CN1401003A - 植物病斑形成抑制基因,Sp17及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明人通过连锁分析成功地从水稻中分离得到一个病斑形成抑制基因(Sp17)。结果显示，将该基因导入植物可以提高其热逆境抗性并能够抑制病斑形成。

Description

植物病斑形成抑制基因，Sp17及其应用

技术领域

本发明涉及与植物病斑(lesion)形成以及植物热逆境抗性有关的基因，以及通过该基因修饰植物的方法。本发明可应用于农业领域，包括应用于植物育种技术。

背景技术

过去产生了各种各样的水稻(rice)突变株。其中包括在水稻生长期间在叶片上形成了病斑样坏死斑的突变株(图1)(Rice Genetics Newsletter 12：9-153(1995))。这些突变株中的这些病斑是在高温和强光照下形成，从而暗示在突变基因与避免光和热所引起的损害之间存在关系(Fuse T等，Physiol.Plant 89：799-804(1993))。另一方面，这些基因被假定与植物细胞的超敏反应相关，并导致细胞死亡，因为一些形成了病斑的植物对于致病微生物的感染具有抗性(Kawasaki T.和Shimamoto K.，Cell Engineering Supplement“Plant Cell Engineering Series 8：Disease Resistance of Plants at MolecularLevel”124-130页(1997))。

所以，鉴定这些突变株中的突变基因以及分离相应的野生型基因可以抑制病斑的形成并通过转化方法将该基因导入到任意品种中来提高水稻植株对于应激，如光和热的抗性。

由此，本领域中存在鉴定这些突变株中的突变基因并分离相应的野生型基因的需要。

发明内容

本发明正为满足本领域的这种需求，本发明的目的是分离一种新颖的与植物病斑形成的抑制相关的基因。本发明的另一目的是通过应用该新基因修饰植株。

为完成该目的鉴定突变基因并分离相应的野生型基因，本发明者对Sp17进行了大量研究，在研究中，在水稻生长期间于叶片上形成病斑样坏死斑的突变株中，在5号染色体上存在一个突变基因。

首先，本发明者进行了连锁分析并排列了酵母人工染色体(YAC)克隆的Sp17基因区。具体地，进行大量分离群的连锁分析，这对于分离Sp17基因是必需的。此外，通过应用水稻基因组研究计划(Rice Genome ResearchProgram)中建立的YAC基因组克隆文库鉴定出与Sp17基因座邻接的YAC克隆。然后，分离所鉴定的YAC克隆的末端片段并通过序列对比证实YAC克隆含有Sp17基因区(图2C)。

本发明者使用由RFLP标记C11368制备的STS引物组，从水稻基因组研究计划构建的Nipponbare基因组PAC克隆文库中，选出了9个PAC克隆，其中所述标记C11368与Sp17在同一基因座位。对这些PAC克隆进行序列对比以指示含有Sp17基因座位的PAC克隆(图2D)。

根据使用排列在Sp17区中的YAC和PAC克隆的末端片段作为新RFLP标记或CAPS标记构建的详细基因图谱，Sp17基因座位被证实存在于RFLP标记P461H4T和P693G10S之间的一段约16kb的基因组区域(图2)。

分析候选基因组区域的核苷酸序列。在序列信息的基础上构建一种新的CAPS标记以便进一步界定候选基因区域，得出结论Sp17基因存在于CAPS标记S12C6-6d和HsfC3-3’之间的约3kb的基因组区域(图3)。

针对候选基因组区域的核苷酸序列进行基因预测和相似性搜索。研究显示只有一个预测的ORF，该ORF与分离自例如番茄和拟南芥属(Arabidopsis)植物的Hsf基因具有相似的序列。这样，该基因被判断为Sp17基因的一个候选，并测定了突变株KL210中相应区域的核苷酸序列。结果揭示与野生型基因相比，在突变基因的核苷酸序列中有核苷酸被取代(图4)。与核苷酸取代相关联的氨基酸取代被认为是Sp17蛋白功能丧失或降低的原因。

进一步，本发明者通过将基因组区域(指定为Sp17基因候选)插入到载体而将该区域导入Sp17突变株，其中的突变株可使用农杆菌(Agrobacterium)转化。转化的植株可以在隔离温室中在自然日照条件下生长，以监测病斑的形成。在对照植株(仅用载体转化)和生长晚期的突变株中都观察到了病斑的形成，而用候选基因转化的植株中没有一株显示出病斑形成(图5)。由此，可以推断，候选基因区抑制了突变株KL210中病斑的形成。而且，在转基因植株的自交子代中，形成病斑的植株和不形成任何病斑的植株之间的分离比率与期望的比率一致。所以，可以推断该候选基因就是Sp17基因。

而且，本发明者检测了病斑形成的必要条件。发现高温(图6)和紫外辐射是增加病斑形成的条件(图7)。这些事实显示Sp17基因在植物预防高温应激中起重要作用。这样，通过培养表达Sp17基因的转基因植物，可以提高植物自身的能力来避免热胁迫以及抑制植物的病斑形成。

换言之，本发明者成功地分离到与植物病斑形成的抑制相关的基因。本发明者还发现该基因可以抑制植物病斑形成并且通过该基因还可以提高植物对热胁迫的抗性，从而完成本发明。

更具体地，本发明提供：

(1)  编码来源于植物的蛋白的DNA，该蛋白可以抑制植物病斑的形成，该DNA是选自：

(a)  编码含有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白的DNA；

(b)  包含SEQ ID NO：1核苷酸序列编码区的DNA；

(c)  编码含有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白的DNA，其中该蛋白中一个或多个氨基酸被取代，缺失，添加和/或插入；以及

(d)  在严紧条件下能够与SEQ ID NO：1核苷酸序列组成的DNA杂交的DNA；

(2)  编码来源于植物的蛋白的DNA，该蛋白能够提高植物对热胁迫的抗性，其中所述DNA选自：

(a)  编码含有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白的DNA；

(b)  含有SEQ ID NO：1核苷酸序列编码区的DNA；

(c)  编码含有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白的DNA，其中该蛋白中一个或多个氨基酸被取代，缺失，添加和/或插入；以及

(d)  在严紧条件下能够与SEQ ID NO：1核苷酸序列组成的DNA杂交的DNA；

(3)  含有(1)或(2)的DNA的载体；

(4)  导入了(1)或(2)的DNA，或者(3)的载体的重组细胞；

(5)  (4)的重组细胞，其中所述的转化细胞是植物细胞；

(6)  由(1)或(2)的DNA编码的蛋白；

(7)  生产(6)的蛋白的方法，其中所述方法包括：

培养(4)的转化细胞；以及

从转化细胞或其培养上清中收集表达的蛋白；

(8)  含有(5)的转化细胞的植物转化体；

(9)  (8)的植物转化体的子代植物转化体或克隆植物转化体；

(10) (8)或(9)的植物转化体的繁殖材料；

(11) 生产(8)的植物转化体的方法，其中所述方法包括

(a)  将(1)或(2)的DNA导入植物细胞，以及

(b)  从所述植物细胞再生植株；

(12)  一种抑制植物病斑形成的方法，其中所述方法包括在所述植物体细胞内表达(1)的DNA；

(13)  一种提高植物热逆境抗性的方法，其中所述方法包括在植物细胞中表达(2)的DNA；

(14)  一种结合(6)的蛋白的抗体；以及

(15)  包含至少15个核苷酸的多核苷酸，所述至少15个核苷酸与由SEQ ID NO：1核苷酸序列组成的DNA互补，或与其互补链互补。

本发明提供编码Sp17蛋白的DNA。Nipponbare水稻Sp17染色体DNA的核苷酸序列在SEQ ID NO：1中列出，所述DNA编码的蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO：2中列出。已知Sp17基因与水稻病斑形成的抑制相关。该基因位于5号染色体上较大范围内的某处。但是，以前并没有鉴定或分离出Sp17基因。经过大量研究，本发明者最终鉴定出该基因存在的区域，并首次将该基因作为单个的基因分离出来。

Sp17蛋白具有抑制水稻由于热胁迫所导致的病斑形成的功能。并且，Sp17蛋白与热休克蛋白基因的转录调节相关联，这点已从Sp17蛋白的结构中得到暗示。最近，据报道一种热休克蛋白与避免植物热胁迫密切相关(Queitsch C等，Plant Cell 12：479-492(2000))。所以，可以总结出：通过用编码Sp17蛋白的DNA转化植物可以提高植物热胁迫的抗性，从而抑制病斑形成。

本发明编码Sp17蛋白的DNA包括染色体DNA，cDNA以及化学合成的DNA。染色体DNA和cDNA可以通过本领域技术人员已知的常规方法制备。更具体地，染色体DNA可按如下制备：(1)从具有Sp17基因的水稻品种(例如Nippombare)中提取染色体DNA；(2)构建基因组文库(利用载体如质粒，噬菌体，粘粒，BAC，PAC等)；(3)铺板该文库；以及(4)使用在编码本发明蛋白的DNA(如SEQ ID NO：1)基础上制备的探针进行菌落杂交或噬斑杂交。或者，可通过使用对编码本发明蛋白质的DNA(例如SEQ ID NO：1)特异性的引物进行PCR来制备染色体DNA。另一方面，cDNA可按如下制备：(1)在从具有Sp17基因的水稻品种(例如Nipponbare)中提取的mRNA基础上合成cDNA；(2)通过将合成的cDNA插入载体如λZAP来制备cDNA文库；(3)将cDNA文库铺板；以及(4)如上所述进行菌落杂交或噬斑杂交。或者，cDNA还可以通过PCR制备。

本发明包括编码与SEQ ID NO：2所示Sp17蛋白功能等价的蛋白(Nipponbare)的DNA。尽管本发明DNA的来源物种没有限制，但优选禾本科(Gramineae)，最优选水稻。在此，短语“与Sp17蛋白功能等价”，指目的蛋白具有抑制植物病斑形成和/或提高植物的热胁迫抗性的功能。

这类DNA的实例包括那些编码突变体，衍生物，等位基因，变体的DNA和包含SEQ ID NO：2氨基酸序列且其中一个或几个氨基酸被取代，缺失，添加和/或插入的同系物。

编码含有改变后氨基酸的蛋白的DNA的制备方法实例对于本领域技术人员而言是公知的，包括定点诱变(Kramer，W和Fritz，H.-J.，“Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA.”Methods in Enzymology，154：350-367(1987))。蛋白的氨基酸序列由于其相应的核苷酸序列的突变还可以天然突变。编码具有天然Sp17蛋白的氨基酸序列且其中一个或几个氨基酸被取代，缺失和/或增加的蛋白的DNA，只要它们编码的蛋白与天然Sp17(SEQ ID NO：2)蛋白功能等价，则也属于本发明的保护范围之内。另外，并不引起蛋白质氨基酸序列改变的核苷酸序列突变体(简并突变体)也属于本发明DNA的保护范围。

本发明者可以评价一段DNA是否编码抑制植物病斑形成的蛋白，其通过将受试DNA插入到合适的载体中，用其转化sp17突变株，然后观察突变株的病斑形成是否被抑制(实施例6中描述)。另一方面，DNA是否编码能够提高植物热逆境抗性的蛋白可通过下述步骤确定：将受试DNA插入到一个合适的载体中；用所述载体转化野生型植株；观察在高温条件(约40℃)和低温条件(约25℃)下该植株的生长；然后比较高温条件下该转化的野生型植株与野生型植株相比生长速度和生长量的降低。受试DNA被认为能够赋予以植物热逆境抗性的条件是，当在高温生长条件下与野生型植株相比，生长速度的降低变小。

编码与SEQ ID NO：2所述Sp17蛋白功能等价的蛋白的DNA可，例如，通过本领域技术人员公知的方法制备。这些方法包括：使用杂交技术的方法(Southern，E.M.Journal of Molecular Biology，98：503，(1975))；以及聚合酶链反应(PCR)技术(Saiki，R.K.等Science，230：1350-1354，(1985)；Saiki，R.K.等Science，239：487-491，(1988))。对于本领域技术人员而言，使用Sp17基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)或其片段作为探针并以特异性杂交Sp17基因核苷酸序列的寡核苷酸作为引物从水稻和其它植物中分离与Sp17基因高度同源的DNA属于常规手段。这种编码与Sp17蛋白功能等价蛋白的DNA也属于本发明DNA的范围，其可通过杂交技术或PCR技术得到。

杂交反应分离这种DNA优选在严紧条件下进行。本发明的严紧杂交条件包括例如：6M尿素，0.4％SDS，和0.5×SSC。当杂交在更严紧条件，如6M尿素，0.4％SDS，和0.1×SSC下进行时，则有望获得具有更高同源性的DNA。这种条件下分离出的DNA预计可以编码与Sp17蛋白(SEQ ID NO：2)具有高氨基酸同源性的蛋白。在此，整个氨基酸序列的“高同源性”指同一性至少为50％或更多，优选70％或更多，最优选90％或更多(例如95％或更多)。可以通过BLASTn程序(核苷酸水平)和BLASTx(氨基酸水平)来测定序列的同源性程度(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410，(1990))。这些程序是基于Karlin和Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：2264-2268，(1990)和Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5877，(1993))。根据BLASTN分析核苷酸序列时，参数设置为例如分数(score)＝100，词长度(wordlength)＝12。另一方面，通过BLASTX分析氨基酸序列所使用的参数应该设置为例如分数＝50，并且词长度＝3。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用每个程序默认的参数。这种分析使用的具体技术是本领域公知的(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)。

本发明DNA可用于例如制备重组蛋白，生产抑制病斑形成或提高热逆境抗性的植物转化体等等。

根据本发明，重组蛋白大致如下制备：将编码本发明蛋白的DNA插入到合适的表达载体中，将载体导入合适的细胞，培养转化的细胞，使细胞表达重组蛋白，然后纯化已表达的蛋白。重组蛋白可作为与其它蛋白一起的融合蛋白被表达，以易于纯化，例如，在大肠杆菌(Escherichia coli)(New EnglandBiolabs，USA，pMAL载体系列)中作为与麦芽糖结合蛋白的融合蛋白，与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)(Amersham Pharmacia Biotech，pGEX载体系列)的融合蛋白，或者用组氨酸标记(Novagen，pET系列)。宿主细胞不限于特定类型，只要细胞适于表达该重组蛋白即可。除上述大肠杆菌外，还可以使用酵母，各种动物，植物或昆虫细胞。可通过本领域公知的方法将载体导入宿主细胞。例如，使用了钙离子的转化方法(Mandel，M.和Higa，A.Journal of MolecularBiology，53：158-162(1970)，Hanahan，D.Journal of Molecular Biology，166：557-580(1983))可用于将载体导入大肠杆菌。宿主细胞表达的重组蛋白可以通过常规的方法从宿主细胞或其培养上清中纯化和收集。当重组蛋白作为与麦芽糖结合蛋白或其它配对物的融合蛋白表达时，该重组蛋白可通过亲和层析而方便地纯化。

所获蛋白可用于制备与该蛋白结合的抗体。例如，可通过用本发明的纯化蛋白或其部分免疫动物(如兔)，然后经历一段时间后收集该动物血液，去除凝块，制备得到多克隆抗体。单克隆抗体可按如下制备：将骨髓瘤细胞与经上述蛋白或其部分免疫的动物的抗体形成细胞融合，分离出表达所需抗体的单克隆细胞(杂交瘤)，以及从所述细胞中收集该抗体。这种方法产生的抗体可用于纯化或检测本发明蛋白。相应地，本发明另一方面包括结合本发明蛋白的抗体。

使用本发明的DNA可以产生抑制病斑形成或提高热逆境抗性的植物转化体。更具体地，编码本发明蛋白的DNA被插入到合适的载体中；该载体被导入植物细胞；再生所获的转化植物细胞。

用于转化植物细胞的载体不限于特定类型，只要该载体能够在植物细胞中表达所插入的基因即可。例如，包含植物细胞组成型基因表达的启动子(例如，花椰菜花叶病毒35S启动子)；以及可被外源刺激诱导的启动子的载体都可以应用于本发明。术语“植物细胞”在此包括各种形式的植物细胞，如培养细胞悬浮液，原生质体，叶的切片和愈伤组织。

可使用已知的方法将载体导入植物细胞，例如聚乙二醇法，电穿孔；农杆菌(Agrobacterium)介导转化，以及粒子轰击。可根据针对植物细胞类型的公知方法从转化的植物细胞再生植株(Toki等，Plant Physiol.100：1503-1507(1995))。转化和再生水稻植株的方法包括：(1)使用聚乙二醇将基因导入原生质体，然后再生植株(适于indica水稻栽培品种)(Datta，S.K.“GeneTransfer To Plants”，Potrykus I和Spangenberg Eds.，66-74页(1995))；(2)使用电脉冲将基因导入原生质体，然后再生植株(适于japonica水稻培养品种)(Toki等，Plant Physiol.100：1503-1507(1992))；(3)通过离子轰击将基因直接导入细胞然后再生植株(Christou等，Bio/Technology，9：957-962(1991))；(4)使用农杆菌导入基因，然后再生植株(Hiei等，Plant J.6：271-282(1994))。这些方法是本领域现有方法并已在本发明所属技术领域广泛应用。这些方法都适用于本发明。

一旦获得在其基因组中导入了本发明DNA的转化植物，就可以通过有性或无性繁殖从该植物体获得子代。或者，可通过该植株以及其子代或克隆的繁殖材料(例如，种子，果实，穗，块茎，块根，株(tubs)，愈伤组织，原生质体等)大量生产植物。用本发明DNA转化的植物细胞，包含这些细胞的植株，该植物的子代和克隆，以及从该植物、其后代和其克隆所获的繁殖材料，都属于本发明的保护范围。

上述产生的植物相较于野生型植物具有提高的热逆境抗性和病斑形成抑制能力。使用本发明的方法，经济作物如水稻的生产力可被大大提高，这是非常有利的。

而且，本发明提供包含至少15个核苷酸的多核苷酸，所述15个核苷酸与由SEQ ID NO：1核苷酸序列构成的本发明DNA，或其互补链互补。术语“互补链”在此是指由A：T和G：C碱基对构成的双链DNA中的一条链。并且，“互补”在此不仅指在至少15个连续核苷酸的区域内完全匹配的那些，而且还包括在该区域内具有至少70％同源性，优选至少80％，更优选90％，最优选95％或更多同源性的那些。这种DNA可用作探针检测或分离本发明DNA，或作为引物扩增本发明DNA。

附图说明

图1是sp17突变株KL210(左图)的叶片和Nipponbare的叶片(右图)的照片。

图2显示Sp17基因区的详细连锁图谱和基因组克隆的序列对比图谱。A和B分别代表298个个体的隔离群体和2944个个体的隔离群体构建的遗传学图谱。C和D分别代表Nipponbare YAC和PAC克隆构建的序列对比图谱。

图3显示Sp17基因区的详细遗传学图谱以及指示候选基因组区域和其中预测基因的图谱。

图4说明Sp17候选基因的结构以及Nipponbare与KL210基因组核苷酸序列的比较。

图5是Sp17突变株KL210的叶片(左图)和转化体的叶片(右侧4图)的照片。

图6代表在Sp17突变株中形成病斑所需要天数以及天然生长条件下的平均温度之间的关系。

图7是Sp17突变株KL210在阻断紫外线条件下生长的叶片(左图)和未阻断紫外线条件下生长的叶片(右图)。

本发明的最佳实施方式

本发明通过下述实施例具体说明，但本发明并不限于以下实施例。

【实施例1】构建遗传学图谱

使用一个大规模隔离群体进行Sp17基因区域的精细连锁分析，其是基于作图进行的克隆所必需的。用Sp17突变株与SL18杂交所得F2代群体的298个个体作为连锁分析的群体。SL18具有Nipponbare的遗传背景，并且它的5号染色体被Kasalath的相应染色体取代。根据使用RFLP标记进行的连锁分析，发现sp17基因座位位于RFLP标记S869和R2781之间，与C11368，S2581，S1762，S1831和B344共分离(图2A)。

进一步地，用F2代群体的2646个个体进行连锁分析以构建sp17区域的详细遗传学图谱。使用CAPS(分裂扩增多态序列，Cleaved AmplifiedPolymorphic Seguence)标记进行有效的分析。更具体地，带有临近Sp17的染色体重组的植物可以使用CAPS标记S869和R2781从F2群体中被筛选出来，所述每个标记都临近Sp17。相应地，选出65个重组体(图2B)。使用这些重组体，按如下所述利用RFLP标记构建精细连锁图谱。

【实施例2】使用酵母人工染色体(YAC)克隆和P1衍生的人工染色体(PAC)克隆对Sp17基因区进行序列对比

使用水稻基因组研究计划构建的Nipponbare YAC克隆的序列对比图谱指定在临近Sp17基因座之处含有DNA标记，S869，C11368，S2581和R2781核苷酸序列的YAC克隆(图2C)。而且，被指定的YAC克隆Y4666，Y2205，Y3824c，Y6089和Y2288的末端片段，通过盒式方法分离出来以便对所述指定的YAC克隆进行序列对比。结果显示YAC克隆Y4666，Y2205和Y3824c包含在Sp17基因区中(图2C)。

进一步地，为界定Sp17的候选区域，自与Sp17基因座位位于相同位置的RFLP标记C11368制备STS引物对(引物5’-GACCTGTGCTCTGCCTTTCT-3’/SEQ ID NO：3和5’-GTATGCCAACTGCTCAACTT-3’/SEQ ID NO：4；扩增的0.4kb基因组片段)，用于筛选水稻基因组研究计划(Bata等，Bull.Natl.Inst.Agrobiol.Resour.14：24-36(2000))构建的Nipponbare PAC克隆文库(平均插入长度为112kb；18432个克隆；约4.5倍水稻基因组)。结果选出9个PAC克隆。通过对这些PAC克隆进行序列对比，代表P0029H1的8个克隆显示含有Sp17基因座位(图2D)。

【实施例3】界定Sp17基因区

对排列在Sp17区域内的YAC和PAC克隆的末端片段进行克隆，并用于作为构建精细遗传学图谱所用的新的RFLP或CAPS标记。结果显示，Sp17基因座位位于RFLP标记P461H4T和P693G10S之间的基因组区域并且与RFLP标记C11368B共分离。相应地，说明Sp17基因座位存在于这2个标记之间的约16kb的基因组区域(图2)。

【实施例4】通过核苷酸序列分析来鉴定候选基因组区域

对PAC克隆P0029H1的16kb基因组候选区域进行核苷酸序列分析，预计该克隆含有Sp17基因。该核苷酸序列分析通过如下进行：首先将候选区域用限制性酶Not I和Sal I，然后用各种其它限制性酶亚克隆，再使用染料-引物法。使用通过连锁分析鉴定候选基因区域的核苷酸序列信息新构建CAPS标记，以进一步界定该候选区域。鉴定出与CAPS标记HsfC2-1(引物5’-TCTCTCTCGTTCGTTCCCCG-3’/SEQ ID NO：5和5’-TGGATAAATGGAGATGGGCA-3’/SEQ ID NO：6；限制性酶Apa I)共分离的Sp17基因，以及分别在S12C6-6d(引物5’-TCGGCATCGGCTATTATCGG-3’/SEQ ID NO：7和5’-GATTTCGGGATACTGTGCGT/SEQ ID NO：8；限制性酶Nla III)和HsfC3-3’(引物5’-ACGATGTGTTTTGGGAGCGG-3’/SEQ ID NO：8和5’-GACCTGTGCTCTGCCTTTCT-3’/SEQ ID NO：10；限制性酶Nla III)的3个和7个重组体。

从而显示出Sp17基因存在于CAPS标记S12C6-6d和HsfC2-3’之间的约3kb基因组区域(图3)。此外，针对该候选基因组区域的核苷酸序列进行基因预测和相似性搜索，仅预测了一个基因，其与诸如番茄和拟南芥属(Arabidopsis)等植物中分离出的Hsf基因的核苷酸序列类似(图3)。该Hsf基因显示具有热休克诱导蛋白的转录调节因子功能。

【实施例5】Sp17候选基因的核苷酸序列分析

使用Hsf样的基因作为Sp17基因的候选，测定突变株KL210的相应区域的核苷酸序列。具体地，核苷酸序列分析如下进行：根据已获得的Nipponbare核苷酸序列信息设计引物，经基因组PCR和RT-PCR扩增相应核苷酸，然后对所得扩增产物进行克隆。可通过比较野生型和突变基因的核苷酸序列而检测出一个核苷酸的取代。正如所预测的，核苷酸取代导致色氨酸被取代为半胱氨酸(图4)。该取代的氨基酸是Hsf基因中高度保守的氨基酸的一部分。因此将此氨基酸取代视为突变株中sp17蛋白功能丧失或降低的原因。

【实施例6】通过转化鉴定候选基因的功能

5.6kb Nsp V-Bgl III是Nipponbare基因组区域片段，它含有指定为Sp17基因候选者的预测的5’上游启动子区，将它插入到载体pPZP2H-lac中，使其可用于农杆菌介导的转化。根据Toki(Plant Mol.Biol.Rep.15：16-21(1997))的方法进行转化，使用与该片段共同插入的载体#178，或者仅仅使用该载体。用Sp17突变株KL210作为转化所用的植株。用5.6kb Nsp V-Bgl II片段和单独载体进行的转化实验分别获得150个和50个潮霉素抗性个体。使用候选基因特异性引物(正义链5’-GTCTCCGTGGCCGTGGCTGA-3’/SEQ IDNO：11和反义链5’-AACGAGGAATCTTAGAAGGG-3’/SEQ ID NO：12)经PCR方法证实候选基因的整合。

结果显示所有150个转化体都含有所述候选基因。转化体在一个隔离的温室中在天然日长条件下生长(在三月从生长室转移到隔离的温室(Tsukuba))，以研究病斑的形成。结果显示，仅用载体单独转化的植株与突变株KL210类似，在生长的晚期形成病斑，而导入了所述候选基因的植株则没有一株显示有病斑形成(图5)。而且，在24个自花传粉的子代中，有6株形成病斑而18株没有形成病斑，而这24个子代预计仅被转基因的一个拷贝转化。获得的分离比率与预计的1∶3一致。这些结果说明，所述候选基因区(5.6kb Nsp V-Bgl II)的功能是抑制突变株KL210的病斑形成，还说明所述候选基因是Sp17基因。

【实施例7】病斑形成的必要条件

从1999年5月17日开始以14天的间隔播种KL210和具有野生型基因的Nipponbare，研究Sp17突变株KL210病斑形成所需要的天数。8月23日前播种的植株形成病斑需要的天数减少，9月6日播种的植株形成病斑需要的天数增加(图6)。另一方面，从播种到病斑形成期间的平均温度在8月9日之前上升，此后降低(图6)。到病斑形成时间最短的是11天，是8月23日播种的，尽管其时平均温度已下降。但是，1999年36℃的最高温度据记载恰在病斑接近形成之前。冬季在温室生长的植株形成病斑所需时间更长(播种后60天以上)。此外，冬季病斑形成的程度也被抑制。而且，当植株在26℃或更低温度的温室中生长时，在任何生长期内都观察不到病斑形成，而在温度为37℃的温室中一个月则出现病斑。根据这些结果，可以说明高温对于病斑形成在某种程度上是必需的，并且，高温增强了病斑的形成。

接下来，用阻断紫外线的板或不阻断紫外线的塑料板覆盖KL210和Nipponbare，然后进行培养。无论用何种板覆盖KL210，在播种的25天后都观察到病斑形成。但是与那些在允许紫外线透过的条件下生长的植株相比，阻断紫外线辐射的植株中病斑形成的程度被抑制(图7)。这些结果说明，紫外线辐射是增强病斑形成的必需条件。

根据以上所获结果，可以总结出，Hsf样的基因是Sp17候选基因。然后根据基于作图的克隆方法证实其为Sp17基因，该基因抑制水稻病斑形成。即，植物中Hsf样基因的生物学功能在本发明中首次得到证实。

工业实用性

热带植物，例如水稻，相较于大麦更适应特定程度的高温，这就需要对热胁迫的抗性。但是，由于全球变暖，植物的生长温度攀高。在这种情况下，需要有效地赋予植物热逆境抗性的方法，以稳定未来的作物产量。热逆境抗性机制的许多细节还不清楚，还没有通过修饰正面提高抗性的有效方法。有效地赋予植物热逆境抗性，不仅是指在全球变暖的情况下仍维持目前水平的稳定食物产量，还指在作物原本不能生长的地区栽培作物的可能性。本发明Sp17基因具有提高植物的热逆境抗性的能力并具有抑制植物形成病斑的能力。这样，本发明的Sp17基因对于上述目的有很大贡献。

                        序列表<110>独立行政法人农业生物资源研究所

(NATIONAL INSTITUTE OF AGROBIOLOGICAL SCIENCES)<120>植物病斑形成抑制基因，Sp17及其应用<130><140>PCT/JP01/09153<141>2001-10-18<150>JP 2000-318557<151>2000-10-18<160>12<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>5579<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<220><223>基因组DNA<220><221>CDS<222>(3711)..(3947)<220><221>CDS<222>(4185)..(5327)<400>1ttcgaagtcc tgagattagc cgatgagagt tatcaagtcg tcagttgtcg gattctttct 60atattcagtt aaggaaattg atctactaaa ggaagcttat acagaagaga ccgagttcaa 120agagaatgcg gcatggaaag ttatctatta attaggaata gtttgttagt ttctttttat 180ctttaggaaa gtgtgtttag tgttctataa gaactttatc ttttcctttt atctttagaa 240aagtttcttt cttgtctaac aaggacttgt atcaacccat gggtataaat atgtacaccc 300ggggtctatg taatctatct tcatgatcaa tacaattcag cgcatcgcca ccttttacct 360tttctacttt attttatcgt ccggcggaac ttggcacctg acacggggct gcatcggtgt 420tcgatctccg gctaaggggt aagtccaatg ttccgccggc caggcaattg tatcgtttac 480gtcggcgttg ttcaaggctg catcagtaca ttcgacctct tgcattgctc tagtttggat 540gatatatttg cctacctatt tatcatatgt ctctgttaat ctagttttag catatcaatt 600tagctctatc ggctgcttct cgttttaggg tttctgccgg tatcggctaa atcgtgttgc 660tagattagat tatcttagac atctaccacc ctgaaaactc agtcaatagc ttgattgtct 720agatatcatg tttcttttca tacttagtgc tgcattagtt aagtttgatc tactaagtcg 780tgcttagaac cataatctct agcctgcttc ttgattgcca attagggttt tatcggggtt 840tcagccggtg agttatctgg acgttgcatc ggctcataag gattgcacat acatataaat 900tggatttagc cgatgacaac aaaggtttca ctgtttaatc taatcttgtg gatttcatga 960catcggacct ccagccgatg tatgctttaa ccttcggatt aatgctaatt ctatcatatc 1020aatgctagcc gattggtttc tactagatta tatttctata ttacatcatc atcagccgat 1080tgcctttata tcattatcta cattggacat atagccgatt gtttaaaccc tatcgctatc 1140cgctgttatc ggcatcggct attatcggct atcggctgga actactccat cagcttgtca 1200gccgatcggc tgttttatct attatttgca tattttgtca gttgcaggat caaactgact 1260ggcacgcccg catctcacca acctttggac ctgcactgga gttaagcaga tctcccaggc 1320cggtgtgttc gattttttca tcaacactac catcttacct accatcaaca cataaaacga 1380gaagttttat tcctgcaata cccttttacc tacctatcac tcttattact tttttcaatg 1440attaaggata ttttagtcat tctcactatc tattaattcc accttcggat gctaagaatg 1500gattttttgt gtgacggagg gagtagttgg gacctaatgt tcggcgtacg taaaacggag 1560cgactcatta gcacatgatt aattaagtat tatctttttt ataaatagat taatatgatt 1620ttttaaagca actttcgtat tttttaaaaa aaataaaccg tttagtagtt tgaaaaacgt 1680gcatgcggaa aaacgagaga gatgagttgg gaaaagtaat agacgaacaa aacctagtag 1740tacaagctac taccccattt atcaatattc ataagtaaaa tttagagaaa atctaaaaaa 1800tatcttgaca aacgtccaac cttaagaaat gtcattgatg agtgcgagtt ccaaaaatac 1860tctcgtataa acgactttat cccagaaatg ctattatcgt taggattcac cttattccgt 1920gatgttaaat aaagtttcca tcctatacca cttaacggag gggttgctaa cagaaccctc 1980cttagcaacc ataacgatga cagtattttt aggacaaagt cacatgtata atagtatttc 2040atgaaacttg ctcttgtcga tggtattttt ttaaattcgg cgctcatcaa taatattcgt 2100tggaccttct ttaaaattta ttatatctta ggacagaaaa actagtactt cgtcccataa 2160tataagtgat tttgagtttt tgcttgtact gtttgaccac tcgtcttatt caaagaattt 2220gtgcaaatat aaaaaacgaa aagttgtgct taaagtactt tagataataa agtaagtcaa 2280aaaagataaa taataatttt aaattttttt aataagacga ttggtcaaac agtgcaaata 2340aaaactcaag atcccttata ttatgggata aatggagtac tactccctcc gtcccaaaat 2400aagtgcagct atagttttcc atgcccaact ttgaccactc atcttatttg aaaaaaatta 2460aaaacataag tcacaagtaa agtagtattc atgttttatc atcttataac aacaaaattg 2520ctaattataa aaaaaaatta aataagacgg acgatcaaaa ttgggtgctg aaactcatgg 2580ctgcacttat tttgggacga aggtagtagt agcttttgat aggtaccagg tactaacgtt 2640attaattact tagtactact atgagttaac tatggccatg gaaaaagcat gcaggaaaac 2700acgcacagta tcccgaaatc ctgttgcggt atttgaatgg ttgaatcaaa tactaccagt 2760accggtctga tgccagcctg ccagccaggc acaccagcga cgatcgattc cggtcggacc 2820ggaccaccac cggtgtacca ctgtcgcgcc gggcggccgc gccgagcgaa ccgcgcgctg 2880cgctgccggt ccatttctag aagccctcgc gctcctgatt gcgctctctc tctctctctc 2940tctctctctc gttcgttccc cggtcagtca accgtctcac gcagcgacca aacgccccgg 3000agagaggaga aatccgcacg ctcgctcgcg ctggcgcgca gcgcacgcct cccgttctct 3060cctctatatt atcgccgacg cgcgcgcgcc actgcactag cacggctgca cgccctgcac 3120ccgttgccac caccaccgcc ttctccgccg cgccgcctcc tctcgcgtct cccgctcgtg 3180cagggcgcgc gtcgtcgggc gagctgctgc cgtctccgtg gccgtggctg atcaggtgag 3240aattgagaaa ggttgtgagt tttcgcgtgg ttgtctggtt gattcgatcg tgccggcgcg 3300ccttggcatg gcaggcaaga ttgtatcagg agataatgaa aaaacataca ctgggctttc 3360tttttcttaa tttctttgca ttctttgctt cgacggctat ggttgcttga actgttcagg 3420cggcgccttt gtgtatacac gtgcttgtat gtgatgctct ggtcatttct ttttgcagaa 3480ctagttggcg ttcgatcgga aagtcgctgt cttttggcga ctcggtgaga atttgcgccg 3540cggttcaatg tgaaaaattt tggcccgtgg cgagttggat ttggcgccga gtccattcag 3600gtggttaaga cttgttcgtg ggagagcgaa gctgcgcgcg ttaagaccgg gctccgttct 3660tgcatcgtgc agagcagctg ctggtttgag aattgagagg cgcggttgac atg gag    3716

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            295                 300                 305cca atg gag aca ggc atc gat ctt cag tta cca gct agc ctc cat ccc   4913Pro Met Glu Thr Gly Ile Asp Leu Gln Leu Pro Ala Ser Leu His Pro

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    405                 410                 415gag tct ccc aag gac gat gta aaa gca gaa tta ggc tgc aat ggc ttc   5249Glu Ser Pro Lys Asp Asp Val Lys Ala Glu Leu Gly Cys Asn Gly Phe

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         20                  25                  30Ala Thr Asn His Val Val Ser Trp Gly Pro Gly Gly Ala Ser Phe Val

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130                 135                 140Lys Ser Ile Leu Val Ala Asp Leu Gln Arg Gln Asn Gln Gln Gln Tyr145                 150                 155                 160Val Ile Asn Trp Gln Met Gln Ala Met Glu Gly Arg Leu Val Ala Met

            165                 170                 175Glu Gln Arg Gln Lys Asn Ile Val Ala Ser Leu Cys Glu Met Leu Gln

        180                 185                 190Arg Arg Gly Gly Ala Val Ser Ser Ser Leu Leu Glu Ser Asp His Phe

    195                 200                 205Ser Lys Lys Arg Arg Val Pro Lys Met Asp Leu Phe Val Asp Asp Cys

210                 215                 220Ala Ala Gly Glu Glu Gln Lys Val Phe Gln Phe Gln Gly Ile Gly Thr225                 230                 235                 240Asp Ala Pro Ala Met Pro Pro Val Leu Pro Val Thr Asn Gly Glu Ala

            245                 250                 255Phe Asp Arg Val Glu Leu Ser Leu Val Ser Leu Glu Lys Leu Phe Gln

        260                 265                 270Arg Ala Asn Asp Ala Cys Thr Ala Ala Glu Glu Met Tyr Ser His Gly

    275                 280                 285His Gly Gly Thr Glu Pro Ser Thr Ala Ile Cys Pro Glu Glu Met Asn

290                 295                 300Thr Ala Pro Met Glu Thr Gly Ile Asp Leu Gln Leu Pro Ala Ser Leu305                 310                 315                 320His Pro Ser Ser Pro Asn Thr Gly Asn Ala His Leu His Leu Ser Thr

            325                 330                 335Glu Leu Thr Glu Ser Pro Gly Phe Val Gln Ser Pro Glu Leu Pro Met

        340                 345                 350Ala Glu Ile Arg Glu Asp Ile His Val Thr Arg Tyr Pro Thr Gln Ala

    355                 360                 365Asp Val Asn Ser Glu Ile Ala Ser Ser Thr Asp Thr Ser Gln Asp Gly

370                 375                 380Thr Ser Glu Thr Glu Ala Ser His Gly Pro Thr Asn Asp Val Phe Trp385                 390                 395                 400Glu Arg Phe Leu Thr Glu Thr Pro Arg Ser Cys Leu Asp Glu Ser Glu

            405                 410                 415Arg Gln Glu Ser Pro Lys Asp Asp Val Lys Ala Glu Leu Gly Cys Asn

        420                 425                 430Gly Phe His His Arg Glu Lys Val Asp Gln Ile Thr Glu Gln Met Gly

    435                 440                 445His Leu Ala Ser Ala Glu Gln Thr Leu His Thr

450                 455<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：人工合成的引物序列<400>3gacctgtgct ctgcctttct                                  20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：人工合成的引物序列<400>4gtatgccaac tgctcaactt                                  20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：人工合成的引物序列<400>5tctctctcgt tcgttccccg                                  20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：人工合成的引物序列<400>6tggataaatg gagatgggca                                  20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：人工合成的引物序列<400>7tcggcatcgg ctattatcgg                                  20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：人工合成的引物序列<400>8gatttcggga tactgtgcgt                                  20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：人工合成的引物序列<400>9acgatgtgtt ttgggagcgg                                  20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：人工合成的引物序列<400>10gacctgtgct ctgcctttct                                  20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：人工合成的引物序列<400>11gtetccgtgg ccgtggctga                                    20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：人工合成的引物序列<400>12aacgaggaat cttagaaggg                                    20

Claims (15)

1.编码来源于植物的蛋白的DNA，该蛋白抑制植物病斑形成，所述DNA选自：

a)编码含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白的DNA；

b)包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的编码区的DNA；

c)编码含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白的DNA，该蛋白中一个或多个氨基酸被取代，缺失，添加和/或插入；以及

d)能够在严紧条件下与SEQ ID NO：1核苷酸序列组成的DNA杂交的DNA。

2.编码来源于植物的蛋白的DNA，该蛋白能够提高植物的热逆境抗性，其中所述DNA选自：

a)编码含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白的DNA；

b)包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的编码区的DNA；

c)编码含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白的DNA，该蛋白中一个或多个氨基酸被取代，缺失，添加和/或插入；以及

d)能够在严紧条件下与SEQ ID NO：1核苷酸序列组成的DNA杂交的DNA。

3.含有权利要求1或2的DNA的载体。

4.导入了权利要求1或2的DNA，或导入了权利要求3的载体的转化细胞。

5.权利要求4的转化细胞，其中所述转化细胞是植物细胞。

6.权利要求1或2的DNA所编码的蛋白。

7.制备权利要求6的蛋白的方法，其中所述方法包括：

培养权利要求4的转化细胞；以及

从所述培养的转化细胞或其培养上清中收集表达的蛋白。

8.含有权利要求5的转化细胞的植物转化体。

9.一种植物转化体，其为权利要求8所述植物转化体的子代或克隆。

10.权利要求8或9的植物转化体的繁殖材料。

11.制备权利要求8的植物转化体的方法，其中所述方法包括：

a)将权利要求1或2的DNA导入植物细胞；以及

b)从所述植物细胞再生植株。

12.一种抑制植物病斑形成的方法，所述方法包括在所述植物体内表达权利要求1的DNA的步骤。

13.一种提高植物热逆境抗性的方法，其中所述方法包括在所述植物细胞中表达权利要求2的DNA的步骤。

14.一种结合权利要求6的蛋白的抗体。

15.一种含有至少15个核苷酸的多核苷酸，所述至少15个核苷酸与由SEQ ID NO：1核苷酸序列组成的DNA互补，或与其互补链互补。

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