre de lecture. Des différences existent en outre entre les lignées de tournesol sauvages résistantes à la maladie et les lignées de tournesol cultivées exprimant une résistance partielle. Ces différences portent sur la modification de divers acides aminés sur la protéine. Il est particulièrement intéressant d'isoler de nouvelles séquences polynucléotidiques permettant d'obtenir la résistance à l'infection pour les cultures
sensibles et plus particulièrement pour les tournesols cultivés sensibles ou partiellement résistants. La séquence polynucléotidique (SEQ ID NO: 1) codant pour la protéine PK-P du tournesol sauvage écotype 101 est indiquée ci-dessous : ATGTCTCCTCATCCACCACCATGTCTCCTCCTCCTCTTCCTCCTCCACCTCCACCTCCTCCCAATC CACCCCACTCTCTCCCAATCCTTCATCTACACCACCTTCAACCCCACCAACCTAACCACCAACGGC AACGCCACCATCACCACCACCGGCATCCTTAAACTCACCAACGTAAGCTCCCACACCATCGGTCAC GCTCTCTACCCACACCCCATCTGTTTCAAAACACCCCACACCAATACCACTCTCTCATTCTCCACC GCTTTTGTCTTCTCCATCGTCCCACGATACCGCAAACTCGGTGGTCATGGCCTTGCTTTCACCATC TCTCCGACCAAACACTTCATCGGAGCCCAACCTAGTCAATACCTCGGACTTGTCAACGTTACTTCA AACGGTAACTCATCAAACCATCTTTTTGCTATAGAGTTTGACACCGTTCAAGATCTTGAGTTTTCT GATATTAACGACAACCATGTTGGTGTTAACATTAACCATATGAAGTCGGTTAATTCGACGAAAGCC GGATTTTTCGTTGATGGGAATGTTACTAAACAGGATCTTTGTTTACATAGTGGGAAAAAGATTCAA GCTTGGGTTGATTATGATGCTGAAAAACATCAAGTTGATGTTTATCTTTCTTTATTTTCAAACAAA CCAAGAAAGGCGATCATGTCGGTTTTCGTCGATTTAACACCGGTTTTTCAAGAGTTTATGTACGTG GGGTTTTCTTCATCAACCGGTGTTCTTGCTAGCTCGCATTATGTGTTTGGTTGGAGCTTTAACATG AGTGGAAATGCAAGTTCTTTGAATGTGGATCAGTTTCCTGAACCTGTTCTGCCATTTAAAAAGAAC AATAATAAAGGTTTCGTGTTCCGGTTTGGTACTACTTTGTTTTTGGTTTTTTGTATTTTTGTGATA ATGGGTGGTGTTTATATTATCAAGAAGTTTAAGATAATTAAGAAGACAGAAGCGGTTGAAAGTTGG GAGCTTGATTTGGGCCCACATTCATATTGTTATAGAGAGTTGAAAGAGGGTACAAAGGGGTTTAAT GAGAAGTTTTTAATTGGGTTTGGTGGGTCGGGTAAGGTTTATAAAGGGGTGTTGCCGGATTCGGGG ATGGAAATCGCGGTGAAGCGGATTTCACGGCAGTCGAAACAAGGGCAGAAGGAGTTTTTGTCGGAG GTGTCGACGATTGGGCGGCTTCGGCACCGGAATTTGGTGCAGTTGTTGGGTTGGTCTAGGAATAAA GGTGAGTTGTTGTTGGTTTATGAGTTTATGGCTAATGGAAGTTTGGATAAGTGTATATATAGTGGT AATAAGCCTAAATTGGTTTTGAGTTGGGAACAAAGGTTTAAGGTTATAAAAGATGTGGCAAATGGG TTGCTTTATTTGCATGAAGGGTGGGAACAAACTGTGGTGCATAGAGATATTAAAGCAGGAAATGTG TTGTTGGATTCTGATTTGAATGGTAAGTTAGGCGATTTCGGGTTGGCTAAGTTGTATGAGCATGGG TCGAACCCGGTAACCACTAAAGTGGTGGGCACATTGGGTTACTTGGCTCCTGAGCTAACCCGAACG GGTAAGCCCACCACGGGTTCGGATGTGTATGCATTCGGGGCTCTTTTGTTGGAAGTGGTGTGTGGA CGGAGACCCGCTGAGCTCAAGGCGTCACCGGAGGAGCTCATTTTGGTTGATTGGGTTTGGGATAAG TGGCGAGAAGGGTGTTTACTTGATGTGGTGGATTCGCGGTTGAAGGGTGAGTTTAATGAGGTTGAA GTTACGATGGTTTTGAAGGTTGGGTTAATGTGTTCTAATGATGAGCCGTCGAGCAGGCCGAGTATG AGGCAGGTGATTCGGTACTTGGAGAGGGAGGCGCCCGTGCCGGAGATTGTAGGTCCGTCGTGTTAT GGTATTGTGATGGAGATTGATCGGCATGCACCTGCATTAGTGAAATTGAAGTCTTTGTGA La séquence polypeptidique de la protéine PK-P du tournesol
(SEQ ID NO: 2), déduite de cette séquence polynucléotidique, est indiquée ci-dessous (en code 1 -lettre) :
MSPHPPPCLLLLFLLHLHLLPIHPTLSQSFIYTTFNPTNLTTNGNATITTTGILKLTNVSSHTIGH ALYPHPICFKTPHTNTTLSFSTAFVFSIVPRYRKLGGHGLAFTISPTKHFIGAQPSQYLGLVNVTS
NGNSSNHLFAIEFDTVQDLEFSDINDNHVGVNINHMKSVNSTKAGFFVDGNVTKQDLCLHSGKKIQ AWVDYDAEKHQVDVYLSLFSNKPRKAIMSVFVDLTPVFQEFMYVGFSSSTGVLASSHYVFGWSFNM SGNASSLNVDQFPEPVLPFKKNNNKGFVFRFGTTLFLVFCIFVIMGGVYIIKKFKIIKKTEAVESW ELDLGPHSYCYRELKEGTKGFNEKFLIGFGGSGKVY/KGVLPDSGMEIAVKRISRQSKQGQKEFLSE VSTIGRLRHRNLVQLLG SRNKGELLLVYEF ANGSLDKCIYSGNKPKLVLSWEQRFKVIKDVANG LLYLHEG EQTVVHRDIKAGNVLLDSDLNGKLGDFG AKLYEHGSNPVTTKVVGTLGYLAPELTRT GKPTTGSDVYAFGALLLEVVCGRRPAELKASPEELΓ VD VWDKWREGCLLDVVDSRLKGEFNEVE VTMVLKVGL CSNDEPSSRPSMRQVIRYLEREAPVPEIVGPSCYGIV EIDRHAPALVKLKSL La séquence polynucléotidique partielle (SEQ ID NO: 23) du gène codant pour la protéine PK-P du colza est indiquée ci-dessous :
GTTTGGAGATATTGATGATAATCATGTTGGGATTAACATCAATGATATGAGATCTGTTGTCTCTGC TTCTGCTGGTTACTATGATGATGAAGATGGACAGTΓTAAGA TCTTTCTTTGATTAGTAGAAATGT AATGAGGCTTTCTATAGTTTATAGTCAGCCTGATCAACAGCTTAΆTGTTACTCTCTTCCCTGCCGA GATCTCTGTTCCTCCTCGAAAACCGCTTTTGTCGTΓAAACCAAGATCTTTCTCCATATTTGCTTGA GGAAATGTATCTTGGATTCACTGCTTCAACTGGTTCAGTTGGTGCAGTTCATTACATGATGGGTTG GTTTATTGTTGGAGAGATCAGTTATCCGAGTTTGGA.GTTTGGTAGGCAACCAAACCTTCCTCCATA TCCAAAGAAAGCATCTCACAGAACAAGAACCGTTTTAGCGGTCTGCTTAACTGTATCCGTAATCGC TGCATTTATCGCCTTGTGGTTTGGTTTAGTCTTTTACTTGAGACACAAGAAAGTTAAAGAAGTTCT TGAGGAATGGGAGATACAATATGGACCTCATAGGTΓTGCTTACAAGGAGCTTTCCAATGCCACAAA GGGTTTCAAGGAGAAACAACTTCTTGGAAGAGGAGGTTTTGGTCAAGTCTATAGAGGCACACTTCC TGGTTCTGATGCAGAGATTGCTGTGAΆACGGACTTCTCATGATTCAAGGCAAGGGATGAGAGAGTT TCTAGCCGAGATATCGACAATTGGTCGGCTCAGACATCCAAATCTAGTCAGGCTTTTGGGGTATTG TAGGCATAAAGAACATCTCTACTTGGTTTATGACTATGCCTAATGGAAGA La séquence polypeptidique partielle (SEQ ID NO: 24) de la protéine PK-P du colza, déduite de cette séquence polynucléotidique, est indiquée ci-dessous (en code 1 -lettre) :
FGDIDDNHVGININDMRSVVSASAGYYDDEDGQFKMLSLISRNVMRLSIVYSQPDQQLNVTLFPAE ISVPPRKPLLSLNQDLSPYLLEEMYLGFTASTGSVGAVHYMMGWFIVGEISYPSLEFGRQPNLPPY PKKASHRTRTVLAVCLTVSVIAAFIALWFGLVFYLRHKKVKEVLEEWEIQYGPHRFAYKELSNATK GFKEKQLLGRGGFGQVYRGTLPGSDAEIAVKRTSHDSRQGMREFLAEISTIGRLRHPNLVRLLGYC RHKEHLYLVYDYA La présente invention a pour objet un polypeptide isolé intervenant dans la résistance d'une plante à Sclerotinia, caractérisé en ce qu'il présente au moins 40%, en particulier au moins 45%, de préférence au moins 50%», de manière tout à fait préférée au moins 55%, et très avantageusement, par ordre de préférence croissante, au moins 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% d'identité avec le polypeptide PK-P du tournesol (SEQ ID NO: 2). Avantageusement ledit polypeptide est choisi parmi : le polypeptide PK- P du tournesol (SEQ ID NO: 2), et le polypeptide PK-P du colza (SEQ ID NO: 24).
On entend ici par «polypeptide intervenant dans la résistance d'une plante à Sclerotinia» un polypeptide dont l'expression ou l'activité sont corrélés au niveau de résistance à Sclerotinia. Sauf précision contraire, les pourcentages d'identité de séquence indiqués ici pour les séquences nucléotidiques et les pourcentages d'identité ou de similarité indiqués pour les séquences peptidiques se réfèrent à la valeur obtenue, sur une fenêtre de comparaison constituée par la totalité de la séquence de référence, avec la suite logicielle BLAST (ALTSCHUL et al, Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402, 1997) en utilisant les paramètres par défaut. Selon la présente invention, une plante est considérée comme résistante à Sclerotinia si l'apparition des symptômes provoqués par l'infection de la plante par le pathogène est retardée. Par exemple, une plante sera dite résistante (ou tolérante) à Sclerotinia si la colonisation des tissus végétaux par le champignon nécessite une durée plus longue par rapport à une plante sensible. La plante est également dite résistante, selon la présente invention, si les symptômes restent localisés à une partie délimitée de la plante. La plante est dite résistante lorsqu'aucun symptôme n'apparaît et/ou lorsqu'il y a absence totale dudit pathogène dans les tissus végétaux après infection par Sclerotinia. La présente invention a également pour objet un polynucleotide isolé choisi parmi : a) un polynucleotide codant pour un polypeptide conforme à l'invention, tel que défini ci-dessus ; b) un polynucleotide complémentaire du polynucleotide a) ; c) un polynucleotide capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec le polynucleotide a) ; ou le polynucleotide b). Selon la présente invention, on définit comme polynucleotide « codant pour » un polypeptide donné, tout polynucleotide contenant l'information génétique permettant la synthèse dudit polypeptide. Il peut s'agir par exemple d'une séquence codante, d'un ADNc ou d'un ARNm, ou d'un fragment d'ADN génomique. Des exemples non limitatifs de polynucléotides conformes à l'invention, codant pour un polypeptide favorisant la résistance à Sclerotinia, est représenté par le polynucleotide SEQ ID NO:l, codant pour le polypeptide PK-P du tournesol, ou par le polynucleotide, dont la séquence partielle est indiquée ci-dessus (SEQ ID NO: 23), codant pour le polypeptide PK-P du colza. La présente invention inclut également tout fragment d'au moins 10 pb, de préférence au moins 15 pb, avantageusement au moins 20 pb, et de manière tout à fait préférée au moins 50 pb d'un polynucleotide a) ou b) ci-dessus, ou capable de s'hybrider sélectivement, en conditions stringentes, avec un polynucleotide a) ou b) ci-dessus. Des fragments préférés sont ceux du polynucleotide SEQ ID NO:l codant pour le polypeptide PK-P du tournesol, ou du polynucleotide codant pour le
polypeptide PK-P du colza, comprenant la séquence (SEQ ID NO: 23) ci-dessus, ou ceux capables de s'hybrider sélectivement en conditions stringentes avec l'un ou l'autre de ces polynucléotides ou de leurs complémentaires. Des conditions stringentes d'hybridation, pour un polynucleotide donné, peuvent être identifiées par l'homme du métier en fonction de la taille et de la composition en bases du polynucleotide concerné, ainsi que de la composition du mélange d'hybridation (notamment pH et force ionique). Généralement, des conditions stringentes, pour un polynucleotide de taille et de séquence données, sont obtenues en opérant à une température inférieure d'environ 5°C à 10°C à la température de fusion (Tm) de l'hybride formé, dans le même mélange réactionnel, par ce polynucleotide et son complémentaire. On définit ici comme polynucleotide capable de s'hybrider sélectivement avec un polynucleotide a) ou b) conforme à l'invention tout polynucleotide qui lorsqu'il est hybride en conditions stringentes avec une banque d'acides nucléiques (par exemple une banque d'ADN génomique ou d'ADNc) produit un signal d'hybridation détectable (c'est-à-dire au moins 2 fois supérieur, de préférence au moins 5 fois supérieur au bruit de fond) avec ledit polynucleotide, mais ne produit aucun signal détectable avec d'autres séquences de ladite banque, et notamment avec des séquences codant pour d'autres kinases, ou des séquences codant pour des protéines, autres que les polypeptides conformes à l'invention, possédant un domaine lectine, ou un domaine GDI. La présente invention a également pour objet des sondes polynucléotidiques ou des amorces d'amplification obtenues à partir de polynucléotides a) ou b) conformes à l'invention, ou de fragments de ceux-ci, tels que définis ci-dessus. A titre d'exemples d'amorces d'amplification conformes à l'invention, on peut citer celles du couple suivant : PKP Forward (SEQ ID NO: 3): 5' ATGTCTCCTCATCCACCACCA 3'
PKP Reverse (SEQ ID NO: 4): 5' TCACAAAGACTTCAATTTCACTAAT 3' qui permettent d'amplifier la totalité de la séquence codant pour PK-P à partir d'une banque d'ADN de tournesol, ainsi que celles du couple suivant: O210 LecRK/for (SEQ ID NO: 25) : 5' -GTTTGGAGATATTGAΓGATAATC-3 ' O211 LecRK/rev (SEQ ID NO: 26) : 5' -TCTTCCATTAGGCATAGTCATA-3' qui sont utilisables pour isoler des orthologues du gène PK-P de tournesol chez d'autres espèces, notamment chez le colza. La présente invention englobe aussi tout polynucleotide codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance à Sclerotinia, et pouvant être obtenu à partir d'une banque d'ADN génomique ou d'ADNc de plante par criblage de ladite banque à l'aide de sondes ou d'amorces conformes à l'invention. Ceci inclut notamment les différents allèles du gène PK-P, du tournesol et du colza, et notamment les allèles capables d'augmenter la résistance à Sclerotinia, ainsi que des orthologues du gène PK-P, chez des plantes autres que le tournesol ou le colza.
La présente invention englobe également des marqueurs génétiques permettant la détection de la présence ou de l'absence chez une plante, de la forme allélique du gène PK-P présente chez ladite plante, et notamment la détection de la présence ou de l'absence d'un allèle du gène PK-P favorable à la résistance à Sclerotinia. Des marqueurs génétiques conformes à l'invention, peuvent par exemple être définis à partir de la séquence SEQ ID NO : 1 ou des séquences d'ADNc ou d'ADN génomique conespondantes, en comparant ces séquences avec leurs homologues obtenus à partir de plantes de différents niveaux de résistance à Sclerotinia, afin de détecter les polymorphismes existant entre ces séquences, et de déterminer la fonrte associée à un niveau de résistance déterminé. Ces polymorphismes peuvent être situés dans les régions codantes du gène. De préférence, il s'agit de polymorphismes se traduisant par des modifications de la séquence peptidique de la protéine. Des exemples de polymorphismes de ce type sont ceux se traduisant par les modifications de séquence peptidique représentées sur la figure 1. Il peut également s'agir de polymorphismes situés dans la région 5' non codante ou dans les introns du gène, qui peuvent se traduire par une modification de séquence de la protéine, ou par une modification de son niveau d'expression. Lorsqu'un polymorphisme a été ainsi identifié, il est possible de l'utiliser comme marqueur génétique de résistance ou de sensibilité, et de définir des outils (sondes d'acide nucléique, amorces d'amplification, enzymes de restriction) permettant de distinguer ses différentes formes. Des plantes possédant un allèle du gène PK-P favorable à la résistance à Sclerotinia ainsi identifié peuvent être utilisées comme source de matériel génétique pour améliorer la résistance à Sclerotinia de plantes non-résistantes ou faiblement résistantes, par exemple par introgression dudit allèle dans lesdites plantes. La présente invention englobe également l'utilisation de polynucléotides conformes à l'invention pour la détection de la forme allélique du gène PK-P présente chez une plante et notamment pour la détection de la présence ou de l'absence d'allèles du gène PK-P favorables à la résistance à Sclerotinia. La présente invention a en particulier pour objet un procédé d'évaluation du niveau de résistance d'une plante à Sclerotinia, caractérisé en ce qu'il comprend la détermination de la forme allélique du gène PK-P présente chez ladite plante. Ce procédé peut notamment être mis en œuvre pour la sélection de plantes résistantes à Sclerotinia, par détection chez lesdites plantes d'un allèle du gène PK-P favorable à la résistance à Sclerotinia. Ladite plante peut appartenir à une quelconque des espèces sensibles à Sclerotinia. Avantageusement, il s'agit du tournesol et du colza.
La présente invention a également pour objet des amorces oligonucléotidiques utilisables pour la mise en œuvre des méthodes de détection définies ci-dessus. En particulier la présente invention a pour objet tout couple d'amorces permettant l'amplification spécifique d'une région du gène PK-P comprenant au moins un polymorphisme associé au niveau de résistance à Sclerotinia. La présente invention a également pour objet des kits pour la mise en œuvre d'un procédé conforme à l'invention. Ces kits comprennent au moins un couple d'amorces conforme à l'invention, éventuellement associé à des réactifs permettant la mise en œuvre d'une réaction d'amplification, à des moyens de détection du produit d'amplification, à une ou plusieurs enzymes de restriction, et/ou à des témoins positifs et/ou des témoins négatifs d'amplification. La présente invention a aussi pour objet : - une cassette d'expression recombinante comprenant un polynucleotide conforme à l'invention, placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ; - un vecteur recombinant résultant de l'insertion, dans un vecteur-hôte approprié, d'un polynucleotide ou d'une cassette d'expression conforme à l'invention. La présente invention englobe aussi des cellules hôtes génétiquement transformées par un polynucleotide conforme à l'invention. De préférence, il s'agit de cellules hôtes comprenant une cassette d'expression conforme à l'invention. On définit comme « cellule hôte génétiquement transformée » toute cellule hôte dont le contenu génétique a été modifié par introduction d'une information génétique étrangère. Les cellules hôtes peuvent être des cellules eucaryotes ou procaryotes. A titre d'exemples on citera des bactéries, notamment E. coli ou Agrobacterium, des levures, par exemple Saccharomyces, des cellules animales ou, préférentiellement, des cellules végétales. La présente invention englobe également un procédé de production d'un polypeptide recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation d'une cellule hôte, procaryote ou eucaryote, par un polynucleotide conforme à l'invention, et la récupération dudit polypeptide produit par ladite cellule. Le choix du vecteur-hôte et des séquences de régulation de l'expression est effectué en fonction de la cellule hôte ou de l'organisme hôte choisi et de l'application envisagée. La présente invention a aussi pour objet un procédé pour augmenter la résistance d'une plante à Sclerotinia, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de ladite plante par un polynucleotide codant pour un polypeptide conforme à l'invention.
Selon un mode de mise en œuvre préféré du procédé conforme à l'invention, ladite plante est transformée par une cassette d'expression conforme à l'invention. La présente invention englobe également des plantes transgéniques susceptibles d'être obtenues par un procédé conforme à l'invention, ainsi que les descendants de ces plantes et les hybrides obtenus par croisement, contenant un transgène comprenant un polynucleotide conforme à l'invention. L'invention concerne de plus les tissus ou parties de plantes, plantes, ou graines transformés par un polynucleotide, une cassette d'expression ou un vecteur recombinant selon l'invention. Le terme "tissu de plante" fait référence à n'importe quel tissu d'une plante, dans une plante ou dans une culture. Ce terme inclut des plantes entières, des cellules de plantes, des organes de plantes, des graines de plantes, des protoplastes, des cals, des cultures de cellules et toutes autres cellules de plantes organisées en tant qu'unité fonctionnelle et/ou structurelle. Des parties de plantes régénérées telles que des fleurs, des graines, des feuilles, des tiges, des fruits, du pollen, des tubercules, bois et analogues sont également dans le cadre de l'invention. Des plantes transgéniques ou parties de plantes conformes à l'invention peuvent avantageusement être obtenues à partir de plantes d'espèces sensibles à
Sclerotinia, et notamment d'espèces telles que le tournesol, le colza, le chou, la laitue, le soja, le citronnier, la tomate, le melon, le concombre, ou encore le haricot de grande culture. La transformation génétique des plantes peut être effectuée par les techniques classiques, qui sont bien connues en elles-mêmes de l'homme du métier. Classiquement, le polynucleotide que l'on souhaite exprimer dans la plante transformée est associé à des séquences de régulation de l'expression appropriées incluant notamment un promoteur. Ces séquences de régulation de l'expression peuvent être les séquences endogènes du gène que l'on souhaite exprimer, il peut s'agir également, en totalité ou en partie, de séquences hétérologues. Le choix d'un promoteur approprié, parmi la très grande variété disponible, dépendra de la plante que l'on souhaite transformer, ainsi que du profil d'expression que l'on souhaite obtenir (par exemple constitutif, inductible ou tissu- spécifique). A titre d'exemples de promoteurs pouvant avantageusement être utilisés dans le cadre de la présente invention, on peut citer notamment les promoteurs des gènes PR5-2 ou BAP, inductibles par Sclerotinia, qui sont décrits dans le Brevet US 6667427. Un très grand assortiment de méthodes pour l'introduction de polynucléotides dans des cellules végétales, des tissus végétaux, ou des plantes est également disponible. Le choix de la méthode la plus appropriée dépend généralement de la plante que l'on souhaite transformer. A titre d'exemples non-limitatifs, pour la
transformation du tournesol, on peut utiliser les techniques décrites dans la Demande PCT WO 95/06741. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l'isolement de la séquence codant pour la protéine PK-P et sa fonction, l'utilisation de cette séquence pour la transformation de plantes.
EXEMPLE 1 : ISOLEMENT DU GENE PK-P La séquence codante du gène PK-P est obtenue à partir d'ADN génomique de tournesol en utilisant les amorces suivantes : PKP Forward (SEQ ID NO: 3): 5' ATGTCTCCTCATCCACCACCA 3'
PKP Reverse (SEQ ID NO: 4): 5' TCACAAAGACTTCAATTTCACTAAT 3' Les conditions d'amplification PCR sont les suivantes:
Mélange réactionnel :
Tampon "Advantage 2 PCR" 10X (BD BIOSCIENCES) 5μl
Mélange de dNTP lOmM 1.5 μl
Amorce PKP Forward (lOOng/μl) lμl
Amorce PKP Reverse (lOOng/μl) lμl
Polymérase Taq "Advantage 2 polymerase Mix" (BD
BIOSCIENCES) μl
ADN génomique 500 ng
Eau qsp 50μl
Conditions de réaction - 95°C 5mn
-(95°C, 30 s; 58 °C, 30s; 72°C 2 mn ) X 35 cycles
- 72°C 5 mn
- 4°C
EXEMPLE 2 : CONSTRUCTION DE VECTEURS D'EXPRESSION ET TRANSFORMATION DU TOURNESOL
Construction du plasmide pkplOl.lpBIN La séquence codante du gène PK-P, (écotype 101, SEQ ID NO: 1) en orientation sens est clonée dans le vecteur pGemT easy (Promega). Un site BamHI est inséré en 5' et un site Pstl est inséré en 3' du gène PK-P, en utilisant le couple d'amorces : >PKP Forward/Ba HI (SEQ ID NO: 5)
CGGGATCCC GAT CAC CGA CAA ATG TCT CCT
>PKP Reverse/Pstl (SEQ ID NO: 6)
AACTGCAGAACCAATGCATTTCACAAAGACTTCAATTTCACTAAT , (les sites introduits sont soulignés). Le produit PCR à bouts francs obtenu est sous-cloné dans le vecteur
PCR-BluntlI-Topo (Invitrogen), pour donner le vecteur pkplOl.l-BluntlI-TOPO. L'insert
BamHI/Pstl contenant la séquence PK-P est excisé du vecteur pkp 101.1 -Bluntïï-TOPO, et introduit dans un vecteur d'accueil (pUCNveaupolylinker), préalablement linéarisé par BamHI et Pstl, entre le promoteur 35S et le terminateur Tnos. Le vecteur obtenu est dénommé PucNveauPoly-P35S-PKPl 01.1. Le vecteur PucNveauPoly-P35S-PKP101.1 est digéré par StuI et EcoRI.
L'insert 35S-PKP-Tnos résultant de cette digestion est introduit dans le vecteur binaire pBIN19 (BEVAN et al, Nucl. Acids Res. 12, 8711-8721, 1984), préalablement ouvert par Hind III, pourvu de bouts francs par action de la polymérase de Klenow, puis digéré par EcoRI. Le vecteur résultant, dénommé pkplOl.lpBIN est schématisé sur la
Figure 2. L'ensemble de ces constructions est réalisé dans E.coli DH5α.
Construction de vecteurs antisens : pkpXantisenspBIN et pkpXantisenspBINGUS Une séquence de la région 3' du domaine kinase de PK-P, représentée ci-dessous (SEQ ID NO: 7), est insérée en orientation antisens dans le vecteur binaire pBIN19.
CGTCACCGGAGGAGCTCATTTTGGTTGATTGGGTTTGGGATAAGTGGCGAGACGGGCGTTTACTTG ATGTGGTGGATTCGCGGTTGAAGGGTGAGTTTAATGAGGGTGAAGTTACGATGGTTTTGAAGGTTG GGTTAATGTGTTCTAATGATGAGCCGTCGAGCAGGCCGAGTATGAGGCAAGTGATTCGGTACTTGG AGAGGGAGGGGCCCGTGCCGGAGATTGTAGGTCCGTCGTGTAATGGTGTTGTGATGGAGATTGATC GGCATGCACTTGCATTAGTGAAATTGAAGTCTTTG Le vecteur résultant, dénommé pkpXantisenspBIN est schématisé sur la Figure 3 A. La même construction a été réalisée en associant la séquence antisens de
PK-P avec le gène rapporteur GUS. Le vecteur résultant, dénommé pkpXantisenspBINGUS est schématisé sur la Figure 3 B. pkpantisens(Lect-Kin) pBIN Une séquence de la région Iectine-kinase de PK-P, représentée ci- dessous (SEQ ID NO: 8), est insérée en orientation antisens dans le vecteur binaire pBIN19.
GATCCGAAATCCGCTTCACCGCTATTTCCACCCCCGAATCCGGCAACACCCCTTTGTAAACCTTAC CCGACCCACCAAACCCAATTAACAACTTCTCATTAAACCCCTTTGTACCCTCTTTCAGCTCTTTAT AACAATATGAATGTGGGCCCAAACCAAGCTCCCAACTTTCAACCGCTTCTGTCTTCTTAATTATCT TAAACTTCTTGATAATATAAACACCACCCATTATCACAAAAATACAAAAAACCAAAAACAAAGTAG TACCAAACCGGAACACGAAACCTTTATTATTGTTCTTTTTCAATGGCAGAACAGGTTCAGGAAACT GGTCCACATTCAAAGAACTTGCATTTCCACTCATGTTAAAGCTCCAACCAAACACATAATGCGAGC
TAGCAAGAACACCGGTTGATGAAGAAAACCCCACGTACATAAACTCTTGAAAAACCGGTGTTAAAT CGAAGAAAACCGACATGATCGCCTTTCTTGGTTTGTTTGAAAATAAAGAAAGATAAACATCAACTT GATGGTTTTCACCATCATAATCAACCCAAGCTTGAATCTTTTTCCCACTATGTAAACAAAGATCCT GTTTAGTAACATTCCCATCGACGAAAAACCCGGCTTTCGTCGAATTAACCGACTTCATATGGTTAA TATTAACACCAACATGGTTGTCGTTAATATCAGAAAACTCAAAATCTTGAACGGTGTCAAACTCTA TAGCGAAAAGATGGTTTGATGAGTTACCGTTTGAAGTAACGTTGACAAGTCCGAGGTATTGACTAG GTTGTGCTCCGATGCTGCA Le vecteur résultant, dénommé pkpantisens(Lect-Kin) pBIN est schématisé sur la Figure 4. Transformation du tournesol : Le plasmide choisi pour la transformation est introduit dans la souche GV2260 (DEBLAERE et al. Nucleic Acids Res 13, 4777-4788, 1985) d' Agrobacterium tumefaciens. La transformation du tournesol (lignée NSU) est effectuée selon le protocole décrit dans la Demande PCT WO 95/06741, avec les modifications suivantes : les graines sont stérilisées pendant 30 minutes dans de l'eau de javel additionnée de quelques gouttes de détergent (Tween 20), puis rincées 3 fois à l'eau distillée stérile, et la pellicule recouvrant la graine est éliminée en conditions aseptiques. Les graines sont stérilisées comme décrit ci-dessus pendant 20 minutes, rincées 3 fois à l'eau distillée stérile, et mises à tremper pendant une nuit dans l'eau distillée stérile, à 25°C et à l'obscurité. Le lendemain, les cotylédons et les radicules sont éliminés, et les apex sont immergés pendant 30 minutes dans une suspension de la souche GV2260 contenant le plasmide pkplOl.lpBIN ou pkpXantisenspBin ou le plasmide pkpantisens(Lect-Kin)pBin. Après la transformation, les apex sont mis en culture, dans les conditions décrites dans la Demande PCT WO 95/06741. Un contrôle de la présence du gène de résistance au Sclerotinia PK-P a ensuite été effectué en utilisant la technique du Southern. Ce contrôle permet aussi d'identifier le nombre de copies du gène qui a été inséré. Une fois la présence des deux gènes confirmée, les plantes transgéniques sont ensuite transférées en serce et isolées pour éviter tout risque de pollinisation croisée.
Caractérisation des tournesol transformés Les caractérisations moléculaires (présence et nombre de copies du gène) des transformants sont effectuées par Southern pour les transformants primaires T0 et la descendance T 1. Les protocoles utilisés sont décrits ci-dessous :
Prélèvements du matériel biologique : Des disques sont prélevés à l'emporte pièce sur des feuilles de transformants primaires cultivés en sene, ils sont immédiatement congelés dans l'azote liquide. Extraction et quantification de l'ADN Après broyage de 50 mg de matériel végétal dans l'azote liquide, l'ADN est extrait selon la méthode de Fulton et al. (Fulton T.M., Chunwongse J. et Tanksley S.D , Plant Molecular Biology Reporter, 1995,13,207-209). L'ADN obtenu est ensuite dosé par une méthode fluorimétrique utilisant le fluorochrome HOECHST 33258. Analyses par Southern L'ADN génomique (5 microgrammes) est hydrolyse par 100 Unités de l'enzyme de restriction EcoRI pendant une vingtaine d'heures à 37°C dans un tampon approprié fourni avec l'enzyme (Biolabs®). EcoRI coupe en un site unique à l'extrémité 3' de la cassette d'expression contenant le gène Nptll, c'est-à-dire en bordure gauche du T-DNA. L'ADN hydrolyse est ensuite séparé par électrophorèse sur gel d'agarose à 1% puis transféré par capillarité sur une membrane de nylon ((Nylon Membranes positively charged : Roche Diagnostics 2, avenue du Vercors BP 59 38242 Meylan Cedex). Les membranes de nylon sont ensuite révélées avec du CDP star (Roche Diagnostics) après hybridation (une nuit) avec une sonde froide selon les recommandations du fabricant (Roche Diagnostics). La sonde froide est marquée à Ta digoxygénine par PCR selon les recommandations du fabricant (Roche Diagnostics) à partir d'ADN plasmidique portant la séquence d'intérêt utilisée pour la transformation du tournesol (PKP sens ou antisens), et le gène de sélection Nptll. Pour chaque série d'analyses, des témoins sont utilisés pour valider les résultats : de l'extrait d'ADN génomique du génotype non transformé utilisé pour la transformation du tournesol sert de témoin négatif, de l'ADN plasmidique provenant du vecteur binaire utilisé pour la transformation du tournesol sert de témoin positif. Une échelle de référence (DNA Molecular Weight III Dig labelled Roche Diagnostics) permet d'estimer la taille des fragments révélés par la sonde froide. Les transformations de plantes de tournesol (génotype NSU de niveau de résistance intermédiaire) ont permis d'obtenir 2 plantes T0 transformées avec la construction pkpXantisenspBin issus d'événements indépendants et 2 plantes T0 issus d'événements indépendants avec la construction pkpantisens(Lect-Kin)pBin. Un événement par construction s'est montré positif après analyse des plantes Tl. Il est confirmé en génération Tl par analyses de Southern qu'une plante, dénommée ci-après plante 1023, a intégré la construction pkpXantisenspBin. De plus, Les analyses Southern indiquent qu'il y a deux insertions et que le transgène s'exprime.
De façon identique, il est confirmé en génération Tl qu'une plante, dénommée ci-après plante 1210, a intégré la construction pkpantisens(Lect-Kin)pBin. Les analyses southern montrent une insertion complexe de 5 copies. Afin d'obtenir des plantes de tournesol transformées présentant une résistance ou une tolérance améliorée à Sclerotinia, il est possible de transformer du tournesol avec le vecteur sens (pkplOl.lpBIN) ce qui permet d'intégrer dans le génome desdites plantes le gène PK-P. Des plantes de tournesol T0, Tl, T2 ont été obtenues avec deux construits antisens différents afin d'analyser l'effet de ce gène PK-P et le phénotype des plantes après extinction de l'expression du gène PK-P.
Etude de l'expression du gène PK-P endogène
A partir de la lignée témoin non transformée NSU, plusieurs paires d'amorces ont été définies afin de pouvoir amplifier spécifiquement le gène endogène dans les plantes transformées. Les amorces 3end-pkp6f et ASpkp2f sont spécifiques du gène endogène. Leurs séquences respectives sont :
3end-pkp6f (SEQ ID NO: 17): TTGTTGGAAGTGGTGTGTGGA
ASpkp2f (SEQ ID NO : 18): CCTGCTCGACGGCTCATCATTA Les deux couples d'amorces 3end-pkp5f/ 3end-pkp5r et 3end- pkp7f/3end-pkp7r permettent d'amplifier à la fois le gène PK-P endogène et le transgène
(PK-P -Antisens). Les séquences respectives des amorces sont :
3end-pkp5f (SEQ ID NO : 19): TAATGATGAGCCGTCGAGCAG
3end-pkp5r (SEQ ID NO :20): GCCGATCAATCTCCATCACAA
3end-ρkp7f (SEQ ID NO :21): CCGGAGGAGCTCATTTTGGTT 3end-pkp7r (SEQ ID NO :22): GCTCGACGGCTCATCATTAGA Les analyses en RT-PCR avec les amorces 3end-pkp7f73end-pkp7r chez les plantes témoins négatives T2 issues de la ségrégation des transformants primaires T0 et conespondant à des autofécondations de plantes Tl ayant ségrégé le gène introduit, indiquent que le gène endogène PK-P s'exprime suite à l'infection par Sclerotinia. Analyse de résistance au Sclerotinia des plantes de tournesol transformées avec les vecteurs antisens. La transformation antisens des plantes de tournesol augmente la sensibilité du tournesol lors de l'infection à Sclerotinia. Les tests de résistance à l'infection par Sclerotinia sont réalisés sur plantes entières après inoculation avec la souche 55 de Sclerotinia sclerotiorum selon le protocole suivant : Les plantes sont inoculées par Sclerotinia sclerotiorum (souche 55) en déposant un morceau de gélose portant du mycélium en croissance sur l'extémité d'un
limbe d'une feuille dont l'insertion est située au milieu de la tige principale. Les notations s'effectuent en cinétique: 3j, 5j, 7j, lOj, 12j, 14j et 17 j après infection. Parallèlement à l'infection des plantes transgéniques, des témoins négatifs conespondant à des plantes négatives issues de la ségrégation du transgène sont également infectés. Les symptômes, c'est-à-dire la taille des nécroses, sont mesurées sur feuilles de plantes entières après inoculation avec la souche 55 de Sclerotinia sclerotiorum. Les plantes de tournesol testées sont des plantes T2, toutes issues de la plante 1023. Les analyses de résistance sur des plantes adultes cultivées en serre confirment l'augmentation de la sensibilité des plantes transformées vis-à-vis des plantes témoins. La figure 5 décrit l'évolution de la taille des nécroses (taille en centimètres), en moyenne, pour les plantes de tournesol transformées (T+, représentées par les losanges et la ligne en trait plein) et pour les plantes témoins (T-, représentées par les canes et la ligne en traits intereompus) en fonction du nombre de jours après inoculation (3j, 5j, 7j, lOj, 12j, 14j et 17 j). Les mesures de nécrose sont effectuées sur feuille selon le protocole décrit ci-dessus. Les plantes transformées montrent une nécrose plus rapide et plus grande que les plantes témoins. La différence entre la moyenne de la croissance des nécroses chez les plantes transformées et celle des plantes témoins est significative au cours du temps: le seuil varie de 0,1% à 1%.
EXEMPLE 3 : CONSTRUCTION DE VECTEURS D'EXPRESSION ET TRANSFORMATION DU COLZA
Obtention de l'orthologue du gène PK-P de tournesol chez le colza, et analyse des séquences Une analyse par blast (ALTSCHUL et al., Nucleic Acids Res., 25, 3389-
3402, 1997) de la séquence PK-P du tournesol contre les séquences du génome d'Arabidopsis thaliana ont pemiis d'identifier le gène At-LecRKl . Le gène lecRKl comprend comme le gène PK-P un domaine lectine et un domaine kinase. Des amorces dessinées sur la partie codante du gène At-lecRKl d'Arabidopsis thaliana ont permis d'amplifier, à partir d'ADN de colza, un produit dont la taille est environ 850 pb. Les amorces utilisées pour l'amplification de l'orthologue sont respectivement nommées O210 (forward) et 0211 (reverse) et ont les séquences suivantes :
0210 LecRK/for (SEQ ID NO : 25) 5'-GTTTGGAGATATTGATGATAATC-3'
0211 LecRK/rev (SEQ ID NO : 26) 5'-TCTTCCATTAGGCATAGTCATA-3'
Le produit d'amplification (environ 850 pb) a été clone dans le vecteur pkplOl.l-BluntlI-Topo (Invitrogen) puis séquence. La séquence ainsi obtenue conespond à la SEQ ID N°23, dénommée aussi BnLecRK(RV27) est représentée dans la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ ID N° 23. Elle conespond à l'orthologue incomplet en 5' et 3' chez le colza de la séquence PK-P de tournesol (SEQ ID N°l). L'alignement de la région de la séquence BnLecRK(RV27) destinée à être clonée avec la région conespondante de la séquence PK-P tournesol est réalisé selon Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol., 48:443-453. Le pourcentage d'identité entre ces deux séquences est de 54,7%. Afin de faciliter le clonage ultérieur dans le vecteur binaire utilisé pour la transformation du colza, les sites Notl et BamHI sont ajoutés à la séquence obtenue par mutagénèse PCR.
Construction du vecteur RNAi : La séquence BnLecRK(RV27) a été introduite dans un vecteur binaire RNAi comparable au vecteur PK-PlOl.lpBIN utilisé pour la transformation du tournesol.
Le T-DNA du vecteur binaire comprend la cassette d'expression suivante :
Bordure droite
ProAtNOS (Bevan,M., et al.(1983), Nucleic Acids Res., 11(2) : 369-385)
EcNPTII (Bevan,M., et al.(1983), Nucleic Acids Res., 11(2) : 369-385) terAtNOS (Depicker A, et al. (1982) Mol. Appl. Genêt.1 : 561-573) proVir35S (Franck,A., et al. (1980) DNA Cell 21 (1), 285-294)
BnLecRK(RV27) en orientation sens intHaGUbB2 (Binet,M.N.,et al. (1991) Plant Mol. Biol. 17 (3), 395-407)
BnLecRK(RV27 en orientation antisens TerAtNos (Bevan,M., et al.(1983), Nucleic Acids Res., 11(2) : 369-385)
Transformation du colza : Les jeunes plantes de colza de la variété RV 27 ont été transformées par la méthode de transformation par Agrobacterium comme décrite dans Moloney et al. (Plant Cell Reports 8 :238-242, 1989) en utilisant la souche d Agrobacterium tumefaciens C58PMP90 contenant le plasmide PK-PlOl.lpBIN tel que décrit ci-dessus. Les plantules transformées sont régénérées dans un milieu de régénération MS (Murashige and Skoog) contenant 15 μg/ml de kanamycine. Seules celles contenant le gène Nptll (Bevan et al., 1983, déjà cité) survivent de part leur résistance à la kanamycine conférée par le gène Nptll. Un Southern est ensuite effectué pour confirmer la présence du gène
Nptll. Un contrôle de la présence du gène de résistance PK-P a ensuite été effectué en utilisant la technique de Southern. Ce contrôle permet aussi d'identifier le nombre de copies du gène qui ont été insérées.
Une fois la présence des deux gènes confirmée, les plantes transgéniques sont ensuite transférées en sene et isolées pour éviter tout risque de pollinisation croisée.
Analyse de résistance au Sclerotinia des plantes de colza transformées avec les vecteurs antisens. Les plantules de colza RV27 de 28 jours (transfomiées par RNai ou non
(plantes témoins)) sont inoculées artificiellement sur la 2ème feuille par une culture de mycélium {Sclerotinia sclerotinium) âgée de 3 jours. La résistance des plantules est analysée en estimant le niveau de nécrose sur le limbe des feuilles à partir du 2ème jour après inoculation (LecJ2) puis le troisième jour (LecJ3), le quatrième (LecJ4) et le 6ème (LecJ6). Comme chez le tournesol, les analyses de résistance sur les plantules de colza confirment l'augmentation de la sensibilité des plantes transformées vis-à-vis des plantes témoins. La figure 6 décrit l'évolution de la taille des nécroses (taille en centimètres), pour une plantule de colza transfomiée (Col 819) et pour les plantes témoins (Col 795) en fonction du nombre de jours après inoculation (2j (LecJ2), 3j (LecJ3), 4j (LecJ4) et 6j (LecJ6)). Les mesures de nécrose sont effectuées sur feuille selon le protocole décrit ci-dessus. Les plantules transformées montrent une nécrose plus rapide et plus grande que les plantes témoins. La différence entre la moyenne de la croissance des nécroses chez les plantes transformées et celle des plantes témoins est significative au cours du temps : le seuil varie de 1 % à 2%.