WO2002033092A1 - Gene sp17 inhibant la formation de lesions chez les vegetaux et son application - Google Patents

Gene sp17 inhibant la formation de lesions chez les vegetaux et son application Download PDF

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Masahiro Yano
Utako Yamanouchi
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National Institute Of Agrobiological Sciences
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Definitions

  • the present invention relates to genes involved in lesion formation and heat stress tolerance in plants, and to modification of plants using the genes.
  • the present invention is useful in fields such as plant breeding. Background art
  • mutant strains have been created in rice. Among them, there is a mutant line in which leaf-like necrotic spots are formed on the leaf blade as rice grows (Fig. 1).
  • mutant genes in these mutant lines have been identified and the corresponding wild-type genes have been isolated, they can be introduced into any varieties by a transformation method to reduce the formation of lesions in those lines. There is a possibility that suppression and improvement of stress resistance to light and heat can be achieved.
  • the present invention has been made in view of such a situation, and an object of the present invention is to provide a novel gene involved in suppressing the formation of a lesion in a plant. Still another object of the present invention is to improve a plant using the gene.
  • the present inventors have proposed that, among mutant lines in which lesion-like necrotic spots are formed on leaf blades as rice grows, S Pl7 having a mutant gene on chromosome 5 Focusing on, we conducted intensive research to identify the mutant gene and isolate the corresponding wild-type gene.
  • the present inventors first performed linkage analysis and aligned the Spl7 gene region using a yeast artificial chromosome (YAC) clone. Specifically, we performed linkage analysis of a large-scale segregated population, which is essential for isolation of the Spl7 gene.
  • the YAC clones located near the Spl7 locus were identified using an aligned map of YAC clones created in the rice genome analysis study. By isolating and aligning the terminal fragments of the identified YAC clone, a YAC clone containing the Spl7 gene region was identified (FIG. 2C).
  • the present inventors used a set of primers obtained by converting SLP7 gene locus C11368 into an STS at the same locus as the Spl7 gene locus.
  • Nine types of PAC clones were selected from a genomic PAC clone library. These PAC clones were aligned, and PAC clones containing the Spl7 gene locus were identified (Fig. 2D).
  • the Spl7 locus showed the RFLP markers P461H4T and P693G10S. It was found to be located in the genome region of about 16 kb, which is flanked by (Fig. 2). The base sequence analysis of this genome candidate region was performed, a new CAPS marker was created using that information, and the candidate region was further narrowed down. As a result, the Spl7 gene was replaced by the CAPS markers S12C6-6d and HsfC3-3 It was clarified that it was present in a genomic region of about 3 kb flanked by '(Fig. 3).
  • the present inventors incorporated the genomic region identified as a candidate for the Spl7 gene into a transformable vector via an agrobacterium and introduced the spl7 mutant strain.
  • the transformed individuals were cultivated in an isolated greenhouse under natural photoperiod conditions, and the formation of lesions was investigated.
  • the control individuals introduced with only one vector
  • lesions were formed, no lesion formation was observed in any of the individuals transfected with the candidate gene (Fig. 5). That is, it was found that the candidate gene region has a function of suppressing the lesion formation of the mutant strain KL210.
  • the candidate gene was the Spl7 gene.
  • the present inventors examined the conditions necessary for lesion formation, and found that a certain high temperature was indispensable for lesion formation ( (Fig. 6), it was found that ultraviolet light was also one of the conditions that promoted lesion formation (Fig. 7). This fact suggests that the Spl7 gene plays an important role in avoiding or eliminating high-temperature stress. Therefore, creating transgenic plants that express the Spl7 gene It is thought that it will be possible to increase the ability of plants to avoid heat stress and suppress the formation of plant lesions.
  • the present inventors succeeded in isolating a gene involved in suppression of plant lesion formation, and were able to suppress plant lesion formation using the gene. Furthermore, they have found that it is possible to improve the heat stress tolerance of a plant by using the gene, thereby completing the present invention.
  • the present invention more specifically relates to
  • transgenic plant which is a progeny or clone of the transgenic plant according to (8).
  • a method for suppressing plant lesion formation comprising expressing the DNA according to (1) in a cell of a plant,
  • a method for improving heat stress tolerance of a plant comprising expressing the MA according to (2) in a cell of a plant,
  • a DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide comprising at least 15 nucleotides complementary to a complementary strand thereof.
  • the present invention provides a DNA encoding the Spl7 protein.
  • the nucleotide sequence of Spl7 genomic DNA of rice Nipponbare is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the protein encoded by the MA is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the Spl7 gene which has been known to exist in any part of the vast region of rice chromosome 5, as a gene involved in the suppression of rice lesion formation, has been identified and isolated. It has not been reached.
  • the present inventors have finally succeeded in elucidating the region of existence through a complicated step and isolating the gene as a single gene.
  • Spl7 protein has the effect of suppressing the formation of lesions in rice caused by heat stress.
  • its structure suggests that it is involved in the transcriptional regulation of the heat shock protein gene. It has recently been reported that one of the heat shock proteins is significantly involved in avoiding heat stress in plants (Queitsch, C. et al. Plant Cell 12, 479-492 (2000)). Therefore, it is thought that by transforming a plant with the DNA encoding the Spl7 protein, the heat stress tolerance of the plant can be improved and the formation of lesions can be suppressed.
  • DNAs encoding the Spl7 protein of the present invention include genomic DNA, cMA, and chemically synthesized DNA. Preparation of genomic MA and cDNA can be performed by those skilled in the art using conventional means.
  • genomic DNA for example, genomic DNA is extracted from rice cultivar (eg, Nipponbare) having Spl7 gene, and genomic library (plasmid, phage, cosmid, BAC, PAC, etc. can be used as vector) ) Is developed and developed to perform colony hybridization or plaque hybridization using a probe prepared based on the DNA encoding the protein of the present invention (for example, SEQ ID NO: 1).
  • cDNA is synthesized based on mMA extracted from a rice variety (for example, Nipponbare) having the Spl7 gene, This is inserted into a vector such as ⁇ to prepare a cDNA library, which is developed and subjected to colony hybridization or plaque hybridization in the same manner as described above. It can be prepared by carrying out.
  • the present invention includes DNA encoding a protein functionally equivalent to the Spl7 protein (Nipponbare) described in SEQ ID NO: 2.
  • the plant species from which the DNA of the present invention is derived is not particularly limited, but is preferably derived from a gramineous plant, and most preferably derived from rice.
  • “has a function equivalent to that of the Spl7 protein” means that the target protein has a function of suppressing the formation of lesions in a plant and / or a function of improving resistance to heat stress in a plant.
  • Such DNAs include, for example, variants, derivatives, and the like, which encode proteins consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, added and / or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Includes alleles, variants and homologs.
  • Methods well known to those skilled in the art for preparing DNA encoding a protein having an altered amino acid sequence include, for example, site-directed mutagenesis (Kramer, W. & Fritz, H.-J. 1987) Oligonucleotiae-directed construction of muta genesis via gapped duplex DNA. Methods in Enzymology, 154: 350-367).
  • mutation of the amino acid sequence of the encoded protein due to mutation of the nucleotide sequence can occur in nature.
  • a DNA encoding a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted or added in the amino acid sequence encoding the native Spl7 protein may be a native Spl7 protein (sequence).
  • a protein having a function equivalent to that of No. 2 is coded, it is included in the DNA of the present invention. Further, even when the nucleotide sequence is mutated, it may not be accompanied by mutation of an amino acid in a protein (degenerate mutation), and such a degenerate mutant is also included in the DNA of the present invention.
  • Whether or not a certain DNA encodes a protein that inhibits plant lesion formation was determined by introducing a test MA into an appropriate vector and introducing it into a spl7 mutant strain as described in Example 6. It can be evaluated by observing whether or not lesion formation in the mutant strain is suppressed.
  • Whether or not a certain DNA encodes a protein having a function of improving heat stress tolerance of a plant may be evaluated as follows. That is, the test DNA was incorporated into an appropriate vector, introduced into a wild-type strain, and this strain was observed under high-temperature (about 40 ° C) and low-temperature (about 25 ° C) cultivation. Alternatively, when the decrease in the growth amount is milder than that in the wild type line, it may be evaluated that the test DM encodes a protein having a function of imparting heat stress tolerance to the plant.
  • the nucleotide sequence of the Spl7 gene (SEQ ID NO: 1) or a part thereof is used as a probe, and an oligonucleotide that hybridizes specifically to the Spl7 gene is used as a primer to obtain Spl7 from rice or other plants. Isolation of DNA with high homology to a gene is usually a task. Thus, DNA encoding a protein having a function equivalent to that of the Spl7 protein which can be isolated by the hybridization technique or the PCR technique is also included in the DNA of the present invention.
  • a hybridization reaction is preferably performed under stringent conditions.
  • the stringent hybridization conditions refer to the conditions of 6M urea, 0.4% SDS, 0.5 ⁇ SSC or the equivalent hybridization condition of stringency. More string Under conditions of high digiency, for example, 6M urea, 0.4% SDS, O. IxSSC, isolation of more homologous DNA can be expected.
  • the isolated DNA is considered to have high homology at the amino acid level with the amino acid sequence of Spl7 protein (SEQ ID NO: 2).
  • High homology refers to sequence identity of at least 50% or more, more preferably 70% or more, even more preferably 90% or more (eg, 95 or more) in the entire amino acid sequence.
  • the DNA of the present invention can be used, for example, for preparing a recombinant protein or for producing a transformed plant in which lesion formation is suppressed or heat stress resistance is improved.
  • a DNA encoding the protein of the present invention is inserted into an appropriate expression vector, the vector is introduced into an appropriate cell, and the transformed cell is cultured and expressed. Is purified.
  • Recombinant proteins can be expressed as fusion proteins with other proteins, for example, to facilitate purification. For example, maltose binding protein using E.
  • coli as a host (Available from New England BioLabs, Inc., vector pMAL series), Glutathione-S-transferase (GST) fusion protein (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.) It is possible to use a vector (pGEX series), a method of preparing by adding a histidine tag (Novagen's pET series), and the like.
  • the host cell is not particularly limited as long as it is a cell suitable for expressing the recombinant protein.
  • Escherichia coli for example, yeast, various animal and plant cells, insect cells, and the like can be used.
  • Various methods known to those skilled in the art can be used to introduce the vector into the host cell. For example, for introduction into E. coli, a method using calcium ions (Mandel, M. & Higa, A. (1970) Journal of Molecular Biology, 53, 158-162, Hanahan,
  • the recombinant protein expressed in the host cell can be purified and recovered from the host cell or a culture supernatant thereof by a method known to those skilled in the art.
  • affinity purification can be easily performed.
  • an antibody that binds to the protein can be prepared.
  • a polyclonal antibody is obtained by immunizing an immunized animal such as a heron with a purified protein of the present invention or a partial peptide thereof, collecting blood after a certain period of time, and removing the blood clot. It can be prepared.
  • Monoclonal antibodies are obtained by fusing antibody-producing cells of an animal immunized with the above-described protein or peptide with bone tumor cells to produce a single clone of cells that produce the desired antibody.
  • the antibody thus obtained can be used for purification and detection of the protein of the present invention.
  • the present invention includes an antibody that binds to the protein of the present invention.
  • the vector used for the transformation of a plant cell is not particularly limited as long as it can express the inserted gene in the cell.
  • a vector having a promoter for constitutive gene expression in plant cells for example, the 35S promoter of califura mosaic virus
  • a promoter that is inducibly activated by an external stimulus It is also possible to use a box having the following.
  • plant cell includes various forms of plant cells, for example, suspension culture cells, protoplasts, leaf sections, and calli.
  • a method for producing a transformed plant is to introduce a gene into protoplasts by polyethylene glycol to regenerate the plant (Indian rice varieties are suitable) (Datta 5 S..
  • progeny can be obtained from the plant by sexual or asexual reproduction.
  • a propagation material eg, seeds, fruits, cuttings, tubers, tubers, roots, strains, calli, protoplasts, etc.
  • the present invention includes plant cells into which the MA of the present invention has been introduced, plants containing the cells, progeny and clones of the plants, and propagation materials of the plants, progeny thereof, and clones.
  • the plant thus produced has improved heat stress resistance and can suppress the formation of lesions as compared with a wild-type plant.
  • the present invention provides a polynucleotide comprising at least 15 nucleotides complementary to the DNA of the present invention comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a complementary strand thereof.
  • the “complementary strand” refers to one strand of a double-stranded DNA consisting of A: T, G: C base pairs with respect to the other strand.
  • the term “complementary” is not limited to a case where the sequence is completely complementary in at least 15 contiguous nucleotide regions, and is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably 90%, and still more preferably It suffices to have 95% or more nucleotide sequence identity.
  • Such DNA is useful as a probe for detecting or isolating the DNA of the present invention, and as a primer for performing amplification.
  • Figure 1 is a photograph showing leaves of spl7 mutant KL210 (left) and Nipponbare leaves (right).
  • Figure 2 shows a detailed linkage map of the Spl7 gene region and an alignment map of genomic clones.
  • a and B Genetic maps created from segregated populations of 298 and 2944 individuals.
  • C and D Nipponbare YAC and PAC clone alignment maps.
  • FIG. 3 is a diagram showing a detailed genetic map of the Spl7 gene region, a candidate genomic region, and a predicted gene.
  • FIG. 4 is a diagram showing the structure of the Spl7 candidate gene and a comparison of the genomic nucleotide sequences of Nipponbare and KL210.
  • Figure 5 is a photograph showing the leaves of spl7 mutant KL210 (left panel) and the leaves of the transformant (four panels on the right panel).
  • Figure 6 is a diagram showing the relationship between the number of days and the average temperature needed for lesion formation on s P 17 mutants in natural cultivation conditions.
  • Fig. 7 is a photograph showing leaves (left panel) when the spl7 mutant KL210 was cultivated by blocking ultraviolet rays (left panel) and leaves (right panel) when KL210 was not blocked.
  • YAC clones having the nucleotide sequences of the DNA markers S869, C11368, S2581, and R2781 near the Spl7 locus were identified ( ( Figure 2C). Further, the terminal fragments of the identified YAC clones Y4666, Y2205, Y3824c, Y6089 and Y2288 were isolated by the cassette method, and the identified YAC clones were sorted. As a result, it was revealed that YAC clones Y4666, Y2205, and Y3824c contain the Spl7 gene region (Fig. 2C).
  • a primer set (primer-1, -GACCTGTGCTCTGC CTTTCT-3 '/ SEQ ID NO: 3 and 5' GTATGCCMCTGCTCAACTT-3, / SEQ ID NO: 4, amplified genomic fragment 0.4kb), a PAC clone library of Nipponbare Genome (average insert length 112kb, 18432 clones; (Corresponding to double) (Baba et al (2000). Bull. Natl. Inst. Agrobiol. Resour. 14, 24-36.).
  • nine types of PAC clones were selected.
  • the alignment of these PAC clones revealed that eight types of PAC clones represented by P0029H1 contained the Spl7 locus (FIG. 2D).
  • the Spl7 locus was found to be the RFLP markers P461H4T and P693G10S. It was found that it was present in the genomic region to be sandwiched and co-segregated with the RFLP marker C11368B. As a result, it was revealed that the Spl7 locus exists in a genomic region of about 16 kb sandwiched between two markers (FIG. 2).
  • the nucleotide sequence of a 16-kb genomic candidate region was analyzed.
  • the nucleotide sequence was analyzed by subcloning the candidate region with the restriction enzyme Not Sail, subcloning it with various restriction enzymes, and using the dye-primer method.
  • a new CAPS marker was created and the candidate region was further narrowed down.
  • the Spl7 gene was co-isolated with the CAPS marker HsfC2-l (primer 5, -TCTCTCTC GTTCGTTCCCCG-3, Z SEQ ID NOS: 5 and 5, -TGGATAMTGGAGATGGGCA-3, Z SEQ ID NO: 6, restriction enzyme Apal) and S12C6-6d (Primers 5'-TCGGCATCGGCTATTATCGG-3, / SEQ ID NOS: 7 and 5, -GATTTCGGGATACTGTGCGT-3, DA SEQ ID NO: 8, restriction enzyme Nlall) and HsfC3-3 '(Primer-5, -ACGATGTGTTTTGGGAGCGG-3, 3 and 7 recombinant individuals were detected between Z SEQ ID NOS: 9 and 5, -GACCTGTGCTCTGCCTTTCT-3, / SEQ ID NO: 10 and restriction enzyme N1 ali i), respectively.
  • the nucleotide sequence of the corresponding region of the mutant strain KL210 was determined. Nucleotide sequence analysis was performed by designing a primer capable of amplifying the relevant portion from the previously obtained nucleotide sequence information of Nipponbare and cloning the genomic PCR and RT-PCR products. When the nucleotide sequences of the wild type and the mutant gene were compared, a single nucleotide substitution was found. This base substitution results in a substitution of the predicted amino acid from tritophan to cysteine ( Figure 4). The amino acids to be replaced are some of the amino acids highly conserved in the Hsf gene, and this amino acid substitution was thought to be responsible for the loss or reduction of the function of the spl7 protein in the mutant strain.
  • the NspV-Bgll l 5.6 kb fragment from the Nipponbare genomic region containing the 5 'upstream predicted promoter region identified as a candidate for the Spl7 gene was incorporated into the vector PPZP2H-lac, which can be transformed via agrobacterium. . Transformation was performed by using Toki's method (Plant Mol. Biol. Rep. 15: 16-21, 1997) using only vector # 178 and vector 1 into which this fragment was introduced. The spl7 mutant strain KL210 was used for the transforming strain. Transformation experiments with the spV-Bglll 5.6 kb fragment yielded 150 hygromycin-resistant individuals from the vector alone and 50 from the vector alone.
  • Spl7 mutant strain KL210 and Nipponbare having a wild-type gene were sown at intervals of 14 days from May 17, 1999, and the number of days required for lesions to appear on KL210 was investigated.
  • the required days decreased until sowing on August 23 and increased on sowing on September 6 (Fig. 6).
  • the average temperature between the time of sowing and the appearance of the lesions increased until August 9, and thereafter decreased ( Figure 6).
  • sowing on August 23 the minimum number of days until the appearance of lesions was recorded as 11 days, even though the average temperature was falling. The highest annual temperature of 36 ° C was recorded.

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Description

明細書 植物の病斑形成を抑制する遺伝子 Spl7およびその利用 技術分野
本発明は、 植物の病斑形成および熱ストレス耐性に関与する遺伝子および該遺 伝子を利用した植物の改変に関する。 本発明は、 植物の品種改良などの分野にお いて有用である。 背景技術
イネには多種多様の突然変異系統が作出されている。 そのなかにはイネの成長 に伴って葉身に病斑様の壊死斑が形成される突然変異系統が存在する （図 1 )
(Rice Genetics Newsletter 12, 9-153 (1995)) 。 これらの突然変異系統では その病斑形成が高温や強光において生じることが知られており、 変異遺伝子は光 あるいは熱障害の回避に関与していることが推定されている （Fuse， T. et. al . Physiol. Plant. 89， 799-804 ( 1993)) 。 一方、 この病斑が形成された植物は、 病原微生物の感染に抵抗性になるものもあることから、 これらの遺伝子が細胞の 過敏感反応とそれに引き続く細胞死に関わることも推定されている （ Kawasaki , T. and Shima oto, K. 細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ 8 分子レベルか らみた植物の耐病性 124- 130( 1997))。
従って、 これら突然変異系統における変異遺伝子が同定され、 対応する野生型 遺伝子が単離されれば、 これを形質転換法により任意の品種に導入することによ つて、 それらの系統の病斑形成の抑制や光や熱などに対するストレス耐性の向上 を図ることができる可能性がある。
そこで、 これら突然変異系統における変異遺伝子の同定および対応する野生型 遺伝子の単離が望まれていた。 発明の開示
本発明は、 このような状況に鑑みてなされたものであり、 その目的は、 植物の 病斑形成の抑制に関与する新規な遺伝子を提供することにある。 さらに、 本発明 は、 該遺伝子を利用して植物を改良することをも目的とする。
本発明者等は、 上記課題を解決すべく、 イネの成長に伴って葉身に病斑様の壊 死斑が形成される突然変異系統のうち、 第 5染色体上に変異遺伝子が存在する S Pl7 に着目し、 その変異遣伝子を同定し、 対応する野生型遺伝子を単離すべく鋭 意研究を行なった。
本発明者らは、 まず、 連鎖解析および酵母人工染色体 （YAC) クローンによる Spl7遺伝子領域の整列化を行った。 具体的には、 Spl7遺伝子単離に不可欠であ る、 大規模分離集団の連鎖解析を行った。 また、 イネゲノム解析研究において作 出された YACクローンの整列化地図を利用して、 Spl7遺伝子座近傍に存在する Y AC クローンを特定した。 さらに特定された YAC クローンの末端断片を単離し、 整列化することにより、 Spl7遺伝子領域を含む YAC クローンを明らかにした (図 2C) 。
Spl7遺伝子の候補領域をさらに絞り込むために、 本発明者等は、 Spl7遺伝子 座と同座の RFLPマ一力一 C11368を STS化したプライマ一セットを用いて、 イネ ゲノム解析研究において作成された日本晴ゲノムの PACクローンライブラリーか ら、 9種類の PACクローンを選抜した。 これら PACクローンを整列化し、 Spl7遺 伝子座を含む PACクローンを明らかにした （図 2D) 。
Spl7領域に整列化された YACおよび PACクローンの末端断片をクローン化し、 それらを新たな RFLPマ一力一あるいは CAPSマーカーとして、 詳細な遺伝地図を 作成したところ、 Spl7遺伝子座は RFLPマーカー P461H4Tおよび P693G10Sに挟み 込まれる約 16kbのゲノム領域に存在することが明らかとなった （図 2) 。 このゲノム候補領域の塩基配列解析を行ない、 その情報を利用して、 新たな C APSマーカ一を作成し、 候補領域のさらなる絞り込みを行った結果、 Spl7遺伝子 は CAPSマーカー S12C6- 6dおよび HsfC3-3'に挟み込まれる約 3kbのゲノム領域に 存在することが明らかとなった （図 3) 。
この候補ゲノム領域の塩基配列に対して遺伝子予測ならびに類似性検索を行つ たところ、 トマト、 ァラビドプシスなどで単離されている Hsf遺伝子と類似した '構造を示す遺伝子のみが予測されたため、 この遺伝子を Spl7遺伝子の候補とし、 突然変異系統 KL210の該当領域の塩基配列を決定した。 その結果、 突然変異遺伝 子の塩基配列に、 野生型遺伝子に対して、 1 塩基置換が見出された （図 4 ) 。 .こ のため、 この塩基置換に対応するアミノ酸置換が突然変異系統の spl7 タンパク 質の機能の消失、 あるいは低下の原因であると考えられた。
さらに、 本発明者等は、 Spl7 遺伝子の候補として特定されたゲノム領域をァ グロパクテリゥムを介して形質転換可能なベクターに組み込んで spl7 突然変異 系統に導入した。 形質転換個体を、 自然日長条件の隔離温室で栽培して、 病斑の 形成を調査した結果、 対照個体 （ベクタ一のみを導入） では、 突然変異系統と同 様に、 生育後期になって病斑が形成されたのに対し、 候補遺伝子が導入された個 体については、 すべての個体で病斑の形成が認められなかった （図 5) 。 即ち、 候補遺伝子領域が、 突然変異系統 KL210の病斑形成を抑制する機能を有すること が判明した。 さらに 1コピーの導入遺伝子が組み込まれたと考えられる個体の自 殖後代を栽培したところ、 病斑が形成される個体と形成されない個体の分離比が 期待比に適合した。 これにより候補遺伝子が Spl7遺伝子であることが判明した c さらに、 本発明者等は、 病斑形成に必要な条件の検討を行なった結果、 病斑形 成にはある程度の高温が不可欠であり （図 6) 、 紫外線もまた病斑形成を促進す る条件の一つであることを見出した （図 7) 。 この事実から、 Spl7遺伝子は高温 ストレスの回避あるいは除去において重要な役割を果たしていることが推定され た。 従って、 Spl7遺伝子を発現するトランスジエニック植物を作出することに より、 本来植物が.もつ熱ストレスの回避能力を高め、 植物の病斑形成を抑制する ことが可能になると考えられる。
即ち、 本発明者らは、 植物の病斑形成の抑制に関与する遺伝子を単離すること に成功すると共に、 該遺伝子を利用して植物の病斑形成を抑制することが可能で あること、 さらには該遺伝子を利用して植物の熱ストレス耐性を向上させること が可能であることを見出し、 これにより本発明を完成するに至った。
本発明は、 より具体的には、
(1) 植物の病斑形成を抑制する機能を有する植物由来のタンパク質をコード する、 下記 （a) から （d) のいずれかに記載の DNA、
(a) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする D
NA。
(b) 配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA。
( c) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1または複数のアミノ酸が 置換、 欠失、 付加、 および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質 をコードする MA。
(d) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件 下でハイプリダイズする DNA。
(2) 植物の熱ストレス耐性を向上させる機能を有する植物由来のタンパク質 をコードする、 下記 （a) から （d) のいずれかに記載の DNA、
(a) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする D
NAヽ
(b) 配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA、
( c) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1または複数のアミノ酸が 置換、 欠失、 付加、 および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質 をコードする DNA。 ( d ) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる MAとストリンジヱントな条件 下でハイブリダィズする DNA。
(3) (1) または （2) に記載の DNAを含むベクタ一、
(4) (1) または （2) に記載の DNAまたは （3) に記載のぺク夕一が導入 された形質転換細胞、
(5) 植物細胞である、 （4) に記載の形質転換細胞、
(6) (1) または （2) に記載の MAによりコードされるタンパク質、
(7) (4) に記載の形質転換細胞を培養し、 該形質転換細胞またはその培養 上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、 (6) に記載のタンパク 質の製造方法、
(8) (5) に記載の形質転換細胞を含む形質転換植物体、
(9) (8) に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、 形質転換 植物体、
(10) ( 8 ) または （ 9 ) に記載の形質転換植物体の繁殖材料、
( 1 1) (8) に記載の形質転換植物体の製造方法であって、 （ 1) または (2) に記載の DNAを植物細胞に導入し、 該植物細胞から植物体を再生させるェ 程を含む方法、
(12) (1) に記載の DNAを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、 植物の病斑形成を抑制する方法、 ，
(13) (2) に記載の MAを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、 植物の熱ストレス耐性を向上させる方法、
(14) (6) に記載のタンパク質に結合する抗体、 および
(15) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAまたはその相補鎖に相補 的な少なくとも 15 ヌクレオチドからなるポリヌクレオチド、 を提供するもので ある。 本発明は、 Spl7タンパク質をコードする DNAを提供する。 イネ日本晴の Spl7 ゲノム DNAの塩基配列を配列番号： 1に、 該 MAがコードするタンパク質のアミ ノ酸配列を配列番号： 2に示す。 Spl7遺伝子は、 イネの病斑形成の抑制に関与 する遺伝子として、 これまでイネ第 5染色体という広大な領域のいずれかの場所 に存在するものとして知られていたが、 その同定および単離には至っていなかつ た。 本発明者らは、 複雑なステップを経て遂にその存在領域を解明し、 単一の遺 伝子として該遺伝子を単離することに初めて成功した。
Spl7 タンパク質は、 熱ストレスによって生じるイネの病斑形成を抑制する作 用をもつ。 また、 その構造から、 熱ショックタンパク質遺伝子の転写調節に関わ つていることが推定される。 熱ショックタンパク質の一つが、 植物の熱ストレス の回避に大きく関与していることが最近報告されている （Queitsch, C. et al . Plant Cell 12, 479-492 (2000)) 。 従って、 Spl7 タンパク質をコードする DNA で植物を形質転換することにより、 植物の熱ストレス耐性を向上させることがで きるとともに、 病斑形成を抑制することができると考えられる。
本発明の Spl7タンパク質をコードする DNAには、 ゲノム DNA、 cMA、 および 化学合成 DNAが含まれる。 ゲノム MAおよび cDNAの調製は、 当業者にとって常 套手段を利用して行うことが可能である。 ゲノム DNA は、 例えば、 Spl7遺伝子 を有するイネ品禾愈 （例えば、 日本晴） からゲノム DNAを抽出し、 ゲノミックライ ブラリー （ベクターとしては、 プラスミ ド、 ファージ、 コスミ ド、 BAC、 PAC な どが利用できる） を作成し、 これを展開して、 本発明タンパク質をコードする D NA (例えば、 配列番号： 1) を基に調製したプローブを用いてコロニーハイプリ ダイゼーシヨンあるいはプラークハイブリダィゼ一シヨンを行うことにより調製 することが可能である。 また、 本発明タンパク質をコードする DNA (例えば、 配 列番号：； I) に特異的なプライマーを作成し、 これを利用した PCR をおこなうこ とによって調製することも可能である。 また、 cDNA は、 例えば、 Spl7遺伝子を 有するイネ品種 （例えば、 日本晴） から抽出した mMAを基に cDNAを合成し、 これを λ ΖΑΡ等のベクターに揷入して cDNAライブラリ一を作成し、 これを展開 して、 上記と同様にコロニーハイブリダィゼ一シヨンあるいはプラークハイブリ ダイゼ一シヨンを行うことにより、 また、 PCR を行うことにより調製することが 可能である。
本発明は、 配列番号： 2 に記載の Spl7 タンパク質 （日本晴） と機能的に同等 な夕ンパク質をコ一ドする DNAを包含する。 本発明の DNAの由来する植物種に特 に制限はないが、 好ましくはイネ科植物由来であり、 最も好ましくはイネ由来で ある。 ここで 「Spl7 タンパク質と同等の機能を有する」 とは、 対象となるタン パク質が植物の病斑形成を抑制する機能および/または植物の熱ストレス耐性を 向上させる機能を有することを指す。
このような DNAには、 例えば、 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1 若しくは複数のアミノ酸が置換、 欠失、 付加および/または挿入されたアミノ酸 配列からなるタンパク質をコードする変異体、 誘導体、 アレル、 バリアントおよ びホモログが含まれる。
アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードする DNAを調製するための当業 者によく知られた方法としては、 例えば、 site-directed mutagenesis 法 （Kram er, W. & Fritz, H. - J. (1987) Oligonucleotiae-directed construction of muta genesis via gapped duplex DNA. Methods in Enzymology, 154: 350-367) が挙 げられる。 また、 塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が 変異することは、 自然界においても生じ得る。 このように天然型の Spl7 タンパ ク質をコードするアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸が置換、 欠失 もしくは付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする DNAであっても、 天然型の Spl7タンパク質 （配列番号： 2) と同等の機能を有するタンパク質をコ —ドする限り、 本発明の DNAに含まれる。 また、 たとえ、 塩基配列が変異した場 合でも、 それがタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合 （縮重変異） もあ り、 このような縮重変異体も本発明の DNAに含まれる。 ある DNAが植物の病斑形成を抑制するタンパク質をコードするか否かは、 実施 例 6に記載のように、 被検 MA を適当なベクタ一に組み込んで、 spl7突然変異 系統に導入し、 この突然変異系統における病斑形成が抑制されるか否かを観察す ることにより評価することができる。 また、 ある DNAが植物の熱ストレス耐性を 向上させる機能を有するタンパク質をコードするか否かは、 次ぎの様にして評価 すればよい。 即ち、 被検 DNAを適当なベクターに組み込んで、 野生型系統に導入 し、 この系統を高温条件 （40°C程度） および低温 （25°C程度） の栽培下で観察し、 高温における生育速度あるいは生育量の低下が野生型系統に比較して、 軽度であ る場合に、 被検 DMが植物の熱ストレス耐性を付与させる機能を有するタンパク 質をコードすると評価すればよい。
配列番号： 2 に記載の Spl7 タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコード する DNAを調製するために、 当業者によく知られた他の方法としては、 ハイプリ ダイゼ一シヨン技術 (Southern, E.M. (1975) Journal of Molecular Biology, 98, 503) やポリメラ一ゼ連鎖反応 （PCR) 技術 （Saiki， E. K. et al. (1985) S cience, 230, 1350 - 1354、 Saiki, R. . et al. (1988) Science, 239， 487-49 1) を利用する方法が挙げられる。 即ち、 当業者にとっては、 Spl7遺伝子の塩基 配列 （配列番号： 1) もしくはその一部をプローブとして、 また Spl7遺伝子に特 異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、 イネや他の 植物から Spl7遺伝子と高い相同性を有する DNAを単離することは通常行いうる ことである。 このようにハイブリダィズ技術や PCR技術により単離しうる Spl7 タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコ一ドする DNAもまた本発明の D NAに含まれる。
このような DNAを単離するためには、 好ましくはストリンジェントな条件下で ハイブリダィゼ一シヨン反応を行なう。 本発明においてストリンジェントなハイ ブリダィゼ一シヨン条件とは、 6M尿素、 0.4%SDS、 0.5xSSC の条件またはこれと 同等のストリンジエンシーのハイプリダイゼーシヨン条件を指す。 よりストリン ジエンシーの高い条件、 例えば、 6M尿素、 0.4%SDS、 O. lxSSC の条件を用れば、 より相同性の高い DNAの単離を期待することができる。 これにより単離された D NA は、 アミノ酸レベルにおいて、 Spl7 タンパク質のアミノ酸配列 （配列番号： 2) と高い相同性を有すると考えられる。 高い相同性とは、 アミノ酸配列全体で、 少なくとも 50%以上、 さらに好ましくは 70%以上、 さらに好ましくは 90%以上 (例えば、 95 以上） の配列の同一性を指す。 配列の相同性は、 BLASTn (核酸レ ベル） や BLASTx (アミノ酸レベル） のプログラム（Altschul et al . J. Mol . Bi ol .215 :403-410, 1990)を利用して決定することができる。 該プログラムは、 Kar 1 in and Altschulによるアルゴリズム BLAST(Proc, Natl. Acad. Sei. USA 87:2 264-2268, 1990、 Proc .Natl . Acad. Sei , USA 90: 5873-5877, 1993)に基づいて いる。 BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、 パラメ一夕 は例えば sco re ： 100、 wordlength = 12とする。 また、 BLASTXによってアミノ酸配列を解析 する場合には、 パラメ一夕一は例えば score = 50、 wordlength = 3 とする。 ま た、， Gapped BLAST プログラムを用いて、 アミノ酸配列を解析する場合は、 Altsc hul ら (Nucleic . Acids. Res.25 : 3389-3402, 1997) に記載されているように行 うことができる。 BLAST と Gapped BLAST プログラムを用いる場合には、 各プロ グラムのデフォルトパラメ一夕一を用いる。 これらの解析方法の具体的な手法は 公知である ( http： I /www . ncb i . nlm.nih.gov. )0
本発明の DNAは、 例えば、 組み換えタンパク質の調製や、 病斑形成が抑制され たあるいは熱ストレス耐性が向上した形質転換植物体の作出などに利用すること が可能である。
組み換えタンパク質を調製する場合には、 通常、 本発明のタンパク質をコード する DNAを適当な発現ベクターに挿入し、 該ベクターを適当な細胞に導入し、 形 質転換細胞を培養して発現させたタンパク質を精製する。 組み換えタンパク質は、 精製を容易にするなどの目的で、 他のタンパク質との融合タンパク質として発現 させることも可能である。 例えば、 大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク 質との融合タンパク質として調製する方法 （米国 New England BioLabs社発売の ベクター pMAL シリーズ） 、 グル夕チオン- S-トランスフェラ一ゼ（GST)との融合 タンパク質として調製する方法 （Amersham Pharmacia Biotech社発売のベクタ 一 pGEXシリーズ） 、 ヒスチジンタグを付加して調製する方法 （Novagen社の pET シリーズ） などを利用することが可能である。 宿主細胞としては、 組み換えタン パク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、 上記の大腸菌の他、 例えば、 酵母、 種々の動植物細胞、 昆虫細胞などを用いることが可能である。 宿主細胞へ のべクタ一の導入には、 当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。 例えば、 大腸菌への導入には、 カルシウムイオンを利用した導入方法 （Mandel, M. & Higa, A. ( 1970) Journal of Molecular Biology, 53, 158-162、 Hanahan,
D. ( 1983) Journal of Molecular Biology, 166, 557-580) を用いることがで きる。 宿主細胞内で発現させた組み換えタンパク質は、 該宿主細胞またはその培 養上清から、 当業者に公知の方法により精製し、 回収することが可能である。 組 み換えタンパク質を上記したマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質 として発現させた場合には、 容易にァフィ二ティ一精製を行うことが可能である。 得られた組換えタンパク質を用いれば、 これに結合する抗体を調製することが できる。 例えば、 ポリクロ一ナル抗体は、 精製した本発明のタンパク質若しくは その一部のぺプチドをゥサギなどの免疫動物に免疫し、 一定期間のにちに血液を 採取し、 血べいを除去することにより調製することが可能である。 また、 モノク ローナル抗体は、 上記タンパク質若しくはべプチドで免疫した動物の抗体産生細 胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、 目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞
(ハイプリ ドーマ） を単離し、 該細胞から抗体を得ることにより調製することが できる。 これにより得られた抗体は、 本発明のタンパク質の精製や検出などに利 用することが可能である。 本発明には、 本発明のタンパク質に結合する抗体が含 まれる。 本発明の DNAを利用して病斑形成が抑制されたあるいは熱ストレス耐性が向上 した形質転換植物体を作製する場合には、 本発明のタンパク質をコードする DNA を適当なベクターに挿入して、 これを植物細胞に導入し、 これにより得られた形 質転換植物細胞を再生させる。
植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、 該細胞内で挿入遺伝子を 発現させることが可能なものであれば特に制限はない。 例えば、 植物細胞内での 恒常的な遣伝子発現を行うためのプロモーター （例えば、 カリフラヮーモザィク ウィルスの 35Sプロモーター） を有するベクターや外的な刺激により誘導的に活 性化されるプロモーターを有するぺク夕一を用いることも可能である。 ここでい う 「植物細胞」 には、 種々の形態の植物細胞、 例えば、 懸濁培養細胞、 プロトプ ラスト、 葉の切片、 カルスなどが含まれる。
植物細胞へのベクタ一の導入ば、 ポリエチレングリコール法、 電気穿孔法 （ェ レクトロボーレ一シヨン) 、 ァグロバクテリゥムを介する方法、 パーティクルカ' ン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。 形質転換植物細胞か らの植物体の再生は、 植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが 可能である (Toki ら ( 1995 ) Plant Physiol . 100 : 1503-1507参照） 。 例えば、 イネにおいては、 形質転換植物体を作出する手法については、 ポリエチレングリ コールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、 植物体 （インド型イネ品種が適し ている） を再生させる方法 (Datta5 S. . (1995) In Gene Transfer To Plants(P otrykus I and Spangenberg Eds . ) pp66-74) 、 電気パルスによりプロトプラス トへ遺伝子導入し、 植物体 （日本型イネ品種が適している） を再生させる方法 (Toki et al ( 1992 ) Plant Physiol . 100, 1503-1507) 、 パ一ティクルガン法 により細胞へ遺伝子を直接導入し、 植物体を再生させる方法 （Christou et al . ( 1991 ) Bio/technology, 9 : 957-962. ) およびァグロパクテリゥムを介して遺伝 子を導入し、 植物体を再生させる方法 （Hiei et al. ( 1994) Plant J. 6 : 271-2 82. ) など、 いくつかの技術が既に確立し、 本願発明の技術分野において広く用 いられている。 本発明においては、 これらの方法を好適に用いることができる。 一旦、 ゲノム内に本発明の DNAが導入された形質転換植物体が得られれば、 該 植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。 また、 該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料 （例えば、 種子、 果実、 切穂、 塊茎、 塊根、 株、 カルス、 プロトプラスト等） を得て、 それらを基に該植物体を 量産することも可能である。 本発明には、 本発明の MAが導入された植物細胞、 該細胞を含む植物体、 該植物体の子孫およびクローン、 並びに該植物体、 その子 孫、 およびクローンの繁殖材料が含まれる。 このようにして作出された植物体は、 野生型植物体と比較して、 熱ストレス耐性が向上され、 病斑形成が抑制されうる 本発明の手法を用いれば、 イネなどの有用農作物の生産性を向上させることがで き非常に有益である。
また、 本発明は、 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる本発明の DNAまたは その相補鎖に相補的な少なくとも 15 ヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを 提供する。 ここで 「相補鎖」 とは、 A:T、 G:Cの塩基対からなる 2本鎖 DNAの一 方の鎖に対する他方の鎖を指す。 また、 「相補的」 とは、 少なくとも 15 個の連 続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、 少なくとも 7 0%、 好ましくは少なくとも 80%、 より好ましくは 90%、 さらに好ましくは 95%以 上の塩基配列の同一性を有すればよい。 このような DNAは、 本発明の DNAの検出 や単離を行なうためのプローブとして、 また、 増幅を行うためのプライマ一とし て有用である。 図面の簡単な説明
図 1は、 spl7 突然変異体 KL210 の葉 （図左） および日本晴の葉 （図右） を示 す写真である。 ' 図 2は、 Spl7遺伝子領域の詳細な連鎖地図およびゲノムクローンの整列地図 である。 Aおよび B : 298個体および 2944個体の分離集団により作成した遺伝地 図。 Cおよび D : 日本晴の YACおよび PACクローンによる整列地図。
図 3は、 Spl7遺伝子領域の詳細な遺伝地図と候補ゲノム領域ならびに予測遺 伝子を示す図である。
図 4は、 Spl7候補遺伝子の構造と日本晴と KL210 のゲノム塩基配列の比較を 示す図である。
図 5は、 spl7 突然変異 KL210 の葉 （図左） および形質転換体の葉 （図右 4 枚） を示す写真である。
図 6は、 自然栽培条件下における sP17突然変異体上の病斑形成に必要な日数 と平均気温との関係を示す図である。
図 7は、 spl7突然変異 KL210 を紫外線を遮断して栽培した場合の葉 （図左） と遮断しない場合の葉 （図右） を示す写真である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例 に制限されるものではない。
[実施例 1 ] 遺伝地図作成
マップべ一スクローニングに不可欠な大規模分離集団による Spl7領域の詳細 な連鎖解析を行った。 連鎖解析用の集団は spl7突然変異系統と、 日本晴の遺伝 的背景ををもち、 第 5染色体が Kasalathの染色体に置換された SL18の交配によ り得られた F2集団. 298個体を用いた。 RFLPマーカ一による連鎖解析の結果、 sp 17遺伝子座は RFLPマーカ一 S869および R2781の間に存在し、 C11368、 S2581, S1762, S183U B344と共分離することが明らかとなった （図 2A) 。
精度の高い spl7領域の遺伝地図を作成するために、 さらに 2646個体の F2集 団を連鎖解析に用いた。 解析作業を効率化するために CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)マ一力一を用いた。 すなわち F2集団の各個体について、 Spl7の両側に存在する CAPSマーカー S869および R2781を利用して、 Spl7近傍 の染色体組み換え個体を選抜した。 その結果、 65 個体の組み換え個体が選抜で きた （図 2B) 。 さらにそれらの個体を用いて、 以下の取り組みにおいて作出さ れた RFLPマーカーによる詳細な連鎖地図作成を行った。
[実施例 2 ] 酵母人工染色体 （YAC) クローンならびに P1由来人工染色体 （PA C) クローンによる Spl7遺伝子領域の整列化
イネゲノム解析研究において作出された日本晴 YACクローンの整列化地図を利 用して、 Spl7遺伝子座近傍に存在する DNAマーカー S869、 C11368、 S2581、 およ び R2781の塩基配列を有する YAC クローンを特定した (図 2C) 。 さらに特定さ れた YACクローン Y4666、 Y2205、 Y3824c、 Y6089および Y2288の末端断片をカセ ット法により単離し、 特定できた YACクローンを整列化した。 その結果、 YACク ローン Y4666、 Y2205、 Y3824cは Spl7遺伝子領域を含むことが明かとなった （図 2C)。
さらに Spl7遺伝子の候補領域を絞り込むために、 Spl7遗伝子座と同座の RFLP マーカ一 C11368を STS化したプライマーセット （プライマ一 5，-GACCTGTGCTCTGC CTTTCT-3' /配列番号： 3および 5' -GTATGCCMCTGCTCAACTT- 3， /配列番号： 4、 増幅ゲノム断片 0.4kb) を用いて、 イネゲノム解析研究において作成された日本 晴ゲノムの PAC クローンライブラリ一 （平均インサート長 112kb， 18432 クロ —ン；イネゲノムの約 4.5倍に相当） を選抜した （Baba et al (2000) . Bul l . N atl . Inst. Agrobiol . Resour. 14, 24-36. ) 。 その結果、 9 種類の PAC クロー ンが選抜できた。 さらにこれらの PACクローンの整列化を行ったところ、 P0029H 1 に代表される 8種類の PACクローンが Spl7遺伝子座を含むことが明らかとな つた (図 2D)。 [実施例 3 ] Spl7遺伝子領域の絞り込み
Spl7領域に整列化された YACおよび PACクローンの末端断片をクローン化し、 それらを新たな RFLPマーカーあるいは CAPSマーカ一として、 詳細な遺伝地図を 作成したところ、 Spl7遺伝子座は RFLPマーカ一 P461H4Tおよび P693G10Sに挟み 込まれるゲノム領域に存在し、 RFLPマーカー C11368Bとは共分離することが明ら かとなつた。 この結果、 Spl7遺伝子座は 2つのマーカーに挟まれる約 16kbのゲ ノム領域に存在することが明らかとなった （図 2)。
[実施例 4 ] 塩基配列解析による候補遺伝子領域の特定
Spl7遺伝子を含むと考えられる PACクローン P0029H1から、 16kbのゲノム候 補領域の塩基配列解析を行なった。 塩基配列の解析は候補領域を制限酵素 Not Sail でサブクローン化したものを、 さらに種々の制限酵素でサブクローン化し、 dye-primer 法により行った。 連鎖解析により特定された候補遺伝子領域内の塩 基配列情報を利用して、 新たな CAPS マーカーを作成し、 候補領域のさらなる絞 り込みを行った。 Spl7遺伝子は CAPSマーカー HsfC2-l (プライマー 5， -TCTCTCTC GTTCGTTCCCCG- 3，Z配列番号： 5および 5， - TGGATAMTGGAGATGGGCA- 3， Z配列番 号： 6、 制限酵素 Apal) と共分離し、 S12C6-6d (プライマー 5' -TCGGCATCGGCTAT TATCGG-3， /配列番号： 7および 5， - GATTTCGGGATACTGTGCGT- 3， ダ配列番号： 8、 制限酵素 Nlal l l) と、 HsfC3-3' (プライマ一 5， - ACGATGTGTTTTGGGAGCGG-3， Z配 列番号： 9および 5，-GACCTGTGCTCTGCCTTTCT-3， /配列番号： 1 0、 制限酵素 N1 ali i) との間にそれぞれ 3および 7個の組み換え個体を検出した。
以上の結果から、 Spl7遺伝子は CAPSマーカー S12C6- 6dおよび HsfC3- 3，に挟 み込まれる約 3kbのゲノム領域に存在することが明らかとなった （図 3) 。 この 候補ゲノム領域の塩基配列に対して遺伝子予測ならびに類似性検索を行ったとこ ろ、 トマト、 ァラビドプシスなどで単離されている Hsf遺伝子と類似した構造を 示す遺伝子のみが予測された （図 3) 。 この遺伝子は熱ショック誘導タンパク質 の転写調節因子として、 その機能が明らかにされている。
[実施例 5 ] Spl7候補遺伝子の塩基配列解析
Hsf 様遺伝子を Spl7遺伝子の候補とし、 突然変異系統 KL210の該当領域の塩 基配列を決定した。 塩基配列解析は、 既に得られている日本晴の塩基配列情報か ら該当部分を増幅できるプライマ一を設計し、 ゲノム PCRおよび RT- PCR産物を クローン化することによって行った。 野生型と突然変異遺伝子の塩基配列を比較 したところ、 1 塩基置換が見出された。 この塩基置換により、 予測アミノ酸のト リブトフアンからシスティンへの置換を生じる （図 4) 。 置換されるアミノ酸は Hsf 遺伝子に高度に保存されるアミノ酸の一部であり、 このアミノ酸置換が突然 変異系統の spl7 タンパク質の機能の消失、 あるいは低下の原因であると考えら れた。
[実施例 6 ] 形質転換による候補遺伝子の機能の同定
Spl7遺伝子の候補として特定された 5'上流予測プロモーター領域を含む日本 晴のゲノム領域 NspV- Bgll l 5.6kb 断片を、 ァグロパクテリゥムを介して形質転 換可能なベクター PPZP2H- lac に組み込んだ。 この断片を導入したベクタ一 #178 ならびにベクタ一のみを用い、 土岐の方法 （Plant Mol . Biol . Rep. 15 : 16-21, 1997) により形質転換を行なった。 形質転換する系統には spl7突然変異系統 KL 210を用いた。 spV-Bgl l l 5.6kb断片の形質転換実験から 150個体、 ベクターの みからは 50 個体のハイグロマイシン耐性個体を得た。 候補遺伝子に特異的なプ ライマー （センス鎖 5， -GTCTCCGTGGCCGTGGCTGA- 3，ノ配列番号： 1 1 ) および (アンチセンス鎖 5， -AACGAGGAATCTTAGMGGG-3， /配列番号： 1 2 ) を用いて、 導入した領域が組み込まれたか否かを PCR法により調査した。 その結果、 150 個体すベての形質転換体について、 候補遺伝子が組み込まれて いることが判明した。 これらの個体を、 自然日長条件の隔離温室 （3 月に培養室 から隔離温室 (つくば巿）に移す） で栽培して、 病斑の形成を調査した。 その結果、 ベクターのみを導入した個体は、 突然変異系統 KL210と同様に、 生育後期になつ て病斑が形成されたのに対して、 候補遺伝子が導入された個体については、 すべ ての個体で病斑の形成が認められなかった （図 5) 。 さらに 1コピーの導入遺伝 子が組み込まれたと考えられる個体の自殖後代 24個体を栽培したところ、 病斑 が形成される個体と形成されない個体が 6および 18個体に分離し、 この分離比 が期待比 1 : 3 に適合した。 これらの結果から、 候補遺伝子領域 (NspV-Bgll l 5. 6kb) には、 突然変異系統 KL210 の病斑形成を抑制する機能を有することが判明 し、 候補遺伝子が Spl7遺伝子であると判断した。
[実施例 7 ] 病斑形成に必要な条件
Spl7突然変異系統 KL210および野生型遺伝子をもつ日本晴を平成 11年 5月 1 7日から 14日間隔で播種し、 KL210に病斑が出現するまでに必要な日数を調査し た。 この所要日数は 8月 23 日の播種まで減少し、 9月 6 日の播種では増加した (図 6) 。 一方、 播種から病斑が出現するまでの期間の平均気温は 8月 9日まで 上昇し、 それ以降、 下降していた （図 6) 。 8月 23日の播種では、 平均気温が下 降しているにもかかわらず病斑が出現するまでの日数が 1 1日という最短を記録 しているが、 病斑出現の直前に、 平成 11年最高気温の 36°Cが記録されていた。 病斑の出現は、 冬場の温室で育成した場合、 多くの日数 （播種後 60 日以上） を 必要とし、 病斑の出現程度も低く抑えられることが観察されている。 また、 気温 が 26°Cを上回らないグロースチャンバ一で育成した場合、 生育期間を通じて全 く病斑の出現が見られなかったが、 37°Cの培養庫では 1ヶ月で病斑が出現した。 これらの結果より、 病斑形成にはある程度の高温が不可欠であり、 かつ高温条件 によって促進されると推定された。 次に、 KL210 と日本晴を、 紫外線遮断シートおよび紫外線を遮らないビニール シートで覆って育成した。 どちらのシートで覆って育成した場合も、 KL210 には 播種後 25 日目に病斑の出現が見られたが、 紫外線を遮らなかったものに比べ、 紫外線を遮断したもののほうが出現程度が低く抑えられた （図 7) 。 この結果よ り、 紫外線は病斑形成を促進する条件のひとつであることが示された。
以上の結果から、 マツプベースクロ一ニング法により候補として絞り込まれた Hsf 様遺伝子がイネ病斑形成抑制遺伝子 Spl7 であることが判明した。 本成果は 植物における Hsf様遺伝子の生物的機能を証明した初めてのケースである。 産業上の利用の可能性
熱帯原産の植物、 例えばイネは、 ムギ類に比較してある程度の高温に対して適 応し、 熱ストレスに対 ·する耐性を獲得している。 しかしながら近年、 地球温暖化 の影響により植物の生育する温度がこれまで以上に上昇傾向にある。 この状況下、 今後の作物生産の安定確保のためには、 熱ストレス耐性を効率的に付与する手法 が望まれている。 熱ストレス耐性機構については、 これまで不明な点が多く、 そ の改変においても、 積極的に向上させる有効な手法はなかった。 熱ストレスが効 果的に付与できれば、 今後、 生じる温暖化においても、 これまで同様の安定した 食料生産が確保できるばかりでなく、 従来は不可能であつた地域への作物栽培が 可能となる。 本発明の Spl7遺伝子は植物の熱ストレス耐性を向上させ、 病斑形 成を抑制する機能を有するため、 これら目的に大きく貢献し得るものである。

Claims

請求の範囲
1. 植物の病斑形成を抑制する機能を有する植物由来の夕ンパク質をコードす る、 下記 （a) から （d) のいずれかに記載の DNA。
(a) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする D NA。
(b) 配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む MA。
(c) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1または複数のアミノ酸が 置換、 欠失、 付カロ、 および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパ ク質をコードする MA。
( d ) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件 下でハイブリダイズする DNA。
2. 植物の熱ストレス耐性を向上させる機能を有する植物由来のタンパク質を コードする、 下記 （a) から （d) のいずれかに記載の DNA。
(a) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする D NA。
(b) 配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA。
(c) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1または複数のアミノ酸が 置換、 欠失、 付カロ、 および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパ ク質をコードする DNA。
( d ) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件 下でハイブリダィズする DNA。
3. 請求項 1または 2に記載の DNAを含むベクター。
4. 請求項 1または 2に記載の DNAまたは請求項 3に記載のベクタ一が導入さ れた形質転換細胞。
5. 植物細胞である、 請求項 4に記載の形質転換細胞。 請求項 1または 2に記載の DNAによりコードされるタンパク質。
請求項 4に記載の形質転換細胞を培養し、 該形質転換細胞またはその培養 上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、 請求項 6に記載の夕 ンパク質の製造方法。
請求項 5に記載の形質転換細胞を含む形質転換植物体。
請求項 8に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、 形質転換 植物体。
. 請求項 8または 9に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
. 請求項 8に記載の形質転換植物体の製造方法であって、 請求項 1または 2に記載の DNAを植物細胞に導入し、 該植物細胞から植物体を再生させる 工程を含む方法。
. 請求項 1に記載の DNAを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、 植物の病斑形成を抑制する方法。
. 請求項 2に記載の DNAを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、 植物の熱ストレス耐性を向上させる方法。
. 請求項 6に記載の夕ンパク質に結合する抗体。
. 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAまたはその相補鎖に相補的 な少なくとも 15ヌクレオチドからなるポリヌクレオチド。
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