CA2518733A1 - Obtention de plantes a digestibilite amelioree possedant une peroxydase inactive - Google Patents

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Abstract

L'invention concerne l'amélioration de la digestibilité d'une plante, par inhibition totale ou partielle de l'expression et/ou de l'activité de la peroxydase Pox3/U19 de ladite plante. L'invention concerne également la sélection de plantes à digestibilité améliorée, chez lesquelles l'expression et/ou l'activité de la peroxydase Pox3/U19 est partiellement ou totalement inhibée.

Description

2 PCT/FR2004/000569 OBTENTION DE PLANTES A DIGESTIBILITE AMELIOREE POSSEDANT
UNE PEROXYDASE INACTIVE.
La présente invention concerne l'amélioration de la digestibilité de plantes fourragères, et plus particulièrement du maïs.
L'utilisation du maïs comme fourrage, notamment sous forme d'ensilage, est de plus en plus répandue. En effet, le maïs fourrage présente de nombreux avantages . son rendement au champ est relativement élevé, sa récolte et son stockage sont aisés. I1 constitue un apport alimentaire riche en énergie dont les qualités nutritionnelles sont stables, qui peut être complémenté en protéines par des protéagineux ou par des tourteaux d'oléoprotéagineux comme le soja, et permet d'obtenïr notamment une production laitière régulière et d'un niveau élevé.
L'amélioration des variétés de maïs fourrager a initialement porté principalement sur l'augmentation de rendement, sur la rusticité et sur la résistance à la verse (BARRIERE et al., Fourrages, I07-119, 2000).
Toutefois, il a été observé que parallèlement, la valeur alimentaire qui n'était pas prise en compte dans les critères de sélection, avait diminué en moyenne et présentait une grande variabilité d' un hybride à l' autre, se traduisant par des écarts importants dans la production de laït. Un effort de sélection a donc été
entrepris pour améliorer la valeur alimentaire des maïs fourragers, en particulier après la mise au point des équations de prédiction de la valeur énergétique et l'adoption d'une solubilité enzymatique de référence (AIVDRIEU, Prod. Anim., 273-274, 1995).
Une composante importante de la valeur alimentaire est la digestibilité. Par exemple, différentes expérimentations menées avec des vaches laitières ont montré que l'utilisation de variétés plus digestibles permet une augmentation de la production de lait et une meilleure prise de poids des vaches, quand le niveau de complémentation ne permet pas aux animaux d'exprimer leur potentiel avec les variétés normales. En outre, ces variétés plus digestibles permettent aux animaux d'atteindre leur potentiel avec un plus faible niveau de complémentation, ce qui permet en particulier de réduire les coûts de production.
Un facteur important limitant la digestibilité
des plantes fourragères est lié à la présence dans les parois des cellules végétales, de composés phénoliques, en particulier de lignines. Les lignines établissent différents types de liaisons avec les autres constituants pariétaux et forment un maillage serré qui gène l'accessibilité des enzymes digestives aux glucides pariétaux, principales sources d'énergie pour les herbivores. La part de résidus non digérés varie au cours du développement de la plante. Le taux de lignification augmente au cours de la maturation de la plante et provoque une diminution de sa digestïbilité. Toutefois, il existe une varïabilité génétique de l'intensité et de la qualité de la lignification entre les lignées ou les hybrides, pour un niveau de maturité donnée, associée à
une variabilité de digestibilité (MECHIN et a.l., J. Sci.
Food Agric., 80, 574-580, 2000). Cette variabilité est aussi illustrée par les modifications de quantité et qualité de lignine et l'amélioration de la digestibilité
observée chez les mutants ee brown-midrib », en particulier le mutant bm3.
Par conséquent, une des voies privilégiées d'amélioration de la valeur alimentaire du maïs fourrager concerne la sélection ou la production par génie génétique de plantes dont les lignines sont modifiées qualitativement ou quantitativement.
Les lignines sont des polymères insolubles de
3 monomères d'alcools ou monolignols, dérivant de la voie des phénylpropanoïdes (NEISH, Constitution and Biosynthesis of Lignin, eds New York: Springer ~Jerlag, 1-43~ 1968) . l'alcool p-coumarylique (sous-unités H), l'alcool coniférylique (sous-unités G) et l'alcool sinapylique (sous-unités S). Chez le maïs les proportions respectives des unités H/S/G sont voisines de 3/35/62 (MECHIN, Thèse INAPG, 2000). Chacun de ces précurseurs peut former diverses liaisons avec les autres et ainsi constituer la lignine. D'autres liaisons peuvent également s'établir avec d'autres composés pariétaux (polysaccharides et protéines) pour former un réseau tridimensionnel complexe. Les monolignols libèrent par oxydation un radical permettant leur association spontanée. La formation de ces radicaux dépendrait de peroxydases et de laccases ou d'autres oxydases. Un nombre important de ces enzymes en association avec des protéines de régulation serait nécessaire dans l'assemblage des sous-unités H, G et S (BOUDET, Plant Physiol. Biochem., 38, 81-96, 2000) Bien que les mécanismes impliqués in vivo dans la biosynthèse de la lignine ne soient pas complètement élucidés, il est généralement considéré que les laccases pourraient intervenir dans la formation des dimères et des trimères alors que les peroxydases permettraient d'obtenir un degré de polymérisation supérieur à partir des dimères et trimères (ROS BARCELO, International Review of Cytology, 176, 87-132, 1997).
Les peroxydases appartiennent à une famille multigénique et'sont très largement représentées dans le génome des plantes. Par exemple le génome d'Arabid~psis thaliana compterait plus de 70 peroxydases (WELINDER et al., Eur. J. Biochem., 269(24), 6063-6081, 2002).
En outre, les peroxydases intervenant dans des voies métaboliques très variées, il est très difficile de déterminer lesquelles sont impliquées dans la lignification (BOUDET et al, Plant Physiol. Biochem., 38, 81-96, 2000) .
~UIROGA et al, (Plant Physiol., 122, 1119 1127, 2000) et OSTERGAARD (Plant Mol. Biol., 44, 231-243, 2000) ont identifié des peroxydases impliquées dans la synthèse de la lignine chez la tomate (TPX1) et chez Arabidopsis thaliana (ATP A2) . MOROSHI et KAJITA (Journal of Plant Research, 517-523, 2001) sont parvenus à sous-
4 réguler une peroxydase impliquée dans la synthèse des lignines chez un arbre. Dans ce cas, la diminution de l'activité de cette enzyme entraîne une augmentati~n de la teneur en sous-unités S et des liaisons n~n condensées ainsi qu' une diminution de la quantité de lignines dans la paroi.
Les inventeurs ont cartographié le gène d' une peroxydase, qu'ils ont dénommée peroxydase Pox3/U19, sur le chromosome 6 (bin 6.06), et ont établi qu'il existait une colocalisation entre ce gène et des QTL de digestibilité et de teneur en lignines de la paroi. Ce gène correspond à la séquence Pox3 répertoriée dans GenBank sous le numéro d'accès AJ401276.
La séquence d'ADN génomique de Pox3/U19, obtenue à partir de la lignée de maïs F2, est représentée sur la Figure 1, ainsi que dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID N0: 1. La séquence polypeptidique correspondante est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 2.
Les Inventeurs ont séquencé l'ADN génomique d'une longueur d'environ 1,7 kb de Pox3/U19 dans 37 lignées ou écotypes de maïs différents et ont ainsi pu déterminer que la région codante était constituée de 2 introns respectivement de 127 et 111 paires de bases et de 3 exons. L'analyse du polymorphisme réalisée sur ces lignées montre qu'il existe un site polymorphe toutes les 57 paires de bases en moyenne, soit 31 SNP (pour Single nucleotide polymorphism - site polymorphe d'1 seul nucléotide) sur la totalité de la séquence et 17 indels pour insertion-délétion représentant 20% de la longueur totale de la séquence.
Les Inventeurs ont en outre découvert que chez certaines lignées de maïs plus digestibles le gène de la peroxydase Pox3/U19 était interrompu par un fragment de transposon de type MITE (Miniature Inverted-repeat Transposable Element s WESSLER et al., Current Opinion in Genetics and Development, 5, 814-821, 1995), introduisant au début du second exon un codon stop résultant en la production d'une protéine tronquée et donc non-fonctionnelle. Ils ont montré une corrélation significative entre la présence de cet élément transposable et la digestibilité de la lignée.
5 La séquence d'ADN génomique de Pox3/U19 obtenue à partir de la lignée de maïs F7 à digestibilité
élevée, est représentée sur la Figure 2, ainsi que dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO:
3. La séquence polypeptidique correspondante est reprêsentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 4.
L'alignement de séquences d'ADN génomique de Pox3/U19, obtenues à partir des lignées à digestibilité
élevée F226, F227, F7012, et F7, des lignées à
digestibilité moyenne F2, W64, et des lignées à faible digestibilité F271, L212, B73, et B14 est représenté sur la Figure 3.
Les analyses effectuées sur 37 lignées ou écotypes de maïs ont permis aux inventeurs de montrer que 5 des sites polymorphes entre les lignées F2 et F7 étaient en déséquilibre de liaison avec l'insertion du transposon MITE au site 50465 (la dénomination des sites polymorphes utilisée ici se réfère à leur position par rapport à l'alignement de séquences de la figure 3 ;
ainsi, le site 50465 correspond au nucléotide 465 selon la numérotation de cet alignement). Ces sites sont . le site 50061 où un C dans la séquence de F2 est remplacé
par un T dans la séquence de F7 ; le site 50231 où un T
est inséré dans la séquence de F7 par rapport à la séquence de F2 ; le site 50447 correspondant à un G dans la séquence de F2 et à un A dans la séquence de F7 ; le site 50797 correspondant à un G dans la séquence de F2 et à un T dans la séquence de F7 ; le site S120S
correspondant à la délétion de 4 paires de lasses GCAT
dans la séquence de F7 par rapport à la séquence de F2.
Chacun des ces polymorphismes caractérise un groupe de 5 lignées apparentées (F7, F7012, F324, F227 and F226) possédant un degré de digestibilité élevé.
6 Les inventeurs ont aussi identifié d'autres sites polymorphes apparaissant associés avec 1a digestibilité des parois cellulaires sans être en déséquilibre de liaison avec l'insertion du transposon MITE au site 50465. I1 s'agit . du site 50270~
correspondant à une délétion d'une base (C), caractéristique d'un groupe de quatre lignées à
digestibilité élevée (F564, EP1, Wis94-443 et Wis93-3520, non représentées sur la figure 3) par rapport à la séquence de F2 ~ du site 509~~ où un G dans la séquence de F2 est remplacé par un C dans la séquence de F7 ; ce SNP affecte un site putatif de N-glycosylation ; du site 51663, localisé dans la région 3' non traduite, et correspondant à un A dans la séquence de F2, et un G dans la séquence de F7 et qui explique 20% de la variabilité
phénotypique.
La mise en évidence par les Inventeurs de l'implication de Pox3/U19 dans la digestibilité fournit un ensemble de moyens permettant d'obtenir des plantes, en particulier des plantes monocotylédones, notamment le maïs, le sorgho, ou le panicum, possédant une digestibilité accrue.
Ces nouveaux moyens font l'objet de la présente invention.
La présente invention a pour objet un procédé
pour améliorer la digestibilité d'une plante, caractérisé
en ce que l'on inhibe totalement ou partiellement l'expression et/ou l'activité de la peroxydase Pox3/U19 de ladite plante.
On dëfinit ici comme <e peroxydase Pox3/U19 toute protéine possëdant une activité peroxydase, et dont la séquence polypeptidique présente au moins 75~, de préférence au moins 55~, avantageusement au moins 94~, et de manière tout à fait préférée au moins 95~ d'identité
avec la séquence SEQ ID N~: 2 sur une fenêtre de comparaison la plus large possible, correspondant de préférence à la totalité de la séquence SEQ ID NO: 2.
7 Sauf précision contraire, les pourcentages d'identité indiqués ici sont établis à l'aide du logiciel BLAST2 (ALTSCHUL et al., Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402, 1997) en utilisant les paramètres par défaut.
L'inhibition totale ou partielle de l'expression et/ou de l'activité de la peroxydase Pox3/U19 peut être obtenue de diverses manières, par des méthodes connues en elles mêmes.
De manière particulièrement avantageuse, cette inhibition peut être obtenue en intervenant en amont de la production de, la peroxydase Pox3/U19, par mutagenèse du gène codant pour cette protéine, ou bien par inhibition ou modification de la transcription ou de la traduction.
La mutagenèse du gène codant pour la peroxydase Pox3/U19 peut intervenir au niveau de la séquence codante ou des séquences de régulation de l'expression, notamment du promoteur. On peut par exemple procéder à la délétion de tout ou partie dudit gène et/ou à l'insertion d'une séquence exogène. A titre d'exemple, on citera la mutagenèse insertionnelle . on produit un grand nombre d'individus dérivant d'une plante active pour la transposition d'un élément transposable, (élément AC ou Mutator chez le maïs), et on sélectionne, par exemple par PCR, les plantes chez lesquelles une insertion s'est effectuée dans le gène de la peroxydase Pox3/U19.
On peut également introduire une ou plusieurs mutations ponctuelles avec des agents physiques (par exemple radiations) ou chimiques. Ces mutations ont pour conséquence de décaler le cadre de lecture et/ou d'introduire un codon stop dans la séquence et/ou de modifier le niveau de la transcription et/ou de la traduction du gène et/ou de rendre l'enzyme moins active que la protéine sauvage. Les allèles mutés du gène de Pox3/U19 peuvent être identifiés par exemple par PCR à
l'aide d'amorces spécifiques dudit gène.
8 Dans ce cadre, on peut notamment utiliser des techniques de type « TILLING » (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes ; McCALLUM et al, Plant Physiol., 123~
439-442~ 2000).
On peut aussi effectuer une mutagenèse dirigée, ciblant le gène codant pour la peroxydase Pox3/U19. L°inhibition ou la modification de la transcription et/ou de la traduction peuvent être obtenues par l'expression d'ARN sens, antisens ou double-brin dérivés du gène de la peroxydase Pox3/U19, ou de l'ADNc de cette protéine, ou bien par l'utilisation d'ARNs interférents (pour revue sur les techniques d'inhibition antisens cf. par exemple . WATSON et GRIERSON, Transgenic Plants . Fundamentals and Applications (HIATT, A, ed) New York . Marcel DEKKER, 255-281, 1992 ; CHICAS et MACINO, EMBO reports, 21(11), 992-996, 2001 ; pour revue concernant plus spécifiquement l'utilisation des ARNs interférents cf. HANNON, Nature, 418, 244-251, 2002).
La présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'au moins un polynuclêotide choisi parmi .
a) un polynucléotide codant pour une peroxydase Pox3/U19 telle que définie ci-dessus ;
b) un polynucléotide complémentaire d'un polynucléotide a) ci-dessus ;
c) un fragment d'au moins 12 nucléotides consécutifs, de préférence au moins 15, avantageusement au moins 20, et de manière tout à fait préférée au moins 50 nucléotides consécutifs, spécifique d'un polynucléotide a) ou b) ci-dessus, ou capable de s'hybrider sélectivement avec ledit polynucléotide, pour obtenir une plante possédant une digestibilité accrue.
On définit ici comme ee polynucléotide codant pour une peroxydase Pox3/U19 » tout polynucléotide contenant l'information génétique permettant la synthèse de ladite peroxydase.
9 Ceci englobe notamment l'ADN génomique, par exemple la séquence SEQ ID N0: 1 représentée en annexe, ainsi que l'ADNc correspondant.
On définit comme « fragment spécifique » d'un polynucléotide a) ou b) ci-dessus, tout fragment dudit polynucléotide dont la séquence n'est pas trouvée dans d'autres gènes de la même plante, et notamment dans d'autres gènes de ladite plante codant pour des peroxydases.
On définit ici comme polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement avec un polynucléotide a) ou b) ci-dessus, tout polynucléotide qui lorsqu'il est hybridé
en conditions strïngentes avec une banque d'acide nucléique de la même plante (notamment une banque d'ADN
génomique, ou d'ADNc) produit un signal d'hybridation détectable (c'est-à-dire au moins 2 fois supérieur, de préférence au moins 5 fois supérieur au bruit de fond) avec ledit polynucléotide, mais ne produit aucun signal détectable avec d'autres séquences de ladite banque, et notamment avec des séquences codant pour d'autres peroxydases.
Des conditions stringentes d'hybridation, pour un polynucléotide donné, peuvent être identifiées par l'homme du métier en fonction de la taille et de la composition en bases du polynucléotide concerné, ainsi que de la composition du mélange d'hybridation (notamment pH et force ionique). Généralement, des conditions stringentes, pour un polynucléotide de taille et de séquence données, sont obtenues en opérant à une température inférieure d'environ 5°C à 10°C à la température de fusion (Tm) de l'hybride formé, dans le même mélange réactionnel, par ce polynucléotide et son complémentaire.
A titre d'exemple de fragment spécifique d'un polynucléotide a) ou b) ci-dessus, ou capable de s'hybrider sélectivement avec ledit polynuclêotide, on citera notamment un polynucléotide susceptible d'être obtenu à partir d'ADNc ou d'ADN génomique non intronique de maïs, par amplification en conditions stringentes avec les amorces .
OL 321 . CACCGGAGTGGCTGCG (SEQ ID N0: 5) et 5 OL 322 . ATCGACAAATATATATGTTTATAAGG (SEQ ID NO:
ainsï que les fragments d'au moins 12 nucléotides consécutifs, de préférence au moins 15, avantageusement au moins 20, et de manière tout à fait préférée au moins 50 nucléotides consécutifs, dudit polynucléotide.
10 Les positions des amorces SEQ ID N0: 5 et SEQ ID N0: 6 sont encadrées sur la séquence représentée sur la Figure 1.
La présente invention a en particulier pour objet un procédé pour augmenter la digestibilité d'une plante, par inhibition totale ou partielle de 1a peroxydase Pox3/U19 endogène de ladite plante, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de ladite plante avec une construction d'ADN recombinant comprenant un polynucléotide tel que défini ci-dessus, placé en orientation sens ou en orientation antisens, ou pouvant être transcrit en ARN double brin, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
La présente invention a également pour objet des constructions d'ADN recombinant, comprenant un polynucléotide tel que défini ci-dessus. Ces constructions peuvent être notamment .
- des cassettes d'expression, comprenant un polynucléotide tel que défini ci-dessus, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. Ces cassettes d'expression peuvent également comprendre, avantageusement, d'autres éléments de rëgulation, en particulier des éléments de régulation de la transcription tels que terminateurs, amplificateurs, etc. ;
- des vecteurs recombinants, comprenant un polynucléotide, ou avantageusement une cassette d'expression tels que définis ci-dessus.
11 Des constructions d'ADN recombinant conformes à l'invention peuvent également comprendre d'autres éléments, par exemple un ou plusieurs marqueurs de sélection.
Z'homme du métier dispose d'un très large choix d'éléments utilisables pour l'obtention de constructions d' ADN recombinant conformes à l' invention.
A titre d'exemples non-limitatifs de promoteurs utilisables dans le cadre de la présente invention, on citera .
- des promoteurs constitutifs, tels que le promoteur 355 du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) décrit par KAY et a1. (Science, 236, 4805, 1987), ou ses dérivés, le promoteur du virus de la mosaïque des nervures de manioc (CsVMV) décrit dans la Demande PCT
WO 97/48819, le promoteur de l'ubiquitine ou le promoteur « Actine-Intron-actine », du riz (McELROY et, al., Mol.
Gen. Genet., 231, 150-160, 1991 ; GenBank numéro d'accès S 44221) .
- des promoteurs inductibles ou tissu-spécifiques, afin de ne modifier la teneur ou la composition en lignines qu'à certains stades du développement de la plante, dans certaines conditions environnementales, ou dans certains tissus-cibles, comme par exemple, les tiges, les feuilles, les graines, les spathes, le cortex ou le xylème.
A titre d'exemples non-limitatifs d'autres éléments de régulation de la transcription utilisables dans le cadre de la présente invention, on citera des terminateurs, tels que le terminateur 3'NOS de la nopaline synthase (DEPICKER et al., J. Mol. Appl. Genet., l, 561-573, 1982), ou le terminateur 3'CaMV (FRANCK et al., Cell, 21, 285-294, 1980 ; GenBank numéro d'accès V00141) .
A titre d'exemples non-limitatifs de gènes marqueurs de sélection utilisables dans le cadre de la présente invention, on citera notamment des gènes conférant une résistance à un antibiotique (HERRERA-
12 ESTRELLA et al., EMBO J., 2, 987-995, 1983) tel que l'hygromycine, la kanamycine, la bléomycine ou la streptomycine, ou à un herbicide (EP 0 242 246) tels que le glufosinate, le glyphosate ou la bromoxynil, ou le gène NPTII qui confère la résistance à la J<_anamyine (BEVAN et al., Nucleic Acid Research, 11, 369-385, 1984).
La transformation des plantes peut s'effectuer par de nombreuses méthodes, connues en elles-mêmes de l'homme du métïer.
On peut par exemple transformer des cellules végétales, des protoplastes ou des expiants, et régénérer une plante entière à partir du matériel transformé. La transformation peut ainsi être réalisée, à titre d'exemples non-limitatifs .
- par transfert des vecteurs conformes à
l'invention dans des protoplastes, notamment après incubation de ces derniers dans une solution de polyéthylèneglycol (PG) en présence de cations divalents (Ca2+) selon la méthode décrite dans l'article de KRENS et al. (Nature, 296, 72-74, 1982) ;
- par électroporation notamment selon la méthode décrite dans l'article de FROMM et al. (Nature, 319, 791-793, 1986) ;
- par utilisation d'un canon à gène permettant la projection, à très grande vitesse, de particules métalliques recouvertes des séquences d'ADN d'intérêt, délivrant ainsi des gènes à l'intérieur du noyau cellulaire, notamment selon la technique décrite dans l'article de FINER et a1. (Plant Cell Report, 11, 323 328, 1992);
-par micro-injection cytoplasmique ou nucléaire.
On peut également utiliser ~lgr~.bacterium tumefacien~, notamment selon les méthodes décrites dans les articles de BEVAN et a1. (Nucleic Acid Research, 11, 369-385, 1984) et d'AN et a1. (Plant Phydiol., 81, 86-91, 1986), ou encore Agrobacterium rhizogenes, notamment selon la méthode décrite dans l'article de JOUANIN et a1.
13 (Plant Sci., 53, 53-63, 197). Par exemple, la transformation de cellules végétales peut être effectuée par le transfert de la région T du plasmide circulaire extra-chromosomique inducteur de tumeurs Ti d'~lgro,~acteriurr~ t~amefaciens, en utilisant un système binaire (WATSON et a.l., Ed. De Boeck Université, 273-292, 1994). On peut aussï utiliser Agrobacterium tumefaciens sur des plantes entières, par exemple par dépôt au niveau de la blessure d'une plante monocotylédone, de la bactérie hébergeant l'ADN à transférer, en présence de substances libérées au niveau de la blessure d'une plante dicotylédone.
La présente invention a également pour objet les cellules végétales et les plantes transgêniques susceptibles d'être obtenues par un procédé conforme à
l'invention. Bien entendu, la présente invention englobe les descendants, notamment les hybrides issus d'un croisement impliquant au moins une plante selon 1°invention, obtenus par semis ou par multiplication végétative, des plantes directement obtenues par le procédé de l'invention. De préférence, lesdites plantes sont des monocotylédones, avantageusement du maïs, du S~L~mv vu czu ja~trmcum.
L'invention comprend également les cellules et tissus végétaux, ainsi que les organes ou parties de plantes, y compris feuilles, tiges, racines, fleurs, fruits, et/ou graines obtenues à partir d'une plante conforme à l'invention.
La présente invention a aussi pour objet un procédé de sélection de plantes, caractérisé en ce qu'il comprend la recherche chez les plantes à tester d'un allèle du gène de la peroxydase Pox3/U19 possédant une mutation résultant en une inhibition totale ou partielle de l'expression et/ou de l'activité de ladite protéine.
Ledit allèle peut être recherché par détection directe de la mutation responsable de l'inhibition ; il peut également être recherché par détection de la forme allélique associée à cette mutation d'un polymorphisme en l4 déséquilibre de liaison avec celle-ci. Par exemple, l'insertion du transposon MITE peut être détectée directement, ou bien par détection de la forme allélique d'un ou plusieurs des polymorphisme 50061, SS0231, 50447, 50797 et 51208.
Les allèles mutants favorables à la digestibilité ainsi identifiés peuvent ensuite être introgressés dans des lignées choisies, et notamment dans des e< lignées élites » à savoir des lignées présentant un l0 potentiel agronomique et commercial important.
On peut en particulier utiliser, dans le cadre de ce procédé, des polynucléotides spécifïques de 1a peroxydase Pox3/U19, tels que définis ci-dessus, et notamment .
- des amorces permettant d'amplifier sélectivement le gène de la peroxydase Pox3/U19 ou des sondes d'acide nucléique permettant la détection sélective de ce gène.
A titre d'exemples non-limitatifs d'amorces permettant d'amplifier sélectivement le gène de la peroxydase Pox3/U19, on citera notamment le couple d'amorces défini par les séquences suivantes .
GACGAAGCGGCACTGCTTGCGCTTCACCA (SEQ ID N0: 7) et TGCCACAGTAACAAGCGAGCTTACCAAGA (SEQ ID N0: 8).
Les positions de ces amorces sont indiquées en gris et soulignées sur les séquences représentées sur les Figures 1 et 2.
L'utilisation de ces amorces permet, par comparaison du produit d'amplification avec celui obtenu à partir de plantes possédant une peroxydase Pox3/U19 active, de détecter les mutations pouvant affecter l'expression ou l'activité de ladite protéine. Par exemple, la comparaison des tailles des produits d'amplification permet de dëtecter la présence d°insertions ou de délétions, susceptibles de résulter en la production d'une protéine inactive.

des amorces ou des sondes d'acide nucléique permettant de détecter une mutation déterminée, préalablement identifiée comme affectant l'expression ou l'activité de la peroxydase Pox3/U19 ou des sondes 5 d'acide nucléique permettant la détection sélective de ce gène:
A titre d'exemple non limitatif, on citera notamment le couple d'amorces défini par les séquences suivantes, qui permet d'amplifier sélectivement l'ADN de 10 plantes possédant l'insertion du transposon MITE dans le gène codant pour Pox3/U19 .
GGCACTGGAGGCTCAGGGTGTGTT (SEQ ID N0:9) AGGAGACAACGCCGGGGCAC (SEQ ID N0: 10) Ces deux types d'amorces peuvent être utilisés 15 séparément ou en combinaison ; par exemple, la combinaison d'un couple d'amorces permettant d'amplifier sélectivement le gène de la peroxydase Pox3/U19 et d'un couple d'amorces permettant de détecter une mutation déterminée est utilisable pour détecter des plantes hétérozygotes pour cette mutation.
L'invention a également pour objet les couples d'amorces définis ci-dessus, ainsi que les kits comprenant ces couples d'amorces individuellement ou en combinaison.
La présente invention sera mieux comprise à
1°a.ide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l'implication de la peroxydase Pox3/U19 dans la digestibilité, et son utilisation pour l'obtention de plantes possédant une digestibilité améliorée.
EXEMPLE 1 . OBTENTION DE D'ADN GENOMI~UE DE POX3/ü19 Des amorces spécifiques de Pox3/U19 ont été
définies à partir de la séquence d'ADNc de la peroxydase Pox3/U19.

L'amorce sens (U19S1) située position 1 à 29 de l'ADNc est représentée par la séquence (SEQ ID NO: 7) ci-dessous .
5'-GACGAAGCGGCACTGCTTGCGCTTCACCA-3' (29 bases Tm=75°C) L°amorce antisens (U19AS1) située position 1170-1198 de l'ADNc est représentée par la séquence (SEQ ID NO: 8) ci-dessous .
5'TGCCACAGTAACAAGCGAGCTTACCAAGA-3' (29 bases Tm=71°C) La position de ces amorces est indiquée sur la Figure 1.
Les amplifications par PCR sont réalisées à
partir de 100-150 ng d'ADN selon le protocole suivant .
Mix PCR .
100-150 ng d'ADN génomique 0,2 ~M de chaque amorce 200 ~M de chaque dNTP
2,5 unités de polymérase REDTaq~ (Sigma) / 50uL de réaction 5 ~L de tampon 10X pH 8, 3 comprenant 100 mM de tris-HCL, 500 mM de KCl, 15 mM de MgCl2 et 0,01 de gélatine Cycle .
5 min à 95°C
cycles . 30 sec à 95°C
30 sec à 60°C
25 1 min 40 à 72°C
5 min à 72°C
La séquence obtenue par amplification a une taille d'environ 1,44 kb. Elle se compose de 3 exons et de 2 introns respectivement d' environ 130 et 100 pb. Les 30 sites d'épissage consensus des monocotylédones sont présents.
EP7GE ~ . â~ISE E~1 E~7II)E~'C~ IRE Ia' ASS~CI~7CI02~ D' LTL~dE
~I~~TI~ï.~' IàE I~ DIG~ESTI~I~II'E, ~~C PEï~~~~IâAS~
~~~~3 /ï71 ~ I~7~CT I~ .
A~~~ci~~~.~xa ~it~s ~~l~~~aes/die~~~ti~ail~.t~
La séquence codant pour la peroxydase Pox3/Ul9 a été amplifiée chez 37 lignées. Les séquences ainsi obtenues ont été alignées. Le pourcentage de polymorphisme est de 2,2~ soit 1 SNP toutes les 45 bases environ. Le taux de polymorphisme de la séquence d'acides aminés est de 1,39% soit seulement 5 changements d'acides aminés sur 358.
La construction d'un arbre phylogénétique selon la méthode UPGMA sur les séquences nucléiques permet de distinguer deux groupes .
Le premier groupe comprend la lignée F7, et des lignées apparentées dont 1°amplification PCR du gène codant pour Pox3/U19 aboutit à l'obtention d'un fragment de 1744 pb.
Le second groupe comprend les lignées dont l'amplification PCR du gène codant pour Pox3/U19 donne un fragment d'environ 1410 pb.
Cette différence de taille entre les amplifiats des deux groupes est due à la présence dans le deuxième exon d'un élément de 321 pb possédant les caractéristiques structurales d'un élément transposable.
En effet, à chacune de ses extrémités une quinzaine de paires de bases est répétée de manière imparfaite et inversée. Une répétition directe de 5 paires de bases est présente de part et d'autre du site d'insertion de l'élément. Celui-ci correspond à un élément MITE
(Miniature Inverted-repeat Transposable Element) (WESSLER
et al., Current Opinion in Genetics and Development, 5, 814-821, 1995).
Une analyse de variance (test ANOVA) réalisée sur chaque locus polymorphe permet de rechercher les associations avec le paramètre de digestibilité. Ensuite, une étape de régression par la méthode des moindres carrés (pour un modèle linéaire) est réalisée afin de repérer le locus qui explique la plus grande part de la variabilité du caractère digestible.
Le résultat au locus d'insertion du transposon MITE est le suivant . la probabilité pour que le polymorphisme correspondant à l'insertion de l'élément soit liée à la digestibïlïté est significative à un seuil de 5~ (probabilité de 0,032).
R~che~ch~ d' ans~ci~tion ente l~ dic~e~tibilit~: ~t la ~a~~~~nc~ ~.~ l' i~a~erti~~a â~ilT~
Un couple d'amorces amplifiant spécifiquement l'insertion de l'élément MITE a été défini.
L'amorce sens est représentée par la séquence (SEQ ID NO: 9) ci-dessous .

5'-GGCACTGGAGGCTCAGGGTGTGTT-3' (24 bases, Tm= 67,8°C) et l'amorce antïsens par la séquence (SEQ ID NO: 10) ci-dessous .

5'-AGGAGACAACGCCGGGGCAC-3' (20 bases, Tm=65,5°C) Les amplifications par PCR sont réalisées à
partir de 100 ng d'ADN selon le protocole suivant .
Mix PCR .
100 ng d'ADN gênomique 0,2 ~M de chaque amorce 200 ~M de chaque dNTP
1,25 unités de polymérase REDTaq~ (Sigma) / 25uL de réaction 2,5 uL de tampon 10X pH 8,3 comprenant 100 mM de tris-HCL, 500 mM de KCl, 11 mM de MgCl2 et 0,01 de gélatine Cycle .
5 min à 95°C
25 cycles . 30 sec à 95°C
sec à 65°C
30 sec à 72°C
30 5 min à 72°C
Ce couple d'amorces amplifie spécifiquement l'insertion MITE dans le gène de Pox3/U19. I1 n'y a aucune amplification avec ce couple d'amorces lorsque les individus n'ont pas cette mutation dans le gène de Pox3/U19.

Caractéristiques de la peroxydase de la lignée F7 La lignée F7 et certaines lignées apparentées, pour lesquelles le gène codant pour la peroxydase a été
séquencé, ont une séquence de 1744 pb au lieu de 1440 pb.
La séquence génomique obtenue se compose de la région codante constituée de trois axons et de deux introns. Les introns sont de petite taille soit respectivement 130 et 100 pb.
La différence de taille est due à l' insertion dans le deuxième exon d'un transposon de type MITE de 321 pb.
La traduction de l'allèle de Pox3/U19 possédant l'insertion de l'élément MITE permet d'obtenir une séquence d'acïdes aminés homologue aux traductions des allèles de Pox3/U19 ne possédant pas cette insertion pour les 111 premiers acides aminés, correspondant à la traduction du premier exon et du premier tiers du deuxième exon. En effet, l'insertion de l'élément MITE
introduit un codon stop dans la séquence 75 nucléotides après le début de l'insertion.
Il apparaît donc que contrairement à la peroxydase sauvage qui comporte 358 acides aminés, la peroxydase de la lignée F7 et des lignées dont le gène est interrompu par l'insertion du MITE, ne comporte que 111+25 acides aminés. L'insertion de l'élément transposable entraîne, dans le produit de traduction, la délétion d'acides aminés putativement impliqués dans l'activité catalytique. En effet, par analyse bioinformatique (Prosite release 10.0), le domaine peroxydase 1 se positionnerait des position 163 à 212, le domaine peroxydase 2 des positions 36 à 87. Par conséquent, l'insertion de l'élément MITE empêcherait la traduction du domaine peroxydase 1 et rendrait l'enzyme totalement ou partiellement inactive.

Génotypage de lignées de maïs Le génotypage est réalisé par PCR sur quelques lignées (F7012, Lan496 et F192) puis sur une collection plus vaste.
5 Les amorces utilisées sont U19S, U19A~, U19MITES, U19MITEAS. En fonction du couple d'amorces utilisé, i1 est possible d'avoir un marqueur dominant ou codominant. Par exemple, le couple U19S/U19MITEAS permet de distinguer les plantes homozygotes pour l'allèle muté
10 ou sauvage des plantes hétérozygotes.
F7012 est une lignée fixée (homozygote) issue de F7 qui possède l'élément MITE. Lan496 est aussi une lignée fixée non apparentée à F7 et qui ne possède pas l'insertion. L'hybride présente les 2 allèles du gène de 15 Pox3/U19. F192, qui est une lignée fixée issue du croisement F7XF2 a été typée et présente l'insertion de l'élément MITE.
Les résultats attendus pour chaque couple d'amorces sont résumés dans la Figure 4.
20 Dans un second temps, une collection plus vaste de lignées ayant le parent F7 dans leur généalogie et ayant un niveau de digestibilité variable a été typée.
Les résultats du typage pour les individus apparentés à F7 et les notes de digestibilité
correspondante sont représentés dans le tableau I ci après.
Les lignées ont été notées .
1 quand l'élément MITE est présent au niveau du gène de Pox3/U19.
0 quand l'élément MITE est absent au niveau du gène de Pox3/U19.

Tahlaa~ i I
MITE
prsence/absence Digestibilit F012 1 4=,5 F226 1 3,5 F324~ 1 5,5 4'S

LGFS 1 3,5 CP1 l18 0 3 SIC02 ~ 3,5 SK122 0 2,5 F268 0 2, 5 F7023 0 1,5 LGD3 0 2,5 1,5 .La note de digestibilité résulte des expérimentations à long terme conduites depuis 1992. Les lignées ont été phénotypées en valeur propre pour leur valeur de digestibilité in vitro des parois (critère DINAG, ARGILLIER et al., Euphytica, 82, 175-184, 1995).
Ces valeurs ont ensuite été homogénéisés et synthétisés sous forme de note de 1 (très peu digestible comme F271) à 5 (très digestible comme F324).
Le tableau II ci-après illustre la comparaison des moyennes des notes de digestibilité des individus ayant l'insertion MITE et des individus ne l'ayant pas.

Tableau II
Moyenne de Ecart-type Variance Nombre de digestibilit lignes Lignes possdant 4>06 0,88 0,78 9 le MITE

Lignes ne possdant 2,55 0,65 0,42 11 pas le MITE

Comparaison des moyennes Estimation F tubul F tubul ~egrs de la pour pour F calcul de un ~~gnificatifun ~~gnificatif ? 2 variance libertseuil seuil de de commune 5~/~ 1/~

0,58 4,41 18 2,101 OUI 2,88 OUI

Le test de comparaison de moyennes entre les lignées possédant l'insertion MITE et celles ne la possédant pas montre que les moyennes des notes de digestibilité pour les lignées ayant et n'ayant pas l'élément MITE sont significativement différentes à un seuil de 1%.
L'analyse de variance réalisée avec comme co variable, le pourcentage de F7 dans les lignées analysées confirme un effet hautement significatif de l'insertion du MITE.
Ces résultats montrent une association entre la présence d'une peroxydase inactive et un niveau de digestibilité accru.
Association entre la digestibilité et la présence de l'insertion MITE dans une population recombinante I~an496 x F7012 L'impact de l'allèle muté de Pox3/U19 a été
évalué d'une autre façon par typage d'une population d'haploïdes doublés issus du croisement de Lan496 (absence d'insertion de l'élément MITE et de digestibilité moyenne) par F7012 (insertion de l'élément MITE et bonne digestibilité) 46 haploïdes doublés ont été typés 0, 48 haploïdes doublés typés 1 La ségrégation est de type L'effet de l'insertion de l'élément MITE sur les caractères de parois (digestibilité, lignification, composition en glucides pariétaux) a été étudïé à partir de l'estimation de ces caractéristiques faite sur des plantes récoltées à une date normale ensilage en 2002 (10 septembre 2002). Ceci étant, la différence de précocité
de floraison entre les parents et les conditions peu favorables à la maturation des maïs en 2002 ont fait qu'il existait à la récolte un écart important de niveau de maturation entre les différentes lignées étudiées.
Les caractéristiques pariétales et les valeurs de digestibilité ont été évaluées par KIRS (Near Infra Red Spectroscopy),en utilisant la calïbration du Centre de Recherches Agronomiques de Libramont, Belgique.
Les mesures de NDF, ADF et ADL sont réalisées selon les protocoles décrits dans GOERING et al., Agric.
Handb., 379, US Gov. Print Office, Washington DC, 1971 ;
celles de lignine Klason selon DENCE et al., Methods in Lignin Chemistry Springer (ed.) Berlin, 33-62, 1992 ; les mesures de DINAG et DINAGZ respectivement selon ARGILLIER
et al., Euphytica, 82, 175-184, 1995 et BARRIERE et al., Fourrages, 163, 221-238, 2000. Enfin, les mesures de dNDF
sont réalisëes selon STRUIK, thèse doctorale, Université
de Wageningen, 1983 et DOLSTRA et MEDEMA, Proceedings of The l5th Congress Maize And Sorghum Section of Eucarpia, 4-8 juin 1990, Baden, Austria, 258-270.
Une analyse de variance a été réalisée avec des effets bloc, sous-bloc, matière sèche, marqueur MITE
et génotype, une covariable matière sèche étant nécessaire en raison du décalage de précocité entre les deux parents, en particulier après un été froid peu favorable à la maturation des lignëes. Les résultats obtenus avec la variable e< marqueur MITE » sont illustrés par le tableau ci-dessous.

TahlPai i I II
Marqueur MITECarr moyen Carr moyen F (Fisher)P
MITE rsiduel (Probabilit en ADL/NDF 0,28 0,14 2,0 16,Ons LK/NDF 30,5 0,65 47,1 0,00**

NDF 92,9 2,23 41,5 0,00''' ADF 52,0 1,15 q.5,2 0,00''i:

NDF-ADF 38,4 0,87 43,9 0,00~'*

ADF-ADL 5,9 0,35 17,0 0,00'-"~

DINAC~~ 89,7 1,33 6i,4 0,00"'1 dNDF ~ 26,6 ~ 2,93 9,1 0,39**

mur : veneur en paroi ns : n~n significatif (P>10%) ADF : teneur cellulose et lignine ADL *t' : significatif au seuil de 1 °/~
NDF-ADF : teneur en hémicellulose ADL/NDF : teneur en lignine ADL
LI~INDF : teneur en lignine Klason dNDF : digestibilité de la paroi DINAGZ : digestibilité des parois (sauf amidon, glucide soluble) A un stade de récolte représentatif du stade ensilage (compris entre 30 et 35 ~ de matière sèche en moyenne), l'effet du MITE mesuré par le critère du test F
de Fisher est très significatif sur de nombreux caractères liés à la digestibilité des parois. Il y a ainsi un effet significatif de l'insertion MITE sur les caractères de digestibilité in vitro des parois DINAGZ et dNDF. De même, il y a un effet du MITE sur la composition en glucides pariétaux hémicellulose et cellulose. Sur la lignification de la paroi, l'effet du MITE est très significatif sur la lignine totale, estimée par le critère lignine Klason dans le NDF, mais ne l'est pas sur la partie la plus résistante de la lignine estimée par l'ADL dans le NDF.
Présence de l'ARN de la peroxydase Pox3/U19 dans F7012 (possédant l'insertion MITE) et dans Lan496 par RT-PCR
Pour confirmer l'inactivation de la peroxydase par l'insertion d'un élément MITE, des analyses de RT-PCR
ont été réalisées sur le haut et le bas de jeunes plantes (mélange tiges et gaines de feuilles) et sur des limbes de feuilles pour des plantes au même stade. Ces analyses ont été réalisées sur la lignée F7012 (porteur de l'insertion MITE) et sur la lignée Lan496. L'extraction d'ARN total se fait à partir des tissus en présence de billes d'inox dans des tubes Eppendorf de 2mL trempés dans l'azote liquide. Les tïssus sont ensuite broyés dans un Mixer Mill MM300 (Qiagen~)en agitant 2 fois 30 secondes. La poudre ainsi obtenue est vortexée avec 1mL
de réactif TRIzol~ (Invitrogen) à température ambiante.
5 Le mélange est centrifugé à 180008 pendant 10 minutes à
4°C_ La phase aqueuse est à nouveau extraite à
température ambiante avec 200 ~L de chloroforme. L'ARN
est ensuite précipité avec 500~L d'isopropanol pendant 10 min à température ambiante. Après 10 minutes de 10 centrifugation (180008, 4°C), le culot d'ARN est lavé
avec 1mL d' éthanol à 70 ~, séché puis suspendu dans 30 uL
d'eau sans RNAse. Après traitement à la DNAse ensuite inactivée conformément aux instructions du fournisseur (AMBION), l'ARN est quantifié au spectrophotomètre à
15 260nm. Environ 5~g d'ARN total est rétro-transcrit en utilisant des hexamères aléatoires (Amersham) et une reverse-transcriptase sans activité RNaseH (Fermentas).
Les 20 HL de la réaction de rétro-transcription contiennent également 2,5105 copies de GeneAmplimer 20 pAW109 RNA (Applied Biosystems). L'ADNc ainsi obtenu est dilué 50 fois dans de l'eau. 5uL sont utilisés pour la réaction PCR dans un volume total de 20uL.
L'allèle Pox3/U19 est amplifié en utilisant l'amorce U19S1 (SEQ ID N°7) avec . soit l'amorce U19R1 25 (SEQ ID N°11 . 5'-CGTCAGGTTGCCTACCGTGTCGATCAGCAC-3') située à 84 pb en amont de l'insertion MITE, soit l'amorce U19MITEAS (SEQ ID N°10) située en aval de l'insertion. L'amplification est conduite avec comme témoins positifs l'ARNr 18S et le GeneAmplimer pAW109 RNA. Le nombre de cycles est ajusté en fonction de la visualisation de bandes visibles sur gel d'agarose et ce afin d'avoir une évaluation semi-quantitative. Les bandes sont visualisées avec du bromure d'éthidium.
Aucune différence d'intensité de signal n'est visible entre F7012 et Lan496 pour la partie amont de Pox3/U19 tandis que les bandes issues de l'amplification avec les amorces encadrant le MITE sont à peine visibles.
Cette différence d'intensité peut s'expliquer par une dégradation rapide de la partie non traduite de l'ARN de l'allèle mutant. Cette expérience confirme que l'insertion du transposon MITE entraîne l'inactivation de la peroxydase Pox3/U19.
~~~PL~ ~ . ~a~Ial~~Tg~~' Iè~ Izr'~ ~g~~~TI~Iâ~IT~ P~
g~~~TZ~~Tg~~ ~~ ~,~ P~~a~~~~~s~ ~~~~/U~~
Pour cette approche, une étude de bioanalyse a été réalisée au préalable pour rechercher une région spécifique de la peroxydase U19 afin de ne déréguler qu'un seul gène de cette famille multigénique. Après clonage de ce fragment il a été vérifié par transfert de Southern que ce fragment n'hybridait qu'un seul locus.
Transformation par Agrobacterium tumefaciens de plantés de mais par un antisens du gène de Pox3/U19 Construction d'un plasmide comprenant la séquence 3'UTR
de la peroxydase Pox3/U19 en orientation antisens Le vecteur utilisé pour la transformation du maïs par Agro,bacterium tumefaciens se présente sous la forme d'un plasmide superbinaire d'environ 50 kb (pREC
30 520 ) .
Ce vecteur comporte .
- une région ori . origine de réplication plasmidique Col EI, nécessaire au maintien et à la multiplication du plasmide dans Escherichia coli.
Cette origine de réplication n'est pas fonctionnelle dans Agrobacterium tumefaciens - une origine de réplication fonctionnelle dans Agrobacterium tumefaciens et dans Escherichia coli, - la région cos du bacteriophage lambda, pouvant présenter une utilité pour la manipulation du vecteur in v~i tr~~
- les régions vira, virC et vire supplémentaires d' Agro.bacterium tumefaciens qui augmentent l'efficacité de transformation - les gènes de résistance à la tétracycline (Tétra) et à la spectinomycine (Spect) qui s'expriment uniquement dans les bactéries, un ADN-T porteur de deux cassettes d'expression . 1°une contient le promoteur CsVI~V, la séquence 3'UTR de Pox3/U19 en orientation antisens et le terminateur NOS et l'autre comporte un gène de sélection (par exemple, un gène de résistance aux herbicides) sous contrôle du promoteur d'actine de riz et suivi du terminateur 3°NOS.
Protocole de transformation par Agrobacterium tumefaciens (d'après ISHIDA et al., Nature Biotechnology,
14, 745-750, 1996).
Des épis immatures d'une lignée produite en serre, sont prélevés 10 jours après la pollinisation et stérilisés pendant 15 minutes. Les embryons sont prélevés et mis en contact 5 minutes avec une suspension d'Agrobacterium contenant le vecteur super binaire tel que décrit ci-dessus. Après avoir été retirés de la suspension d'Agrobacterium, les embryons sont mis en culture sur un milieu ne contenant ni de bactériostatique, ni d'agent sélectif. Cette coculture a lieu 4 à 7 jours à l'obscurité.
Après la coculture, les embryons sont repiqués sur un milieu de callogénèse frais contenant le bactériostatique et l'agent sélectif. Un cal va s'initier et se développer à partir de cellules transformées de ces embryons. L'étape de callogénèse se passe à 25 °C à
l'obscurité et dure 5 semaines. Les embryons-cals sont repiqués sur milieu frais toutes les 2 à 3 semaines.
Au terme de cette étape les cals blancs, transformés, sont excisés de l'expiant primaire et sont repiqués sur un milieu de régénération contenant de la zéatine au lieu d'auxine. L'étape de régénération dure aussi 5 semaines entrecoupées d'un repiquage du cal sur milieu frais toutes les 2 à 3 semaines.

Après 2-3 semaines sur ce milieu, des plantules régénèrent à partir des cals. Une fois que les plantules sont assez développées, elles sont mises en enracinement en tube.
Après 10-15 jours en tube, les plantules sont acclimatées en phytotron avant d'être transférées en serre. Les transformants sont ensuite cultivés et croisés avec du pollen d'une plante non transgénique pour produire la génération T1.
T:~~n~~~~ti~~. ~a~r bi~li~ti~~ ~~ ~l~.aat~~ de m~,ï~ ~~r un anti sens d~z ~~ra~ ~e P~~~3 /ZJ1 ~
Construction d'un plasmide comprenant la séquence 3'UTR
de Ia peroxydase Pox3/U19 en orientation antisens La région 3'UTR de Pox3/U19 en orientation antisens a été clonée dans Ie vecteur pTriplEX2 (SMARTTM
cDNA Library construction Kit, CZONTECH). Le fragment Hind III - EcoR I encadrant Ia séquence d'intérêt a été
introduit dans le vecteur E 919 également ouvert aux sites de restriction H.ind III et EcoR I, sites situés respectivement en aval du promoteur CsVMV et en amont du terminateur NOS. On obtient ainsi le plasmide d'intérêt E
1105.
La technique de transformation par biolistique implique de co-transformer des cellules vêgëtales d'une part avec le gène d'intérêt (E 1105), et d'autre part avec un plasmide porteur d'une cassette d'expression (pDM302) comprenant un gène de sélection (par exemple, un gène de résistance à un herbicide) précédé du promoteur adéquat et suivi du terminateur adapté.
Protocole de transformation Des embryons immatures de HiII sont prélevés 10 jours après la pollinisation. Ils sont mis en culture sur un milieu osmotique. 4 jours après ils sont bombardés avec des particules d'or enrobées de plasmide contenant le gène d'intérêt et un plasmide portant le gène de sélection.

Les embryons sont ensuite repiqués sur un milieu de callogénèse. Cette étape, à l'obscurité et à
25 °C, dure environ 2 mois, entrecoupés de repiquage sur milieu frais tous les 15 jours. Une fois que les cals transformés sont sélectionnés, ils sont cultivés sur milieu de maturation, puis sur milieu de régénération.
L' étape de régénération se fait à la lumière et dure 2 à
4 semaines.
Dès 1 à 2 semaines après le passage sur ce milieu des plantules régénèrent à partïr d'embryons somatiques initiés pendant l'étape de maturation. Ces plantules sont ensuite mïses en enracinement en tube.
Comme dans le cas des plantes produites par transformation par Agrobacterium, les plantules enracinées sont ensuite acclimatées au phytotron avant transfert en serre pour production de graines T1 Inactivation de la peroxydase Pox3/U19 par RNAi Construction d'un vecteur comprenant la séquence 3'UTR de la peroxydase Pox3/U19 en orientation sens et antisens Ce vecteur est construit en utilisant le système Gateway~ (Invitrogen).
Un fragment 3'UTR du gène de Pox3/U19, est amplifié par PCR, à partir d'ADNc de maïs contenu dans un plasmide dénommé E1100.
Les amorces utilisées sont les suivantes .
O1 321 . (CACCGGAGTGGCTGCG; SEQ ID N0: 5) comportant une extension CACC en 5', nécessaire pour le clonage dans le vecteur d'entrée, et O1 322: (ATCGACAAATATATATGTTTATAAGG; SEQ ID N0: 6).
Les conditions d'amplification utilisées sont les suivantes .
plasmide E 1100 (10 ng/ul) . 2 ul Tampon x10 (Cloned Pfu Puffer) 2 ~l dNTP (5mM each) 0,8 ul 01 321 10 ~aM 1 dal Ol 322 10 pM 1 ul Pfu (2.5U/ul)(Stratagene) 1 ~1 H20 10 , 7 pl Cycle . l0 min 95°
30 sec 92°
30 sec 55° 20 fois 5 40 sec 72°
10 min 72°
Le fragment amplifié est ensuite cloné en antisens et en sens dans le vecteur dans le vecteur pENTR
D/Topo (Invitrogen), pour donner le vecteur d'entrée 10 E1121.
Parallèlement le vecteur de destination E1122, qui contient l'intron de tubuline de riz est construit.
Une double recombinaison entre ces 2 vecteurs aboutit à
l'obtention du vecteur E1129, qui contient une cassette
15 comprenant la 3'UTR de Pox3/U19 en orientation antisens, l'intron de tubuline de riz, et la 3'UTR de Pox3/U19 en orientation sens. De part et d'autre de cette cassette se trouvent deux sites de restriction Sac I. Ze fragment Sac I est cloné dans un vecteur de clonage intermédiaire 20 portant un gène de résistance à la kanamycine. Ze vecteur obtenu est dénommé E 1137. Ze fragment Sac I de E 1137 est introduit dans le vecteur E 919 ouvert au site Sac I, pour obtenir le vecteur E 1142. Ce vecteur porte une cassette d'expression constituée du promoteur CsVMV, de 25 la séquence 3'UTR de U19 en orientation antisens, du premier intron du gène de la tubuline de riz, de la séquence 3'UTR de Pox3/U19 en orientation sens et du terminateur NOS.
Il peut être utilisé pour la transformation du 30 maïs par biolistique, comme décrit ci-dessus.
Obtention des filantes 115 lignëes transgéniques ont été obtenues en suivant le protocole de dérégulation décrit ci-dessus.
Parmi elles, 105 sont en cours d'observation en serre et 18 en champ. Ces plantes font l'objet d'observations phénotypiques complétées par des analyses croisées d'histochimie, de RT-PCR et d'évaluation dans le proche infra-rouge (NIRS). Suite à ces diverses analyses, les lignées retenues font l'objet d'analyses de digestibilité
in vitro (selon les diffërents protocoles mentionnés dans l'exemple 2 ci-dessous).

SEQUENCE LISTING
<110> GENOPLANTE-VALOR
GUILLET, Carine BARRIERE, Yves MURIGNEUX, Alain MARTINANT, Jean-Pierre <120> OBTENTION DE PLANTES A DTGESTIBILITE AMELIOREE POSSÉDANT UNE
PERO~fYDASE INACTIVE
<130> MJPbv1516-15 <160> 11 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1532 <212> DNA
<213> Zea mays <220>
<221> CDS
<222> (2)..(208) <223>
<220>
<221> Intron <222> (209)..(322) <223>
<220>
<221> CDS
<222> (323)..(781) <223>
<220>
<221> Intron <222> (782)..(880) <223>
<220>
<221> CDS
<222> (881)..(1285) <223>
<400> 1 g acg aag cgg cac tgc ttg cgc ttc acc acc gtc ctg gcg acg acg ctt 49 Thr Lys Arg His Cys Leu Arg Phe Thr Thr Val Leu Ala Thr Thr Leu ctc tcc gcc acc gcc gcc tgc ctc gac gtc ggc ttc tac gac agg aca 97 Leu Ser Ala Thr Ala Ala Cys Leu Asp Val Gly Phe Tyr Asp Arg Thr tgc ccc act gcc gag acc atc gtg cag cag acc gtg gcg gcc gcg ttc 145 Cys Pro Thr Ala Glu Thr Ile Val G1n Gln Thr Val Ala Ala Ala Phe WO 2004/080202 ~ PCT/FR2004/000569 aggaac aactccggc gtcgctccg gcgctg atccgcatg cacttccat 193 ArgAsn AsnSerGly ValA1aPro AlaLeu IleArgMet HisPheHis gactgc tttgtcagg gtaattaagc tcacgcatgc tgtggctag gacatgct 248 a aa AspCys PheValArg gttttttttt cctctccaca gagtg tgtacgtacgcgcgcgggctctaaactc 308 cgagc ac cttgcttgct gcagggc tgcgatggc tcggtg ctgatcgac acggtaggc 358 Gly CysAspGly SerVal LeuIleAsp ThrValGly aacctg acggcggag aaggacgcg ccaccc aacaacccc agcctccgg 406 AsnLeu ThrAlaGlu LysAspAla ProPro AsnAsnPro SerLeuArg ttcttc gacgtggtc gaccgtgcc aaggcg tcactggag gctcagtgc 454 PhePhe AspValVal AspArgAla LysAla SerLeuGlu AlaGlnCys 100 105 lI0 cccggc gtggtctcc tgcgccgac gtgctc gccttcgcg gccagggac 502 ProGly ValValSer CysAlaAsp ValLeu AlaPheAla AlaArgAsp agcgtc gtgctctcc ggtggcctc ggctac caggtgccg gccggacgc 550 SerVal ValLeuSer GlyGlyLeu GlyTyr GlnValPro AlaGlyArg cgtgac gggcggata tccaatgac accgaa gccctcaac aacctgcct 598 ArgAsp GlyArgIle SerAsnAsp ThrGlu AlaLeuAsn AsnLeuPro ccgccg ttcttcaac gccaccgag ctggca gacaggttc gcctccaag 646 ProPro PhePheAsn AlaThrGlu LeuAla AspArgPhe AlaSerLys aacctc agtatcgag gacctggtc gtgctc tccggcgcg cacaccatc 694 AsnLeu SerI1eGlu AspLeuVal ValLeu SerGlyAla HisThrIle ggcgtc tcgcactgc agcggcttc gccggc ccgacagac ctgaacggc 742 GlyVal SerHisCys SerGlyPhe AlaGly ProThrAsp LeuAsnGly cccgtt gaccggctc tacaacttc agctcg cctgacggg gtaggggcat 791 ProVal AspArgLeu TyrAsnPhe SerSer ProAspGly cgtctgtcac t aaaacctt gaatgcgaaa aaaagatgac cccggttat 851 ctcgctctc gc c tacttaccat gctgt tgtacag attgac ccgacgctg agcaaagcc 904 gcatt gg IleAsp ProThrLeu SerLysAla tacgca tttcttcte aagagcatc tgcccg gccaacacc agccagttc 952 TyrAla PheLeuLeu LysSerIle CysPro Ala Thr SerGlnPhe Asn ttcccgaac acgacggtg ttcatg gacctcatcacg ccggaa aggttt 1000 PheProAsn ThrThrVal PheMet AspLeuIleThr ProGlu ArgPhe 250 255 2~0 gacaacaag tactacgtc ggcctg accaacaacctg ggcctc ttcaag 1048 AspAsnLys TyrTyrVal GlyLeu ThrAsnAsnLeu GlyLeu PheLys tcagacgtg gcgctgctg accaac gcgacgatgaag gccctg gtcgac 1096 SerAspVal AlaLeuLeu ThrAsn AlaThrMetLys AlaLeu ValAsp tccttcgtg cgcagcgag gcgact ttcaggaccaag tttgcc aggtcc 1144 SerPheVal ArgSerGlu AlaThr PheArgThrLys PheAla ArgSer atgatcaag atggggcag atcgag gtgctgacgggg acgcag ggcgag 1192 MetIleLys MetGlyGln IleGlu ValLeuThrGly ThrGln GlyGlu atcaggcgc aactgcagg gtcatc aaccccgttagt gccacc gatgat 1240 TleArgArg AsnCysArg ValIle AsnProValSer AlaThr AspAsp gtcgtcctc gcccgccca tcagga ttcactggagtg gctgcg agc 1285 ValValLeu AlaArgPro SerGly PheThrGlyVal AlaAla Ser tagctaacca cggtt tgcacatgcattgtgcag tgtgtgatgt gtgag 1345 actgt ca ctagt ttgatgtgtg aaattgtaat aagtaatgag cagattatct tggtaagctc gcttgttact 1405 gtggcaaaag ttgttttgtt gcatgacaaa aatgtatact catcggatta ttgaaaacaa 1465 aactgatatt tgtgttcagg caaataatag ttctacaaat tccttataaa catatatatt 1525 tgtcgat 1532 <210> 2 <211> 357 <212> PRT

<213> Zeamays <400> 2 Thr ArgHis CysLeu ArgPheThr ThrValLeu AlaThrThr Leu Lys Leu AlaThr AlaAla CysLeuAsp ValGlyPhe TyrAspArg Thr Ser Cys ThrAla GluThr IleValGln GlnThrVal AlaAlaAla Phe Pro Arg AsnSer GlyVal AlaProAla LeuIleArg MetHisPhe His Asn Asp PheVal ArgGly CysAspGly SerValLeu IleAspThr Val Cys Gly Asn Leu Thr Ala Glu Lys Asp Ala Pro Pro Asn Asn Pro Ser Leu 85 90 g5 Arg Phe Phe Asp Val Val Asp Arg Ala Lys Ala Ser Leu Glu Ala Gln Cys Pro Gly Val Val Ser Cys Ala Asp Val Leu Ala Phe Ala Ala Arg Asp Ser Val Val Leu Ser Gly Gly Leu Gly Tyr Gln Val Pro Ala Gly Arg Arg Asp Gly Arg Ile Ser Asn Asp Thr Glu Ala Leu Asn Asn Leu Pro Pro Pro Phe Phe Asn Ala Thr Glu Leu Ala Asp Arg Phe Ala Ser Lys Asn Leu Ser Ile Glu Asp Leu Val Val Leu Ser Gly A1a His Thr Ile Gly Val Ser His Cys Ser Gly Phe Ala Gly Pro Thr Asp Leu Asn Gly Pro Val Asp Arg Leu Tyr Asn Phe Ser Ser Pro Asp Gly Ile Asp Pro Thr Leu Ser Lys Ala Tyr Ala Phe Leu Leu Lys Ser Ile Cys Pro Ala Asn Thr Ser Gln Phe Phe Pro Asn Thr Thr Val Phe Met Asp Leu Ile Thr Pro Glu Arg Phe Asp Asn Lys Tyr Tyr Val Gly Leu Thr Asn Asn Leu Gly Leu Phe Lys Ser Asp Val Ala Leu Leu Thr Asn Ala Thr Met Lys Ala Leu Val Asp Ser Phe Val Arg Ser Glu Ala Thr Phe Arg Thr Lys Phe Ala Arg Ser Met Ile Lys Met Gly Gln Ile Glu Val Leu Thr Gly Thr Gln Gly Glu Ile Arg Arg Asn Cys Arg Val Ile Asn Pro Val Ser Ala Thr Asp Asp Va1 Val Leu Ala Arg Pro Ser Gly Phe Thr Gly Val Ala Ala Ser <210> 3 <211> 1744 <2l2> DNA

<213> Zea mays <220>
<221> CDS
<222> (2)..(208) <223>
<220>
<221> CDS
<222> (334)..(534) <223>
<220>

<221> misc feature <222> _ (458)..(779) <223> Insertion MITE

<400> 3 g acg ag cgg cac tgc ttg tc ctg 49 a cgc ttc acc acc g gcg acg acg ctt Thr ys Arg His Cys Leu L Arg Phe Thr Thr Val Leu Ala Thr Thr Leu ctc gcc act gcc gcc tgc gac gtc ttc gac agg aca 97 tcg ctc ggc tac Leu Ala Thr Ala Ala Cys Asp Val Phe Asp Arg Thr Ser Leu Gly Tyr tgc act gcc gag acc atc cgg cag gtg gcc gcg ttc 145 ccc gtg acc gcg Cys Thr Ala Glu Thr Ile Arg Gln Val Ala Ala Phe Pro Va1 Thr A1a agg aac tcc ggc gtc gct gcg ctg cgc cac ttc cat 193 aac ccg atc atg Arg Asn Ser Gly Val Ala Ala Leu Arg His Phe His Asn Pro Ile Met gac ctt gtc agg gtaatcaagccactgcacg tgtagctaga 248 tgc a catgcacgca Asp Leu Val Arg Cys cgacatgctg gagcgagtgacgtaagtacg cgcgcgggct308 tttttttttt ctctccacac ctaactctaa actacttgct ggctgc gatggctcg gtgctggtc gac 360 tgcag GlyCys AspGlySer ValLeuVal Asp acggtgggcaac ctgacg gcggagaag gacgcgcca cccaacaac ccc 408 ThrValGlyAsn LeuThr AlaGluLys AspAlaPro ProAsnAsn Pro agcctccggttc ttcgac gtggtcgac cgtgccaag acggcactg gag 456 SerLeuArgPhe PheAsp ValValAsp ArgAlaLys ThrAlaLeu Glu ~5 100 105 1l0 gctcagggtgtg tttggt ttggctttt ggttttggc ttttgcccc cta 504 AlaGlnGlyVal PheGly LeuAlaPhe GlyPheGly PheCysPro Leu aaagccaaaagc caacca aagggctgg atctaggaagcag a 554 ctttttcta LysAlaLysSer GlnPro LysGlyTrp Ile aagtcgactt tctcgtagtg caaaactgaa agcacccctg gacctgcttt tagtggcttt 614 tgaatggaac tgtgaaaaca tatatcaaag aacttttaac gacttctagt ggttttcacc 674 aaacgatttt tagcttttta acagcacaca gcctacagca gctttttcca cagctcacag 734 cccacagcaa ctttttccac agccacagcc caaccaaaca gaccctcagt gccccggcgt 794 tgtctcctgc gccgacgtgc tcgccttcgc ggccagggac agcgtcgtgc tctccggtgg 854 cctcggctac caggtgccgg ccggacgccg tgacgggcgg atatccaatg acaccgaagc 914 cctcaacaac ctgcctccgc cgttcttcaa cgccaccgag ctggcagaca ggttcgcctc 974 caagaacctc actatcgagg acctggtcgt gctctccggc gcgcacacca tcggcgtctc 1034 gcactgcagc ggcttcgccg gcccgacaga cctgaacggc cccgttgacc ggctctacaa 1094 cttcagctcg cctgacgggg tagggacatc gtctgtcacc tcgctctctc tgtccaaaac 1154 cttgaatgcg aaaaaaagat gacccccggt tacttaccat tgctgtggtg tacagattga 1214 cccgacgctg agcaaagcct acgcatttct tctcaggagc atctgcccgg ccaacaccag 1274 ccagttcttc ccgaacacga cggtgttcat ggacctcatc acgccggaaa ggtttgacaa 1334 caagtactac gtcggcctga ccaacaacct gggcctcttc aagtcagacg tggcgctgct 1394 gaccaacgcg acgatgaagg ccctggtcga ctccttcgtg cgcagcgagg cgactttcag 1454 gaccaagttt gccaggtcca tgatcaagat ggggcagatc gaggtgctga cggggacgca 1514 gggcgagatc aggcgcaact gcagggtcat caaccccgtt agtgccaccg atgatgtcgt 1574 cctcgcccgc ccatcaggat tcactggagt ggctgcgagc tagctaacca actgtcggtt 1634 catgcacatg cgttgtgcac agtgtgtgat gtctagtgtg agttgatgtg tgaaattgta 1694 ataagtaatg agcagattat cttagtaagc tcgcttgtta ctgtggcaaa 1744 <210> 4 <211> 136 <212> PRT

<213> Zea mays <220>

<221> misc feature <222> _ (458)..(779) <223> Insertion MITE

<400> 4 Thr Arg His Cys Arg ThrThr Val Leu ThrThr Lys Leu Phe Ala Leu Leu Ala Thr Ala Cys AspVal G1y Phe AspArg 5er Ala Leu Tyr Thr Cys Thr Ala Glu Ile ArgGln Thr Val AlaAla Pro Thr Val Ala Phe WO 2004/080202 ~ PCT/FR2004/000569 ArgAsn AsnSerGly ValAla ProAlaLeu IleArgMet HisPheHis AspCys LeuValArg GlyCys AspGly5er ValLeuVal AspThrVal GlyAsn LeuThrAla GluLys AspAlaPro ProAsnAsn ProSerLeu ArgPhe PheAspVal ValAsp ArgAlaLys ThrAlaLeu GluAlaGln GlyVal PheGlyLeu AlaPhe GlyPheGly PheCysPro LeuLysAla 1l5 120 125 LysSer GlnProLys GlyTrp Ile <210> 5 <211> 16 <212> DNA
<2I3> Zea mays <400> 5 caccggagtg gctgcg 16 <210> 6 <21l> 26 <212> DNA
<213> Zea mays <400> 6 atcgacaaat atatatgttt ataagg 26 <210> 7 <211> 29 <212> DNA
<213> Zea mays <400> 7 gacgaagcgg cactgcttgc gcttcacca 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA
<213> Zea mays <400> 8 tgccacagta acaagcgagc ttaccaaga 29 <210> 9 <211> 24 <212> DNA
<213> Zea mays <400> 9 ggcactggag gctcagggtg tgtt 2~
<210> 10 <211> 20 <212> DNA
<213> Zea mays <400> 10 aggagacaac gccggggcac <210> 11 <21l> 30 <212> DNA
<213> Zea mays <400> 11 cgtcaggttg cctaccgtgt cgatcagcac 30

Claims (18)

1) Procédé pour améliorer la digestibilité
d'une plante, caractérisé en ce que l'on inhibe totalement ou partiellement l'expression et/ou l'activité
dans ladite plante, d'une peroxydase, dénommée ci-après peroxydase Pox3/U19, dont la séquence polypeptidique possède au moins 75% d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 2.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite plante est le maïs.
3) Utilisation d'au moins un polynucléotide choisi parmi :
a) un polynucléotide codant pour une peroxydase Pox3/U19 telle que définie dans la revendication 1 ;
b) un polynucléotide complémentaire d'un polynucléotide a) ci-dessus ;
c) un fragment d' au moins 12 nucléotides consécutifs, d'un polynucléotide a) ou b) ci-dessus, ou capable de s'hybrider sélectivement avec ledit polynucléotide, pour la mise en ouvre d'un procédé selon une quelconque des revendications 1 ou 2.
4) Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit polynucléotide est choisi parmi :
un polynucléotide susceptible d'être obtenu à partir d'ADNc ou d'ADN génomique de maïs, par amplification avec les amorces CACCGGAGTGGCTGCG (SEQ ID NO: 5) et ATCGACAAATATATATGTTTATAAGG (SEQ ID NO: 6) ;
- un fragment d'au moins 12 nucléotides consécutifs dudit nucléotide.
5) Procédé selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'inhibition de l'expression et/ou de l'activité de la peroxydase Pox3/U19 est obtenue par mutagenèse du gène codant pour ladite peroxydase.
6) Procédé selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation de ladite plante avec une construction d'ADN recombinant comprenant un polynucléotide tel que défini dans une quelconque des revendications 3 ou 4, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
7) Cassette d'expression comprenant un polynucléotide tel que défini dans une quelconque des revendications 3 ou 4, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
8) Vecteur recombinant contenant une cassette d'expression selon la revendication 7.
9) Plante génétiquement modifiée, susceptible d'être obtenue par un procédé selon la revendication 6.
10) Procédé de sélection de plantes, caractérisé en ce qu'il comprend la recherche chez les plantes à tester d'un allèle du gène de la peroxydase Pox3/U19 possédant une mutation résultant en une inhibition totale ou partielle de l'expression et/ou de l'activité de ladite peroxydase.
11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est mis en ouvre sur le maïs.
12) Utilisation d'au moins un polynucléotide tel que défini dans une quelconque des revendications 3 ou 4, pour la mise en ouvre d'un procédé selon une quelconque des revendications 10 ou 11.
13) Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en ouvre du couple d'amorces SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8.
14) Utilisation selon une quelconque des revendications 12 ou 13, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en ouvre du couple d'amorces SEQ ID NO:
9 et SEQ ID NO: 10.
15) Couple d'amorces de séquences SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6.
16) Couple d'amorces de séquences SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8.
17) Couple d'amorces de séquences SEQ ID NO: 9 et SEQ ID NO: 10.
18) Kit pour la mise en ouvre d'un procédé
selon une quelconque des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un couple d'amorces selon une quelconque des revendications 16 ou 17.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US20090087878A9 (en) * 1999-05-06 2009-04-02 La Rosa Thomas J Nucleic acid molecules associated with plants
NZ521545A (en) * 2000-03-24 2004-04-30 Samuel Roberts Noble Found Inc Method for modifying lignin composition and increasing in vivo digestibility of forages
US20020144307A1 (en) * 2000-10-25 2002-10-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant defense-inducible genes and their use

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