CN108024518A

CN108024518A - 具有抗裂荚性的芸薹属植物

Info

Publication number: CN108024518A
Application number: CN201680047286.6A
Authority: CN
Inventors: 斯蒂芬·亚伯; 劳伦特·汉纳东; 瓦西利斯·吉格斯; 若尔迪·科马德兰; 让-皮埃尔·马丁南
Original assignee: Limagrain Europe SA
Current assignee: Groupe Limagrain Holding SA; Limagrain Europe SA
Priority date: 2015-08-11
Filing date: 2016-08-04
Publication date: 2018-05-11
Also published as: CA2994405A1; EP3334272A1; WO2017025420A1; EA201890462A1; AU2016307234A1; US20180220607A1; EA039899B1; AU2016307234B2; US20210169029A1; EP4129051A1

Abstract

本发明的领域涉及植物育种，具体地涉及具有抗裂荚性的新芸薹属植物的开发。本发明具体提供了在其基因组中包含萝卜属基因组片段的芸薹属植物，其中所述片段赋予抗裂荚性表型POSH*，并且所述片段的特征是在以下萝卜属标志物：SEQ ID NO 4至SEQ ID NO 18中的一种或更多种内缺失至少一个SNP。

Description

具有抗裂荚性的芸薹属植物

本发明的领域涉及植物育种，具体地涉及具有抗裂荚性的新芸薹属(Brassica)植物的开发。

发明背景

油菜在大西洋对岸也被称为卡诺拉(canola)，由于油菜在食品和产业部门的多种优势，其栽培遍及所有大洲。事实上，油菜籽产生大量的油，其被广泛用作食品，也被用作生物燃料，尤其是在汽车工业中等。油菜也能够生产饼粕，其是动物饲料(牛、猪和家禽)中蛋白质的良好来源。

尽管有这些优势，油料油菜油的食品用途由于其过高的芥酸含量而一直受到限制。事实上，基于油菜籽品种，芥酸的水平最高可以达到植物总脂肪酸的50％，并对人体健康产生有害的影响。

类似地，由于种子中芥子油甙的高含量油菜籽制造粕的用途也一直受到阻碍。当形成饼粕时，研磨种子释放芥子酶，其将芥子油甙籽转化为多种副产物如葡萄糖、硫氰酸酯、异硫氰酸酯和腈，它们会导致哺乳类动物的代谢紊乱。油菜作物的广泛开发主要是由于两个重要技术进步：油中芥酸水平的降低以及种子中芥子油甙水平的减少。事实上，目前植物育种的网络已经生产出芥酸水平少于油菜籽植物的总脂肪酸的2％的商业品种。此外，在欧洲，法令2294/92已经设置了种子中芥子油甙的最大可接受率为在9％的湿度下每克种子25毫摩尔。芥子油甙率和芥酸水平在油菜籽衍生产品的生产中是两个值得关注的参数，因此，育种者已经试图开发被称为―双零”的品种，也就是说，呈现出油中非常低水平的芥酸并且种子中低水平的芥子油甙的油菜籽品种。

尽管油料特性对于芸薹属植物育种活性是特别重要的，也可以选择其他农业特性以增加有竞争力的新品种的产生。例如，抗病性、产率、形态学特性如角果长度、或生理学特性如雄性不育、育性恢复或抗裂荚性。裂荚在农业上是重要的，这是因为其可以导致种子在农作物可以收获之前过早脱落。不利的天气条件可以加剧该过程，导致超过50％的种子损失。种子的这种损失不仅对产率产生巨大的影响，也会导致农作物在随后的生长期中成为杂草。

拟南芥突变体已经被用于更好地理解裂荚的基因决定论。已经识别出用于编码转录因子的不同基因参与抗裂荚性的调节。例如，SHATERPROOF 1(SHP1)和2(SPH2)、NAC、INDEHISCENT(IND)、ALCATRAZ(ALC)参与了瓣边缘发育。REPLUMLESS(RPL)和FRUITFULL(FUL)参与了抑制瓣边缘特征基因的表达。通过异位表达已经确认了FUL和IND功能。

已经在油料作物物种如欧洲油菜(Brassica napus)中识别出抗裂荚性的天然遗传变异。从源自欧洲油菜的中国亲本系的F2群体识别出一个重要的基因座，并且已经在染色体A09上定位(Hu Z等人，2012-Discovery of pod shatter-resistant associatedSNPs by deep sequencing of a representative library followed by bulksegregant analysis in rapeseed-PLoS ONE 7:e34253)。最近，对双亲群体进行了实验，并且来自欧洲油菜的不同的种质组使得能够识别用于抗裂荚性的少量QTL。其已经在欧洲油菜基因组的不同染色体上定位(Raman等人，2014，Genome-wide delineation ofnatural variation for pod shatter resistance in Brassica napus–PLoS ONE 9，7，e101673)。有趣的是，作者对困难进行了总结以证明，等位变异在赋予抗裂荚性中的功能，显著地归因于裂荚涉及的不同基因的预期的高水平拷贝数以及它们在基因组中的组织复杂性。

油菜是自花授粉物种，这些品种一直以来是仅有的群体品种，而非杂交种。然而，杂交植物的开发对于农民和育种者都具有多重利益，由于其能够获得显示出以下品质的改进的植物：杂种优势(或杂交优势)、稳态(植物在不同环境中的稳定性)、能够引入并结合对于昆虫、真菌、细菌或病毒的抗性基因、或对非生物逆境的适应性。但是该油菜籽杂种的开发需要授粉控制的有效方法。为此，已经开发出细胞质雄性不育(或CMS，细胞质雄性不育)体系，例如Polima，特别是Kosena和Ogura体系。

Ogura细胞质雄性不育体系是基于使用源自萝卜(Raphanus sativus)的细胞质的雄性不育的决定子，其通过种间杂交、胚拯救和回交从萝卜转移至欧洲油菜中(Bannerot等人，1974)。需要原生质体融合以产生细胞质雄性不育杂种(Pelletier等人，1983)。但是，CMS Ogura细胞质雄性不育是显性的，杂交的油菜籽植物不产生花粉，而没有花粉，植物不产生种子。为了解决这种情况并获得产量，需要杂种的雄性亲本包含恢复雄性能育性的基因。在萝卜Raphanus sativus和在1987年由国家农业科学研究院转移至细胞质雄性不育的载体的芸薹属植物中识别出这种Ogura体系的雄性能育性恢复基因(Pelletier等人，1987，Proc 7th Int.Rapeseed Conf.Poznan，Poland，113/119)。Rf恢复基因已经在WO92/05251专利申请和Delourme等人，1991，Proc 8th Int.Rapeseed Conf.Saskatoon，Canada，1506/1510中描述。然而，得到的携带恢复雄性能育性的该Rf基因的植物具有两个主要的缺点：种子中芥子油甙的显著增加和植物的农业特征的显著下降，例如所产生的种子的量下降、下降的抗病性和增加的易倒伏性。这些缺点表现出与携带者基因渗入片段直接相关联，其包括从萝卜转移的细胞质雄性能育性的基因Rf恢复。该染色体区域不具有Rf恢复基因，其也包含造成上述缺点的一个或多个基因。为了解决这种情况，多种研究项目都在该染色体区域中寻求重组事件，重组以打破编码不同特征的DNA片段之间的现有连锁。尽管研究由于恢复基因Rf周围的染色体区域很难进行重组的事实而受到阻碍，不同的专利申请描述了萝卜属片段中重组事件的产生，这导致新的携带Rf基因的重组系和芥子油甙水平减少和更好的果荚大小(参见WO97/02737、WO98/27806、WO2005/002324、WO2005/074671和WO2011020698)。每个文献都描述了恢复雄性能育性的Rf基因和与种子中高水平芥子油甙相关联的基因或与小荚尺寸相关联的基因之间的特定重组事件的产生，并且每个事件的特征是使用特定标志物。

种子中的低芥子油甙水平和良好的果荚大小对于任何商业化植物是必需的。在Ogura恢复系中降低芥子油甙水平和改善果荚大小的一个有效方法是缩短萝卜属基因渗入。另一方面，减小萝卜属片段的大小可以导致消除感兴趣的农业特性。在萝卜属片段大小减小之后丧失的这些农业特性中的一种是抗裂荚性，这对于在收获之前减少种子损失是非常重要的并且是Ogura杂交种的主要优点。因此需要在该区域的新开发，但是由于以下原因受到严重阻碍：萝卜属片段的重组率极低，缺乏任何萝卜属基因组定位或序列，因此缺乏对该片段特异性的任何标志物，并最终由于芸薹属基因组的复杂性。

在该背景下，本发明的基本目的之一是获得克服上述所有缺点的芸薹属植物。具体而言，一个目的是获得包含缩短的萝卜属片段的芸薹属植物，所述片段含有抗裂荚性等位基因。所述芸薹属植物可以有利地用于育种以容易地将这种抗裂荚性等位基因转移至具有其他遗传背景的其他芸薹属植物。具体而言，本发明的一个目的是提供一种包含缩短的萝卜属片段芸薹属植物，所述缩短的萝卜属片段含有抗裂荚性等位基因和雄性能育性恢复Rf0基因。

本发明的另一目的是识别可以用于芸薹属育种活动的新的萝卜属抗裂荚性。

本发明的另一个目的是获得包含萝卜属抗裂荚性的芸薹属植物，以及该植物推动抗裂荚性基因渗入至具有抗裂荚性表型的芸薹属植物中的用途。

本发明的另一目的是获得所述芸薹属植物的种子、杂种植物和子代。

本发明还涉及用于识别芸薹属植物中所述抗裂荚性等位基因的存在的方法，特别地涉及与所述新的抗裂荚性相关(或不相关)的合适标志物。

概述

因此，本文公开了在其基因组中包含萝卜属基因组片段的芸薹属植物，其中所述片段赋予抗裂荚性表型POSH⁺，并且所述片段的特征是在以下标志物：SEQ ID NO 4至SEQ IDNO 18中的至少一种内缺失至少一个萝卜属SNP。

在所述芸薹属植物的具体实施方案中，通过SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20或SEQID NO 21标志物内至少一个萝卜属SNP的存在来进一步定义萝卜属基因组片段。例如，在SEQID NO:9和SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:18标志物中缺失所述萝卜属SNP。例如，在全部标志物SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:18中缺失所述萝卜属SNP。

在另一个具体的实施方案中，本文公开的芸薹属植物还包含萝卜属FRUITFULL等位基因。通常，所述萝卜属FRUITFULL等位基因包含标志物SEQ ID NO 22内的萝卜属SNP。

在具体的实施方案中，如上述公开的所述芸薹属植物还包含萝卜属片段内的雄性能育性恢复基因座Rf0。

在其他具体的实施方案中，如上述定义的所述芸薹属植物包含CMS Ogura细胞质。

本文还公开了杂交的芸薹属植物，其通过将具有如上所公开的具有赋予POSH+表型的萝卜属片段的芸薹属植物与不具有赋予POSH+表型的所述萝卜属片段的另一种芸薹属植物杂交，其中所述杂交植物包含赋予抗裂荚性表型POSH⁺的萝卜属基因组片段。

本文还公开了所述芸薹属植物的种子、或植物的部分、或其子代。

本文公开的另一方面涉及用于识别如上所述的POSH+芸薹属植物的方法，其中所述芸薹属植物通过检测在以下标志物SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 21中的至少一个内一个或多个萝卜属SNP的存在来识别，和/或通过检测在以下标志物SEQ ID NO 4至SEQ ID NO 18中的至少一个内萝卜属SNP的缺失来识别。

在这种方法的具体实施方案中，通过使用萝卜属fruitfull等位基因、更具体地萝卜属标志物SEQ ID NO 22来识别POSH+芸薹属植物。

本文公开的另一方面涉及用于检测以下标志物SEQ ID NO 4至SEQ ID NO 22中的一种或更多种内的一个或多个萝卜属SNP的新工具。

这种工具通常可以是核酸探针或引物或一组引物或其组合，例如包括任意SEQ IDNO 64至SEQ ID NO 99、SEQ ID NO 106至SEQ ID NO 108、SEQ ID NO 112至SEQ ID NO 114和SEQ ID NO 52至SEQ ID NO 54的一种或更多种引物。

本文所公开的这种芸薹属植物或种子可用于食品应用，优选用于油生产和饲料应用，优选用于饼粕生产，或育种应用，例如用作育种的亲本植株以改善芸薹属植株、系、杂交种或品种的农业价值。

还公开了一种产生POSH+芸薹属植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a.将如上所公开的本发明的具有POSH+表型的第一芸薹属植物与第二POSH^-或POSH+芸薹属植物杂交；从而获得F1杂种植物；

b.使所述F1杂种植物自交或使所述F1杂种植物与所述第二POSH^-或POSH+芸薹属植物回交；

c.从步骤b)获得的植物中选择POSH⁺芸薹属植物，任选地使用标志物SEQ ID NO19、SEQ ID NO 20或SEQ ID NO 21中的至少一种内的至少一个萝卜属SNP，以及

d.任选地，进一步选择所述POSH+芸薹属植物，其在标志物SEQ ID NO 4至SEQ IDNO 18中的至少一种内缺失至少一个萝卜属SNP。

在这种方法的具体实施方案中，第二POSH^-芸薹属植物的特征是在其基因组内不存在任何萝卜属基因组片段。

在这种方法的另一个具体实施方案中，第一植物是从保藏在NCIMB保藏中心、编号为42444的种子的代表性样品获得的植物。

还公开了一种产生如上所述的本发明的POSH+芸薹属植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a.提供第一POSH+芸薹属植物，其包含赋予所述POSH+特性的萝卜属基因渗入，所述萝卜属基因渗入在以下标志物SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:18中的一个或更多个内包含至少一个萝卜属SNP；

b.将所述第一POSH+芸薹属植物与第二POSH-或POSH+芸薹属植物杂交，由此获得F1杂种植物；

c.使所述F1杂种植物自交或使所述F1杂种植物与所述第二POSH^-或POSH+植物回交；

d.在步骤c)中获得的植物中选择POSH⁺植物，任选地选择在标志物SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20或SEQ ID NO 21中的至少一种内存在至少一个萝卜属SNP和/或任选地进一步选择标志物SEQ ID NO 4至SEQ ID NO 18中的至少一种内缺失至少一个萝卜属SNP。

在上述方法的具体实施方案中，所述第一POSH+芸薹属植物包含Rf0Ogura能育性恢复基因。

本公开还涉及通过上述产生方法可获得的或获得的芸薹属植物。

附图说明

图1示出用于标志物FRUITFULL_H1_04的非基因组的特异性设计策略。

图2示出在萝卜属序列和芸薹属序列的比对上用于标志物FRUITFULL_spe_01的基因组特异性设计策略。

发明详述

芸薹属植物

如本文所用，术语―芸薹属植物”包括芸薹属物种的植物，其包括欧洲油菜(B.napus)、芥菜(B.juncea)和芜菁(B.rapa)，优选欧洲油菜(B.napus)。

如本文所用，―裂荚”也被称为―果实或果荚开裂”，是指在种子成熟后发生在果实中的过程，其中壳瓣从中央隔膜分离，释放种子。裂开的区域(即―开裂区”)在壳瓣和胚座框(外隔膜)之间果实的整个长度上延伸。在成熟时，―开裂区”基本上是壳瓣中木质化细胞区域与胚座框之间的非木质化层细胞。破裂发生是由于开裂区中的细胞壁松动和由长角果中干燥细胞的差异化机械性质所产生的张力的组合。

通常通过模拟在自然条件下作用在果荚上的力的实验室测试来测量裂荚特性。可使用不同的方法，如Kadkol等人1984年—Evaluation of brassica accessions forresistance to shatter-Euphytica，33，61-71，Liu等人，1994—Pendulum test forevaluation of rupture strength of seed pods—Journal of texture studies，25，179-189所描述的或如本公开的实施例3中所述的方法。使用该最后的方法，在完全成熟阶段(BBCH97)收获果荚。抗裂荚性对应于用于将果荚分成两半所需的张力。

如本文所用，将具有张力值大于或等于2.3牛顿(N)的果荚的芸薹属植物定义为抗裂荚。在本公开中，它们也被定义为POSH+，其指植物基因组中存在萝卜属POSH区域。在具体的实施方案中，POSH+芸薹属植物将具有耐受性为2.3至7N(单位)的果荚。优选地，POSH+芸薹属植物将具有耐受性为2.3至5N的豆荚。更一般地，POSH+芸薹属植物可以是在其基因组内具有萝卜属基因组的长基因渗入的芸薹属植物，或者其也可以是本公开的芸薹属植物中的一种。

如本文所用，具有张力值小于2.3N的果荚的芸薹属植物被定义为非抗裂荚。具体来说，果荚张力会是大于0.6N。在本公开中，它们也被定义为POSH-，其指植物基因组中不存在萝卜属POSH+区域。更一般地，POSH-芸薹属植物可以是可育的或不可育的，例如可以包含或不包含Rf0能育性恢复基因，其也可以是不育的或非不育的，例如可以包含或不包含Ogura雄性不育细胞质，其也可以是或不是保持系植物。此外，所述POSH-芸薹属植物可以包含萝卜属基因渗入或不包含萝卜属基因渗入。

如本文所用，术语―等位基因”是指特定基因座处的基因的一种或更多种替代形式中的任一种。在二倍体(或生物体的双二倍体细胞)中，给定基因的等位基因位于染色体上的特定位置或基因座。在同源染色体对的各个染色体上存在一个等位基因。

每当提到―植物”或―植物”时，除非另有说明，应理解的是本文还涵盖植物部分(细胞、组织或器官、种荚、种子、分离的部分如根、叶、花、花粉等)、保留了亲本的区别特征(特别是与萝卜属片段相关的抗裂荚性)的植物子代，例如通过自交或杂交获得的种子，例如杂交种子(通过杂交两个近交的亲本植物获得)，杂交植物和由此衍生的植物部分。

如本文所用，―萝卜属基因组片段”是指欧洲油菜基因组中萝卜(Raphanussativus)基因组的基因渗入、优选原始基因渗入及其重组片段中的任一个，其基因渗入在许多商业化的芸薹属品种中发现，包括但不限于Albatros或Artoga品种。为了便于阅读，原始基因渗入将在下文中定义为―萝卜属基因组的长基因渗入”。

欧洲油菜基因组中的这种萝卜属基因组的长基因渗入还包括用于Ogura CMS系的能育性恢复的Rf0基因。这种萝卜属长基因渗入可以不包含任何欧洲油菜基因组片段。在图5中绘出包含萝卜属长基因渗入片段的商业化芸薹属品种的实例，如Albatros或Artoga。

本领域也已经描述了欧洲油菜基因组内萝卜属基因组的较短的基因渗入，并且所述基因渗入包含用于Ogura CMS系的能育性恢复的Rf0基因，但是发明人现在识别了这种较短的基因渗入不包含被称为POSH+的赋予抗裂荚性的基因组区域。包含这种较短的萝卜属基因渗入片段的商业化芸薹属品种的实例如图5中列出的，如Anterra，或也在专利申请WO2011/020698、WO97/02737、WO98/27806、WO2005/002324或WO2005/074671中描述。

如本文所用，术语―基因渗入”是指特定物种的并且被转移到另一种植物物种中的DNA片段，所述特定物种在当前情况下是萝卜(Raphanus sativus)物种，所述另一种植物物种在当前情况下是芸薹属，更优选是欧洲油菜。

如本文所用，―标志物”是指在植物基因组内识别的特定DNA序列，其可以用于确定植物是否从亲本植物遗传了感兴趣的特定表型或等位基因。所述标志物可以包括编码序列或非编码序列。具体来说，所述标志物可以包括在萝卜属基因组和油菜基因组之间识别的一个或多个单核苷酸多态性或SNP。其也可以识别序列的缺失/插入(插入缺失标记)多态性。在本发明中，由于不考虑芜菁基因组，因此欧洲油菜基因组也会被识别为甘蓝基因组。

如本文所用，―萝卜属SNP”对应于在相比甘蓝基因组的多态性位置处存在的核苷酸。

本文公开了标志物内的萝卜属SNP(通过它们的核苷酸序列来识别)，用于确定在芸薹属植物中萝卜属长基因渗入的任何重组片段是否进一步保留赋予抗裂荚性的POSH+等位基因。因此，本公开的芸薹属植物包含所述长基因渗入的重组片段，其有利地比长基因渗入短，同时至少保留POSH+等位基因。

更具体地，在所述萝卜属长基因渗入中发现的某些萝卜属SNP已被表征为不与POSH+等位基因连锁。这种SNP包含于任意以下15个标志物：SEQ ID NO 4至SEQ ID NO 18之中。

因此，根据本公开的芸薹属植物在其基因组中包含萝卜属基因组片段，其中所述片段赋予抗裂荚性表型(POSH+)，并且所述片段的特征是在以下标志物SEQ ID NO 4至SEQ IDNO 18中的至少一种内缺失至少一个萝卜属SNP。

对于这些标志物中的每一种，已经识别了萝卜属SNP(见表2)。优选地，在所述芸薹属植物中缺失这些SNP中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或全部。

其他标志物、更具体地萝卜属SNP已经在所述萝卜属长基因渗入中被发现，并且被表征为与POSH+等位基因连锁。这样的萝卜属SNP在任意以下三个序列标志物：SEQ ID NO 19，SEQ ID NO 20或SEQ ID NO 21中被识别。

在具体的实施方案中，所述芸薹属植物在其基因组内包含萝卜属基因组片段，但不包含含有标志物：SEQ ID NO 12至SEQ ID NO 18和SEQ ID NO 9内的萝卜属SNP的区域。

在具体的实施方案中，所述芸薹属植物在其基因组内包含萝卜属基因组片段，但不包含含有标志物：SEQ ID NO 4至SEQ ID NO 18内的萝卜属SNP的区域。

在可以与之前的实施方案组合的另一个具体实施方案中，所述芸薹属植物至少包含在以下标志物：SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20或SEQ ID NO 21内包含1个、2个或3个萝卜属SNP的萝卜属基因组片段的区域，所述SNP在表1中识别。

或者，在另一个具体的实施方案中，所述芸薹属植物至少包含如在以下标志物：SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:31中所识别的包含萝卜属FRUITFULL等位基因的萝卜属基因组片段的区域。

在另一个具体的实施方案中，芸薹属植物是非转基因植物。如本文使用的转基因或―遗传修饰的生物体”(GMO)是其遗传物质已经使用通常称为―重组DNA技术”的技术改变的生物体。重组DNA技术是体外地(例如在试管中)将来自不同来源的DNA分子组合成一个分子的能力。该术语通常不包括其遗传组成已通过常规杂交育种而改变或通过―诱变”育种而改变的生物体。因此，―非转基因的”是指来源于非―转基因的”或不是―遗传修饰的生物体”的植物的植物和食品。

本发明还涉及可以通过将上面获得的芸薹属植物与第二植物杂交而产生的杂种芸薹属植物。例如，可以通过杂交如本文所公开的具有赋予POSH+表型的萝卜属片段的芸薹属植物和不具有赋予POSH+表型的所述萝卜属片段的另一种芸薹属植物而获得杂种芸薹属植物，其中所述杂种植物包含赋予抗裂荚性表型POSH⁺的萝卜属基因组片段。

用于产生杂种植物的方法是本领域熟知的。通常，杂种植物通过防止雌性亲本植物的自花授粉而产生，允许来自雄性亲本植物的花粉以使这种雌性亲本植物受精，使得在雌性植物上形成F1杂交种子。通过在花发育的早期阶段将花去除，可以防止自花授粉。或者，使用雄性不育的形式，可以防止雌性亲本植物上的花粉形成。杂种植物可以通过本领域技术人员熟知的不同遗传系获得，例如CMS系，如Ogura系或Kosena系(参见Yamagashi和Bhat，2014，Breeding Science，64：38-47)，或MSL(雄性不育Lembke)系(Pinochet等人，2000OCL-Leagineux Corps Gras Lipides 7：11-16)。优选地，本发明的杂种植物用Ogura系获得。

因此，本文还公开了根据本公开开发的芸薹属植物或芸薹属系，以获得这种杂种植物。这样的植物或系通常包含实施相应的杂交系所必需的遗传和/或细胞质元件。优选地，植物或系包含Ogura系的能育性恢复基因Rf0和/或细胞质。

产生具有抗裂荚性表型(POSH+)的芸薹属植物的方法

本公开还涉及产生如之前部分所述的具有抗裂荚性表型(POSH+)的芸薹属植物的新方法。

在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：

a.提供第一POSH+芸薹属植物，其包含赋予抗裂荚性POSH⁺的萝卜属基因渗入；所述萝卜属基因渗入在以下标志物：SEQ ID NO 4至SEQ ID NO 18中的一个或更多个内包含至少一个萝卜属SNP；

b.将所述第一POSH+芸薹属植物与所述第二POSH^-或POSH+芸薹属植物杂交，由此获得F1杂种植物；

c.使所述F1杂种植物自交或使所述F1杂种植物与第二POSH^-或POSH+植物回交；

d.在步骤c)中获得的植物中选择POSH⁺植物，任选地通过选择在标志物SEQ ID NO19、SEQ ID NO 20或SEQ ID NO 21中的至少一种内存在至少一个萝卜属SNP和/或任选地进一步选择标志物SEQ ID NO 4至SEQ ID NO 18中的至少一种内缺失至少一个萝卜属SNP。

有利地，可以使用包含长基因渗入或短基因渗入的已知品种中的一种作为第一芸薹属植物。在具体的实施方案中，在上述方法中使用的第二(反复使用的)芸薹属是特征是其基因组内不存在任何萝卜属基因组片段的芸薹属植物，即其中尚未被萝卜属基因组片段基因渗入的植物。或者，所述第二芸薹属植物至少不含有用于Ogura CMS系的能育性恢复的Rf基因，并且不包含抗裂荚性区域(POSH^-)。该第二芸薹属植物可以是例如任何野生型非恢复系和POSH^-欧洲油菜植物。或者，所述第二植物包含短基因渗入，其包括Rf0Ogura能育性恢复基因。在另一个具体的实施方案中，第一芸薹属植物还包含Rf0Ogura能育性恢复基因。

在步骤c中，F1杂种植物与反复使用的第二植物的回交旨在降低反复出现植物的基因组百分比并降低亲本植物的基因组(包含萝卜属基因渗入)的百分比。由于上述方法中公开的选择标志物，能够在选择过程中选择/保留POSH+表型。

根据布达佩斯条约，申请人已经将所公开的具有赋予POSH+特性的所述萝卜属基因渗入的芸薹属植物的种子样品在NCIMB保藏中心以编号为42444保藏。

本公开进一步包括并且提供了识别如在前文部分中公开的POSH+芸薹属植物的方法，以及更一般地选择或育种存在或不存在包含在萝卜属基因渗入中的POSH+等位基因的芸薹属植物的方法，例如，作为分子导向的程序。这样的识别、选择或育种芸薹属植物的方法包括获得一种或更多种芸薹属植物并评估它们的DNA以确定包含在萝卜属基因渗入中的POSH+等位基因的存在或不存在，和/或其他等位基因或标志物、例如与POSH+等位基因不相关的萝卜属基因渗入的其他标志物的存在或不存在。例如，可以使用这样的方法来确定由杂交产生的哪个子代具有POSH+等位基因，并因此指导制备具有POSH+等位基因与存在或不存在其他期望的特性的组合的植物。

在具体的实施方案中，确定POSH+等位基因或其他标志物的存在包括确定与POSH+等位基因相关的萝卜属基因渗入的标志物的存在，和/或与POSH+等位基因不相关的萝卜属基因渗入的标志物的缺失。因此，可以通过评估用于POSH+的出现在表1中的一个或更多个个别SNP的存在，和/或用于与POSH+等位基因不相关的萝卜属片段的出现在表2中的一个或更多个个别SNP的缺失来识别或选择植物。

在具体的实施方案中，可以进一步识别Rf0基因座。

表1：与POSH+等位基因相关的萝卜属SNP(以粗体字突出一个识别的SNP)

表2：与萝卜属片段相关但与POSH+等位基因不相关的萝卜属SNP

已经以粗体来显示表1和表2中的每个上述标志物序列内的特定萝卜属SNP。当然，本领域技术人员可以使用表1和表2中所示的上述标志物内识别的其他萝卜属SNP。通过上述序列中的IUPAC码来表明这些SNP中的一些。

更一般地，本文公开了用于检测植物中萝卜属基因渗入的POSH+等位基因的特异性工具，所述植物更具体地为芸薹属植物。

所述工具因此包括适用于检测在以下标志物：SEQ ID NO 4至SEQ ID NO22中的一个或更多个内以下萝卜属SNP标志物的任意工具。

可以使用本领域中任意已知的方法来评估SNP的存在或不存在。一些合适的方法包括但不限于测序、杂交分析、聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、通过序列的基因分型(GBS)、或其组合。

基于PCR的不同方法对于本领域技术人员是可用的。本领域技术人员可以使用RT-PCR方法或来自KBioscience的Kaspar方法(LGC集团，特丁顿，米德尔塞克斯，英国)。

KASP^TM基因分型系统使用三种靶特异性引物：两种引物，其中每一种对SNP(单核苷酸多态性)的每种等位基因形式都是特异性的，以及另一种引物实现反向扩增，其是两种等位基因形式共享的。每个靶向特异性引物也存在与两个FRET探针中的一个对应的尾部序列：一个用染料标志物，另一个用染料标志物。

进行连续的PCR反应，探针扩增的最后一次出现。所发射的荧光的性质被用于从所研究的DNA中识别存在于混合物中的等位基因形式。

表3中识别的引物特别适用于KASP^TM基因分型系统。当然，本领域技术人员可以使用表3中识别的引物的变体引物或核酸探针，所述变体引物或核酸探针与表3中识别出的引物中的任一种、或与由表3中识别出的相应引物组扩增的DNA基因组片段具有至少90％、优选95％的序列一致性。

本文所用的序列一致性的百分比是通过计算比对核酸序列中匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比对核苷酸的总数并乘以100来确定。匹配的位置是指在比对核酸序列中的相同位置出现相同核苷酸的位置。例如，可以使用BLASTN算法(www.ncbi.nlm.nih.gov)使用BLAST 2序列(B12seq)来比对核酸序列。

如本文所用，引物包括能够在依赖模板的过程(例如PCR)中引发新生核酸的合成的任何核酸。通常，引物是10到30个核苷酸的寡核苷酸，但是可以使用更长的序列。尽管单链形式是优选的，但是可以以双链形式提供引物。或者，可以使用核酸探针。核酸探针包括至少30个核苷酸的任何核酸，其可以在标准严格条件下与定义的核酸特异性杂交。如本文所用的标准严格条件是指例如Sambrook等人1989中描述的杂交条件，其可以包括1)将植物基因组DNA片段或DNA文库固定在滤膜上，2)在6×SSC 5×Denhardt试剂、0.5％SDS和20mg/ml变性载体DNA中，将滤膜在65℃下预杂交1小时至2小时，3)加入探针(标记的)，4)培育16小时至24小时，5)在68℃下，用6×SSC、0.1％SDS洗涤滤膜一次30分钟，6)在68℃下，用2×SSC、0.1％SDS洗涤滤膜三次(用30ml洗涤两次30分钟，用500ml洗涤一次10分钟)。

在具体的实施方案中，用于检测本公开的SNP标志物的所述引物如下表中所列：

表3：用于检测本发明的萝卜属SNP标志物的引物(如引物名称所示)

本公开的芸薹属植物的用途

本公开的芸薹属植物可以用于育种应用。如本文所用，育种应用包括谱系育种以改善植物、系、杂种或品种的农业价值。在具体的实施方案中，其涉及回交活动以便在感兴趣的基因组区域中产生新的重组系或使不包含该区域的另一个植物基因渗入感兴趣区域。通常，在本公开中，芸薹属植物被用于在另一个植物中基因渗入赋予POSH+表型的萝卜属区域。

因此，其还公开了一种产生POSH+芸薹属植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a.将如上文部分所述的第一芸薹属植物与第二POSH^-或POSH+芸薹属植物杂交；从而获得F1杂种植物；

b.使所述F1杂种植物自交或使所述F1杂种植物与所述第二POSH^-或POSH⁺芸薹属植物回交；

d.任选地，进一步选择所述POSH+芸薹属植物，其在标志物SEQ ID NO 4至SEQ IDNO 18中的至少一种中缺失至少一个萝卜属SNP。

在具体的实施方案中，上述方法中使用的第一植物是从如2015年7月27日保藏在NCIMB保藏中心、登记号为42444的种子的代表性样品获得的植物，其如下述实施例5中描述的从欧洲油菜R42141F获得。

通过所公开的用于产生具有POSH+表型的芸薹属植物的方法获得或可以获得的任何芸薹属植物也是本发明的一部分。

本文公开的芸薹属植物还对于例如产生卡诺拉油是有用的。从本文所述的植物收获的种子可以用于生产粗制卡诺拉油或精炼的、漂白的、除臭的(RBD)卡诺拉油。可以使用本领域已知的技术压碎所收获的卡诺拉种子。种子可以通过用水喷洒种子来调和，以将水分提高至例如约8.5％。经调和的种子可以使用具有例如0.23mm至0.27mm的间隙设置的光滑辊进行剥落。可以对片施加热量以使酶失活，进一步促进细胞破裂，使油滴合并，或使蛋白质颗粒聚集以便于提取过程。通常，通过螺旋压榨机从加热的卡诺拉片中移除油，以从片中压榨出大部分油。得到的压榨饼含有一些残油。

由压榨操作产生的粗榨油通常经过具有槽线引流顶部的沉降池，以去除在螺杆操作中随油压榨出的固体。澄清的油可以经过板框式过滤器以去除细小的固体颗粒。由螺旋压榨操作产生的卡诺拉压榨饼可以用商用的正己烷萃取。将从萃取过程中回收的卡诺拉油与来自螺旋压榨操作的澄清油合并，得到共混的粗榨油。

芸薹属植物或其油作为人或动物的食品组合物也是有用的。油也可以用于生物燃料。

实施例

实施例1：新的重组芸薹属植物的生成

欧洲油菜是相对年轻的作物，并且仍然显示出野生物种的一些特征。这些特征中的一种是在收获期裂荚的趋势。已经显示出，一些欧洲油菜Ogura杂种显示出更好的抗裂荚性。为了表征该特征并且获得新的重组系，2011年1月完成了204次杂交。这里，具有原始的萝卜属基因渗入并且具有抗裂荚性的Ogura雄性及杂种与携带缩短的萝卜属基因渗入的Ogura雄性杂交，或与不携带萝卜属基因渗入的自交系杂交。此外，具有缩短的萝卜属基因渗入的Ogura雄性已经与不携带萝卜属基因渗入的自交系杂交。使用位于C09上并侧翼萝卜属基因渗入的SNP标志物对在2011年11月得到的F2植物进行基因分型。一个SNP标志物在端粒区上侧翼萝卜属基因渗入，四个其他SNP标志物在着丝粒区上侧翼萝卜属基因渗入。

因此，在各个杂交的亲本中不存在的端粒和着丝粒SNP标志物的所有标志物特征组合表明了这些标志物之间的并因此可能在位于这些标志物之间的萝卜属基因渗入内的重组。通过该方法，从11770株F2植物中识别62株潜在的重组植物。这种筛选在2013、2014和2015年被重复，来自2012年的全部62株潜在重组的自交种子播种于F3，以验证来自F2植物的结果。用侧翼基因渗入的端粒和着丝粒SNP标志物和位于萝卜属基因渗入的SNP标志物BnRfo5(描述为SEQ ID NO 1)和SSR标志物C08和Boljon(描述为SEQ ID NO:2)再次分析F3植物。重组被验证的F3系被持续到F4。

实施例2：新标志物的开发

用新重组植物的分子标志物表征是非常困难的。事实上，一方面，基因渗入已经取代了部分欧洲油菜基因组，并且找到在萝卜属和欧洲油菜物种两者中起作用的标志物是困难的。此外，由于在该区域的低水平重组率，在基于连锁的基因渗入上定位标志物的位置是不可能的。因此，描述基因渗入的可能性是非常有限的。为了解决发现SNP的问题，对植物组织的转录组使用了基于下一代测序(NGS)的方法。

具体来说，在出苗期4周后取样118个固定恢复系和27个固定雌性系，并冲洗冷冻以准备RNA提取。在Qubit荧光计(Invitrogen)上使用1μl的每种RNA样品来测量每种组合样品的RNA浓度。根据制造商的方案使用当前版本的Illumina mRNA-Seq试剂盒将全部RNA转化为适合高通量DNA测序的模板分子文库，用于随后的簇生成。使用5μg的全部RNA来制备库，通过在Agilent DNA 1000LabChip(Agilent Technology 2100Bioanalyzer)上运行1μl文库进行定量和质量评估。将这些文库按每泳道2次多重测序，按照生产商的说明书加载到Illumina HiSeq2000仪器上并运行100个循环(单端读数)以产生每个样品至少2.0Gb的序列。

为了开发对于识别新重组系有用的本发明的标志物，使用MAQ(Li等人，GenomeResearch 18：1851-1858，2008)和Perl脚本(Trick等人，Plant Biotech J.7：334，2009；Bancroft等人，2011)进行跨系组的初始序列比对和SNP发现。

跨越获得序列数据的143个OSR系，平均而言，将100个碱基的1.59×107个序列读数(1.59Gb序列数据)与50.4Mb的参考序列比对，得到31.5倍的覆盖率。因此，开发了包含84022个简单SNP(在除去次要等位基因频率低于5％的那些之后28402个)和119523个半SNP(在除去次要等位基因频率低于5％的那些之后80100个)的标志物数据集。简单SNP的优势在于这些标志物可以比半-SNP标志物更可靠地分配给油料油菜的两个基因组中的一个。为了识别与雄性亲本(MP)或雌性亲本(FP)的系指定相关的SNP标志物，进行了分析。确定了169个标志物，这些标记物在类型之间完全不同。这169个标志物全部共享等位基因的特征，所述等位基因包含MP系的歧义编码(即指示2个碱基的存在)和FP系分辨的碱基，与添加另外的基因组区段(即与来自萝卜的CMS恢复基因座相关)一致。这些标志物主要聚集在A9和C9连锁群上的两对同源区域中，少数在与这些平行同源的区域中。

发明人开发了大约550种对萝卜属基因渗入具有特异性的新SNP标志物。通过将这些SNP与甘蓝基因组进行基本局部比对搜索(BLAST)，可以得出结论，萝卜属基因渗入的特异性标志物覆盖大约24Mbp(萝卜属基因渗入的长度)，其约为染色体C09的50％。

此外，已经识别了在原始欧洲油菜中有功能但在Ogura恢复系中不存在的大量标志物。通过将这些标志物与甘蓝基因组进行基本局部比对搜索(BLAST)，发现这些标志物再次覆盖了约24Mbp(缺失欧洲油菜染色体片断)。这也由Illumina 50k芯片阵列得到的结果而验证，其中在覆盖约22Mbp片段的恢复材料中也不存在标志物。

这个结果清楚地表明，当生成Ogura基因渗入时，染色体C09的一条臂被萝卜属染色体的一条臂替代。

实施例3：新重组系的表型表征

果荚的稳定性可以通过由LFA-Mecklenburg-Vorpommern研究所的Schulz博士开发的测试来测量，如2013年3月在Abschlussbericht 2013，Forschungsnummer1/29，Verfahrensoptimierung zur Verbesserung der Wirtschaftlichkeit中所描述的(http://www.landwirtschaft-mv.de/cms2/LFA_prod/LFA/content/de/Fachinformati onen/Acker-_und_Pflanzenbau/Winterraps/Produktionstechnik/AB_Platzfestigkeit_ 2013/Online_Forschungsbericht_Platzfestigkeit_1_29.pdf)。果荚从完全成熟(BBCH97)的主茎的中部取样。取样后，果荚在室温下在干燥条件下保持至少21天，以确保所有果荚完全成熟。在测试中，抗裂荚性的测量参数是将果荚撕成两半所测量的张力。为了测量，使用了Sauter Digital Force Gauge FK 50。已经测量了每种基因型的20个单独果荚，并计算了20个测量值的平均值。

表4和表5给出了用不同系或杂种进行的这些测量结果的实例。这些表格清楚地表明，增加的抗裂荚性限于一些Ogura恢复系和具有来自萝卜的长基因渗入的杂种，并且可以得出结论，增加的抗裂荚性在萝卜属基因渗入上被编码。

表4：来自2013年收获的基因型组的荚稳定性和基因型谱图的结果。给定的等位基因代表了来自萝卜属和甘蓝基因组的等位基因的集合，不考虑来自芜菁基因组的等位基因。黑色表示萝卜属基因组的存在，白色表示甘蓝基因组的存在，灰色表示两个基因组的存在。

表5：来自2014年收获的基因型组的荚稳定性和基因型谱图的结果。给定的等位基因代表了来自萝卜属和甘蓝基因组的等位基因的集合，不考虑来自芜菁基因组的等位基因。黑色表示萝卜属基因组的存在，白色表示甘蓝基因组的存在，灰色表示两个基因组的存在。

实施例3：由萝卜属提供的抗裂荚性是部分显性的

Ogura恢复系被用于产生具有不育CMS系的杂种。在所得到的杂种中，萝卜属基因渗入处于杂合子状态，因此这些杂种适合于测试抗裂荚性是遗传显性的、隐性的还是介于中间的。

图5给出了不同Ogura杂种的测量结果的实例。黑色表示萝卜属基因组的存在，白色表示甘蓝基因组的存在，灰色表示两个基因组的存在。对于这些测量，测量了共100个果荚，计算这100个测量的平均值。该表格清楚地表明，抗裂荚性从长基因渗入Ogura恢复系到各个杂种(基因型1到7和11)是至少部分显性的遗传。基因型7到10也是Ogura杂种，但是对于这些，各自的恢复系是缺少来自萝卜属基因渗入的抗裂荚区域的短基因渗入。因此，这些杂种不显示抗裂荚性。

实施例4：与POSH基因座强相关的其他标志物的识别：

发明人已经示出了，出人意料地，FRUITFULL基因座位于萝卜属基因渗入上，因为从如萝卜属基因组上所识别的FRUITFULL基因序列开发的所有标志物与上述POSH基因座标志物强相关(图5)。

具体而言，发明人还识别了萝卜属FRUITFUL基因的预测的开放阅读框(SEQ ID NO:31)和如预测的相应的蛋白质(SEQ ID NO:32)或相应的预测的cDNA(SEQ ID NO:33)。这样的序列可以进一步有利地用于识别与芸薹属植物中的POSH+基因座相关的萝卜属SNP。

识别了两种不同类型的标志物。第一类是非基因组特异性的。它来源于具有欧洲油菜和萝卜属之间的SNP以及与甘蓝、芜菁和萝卜共享的共同标志物的经典设计。因此，一个等位基因会扩增芜菁和甘蓝，另一个等位基因是对萝卜基因组特异性的。在这种类型的设计中，A基因组总是被扩增，因此产生降低观测分辨率的背景信号。这种标志物不允许我们区分AA/CC和

第二种类型的标志物是基因组特异性的。因此，没有'A'芜菁基因组的扩增。在欧洲油菜和萝卜属之间的SNP和与甘蓝和萝卜属共享的HSV(同源序列变异)之间实现设计。

用于识别非基因组特异性标志物FRUITFULL_H1_04的引物序列的实例是FRUITFULL_H1_04_F_A1(SEQ ID NO 40)、FRUITFULL_H1_04_F_A2(SEQID NO 41)和(FRUITFULL_H1_04_F_C)SEQIDNO 42，并且用于识别基因组特异性标志物FRUITFULL_spe_01的引物是FRUITFULL_spe_01_R_A1(SEQ ID NO 52)、FRUITFULL_spe_01_R_A2SEQIDN053)和FRUITFULL_spe_01_R_C(SEQIDN0 54)。

如表5所示，这些标志物已被用于在育种计划中识别和追踪POSH区域。

实施例5：具有缩短的萝卜属基因渗入的新抗裂荚性欧洲油菜系的开发

对实施例1中获得的系的F4子代进行抗裂荚性的系统性表型分型，并用实施例3中开发的共显性SNP标志物进行筛选。

下表6显示了用于分析所有产生的新重组植物的SNP共显性标志物：

在上述标志物序列的括号内显示SNP，第一个核苷酸代表萝卜属SNP，第二个核苷酸代表甘蓝SNP。

这种系统的评分结果是识别了一种具有缩短的萝卜属基因渗入的重组植物，其中裂荚编码区仍然存在。该植物的F5子代是具有谱系(FOCTD909×NSL09/196)的基因型R42141F。这种重组系具有良好的抗裂荚性，并具有良好的豆荚大小。

图6显示了与其他系和杂种相比，F5子代的表型分型和基因分型的结果。Amalie和Arabella是非恢复系。R7011-AB是具有包含Rf0基因(SEQ ID NO:1中所述的BnRF0标志物)和POSH区域标志物的长基因渗入的恢复系。Arsenal是具有包含Rf0基因(SEQ ID NO:1中所述的BnRF0标志物)和POSH区域标志物的长基因渗入的杂种品种。RD153-101是专利申请WO2011020698中描述的没有抗裂荚性的恢复系，其具有短基因渗入。R101540103-AACCBA是没有抗裂荚性的恢复系，其具有短基因渗入。

该结果显示POSH区域位于与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的POSH基因座标志物强相关的区域中。

图6中显示了抗裂荚的重组系R51542141F(也称为R42141F)和一组参考基因型的果荚稳定性和基因型谱的结果。给定的等位基因代表了来自萝卜属和甘蓝基因组的等位基因，不考虑来自芜菁基因组的等位基因。黑色表示萝卜属基因组的存在，白色表示甘蓝基因组的存在，灰色表示两个基因组的存在。

实施例6：识别无Rf0萝卜属区域的新抗裂荚的欧洲油菜系和获得抗裂荚的雌性和非Ogura自交系：

为了生成携带较短萝卜属基因渗入的新重组恢复系，在2012年1月已经完成了128次杂交。这里，具有原始的萝卜属长基因渗入并且具有抗裂荚性POSH+的Ogura雄性及杂种与POSH-植株杂交、与携带缩短的萝卜属基因渗入的Ogura雄性杂交、或与不携带萝卜属基因组片段基因渗入的自交系杂交。在2012年11月，使用位于C09上的4个SNP标志物对来自这些杂交的6421株F2植物进行了基因分型，如―实施例1”中所述。将所有353个潜在重组体的自交种子播种于F3以验证来自F2植物的结果。在2013年11月用实施例3中开发的一组共显性SNP标志物分析了F3植物。

使用相同的SNP共显性标志物分析于2013年11月播种于F3所产生的所有新重组植物(参见前表7)。

在这些F3植物中，识别了编码为FR-13C-3-03137-2和FR-13C-3-03137-5的植物。选择这些植物是因为它们仅携带与抗裂荚性有关的标志物SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的萝卜属的有利等位基因，而没有任何其他萝卜属等位基因的基因渗入。由于这些植物在不育的Ogura细胞质中，但不含有Rf0基因，因此它们是不育的，并因此不能自交。为了保持这种重组事件，选择了具有缩短的萝卜属基因渗入但携带有Rf0基因的其他4种重组可育系与不育的抗裂荚性重组体杂交(图7中给出了基因型谱，其呈现了F3重组系在萝卜属基因渗入上的分子表征。黑色表示萝卜属基因组的存在，白色表示甘蓝基因组的存在，灰色表示两个基因组的存在)。

由此产生的F1是可育的，携带有缩短的萝卜属片段和抗裂荚性。通过这个F1，一方面可以通过近交和辅助选择的标志物来开发具有缩短的萝卜属基因渗入并携带有抗裂荚性的自交系，另一方面与作为雄性亲本的F1杂交，从而将抗裂荚性转移到任何其他芸薹属植物。在这方面，特别关注的是将F1杂交到欧洲油菜植物得到可育的细胞质，以便将不育Ogura细胞质外的抗裂荚性转移并且开发具有抗裂荚性但没有Rf0基因的自交系。这些自交系可以随后用作其他杂交体系(例如GMS)中的雄性/雌性亲本或在Ogura杂交体系中作为雌性亲本进行CMS-转换之后。

实施例7：萝卜属基因渗入片段减少和果荚尺寸增加之间的关系

已经测量了携带POSH特性的不同系或杂种的果荚尺寸。在田间种植植物，并且在完全成熟时将果荚取样。果荚尺寸的测量对应于不包括果喙和花梗的果荚的上半部分的尺寸(cm)。结果显示在图3A和3B中。

R51542141F是重组系，R4513-CA是具有长基因渗入的系。Adriana是不包含萝卜属基因组基因渗入的对照非恢复系杂种。

Arsenal是包含Rf0基因和POSH区域标志物的长基因渗入的杂种品种。RD153-101是具有短基因渗入的恢复系，其不具有抗裂荚性。

结果表明，萝卜属基因渗入片段减少与果荚尺寸增加有相关性。

实施例8：在双杂种群体中分离POSH

使包含短基因渗入的杂种与包含长基因渗入的杂种杂交。产生分离的DH-群体，在田间种植植物。根据实施例3测量果荚的稳定性。

图4A至图4H中的结果显示了双杂种群体中POSH的分离。

结果表明，携带以黑框等位基因为代表的POSH标志物的长基因渗入与果荚的高水平稳定性之间存在显著的相关性。

序列表

<110> 利马格兰集团

<120> 具有抗裂荚性的芸薹属植物

<130> LVH 003 EP

<160> 125

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 100

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 1

ctctccataa gaagatggaa atgcggcgca ttccatgtga tgcatacagc ttcaatattc 60

tgataaagtg tttctgcagc tgctctaagc tgccctttgc 100

<210> 2

<211> 959

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 2

gatccgattc ttctcctgtt gagatcagct ccaaacatca aacaacttgt acacaaatat 60

ctttacttgc taaatggaac atgacaagag atagaaaatc ttgctcatag tattgtacaa 120

gggataacag tgtagaaaac aaaccgtctg taagattttc tccctgatcc tctcacttaa 180

ccagtaggcg tttttcacat tgaagcgcat atctactttg gtattcactg aataaaaaaa 240

gaaggctggt aacatgtgga ggatatacaa gcattgatac accaagtagt cacaaactac 300

attataaagg tcagaccttt gttcacattc tggcctccag gatcaccgct tctagcaaag 360

ttaagcgtaa catggtctgc acgtatacaa atgaaaatgt ttctatcaaa atcactataa 420

aatagagctc tataacattg tcgatacata gtttcactaa ctctgcaagt actaaacaca 480

tatacaaaca aaactatgcg aacagatcaa aactactaca gaacacagtt ctatgacact 540

gtcgatagta acatcctctg caagtaccaa agagatagca aatgaaacta tgtaaacaaa 600

tcaaaattct aaatttctcc atcacaagga cctacagaat agagttatca taacattttc 660

tgtaaatatt tccatcaaaa tgactagaga acagagttct tataacatta tctgtaaatg 720

ttccaacaaa accactacat agcagagttc ttataacatt gtctgtaaat gtccaatcaa 780

aaccactaca gaacaaagct cctataacat tgtttataca aagtttcact aaatctacaa 840

actttccccg taaatgagct taatatcacc caaagatgtt tcaatcagat aaagagtaac 900

gacatcgttt tgagattaga acaaactgaa acttacgtag agtgatttga ggagtaggc 959

<210> 3

<211> 603

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 3

caggttctga acctttctct cccttgcttt tgggcgatga ttcgattctt ctgggcttgc 60

ttgtggccac ttaagaaaga gttctgcctt ctagccaagc ctttgagttt gagaccaagt 120

aaagcttccc ggcagtcaac caagaaagac tctttctccc ctactgaaga aatggaagtc 180

agatcttttt ccataccata acgtatatag aatcgatttt cttttctgat cgctagcctg 240

ccgggccgcc cccgcgatca aactatcaat ctcataagag aagaaatctc tatgccccct 300

ttgttcttgg ttttctccca tgcttttgtt ggtcaacaac caaccacaac tttctatagt 360

tcttcactac tcctagaggc ttgacggagt gaagctgtct ggagggaatc attttgttga 420

aatcaattaa tctaatcatg cctcaactgg ataaattcac ttatttttca caattcttct 480

ggttatgcct tttcttcttt actttctata ttttcatatg caatgatgga gatggagtac 540

ttgggatcag cagaattcta aaactacgga accaactgct ttcacaccgg gggaagacca 600

tcc 603

<210> 4

<211> 201

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 4

tcagactcat ccagataaag aagaacaaaa tctcatcttc tgtgcactct atggtacaaa 60

ctccttcagg tacagcwcga acgcacaggt ttgccactga aacagccgag ctccctgcgc 120

aagaaggaga aagagtgaca attgcatctg ctgctccatc agatgtttac agacaagtgg 180

gacctttcaa gtttaccccc a 201

<210> 5

<211> 201

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 5

taaagtatac tcgaaatggc ccaaatctca ctctttcaag atcggcgact ccctcttgtt 60

cttgtaccca ccaagcgaag attcaatgat tcaagtgaca ccttccaact tcaagagctg 120

caacaccaaa gatccgatct tgtacatgaa cgacggcaac tctctcttca acctcaccca 180

aaacggaacc ttttacttca c 201

<210> 6

<211> 201

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 6

gaagtgttct ggacacagct gagaaagccc acgaagggga tatcacatgc atttcgtggg 60

cacccaaggc aatgacagtt ggggagagaa aggcgcaggt attagcgaca gcaggggttg 120

acaaraaagt gaagctgtgg gaagctccaa mgttgcagtc tgtgtagact tgctactgct 180

gctgcaatac aaagaaagtc t 201

<210> 7

<211> 201

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 7

ctagtttcag ggaatggttt rcagaaggtt gaattgatga agacgagagc ttcttcatca 60

gacgagacct caacgtccat tgacaccaac gaactcttta cwgacttgaa ggaaaagtgg 120

gatggtcttg agaacaarac racygtggtt atctayggag gaggagccat tgtwgctgtt 180

tggttatctt ccattcttgt t 201

<210> 8

<211> 201

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 8

tcaagaagac ttacccaaca gtccagctta cagcatggac atttttcccc attgtgggat 60

gggtaaayta caagtatgtg ccactgcact tccgggtcat cttgcacagc ctcgtygcat 120

tcttctgggg aatcttcctg accctgcgag caaggtcaat gacactagct ttggcaaagg 180

ctaagtgatc agggaaacac a 201

<210> 9

<211> 201

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 9

agtatgaaga agagggygag tatgagagag gtgggtcgaa gcagaggaga ggagagtcag 60

aggaaggkca tggrtactac gaagggcgta gtagacgttc aagccattat gagcgtgagg 120

aggaacaagg aggtgascaa gaccgktacg aygaccgtta tgggagagtg gaggaagaag 180

aataccgtta tgatgatcgt g 201

<210> 10

<211> 201

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 10

ctcctcckcc gaatccgttt ggggaygcgt tcaaggggcc mgagatgtgg gcsaagctga 60

cggcggatcc gtcgacgagg gggttcttga agcagcctga cttcgtcaac atgatgcagg 120

agatccagag gaaccctagc agtctcaatc tctacttgaa ggaccagagg gtgatgcagt 180

ctctyggggt tttgttgaat g 201

<210> 11

<211> 201

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 11

tcaaggactt tggtgatagt attccaggac atggtggaat cactgataga atggactgcc 60

agatggtaat ggcagtattt gcttacatat atctccagtc ctttatcgtc tcccaaagcg 120

tttcggttga caaaatcctg gaccagatat tgacgaacct tagcttcgag gaacaacaag 180

ctctcttcac tagattaggg c 201

<210> 12

<211> 201

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 12

ttggccctga aggttctaca gtgcttcatt atagacaatc ttcaacttct gcttctattg 60

ggaaaatcag ttgcaaggtg tactattgca aagaagacga agtttgcttg taccagtctg 120

ttcagtttga ggtacctttc aagrtggaat cagaakcrtc tycttcycag gtgatcgcat 180

tcaccgttaa acctagagca t 201

<210> 13

<211> 201

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 13

ctaaggcaat gaagtacctg tcaataggtg aagaagacga tatatcatgg tcacttatca 60

aagctgcctt ctcttcagta gctcaaaccg caatcatacc aatgcaagac attctcggwc 120

tyggaagttc tgccaggatg aacactccag ccactgaggt ggggaactgg ggttggagga 180

ttccgagttc aacgaacttt g 201

<210> 14

<211> 193

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 14

cttttgctgg ttttggtgaa atagtatctg tcaagatacc agttgggaaa ggatgtggat 60

tcattcagtt tgtcaacaga gaaaacgcag aggaggcttt agagaaacta aatggttctg 120

taattggaaa acaaaccgtt cgcctttcmt ggggtcgtaa ycaaggcaay aaacagcctc 180

gaggtgggta tgg 193

<210> 15

<211> 201

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 15

gtccatgttt gatgcaattg tatcagcaga cgcatttgag aacttgaaac cagctccaga 60

tattttcttg gctgcttcca akatcttggg tgtgcccaca tgcgagtgta ttgttattga 120

agatgcactt gctggagtcc aggctgctca agctgcaaac atgagatgca tagctgtgaa 180

aactacttta tctgaagcaa t 201

<210> 16

<211> 201

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 16

actttgttga yagycttacm ggagtaggac ttgttgatca aatgggaaac ttcttctgca 60

aaacgctctt gtttgtggct gtagctggag ttcttttcat tcgcaagaac gaagatttag 120

ataagctcaa gggtctrwty gaagagacga cgytrtatga caagcartgg caagcggctt 180

ggaaagagcc ggaaataatc a 201

<210> 17

<211> 201

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 17

cacaacatgc cggtgattgg tatccagctg accttggatc caacgatttc aaaggtctct 60

atggatataa ggtctttatt gccattgcca ttatccttgg ggacggtctc tacaatcttg 120

tcaagatcat tgctgtcact gtgaaggaat tatgcagcaa tagctctaga cacctcaatc 180

tacccgttgt trccaacgtt g 201

<210> 18

<211> 201

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 18

agaagatgga gttcttgatg tttgatctyg atcgggtttt gaarcccggt gggttgttct 60

ggttggataa cttctactgc gctagtgacg tgaagaagaa agagctgacg cgtttgatyg 120

agaggtttgg gtataagaag ctgaaatggg ttattggaga gaaggctgat gggcaagtgw 180

atctctctgc tgttctkcaa a 201

<210> 19

<211> 201

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 19

tagagctgaa gctaggtata ggaggcacat catayaaaga tttcattcaa agccttcatc 60

tacctatgca attgagtcaa gtagacccaa tagtagcgtc cttctcygga ggagctgttg 120

gtgtgatctc rgckytgatg gtwgtwgaag tcaacaacgt gaagcagcaa gagcacaaga 180

gatgcaaata ctgtctagga a 201

<210> 20

<211> 201

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<220>

<221> misc_feature

<222> (165)..(165)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 20

ttaagaactg tgtcactgac attgaccctg agagggagaa ggagaagaga gaaaggatgg 60

aaagccaaaa cctcaaggct agtacaaagc tgagtcaagc gagggagaaa atcaagcgca 120

agtatccact tcctgttgca aggagrcaac tytccactgg rtacntggaa gatgctctcg 180

aagaggatga agagacagac c 201

<210> 21

<211> 201

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 21

gctcaggtag atctcccacg ggttggggaa gaggatccgg atatgggtat gggtctggat 60

ctggatcagg tagcggatat gggtacggtt ccggaggtgg aggagsacgt ggtggtgggt 120

atggttatgg aagcggaaat ggtcggtctg gaggwggtgg tggtggctct aatggtgaag 180

ttgccgcttt gggccacggt g 201

<210> 22

<211> 107

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 22

gggagagaga ggaaacctgg aggatgttac gcagtactgg ggctgaagaa ctgaagaatt 60

gttggagcat tggattaatt gtccttcktg ctgacccgtg ttcttct 107

<210> 23

<211> 109

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 23

gggagagaga ggaaacctgg aggakgttac gcagtactgg ggctgaagaa ctgaagaatt 60

gttggagcat tggattaatt gtccttcgtg ctgacccgtg ttcttctcc 109

<210> 24

<211> 88

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 24

gagagagaaa ygacaaccct gaaataacca aagtatatmt ctctctcttt ctttcctatg 60

tctctctggg tatcttttgt gttaaatt 88

<210> 25

<211> 88

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 25

gagagagaaa ygacaaccct gaaatracca aagtatatct ctctctcttt ctttcctatg 60

tctctctggg tatcttttgt gttaaatt 88

<210> 26

<211> 84

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 26

gaaatgtctc ggccaacaag ttgtttgtct gaatataaat agcgatcrta kcgttcaagt 60

atcctttcca tgctatattt caga 84

<210> 27

<211> 101

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 27

tgcatttata tcagtacgaa cttacatata tgttgagcgt tatgttatta tccamtggat 60

tatagcayat ccttgtaaat gcttattcca ttgtttcaaa t 101

<210> 28

<211> 113

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 28

tgcatttata tcagtacgaa cttacatata tgttgagcgt tatgttatgc gttatgttat 60

tatccamtgg attatagcac atccttgtaa atgcttattc cattgtttca aat 113

<210> 29

<211> 156

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 29

tggaagagaa gacaacgaga gcaacctcag catcgcagag aacagagatc tcatgagctt 60

tcttgagcaa accagatctt ctcttkgaga aagtaacttg cctattgatc ttgttctcta 120

tcctcttcag ctgaacccta ccccttccca tctctc 156

<210> 30

<211> 726

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 30

atgggaaggg gtagggttca gctgaagagg atagagaaca agatcaatag gcaagttact 60

ttctccaaga gaagatctgg tttgctcaag aaagctcatg agatctctgt tctctgcgat 120

gctgaggttg ctctcgttgt cttctcttcc aaaggcaaac tcttcgaata ttccactgac 180

tctagcatgg aaaggatact tgaacgctac gatcgctatt tatattcaga caaacaactt 240

gttggccgag acatttcgca gagtgaaaat tgggttctag agcatgctaa gctcaaggca 300

agagttgagg tacttgagaa gaataaaagg aattttatgg gggaagatct tgattccttg 360

agcctaaagg agcttcaaag cttggagcat cagctcgacg ctgctatcaa gagcattagg 420

tcaagaaaga accaagctat gttcgaatcc atatcagcgc tccagaagaa ggataaggca 480

ttgcaagatc ataataatac gcttctcaaa aagattaagg agagggagaa gaacacgggt 540

cagcacgaag gacaattaat ccaatgctcc aacaattctt cagttcttca gccccagtac 600

tgcgtaacat cctccagaga tggtcttgtg gagagagttg ggggagagaa cggaggtgca 660

tcgtcattga ttgaaccaaa ctctcttctt ccagcttgga tgttacgtcc tactacgaat 720

gagtaa 726

<210> 31

<211> 726

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 31

atgggaaggg gtagggttca gctgaagagg atagagaaca agatcaatag gcaagttact 60

ttctccaaga gaagatctgg tttgctcaag aaagctcatg agatctctgt tctctgcgat 120

gctgaggttg ctctcgttgt cttctcttcc aaaggcaaac tcttcgaata ttccactgac 180

tctagcatgg aaaggatact tgaacgctac gatcgctatt tatattcaga caaacaactt 240

gttggccgag acatttcgca gagtgaaaat tgggttctag agcatgctaa gctcaaggca 300

agagttgagg tacttgagaa gaataaaagg aattttatgg gggaagatct tgattccttg 360

agcctaaagg agcttcaaag cttggagcat cagctcgacg ctgctatcaa gagcattagg 420

tcaagaaaga accaagctat gttcgaatcc atatcagcgc tccagaagaa ggataaggca 480

ttgcaagatc ataataatac gcttctcaaa aagattaagg agagggagaa gaacacgggt 540

cagcacgaag gacaattaat ccaatgctcc aacaattctt cagttcttca gccccagtac 600

tgcgtaacat cctccagaga tggtcttgtg gagagagttg ggggagagaa cggaggtgca 660

tcgtcattga ttgaaccaaa ctctcttctt ccagcttgga tgttacgtcc tactacgaat 720

gagtaa 726

<210> 32

<211> 241

<212> PRT

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 32

Met Gly Arg Gly Arg Val Gln Leu Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ile Asn

1 5 10 15

Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Ser Gly Leu Leu Lys Lys Ala

20 25 30

His Glu Ile Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Val Val Phe

35 40 45

Ser Ser Lys Gly Lys Leu Phe Glu Tyr Ser Thr Asp Ser Ser Met Glu

50 55 60

Arg Ile Leu Glu Arg Tyr Asp Arg Tyr Leu Tyr Ser Asp Lys Gln Leu

65 70 75 80

Val Gly Arg Asp Ile Ser Gln Ser Glu Asn Trp Val Leu Glu His Ala

85 90 95

Lys Leu Lys Ala Arg Val Glu Val Leu Glu Lys Asn Lys Arg Asn Phe

100 105 110

Met Gly Glu Asp Leu Asp Ser Leu Ser Leu Lys Glu Leu Gln Ser Leu

115 120 125

Glu His Gln Leu Asp Ala Ala Ile Lys Ser Ile Arg Ser Arg Lys Asn

130 135 140

Gln Ala Met Phe Glu Ser Ile Ser Ala Leu Gln Lys Lys Asp Lys Ala

145 150 155 160

Leu Gln Asp His Asn Asn Thr Leu Leu Lys Lys Ile Lys Glu Arg Glu

165 170 175

Lys Asn Thr Gly Gln His Glu Gly Gln Leu Ile Gln Cys Ser Asn Asn

180 185 190

Ser Ser Val Leu Gln Pro Gln Tyr Cys Val Thr Ser Ser Arg Asp Gly

195 200 205

Leu Val Glu Arg Val Gly Gly Glu Asn Gly Gly Ala Ser Ser Leu Ile

210 215 220

Glu Pro Asn Ser Leu Leu Pro Ala Trp Met Leu Arg Pro Thr Thr Asn

225 230 235 240

Glu

<210> 33

<211> 1067

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 33

gggagatata ctttggttat ttcagggttg tcgtttctct ctcttgttct tgaagtttta 60

aggggagaga gagagagaga gaaaagattg agagatggga aggggtaggg ttcagctgaa 120

gaggatagag aacaagatca ataggcaagt tactttctcc aagagaagat ctggtttgct 180

caagaaagct catgagatct ctgttctctg cgatgctgag gttgctctcg ttgtcttctc 240

ttccaaaggc aaactcttcg aatattccac tgactctagc atggaaagga tacttgaacg 300

ctacgatcgc tatttatatt cagacaaaca acttgttggc cgagacattt cgcagagtga 360

aaattgggtt ctagagcatg ctaagctcaa ggcaagagtt gaggtacttg agaagaataa 420

aaggaatttt atgggggaag atcttgattc cttgagccta aaggagcttc aaagcttgga 480

gcatcagctc gacgctgcta tcaagagcat taggtcaaga aagaaccaag ctatgttcga 540

atccatatca gcgctccaga agaaggataa ggcattgcaa gatcataata atacgcttct 600

caaaaagatt aaggagaggg agaagaacac gggtcagcac gaaggacaat taatccaatg 660

ctccaacaat tcttcagttc ttcagcccca gtactgcgta acatcctcca gagatggtct 720

tgtggagaga gttgggggag agaacggagg tgcatcgtca ttgattgaac caaactctct 780

tcttccagct tggatgttac gtcctactac gaatgagtaa aattatctaa gtatgataac 840

atcatcaatg cttaatattt tcataatata tatcagcatt tttggtgacc ttactcttca 900

ttaatactga tatatgtaat gacggaatta caatgtcaag aacgtacgta ctctatcact 960

ggattcactg cgtcttaagg acaaaggttc atgatatcgt tgtgatgatt tctgatgaat 1020

gatgtattga tacttttcct tttactgtgg catagatgcg tgaaatc 1067

<210> 34

<211> 42

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 34

gaaggtgacc aagttcatgc tcggcgcatt ccatgtgatg ca 42

<210> 35

<211> 43

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 35

gaaggtcgga gtcaacggat tgcggcggat tccgtgtaat atc 43

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 36

gcttagagca gctgcagaaa cactt 25

<210> 37

<211> 47

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 37

gaaggtgacc aagttcatgc tcaaaagcat gggagaaaac caagaac 47

<210> 38

<211> 48

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 38

gaaggtcgga gtcaacggat tacaaaagca tgggagaaaa ccaagaaa 48

<210> 39

<211> 30

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 39

cgcgatcaaa ctatcaatct cataagagaa 30

<210> 40

<211> 49

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 40

gaaggtgacc aagttcatgc tgaaatatag catggaaagg atacttgaa 49

<210> 41

<211> 49

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 41

gaaggtcgga gtcaacggat tgaaatatag catggaaagg atacttgag 49

<210> 42

<211> 29

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 42

cggccaacaa gttgtttgtc tgaatataa 29

<210> 43

<211> 53

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 43

gaaggtgacc aagttcatgc tatttatatc agtacgaact tacatatatg ttg 53

<210> 44

<211> 54

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 44

gaaggtcgga gtcaacggat tcatttatat cagtacgaac ttacatatat gtta 54

<210> 45

<211> 30

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 45

tgaaacaatg gaataagcat ttacaaggat 30

<210> 46

<211> 50

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 46

gaaggtgacc aagttcatgc taaacaatgg aataagcatt tacaaggatg 50

<210> 47

<211> 51

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 47

gaaggtcgga gtcaacggat tgaaacaatg gaataagcat ttacaaggat a 51

<210> 48

<211> 30

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 48

tgcatttata tcagtacgaa cttacatata 30

<210> 49

<211> 47

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 49

gaaggtgacc aagttcatgc tcatgagctt tcttgagcaa accagat 47

<210> 50

<211> 46

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 50

gaaggtcgga gtcaacggat tatgagcttt cttgagcaaa ccagac 46

<210> 51

<211> 29

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 51

ggatagagaa caagatcaat aggcaagtt 29

<210> 52

<211> 42

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 52

gaaggtgacc aagttcatgc tcagccccag tactgcgtaa ca 42

<210> 53

<211> 42

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 53

gaaggtcgga gtcaacggat tcagccccag tactgcgtaa cc 42

<210> 54

<211> 23

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 54

ggagagagag gaaacctgga gga 23

<210> 55

<211> 42

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 55

gaaggtgacc aagttcatgc tgagaagaac acgggtcagc ac 42

<210> 56

<211> 43

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 56

gaaggtcgga gtcaacggat tggagaagaa cacgggtcag caa 43

<210> 57

<211> 23

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 57

ggagagagag gaaacctgga gga 23

<210> 58

<211> 47

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 58

gaaggtgacc aagttcatgc tgagagagaa aygacaaccc tgaaata 47

<210> 59

<211> 46

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 59

gaaggtcgga gtcaacggat tagagagaaa ygacaaccct gaaatg 46

<210> 60

<211> 27

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 60

tttaacacaa aagataccca gagagac 27

<210> 61

<211> 49

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 61

gaaggtgacc aagttcatgc tgacaaccct gaaatracca aagtatatc 49

<210> 62

<211> 49

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 62

gaaggtcgga gtcaacggat tgacaaccct gaaatracca aagtatata 49

<210> 63

<211> 27

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 63

tttaacacaa aagataccca gagagac 27

<210> 64

<211> 43

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 64

gaaggtgacc aagttcatgc tcgaagggcg tagtagacgt tca 43

<210> 65

<211> 42

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 65

gaaggtcgga gtcaacggat tgaagggcgt agtagacgtt cg 42

<210> 66

<211> 25

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 66

ccttgttcct cctcacgctc ataat 25

<210> 67

<211> 42

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 67

gaaggtgacc aagttcatgc tccactgcac ttccgggtca ta 42

<210> 68

<211> 42

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 68

gaaggtcgga gtcaacggat tccactgcac ttccgggtca tc 42

<210> 69

<211> 24

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 69

gaagaatgcg acgaggctgt gcaa 24

<210> 70

<211> 45

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 70

gaaggtgacc aagttcatgc tagagaaaac gcagaggagg cttta 45

<210> 71

<211> 44

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 71

gaaggtcgga gtcaacggat tgagaaaacg cagaggaggc tttg 44

<210> 72

<211> 28

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 72

gcgaacggtt tgttttccaa ttacagaa 28

<210> 73

<211> 45

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 73

gaaggtgacc aagttcatgc tcaagtagac ccaatagtag cgtca 45

<210> 74

<211> 44

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 74

gaaggtcgga gtcaacggat taagtagacc caatagtagc gtcc 44

<210> 75

<211> 25

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 75

accatcaacg ctgagatcac accaa 25

<210> 76

<211> 41

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 76

gaaggtgacc aagttcatgc tggtacggtt ccggaggtgg a 41

<210> 77

<211> 40

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 77

gaaggtcgga gtcaacggat tgtacggttc cggaggtggc 40

<210> 78

<211> 25

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 78

cgaccatttc cgcttccata accat 25

<210> 79

<211> 42

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 79

gaaggtgacc aagttcatgc tagtacaaag ctgagtcaag ca 42

<210> 80

<211> 44

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 80

gaaggtcgga gtcaacggat tctagtacaa agctgagtca agcg 44

<210> 81

<211> 25

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 81

caggaagtgg atacttgcgc ttgat 25

<210> 82

<211> 47

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 82

gaaggtgacc aagttcatgc tttattgcca ttgccattat ccttgga 47

<210> 83

<211> 45

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 83

gaaggtcgga gtcaacggat tattgccatt gccattatcc ttggg 45

<210> 84

<211> 29

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 84

gtgacagcaa tgatcttgac aagattgta 29

<210> 85

<211> 48

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 85

gaaggtgacc aagttcatgc taaggtgtac tattgcaaag aagacgaa 48

<210> 86

<211> 46

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 86

gaaggtcgga gtcaacggat tggtgtacta ttgcaaagaa gacgag 46

<210> 87

<211> 28

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 87

tcaaactgaa cagactggta caagcaaa 28

<210> 88

<211> 41

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 88

gaaggtgacc aagttcatgc tgggagagaa aggcgcaggt a 41

<210> 89

<211> 41

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 89

gaaggtcgga gtcaacggat tgggagagaa aggcgcaggt t 41

<210> 90

<211> 25

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 90

ttttgtcaac ccctgctgtc gctaa 25

<210> 91

<211> 44

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 91

gaaggtgacc aagttcatgc tcaagatctt gggtgtgccc acaa 44

<210> 92

<211> 44

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 92

gaaggtcgga gtcaacggat tcaagatctt gggtgtgccc acat 44

<210> 93

<211> 29

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 93

ctccagcaag tgcatcttca ataacaata 29

<210> 94

<211> 47

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 94

gaaggtgacc aagttcatgc tcgaagattc aatgattcaa gtgacac 47

<210> 95

<211> 47

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 95

gaaggtcgga gtcaacggat tcgaagattc aatgattcaa gtgacag 47

<210> 96

<211> 25

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 96

ggtgttgcag ctcttgaagt tggaa 25

<210> 97

<211> 42

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 97

gaaggtgacc aagttcatgc tgtagctgga gttcttttca tc 42

<210> 98

<211> 46

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 98

gaaggtcgga gtcaacggat tggctgtagc tggagttctt ttcatt 46

<210> 99

<211> 29

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 99

cccttgagct tatctaaatc ttcgttctt 29

<210> 100

<211> 46

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 100

gaaggtgacc aagttcatgc tagtagctca aaccgcaatc atacca 46

<210> 101

<211> 43

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 101

gaaggtcgga gtcaacggat tagctcaaac cgcaatcata ccg 43

<210> 102

<211> 25

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 102

ttccgagacc gagaatgtct tgcat 25

<210> 103

<211> 50

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 103

gaaggtgacc aagttcatgc tcagtatttg cttacatata tctccagtca 50

<210> 104

<211> 48

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 104

gaaggtcgga gtcaacggat tgtatttgct tacatatatc tccagtcc 48

<210> 105

<211> 25

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 105

ccgaaacgct ttgggagacg ataaa 25

<210> 106

<211> 42

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 106

gaaggtgacc aagttcatgc tgggttcttg aagcagcctg ac 42

<210> 107

<211> 43

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 107

gaaggtcgga gtcaacggat tggggttctt gaagcagcct gat 43

<210> 108

<211> 25

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 108

ggatctcctg catcatgttg acgaa 25

<210> 109

<211> 44

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 109

gaaggtgacc aagttcatgc tgaacgcaca ggtttgccac tgaa 44

<210> 110

<211> 43

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 110

gaaggtcgga gtcaacggat taacgcacag gtttgccact gag 43

<210> 111

<211> 29

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 111

agatgcaatt gtcactcttt ctccttctt 29

<210> 112

<211> 46

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 112

gaaggtgacc aagttcatgc tccattgaca ccaacgaact ctttaa 46

<210> 113

<211> 46

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 113

gaaggtcgga gtcaacggat tccattgaca ccaacgaact ctttac 46

<210> 114

<211> 26

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 114

gtcttgttct caagaccatc ccactt 26

<210> 115

<211> 44

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 115

gaaggtgacc aagttcatgc tgcgctagtg acgtgaagaa gaaa 44

<210> 116

<211> 44

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 116

gaaggtcgga gtcaacggat tgcgctagtg acgtgaagaa gaag 44

<210> 117

<211> 29

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 117

gcttcttata cccaaacctc tcaatcaaa 29

<210> 118

<211> 21

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 118

gatccgattc ttctcctgtt g 21

<210> 119

<211> 21

<212> DNA

<213> 萝卜(Raphanus sativus)

<400> 119

gcctactcct caaatcactc t 21

<210> 120

<211> 195

<212> DNA

<213> 油菜萝卜(Napus sativus)

<400> 120

tatacataac tgagtaagac ttataaacat aaacatctag aagaaaaaca aagcttaaaa 60

cttacactct gcgaaatgtc tcggccaaca agttgtttgt ctgaatataa atagcgatcg 120

tagcgttcaa gtatcctttc catgctatat ttcagaaaaa taaaacaaaa tatacttcag 180

taatttgatc catgt 195

<210> 121

<211> 198

<212> DNA

<213> 甘蓝(Brassica oleracea)

<400> 121

tatacataac tgagcaagac ttatgagtac ataaacatct agaagaaaca aagcttaaaa 60

cttacacttt gtgaaatgtc tcggccaaca agttgtttgt ctgaatataa atagcgatca 120

tatcgctcaa gtatcctttc catgctatat ttcagagaaa aaaacaatca aaatatactt 180

cattaatttg atccatgt 198

<210> 122

<211> 195

<212> DNA

<213> 芜菁(Brassica rapa)

<400> 122

tacacataac tgagcaagac ttatgaacat aaacatctag aagaaacaaa gcttaaaact 60

tacactttgt gaaatgtctc ggccaacaag ttgtttgtct gaatataaat agcgatcata 120

tcgctcaagt atcctttcca tgctatattt cagagaaaaa acaatcaaaa tatacttcat 180

taatttgatc catgt 195

<210> 123

<211> 194

<212> DNA

<213> 油菜萝卜(Napus sativus)

<400> 123

tcagaatctt tcatagctag agatgtatat tacacaatta atcatactct acatgtaatt 60

aagaatgcta ccgagaaagg gagagagagg aaacctggag gatgttacgc agtactgggg 120

ctgaagaact gaagaattgt tggagcattg gattaattgt ccttcgtgct gacccgtgtt 180

cttctccctc tcct 194

<210> 124

<211> 187

<212> DNA

<213> 甘蓝(Brassica oleracea)

<400> 124

tcagaatctt ccatagctag agatgtatta atcataatct aaatgtaatt tagaatgcta 60

ctgagaggga gagagaggaa acctggagga ggttacgcag tactggggct gaagaactga 120

agaattgttg gagcattgga ttaattgtcc ttcttgctga cccgtgttct tctccttttc 180

ctctcct 187

<210> 125

<211> 197

<212> DNA

<213> 芜菁(Brassica rapa)

<400> 125

tcagaatctt ccatagctag agatgtatat tacacaatta atcataatct aaatgtaatt 60

aagaatgcta ctgagaggga gagagaggaa acctggaggc ggttacgcag tactggggct 120

gaagaactga agaattgttg gagcattgga ttaattgtcc ttcttgctga cccgtgttct 180

tctccttttc ctctcct 197

PCT/RO/134表

Claims

1.一种芸薹属植物，其基因组中包含萝卜属基因组片段，其中所述片段赋予抗裂荚性表型POSH⁺，并且所述片段的特征是在以下标志物：SEQ ID NO 4至SEQ ID NO 18中的至少一种内缺失至少一个萝卜属SNP。

2.根据权利要求1所述的芸薹属植物，其中在所述萝卜属基因组片段中存在至少一种标志物SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20或SEQ ID NO 21中的至少一个萝卜属SNP。

3.根据权利要求1或2所述的芸薹属植物，其中缺失在所述标志物SEQ ID NO:9和SEQID NO:12至SEQ ID NO:18中的萝卜属SNP。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的芸薹属植物，其中缺失所述标志物SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:18中的萝卜属SNP。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的芸薹属植物，其中所述植物还包含萝卜属FRUITFULL等位基因。

6.根据权利要求5所述的芸薹属植物，其中所述萝卜属FRUITFULL等位基因包含标志物SEQ ID NO:22中的萝卜属SNP。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的芸薹属植物，其中所述植物还包含萝卜属片段中的雄性能育性恢复基因座Rf0。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的芸薹属植物，其中所述芸薹属植物包含CMSOgura细胞质。

9.一种杂种芸薹属植物，其是通过将根据权利要求1至8中任一项所述的具有赋予POSH+表型的萝卜属片段的芸薹属植物与不具有赋予POSH+表型的所述萝卜属片段的另一种芸薹属植物杂交得到的，其中所述杂种植物包含赋予抗裂荚性表型POSH+的萝卜属基因组片段。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的芸薹属植物的种子、植物的部分或子代。

11.一种用于识别根据权利要求1至10中任一项所述的POSH+芸薹属植物的方法，其中所述芸薹属植物通过检测以下标志物SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 21中的至少一种内存在至少一个萝卜属SNP来识别，和/或通过检测以下标志物SEQ ID NO 4至SEQ IDNO 18中的至少一种内缺失至少一个萝卜属SNP来识别。

12.根据权利要求11所述的方法，其中通过使用萝卜属fruitfull等位基因、更具体地使用萝卜属标志物SEQ ID NO 22来进一步识别POSH+基因座。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中进一步识别Rf0基因座。

14.用于检测以下标志物：SEQ ID NO 4至SEQ ID NO 22中的一种或更多种内的一个或更多个萝卜属SNP的工具。

15.根据权利要求14所述的工具，其由核酸探针、引物或引物组或其组合组成。

16.根据权利要求14至15中任一项所述的工具，其由一种或更多种引物组成，所述引物包含SEQ ID NO 64至SEQ ID NO 99、SEQ ID NO 106至SEQ ID NO 108、SEQ ID NO 112至SEQ ID NO 114和SEQ ID NO 52至SEQ ID NO 54中的任一个。

17.根据权利要求1至10中任一项所述的芸薹属植物或其种子用于食品应用、优选用于油生产和用于饲料应用、或用于育种应用的用途，例如用作育种中的亲本植物以改善芸薹属植物、系、杂种或品种的农业价值。

18.一种产生POSH+芸薹属植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a.将根据权利要求1至9中任一项所述的第一芸薹属植物与第二POSH^-或POSH+芸薹属植物杂交；从而获得F1杂种植物；

c.从步骤b)获得的植物中选择POSH⁺芸薹属植物，任选地使用标志物SEQ ID NO 19、SEQID NO 20或SEQ ID NO 21中的至少一种内的至少一个萝卜属SNP，以及

d.任选地，进一步选择所述POSH+芸薹属植物，其在标志物SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:18中的至少一种内缺失至少一个萝卜属SNP。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第一植物是从保藏在NCIMB保藏中心、编号为42444的种子的代表性样品获得的植物。

20.产生根据权利要求1至9中任一项所述的POSH+芸薹属植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a.提供第一POSH+芸薹属植物，其包含赋予POSH+特性的萝卜属基因渗入，所述萝卜属基因渗入包含以下标志物：SEQ ID NO 4至SEQ ID NO 18中的一种或更多种内的至少一个萝卜属SNP；

d.在步骤c)中获得的植物中选择POSH⁺植物，任选地选择标志物SEQ ID NO 19、SEQ IDNO 20或SEQ ID NO 21中的至少一种内存在至少一个萝卜属SNP，和/或任选地进一步选择标志物SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:18中的至少一种内缺失至少一个萝卜属SNP。

21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述第一POSH+芸薹属植物包含Rf0 Ogura能育性恢复基因。

22.一种芸薹属植物，其是通过权利要求18至21中任一项所述的方法能够获得的或获得的。