CN113151298A

CN113151298A - 烟草转录因子NtMYB305及其在调控烟草烟碱生物合成中的应用

Info

Publication number: CN113151298A
Application number: CN202110398497.7A
Authority: CN
Inventors: 张洪博; 卞士权; 王嘉豪; 王春凯; 刘艳华; 张忠锋
Original assignee: Qingzhou Tobacco Research Institute of China National Tobacco Corp of Institute of Tobacco Research of CAAS
Current assignee: Qingzhou Tobacco Research Institute of China National Tobacco Corp of Institute of Tobacco Research of CAAS
Priority date: 2021-04-12
Filing date: 2021-04-12
Publication date: 2021-07-23

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种烟草转录因子NtMYB305及其在调控烟草烟碱生物合成中的应用，包括烟草转录因子NtMYB305，编码基因如SEQ ID NO:1所示；其同源基因NtMYB305a.1、NtMYB305a.2、NtMYB305b.1、NtMYB305b.2分别由SEQ ID NO:2‑5所示核苷酸序列组成。本发明提供了烟草转录因子NtMYB305及其编码基因在调控烟草烟碱生物合成中的应用，通过超表达及基因沉默技术等基因工程手段对该基因在烟草植株内进行上调或下调表达，可以显著提高或降低烟草烟碱的含量，为未来培育高烟碱含量和低烟碱含量的转基因烟草品种提供新的思路和方法。

Description

烟草转录因子NtMYB305及其在调控烟草烟碱生物合成中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及烟草烟碱代谢调控技术领域，具体涉及一种烟草转录因子NtMYB305及其在调控烟草烟碱生物合成中的应用。

背景技术

烟草是一种代谢产物非常丰富的植物种类，烟草植株中的生物碱含量约为烟草植株干重的0.5％～10％，其中最主要的成分就是烟碱。在烟草工业中，烟碱的质量和含量是评价烟叶品质的重要指标之一，是香烟的香气的主要来源；由于烟碱具有高效的抗虫性，还可以被制备成高效生物源农药；研究还表明烟碱可以有效缓解阿尔兹海默症。由此可见，烟碱的应用潜力巨大，研究烟草的烟碱代谢调控具有重要的理论和应用价值。

烟碱又被称为尼古丁，化学组成式为C₁₀H₁₄N₂，烟碱的化学结构中包含一个甲基吡咯环和一个吡啶环。在吡咯烷环合成途径中，吡咯烷环是由鸟氨酸、天冬氨酸和精氨酸为前体合成的，其中鸟氨酸脱羧酶(ODC)作用于鸟氨酸，使其脱羧形成腐胺。精氨酸在精氨酸脱羧酶(ADC)的作用下经3步反应间接转化成腐胺，形成的腐胺对烟碱合成具有重要的作用。腐胺在腐胺-N-甲基转移酶(PMT)的作用下形成N-甲基腐胺；随后，N-甲基腐胺氧化酶(MPO)催化合成4-甲氨基丁醚，4-甲氨基丁醚通过环化作用形成N-甲基-Δ1-吡咯啉，该化合物作为烟碱的前体物质直接进入烟碱合成。在吡啶环合成途径中，喹啉酸磷酸核糖转移酶(QPT)催化喹啉酸转化成烟酸单核苷酸(NAMN)，该物质是吡啶核苷酸循环中的重要化合物，最终形成烟酸，随后烟酸通过异类黄酮还原酶类蛋白A622和小檗碱桥连酶类蛋白(BBL)的作用转化成烟碱。PMT是控制烟碱合成的关键限速酶，对其表达调控的研究一直是烟碱代谢调控的热点。

在PMT的基因启动子中存在一段由G-box、AT-rich和GCC-box-like元件组成的三元调控结构域，共同控制着PMT的基因诱导表达。目前，结合G-box及GCC-box-like元件的调控因子已有报道，但结合AT-rich元件的调控因子至今未被发现。分离和鉴定结合AT-rich元件的调控因子是揭示PMT基因表达调控及烟碱合成调控的关键所在。

发明内容

为了揭示烟碱代谢调控的分子机制，有效调控烟草中烟碱的含量，本发明首次发现并提出了一种烟草转录因子NtMYB305及其在调控烟草烟碱生物合成中的应用，通过超表达及基因沉默技术等基因工程手段对该基因在烟草植株内进行上调或下调表达，就可以显著提高或降低烟草烟碱的含量，为未来培育高烟碱含量和低烟碱含量的转基因烟草品种提供新的思路和方法。

本发明的技术方案是：

本发明提供了一种烟草转录因子NtMYB305，转录因子NtMYB305的编码基因如SEQIDNO:1所示；该编码基因的同源基因NtMYB305a.1、NtMYB305a.2、NtMYB305b.1、NtMYB305b.2分别由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示核苷酸序列组成。

以及，含有如权利要求1所述的编码基因及其同源基因的表达载体。

另外，本发明还提供了所述的烟草转录因子NtMYB305在调控烟草烟碱生物合成中的应用；以及所述的编码基因及其同源基因在调控烟草烟碱生物合成中的应用。

在调控烟草烟碱生物合成中的应用方面，用于培育高烟碱含量的转基因烟草品种；以及用于培育低烟碱含量的转基因烟草品种。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种烟草转录因子NtMYB305及其在调控烟草烟碱生物合成中的应用，该转录因子NtMYB305能够显著调控烟草烟碱代谢，通过超表达及基因沉默技术等基因工程手段对该基因在烟草植株内进行上调或下调表达，可以显著提高或降低烟草烟碱的含量。

本发明首次发现并报道烟草中转录因子NtMYB305在调控烟碱生物合成上具有重要作用，通过基因工程的方法，上调或下调烟草中的NtMYB305的表达量可以显著提高或降低烟草植株中的烟碱含量，这为未来培育高烟碱含量和低烟碱含量的转基因烟草品种提供新的思路和方法。

附图说明

图1为本发明提供的超表达及沉默NtMYB305转基因植株的qPCR鉴定分析结果；

图2为本发明提供的对照组及转基因植株在打顶前和打顶后2个周的叶片烟碱含量测定；

图3为NtMYB305特异性识别并结合NtPMT启动子GAG区域。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了进一步理解本发明，将结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

下述各实验步骤中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

1、总RNA的提取

选取烟草品种TN90在1/2MS或MS液体培养基中培养，在温度为23℃且光周期为光照14h/黑暗10h的温室中培养15～20天，然后称取0.1～0.2g的根，用液氮充分研磨，采用植物RNA提取试剂Trizol(购买自Invitrogen公司)提取总RNA。

2、转录因子NtMYB305的CDS片段的克隆

以提取到的总RNA为模板，利用反转录试剂盒(TaKaRa PrimeScriptTMII 1stStrand cDNASynthesis Kit，型号：6210B)对RNA样品进行反转录合成cDNA；

按照转录因子NtMYB305的CDS序列设计引物，其中，

转录因子NtMYB305的CDS序列如下所示：

ATGGATAAAAAACCATGCAACTCTCAAGATGTTGAAGTGAGGAAAGGACCTTGGACTATGGAAGAGGATTTAATTCTCATTAACTACATTGCTAATCATGGTGAAGGTGTTTGGAATTCCTTAGCTAAATCTGCTGGTCTCAAACGTACCGGAAAAAGCTGTCGGCTCCGGTGGCTAAATTATCTCCGGCCTGATGTCCGGAGGGGAAATATTACACCTGAAGAACAACTTTTGATAATGGAACTGCATGCTAAGTGGGGAAACAGGTGGTCAAAAATTGCAAAGCATTTGCCTGGAAGAACAGATAATGAGATAAAGAACTATTGGAGGACAAGGATTCAGAAGCACATAAAGCAAGCAGAAAACATGAATGGACAAGCAGCTAATTCAGAGCAAAATGATCATCAAGAAGGAAGCAGTAGCCATATGTCGTCTGCTGGTCCAGCAGAGACTTACTCTCCAAGTTCATACTCTGCAAATATTGACACTACTTTTCAAGGCCCTTTTCTCACTGAAACAAATGACAACATTTGGAGCATGGAGGATATCTGGTCCATGCAATTGCTTAA(SEQ ID No.1)

引物序列如下所示：

NtMYB305-F：5’-ATGGATAAAAAACCATGCAAC-3’(SEQ ID No.6)；

NtMYB305-R：5’-ATCGCCGTTAAGCAATTGCAT-3’(SEQ ID No.7)；

以cDNA为模板，以NtMYB305-F/NtMYB305-R为引物，利用高保真酶(Vazyme 2×

Max Master Mix(Dye Plus)，型号：P525-02)进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性2～4min；94℃变性30～40s；58℃退火30～40s，72℃延伸30～50s，33～35个循环；72℃保温5～10min；

PCR反应体系及反应条件：

使用1％～1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离上述步骤扩增的PCR产物，随后使用凝胶回收试剂盒(Vazyme FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit,型号：DC301-01)进行切胶回收，得到转录因子NtMYB305的CDS片段；

3、超表达载体pBin-NtMYB305-YFP和沉默载体pBin-NtMYB305-RI的构建

将得到的转录因子NtMYB305的CDS片段连接到T载体pMD18-T上。经过菌落PCR及测序鉴定出阳性的单菌落。随后再设计含有酶切位点的引物，引物如下：

NtMYB305-Etr5:AAAGCGGCCGCATGGATAAAAAACCATGCAAC(NotI)(SEQ IDNo.8)；

NtMYB305-Etr3:AAAGGCGCGCCATCGCCGTTAAGCAATTGCAT(AscI)(SEQ ID No.9)

将含有正确连入pMD18-T载体的NtMYB305的阳性单菌落进行扩大培养，并提取质粒(Vazyme FastPure PlasmidMini Kit，型号：DC201-01)。以该质粒为模板，以上述NtMYB305-Etr5/NtMYB305-Etr3为引物，利用高保真酶进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性2～4min；94℃变性30～40s；62℃退火30～40s，72℃延伸30～50s，33～35个循环；72℃保温5～10min；

PCR反应体系及反应条件：

使用1％-1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离上述步骤扩增的PCR产物，随后使用凝胶回收试剂盒(Vazyme FastPure Gel DNAExtraction Mini Kit，型号：DC301-01)进行切胶回收，得到含有酶切位点的转录因子NtMYB305的基因片段，然后将NtMYB305的基因片段和入门载体pENTR-D-TOPO分别进行NotI和AscI双酶切，随后再将NtMYB305的基因片段连入pENTR-D-TOPO载体中。

然后通过Gateway载体系统(购买自Invitrogen公司)进行LR反应使用将基因NtMYB305的CDS片段分别连接到植物表达载体pBin-attR-YFP和沉默载体pBin-attR-RI上，得到超表达载体pBin-NtMYB305-YFP和沉默载体pBin-NtMYB305-RI。

LR反应体系及反应条件：

反应条件：25～28℃

然后将超表达载体pBin-NtMYB305-YFP和沉默载体pBin-NtMYB305-RI转化至感受态大肠杆菌DH5α中(Sangon)，然后进行菌落PCR鉴定，扩大培养阳性菌落并提取超表达载体pBin-NtMYB305-YFP和沉默载体pBin-NtMYB305-RI质粒备用(Vazyme FastPure PlasmidMiniKit，型号:DC201-01)。

4、烟草转基因植株的获取

将上述获得的超表达载体pBin-NtMYB305-YFP和沉默载体pBin-NtMYB305-RI的大肠杆菌质粒通过热激法转化到农杆菌，再利用叶盘法侵染至烟草的叶片中。具体步骤为：

(1)用新鲜的专有表达载体pBin-NtMYB305-YFP和pBin-NtMYB305-RI的农杆菌在含有卡纳和头孢的YEB固体培养基上划板，28℃培养2～3天，用枪头沾取单克隆农杆菌菌落放入5～8ml含有卡纳和头孢的YEB液体培养基吹打，随后将其放入28℃摇床，200rpm，培养2～3天；然后将上述培养液转入50～80mL含有卡纳和头孢的YEB液体培养基中继续培养过夜；次日，将上述50～80mL的YEB液体培养基进行800rpm离心10min，用新鲜的40～50mlYEB液体培养基悬浮备用。

(2)选取生长60～80天的TN90品种烟草的叶片，将其剪成大约1cm²的小片，将剪好的小叶片放入上述40～50ml悬浮的YEB液体培养基中浸泡5～7min，随后再将小叶片转移至含有卡纳和头孢抗生素以及6BA的MS固体培养基上，放入温度23℃，且光周期为光照14h/黑暗10h的温室中培养2～3月，待小叶片重新发出嫩叶之后，将嫩叶剪下插入只含有6BA的MS固体培养基中，再放入上述温室中继续培养1～2月，最终得到T0代烟草转基因植株。

实施例2

转基因植株的鉴定

按照上述同样的提取方法提取野生型烟草TN90和超表达和沉默NtMYB305的转基因烟草植株叶片的RNA，并将其反转录为cDNA，依照NtMYB305的CDS序列设计qPCR引物：

引物序列如：

qNtMYB305-F：AAACCATGGATAAAAAACCATGCAA(SEQ ID No.10)；

qNtMYB305-R：AAACTCGAGATCGCCGTTAAGCAATTGCA(SEQ ID No.11)。

利用qPCR酶(Vazyme ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix,型号:Q711-02)进行qPCR扩增，qPCR程序如下：94℃～96℃预变性5～6min；94℃～96℃变性20～40s，58℃～60℃退火30～40s，72℃延伸30～50s，40～45个循环。

qPCR反应体系及反应条件：

超表达NtMYB305转基因植株(OE-9，OE-10，OE-11)和沉默NtMYB305转基因植株(RI-1，RI-2，RI-3)的qPCR鉴定分析结果如图1所示。

由图1-A看出，qPCR结果表明超表达NtMYB305的转基因植株OE-9，OE-10，OE-11中的NtMYB305的表达量均高于对照组(Control)；由图1-B可以看出，相比于对照组，沉默NtMYB305的转基因植株RI-1，RI-2，RI-3中的NtMYB305的表达量出现了明显的下调。上述结果表明，依照本实施方案得到的3株独立的超表达NtMYB305转基因植株和3株独立的沉默NtMYB305转基因植株是阳性的。

实施例3

转基因植株的烟碱含量的测定

通过气相色谱方法测定上述阳性的超表达NtMYB305和沉默NtMYB305的转基因烟草植株以及对照组在打顶前和打顶2个周之后的叶片中的烟碱含量。测定结果如图2所示。

由图2的结果表明，在打顶前，三个超表达NtMYB305的转基因植株(OE-9，OE-10，OE-11)的叶片烟碱含量分别比在同一种植条件且生长时间一致的对照组多52.59％，68.24％和80.81％；打顶2个星期之后，三个超表达NtMYB305的转基因植株(OE-9，OE-10，OE-11)的叶片烟碱含量分别比对照组高48.24％，37.09％和27.49％。

相比于对照组，沉默NtMYB305的转基因烟草株系(RI-1，RI-2，RI-3)的叶片的烟碱含量在打顶前下降了80.81％，89.43％和78.56％，打顶2个周之后，沉默NtMYB305的转基因烟草株系的叶片的烟碱含量仍然比对照组烟草叶片烟碱含量低55.15％，55.75％和52.96％。这个结果表明烟草转录因子NtMYB305在调控烟草烟碱生物合成方面起到非常重要的作用。

实施例4

NtMYB305特异性识别并结合烟碱合成酶基因NtPMT启动子GAG区

根据实施3中的结果，可以得知NtMYB305在烟草烟碱生物合成方面起到一个正向调控作用，但是其作用机理仍不清楚。因此，设计如下引物：

NtMYB305-Exp5：AAACCATGGATAAAAAACCATGCAAC(NcoI)(SEQ ID No.12)；

NtMYB305-Exp3：AAACTCGAGAGCAATTGCATGGACCAGATA(XhoI)(SEQ IDNo.13)。

将含有正确连入pMD18-T载体的NtMYB305的CDS阳性单菌落的质粒为模板，以上述NtMYB305-Exp5/NtMYB305-Exp3为引物，利用高保真酶进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性3～4min；94℃变性35～45s，56-58℃退火35～45s，72℃延伸30～50s，34～36个循环；72℃保温5～10min。

PCR反应体系及反应条件：

使用1％～1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离上述步骤扩增的PCR产物，岁后使用凝胶回收试剂盒(Vazyme FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit，型号:DC301-01)进行切胶回收，得到含有酶切位点的转录因子NtMYB305的基因CDS片段，将扩增出的NtMYB305的CDS连入蛋白原核表达载体pET28b中，随后进行蛋白原核表达，得到带有His标签的NtMYB305蛋白。NtMYB305蛋白纯化后，经PAGE电泳的结果如图3-A所示。

QPT和PMT是两个控制烟碱合成的关键限速酶，其中PMT尤为重要。NtPMT的启动子有一个GAG区域，转录因子MYC2和ERFs都被证明作用于NtPMT启动子GAG区域，因此设计以下GAG探针，并通过凝胶迁移阻滞试验(EMSA)来证明NtMYB305与GAG的关系。

GAG-W5:CTGCACGTTGTAATGAATTTTTAACTATTATATTATATCGAGTTGCGCCCTCCACTC(SEQID No.14)；

GAG-W3:GAGTGGAGGGCGCAACTCGATATAATATAATAGTTAAAAATTCATTACAACGTGCAG(SEQID No.15)。

EMSA结果如图3-B所示，孔道1是没有加NtMYB305蛋白的阴性对照，孔道2是加入了10ug的NtMYB305蛋白，孔道3加入了20ug的NtMYB305蛋白。孔道1中没有形成蛋白和探针复合体，而孔道2和孔道3均形成了蛋白和探针复合体，且孔道3中的蛋白探针复合体比孔道2中的蛋白探针复合体更明显。这个EMSA结果表明了NtMYB305是特异性识别并结合NtPMT启动子的GAG区域。

实施例5

转录因子NtMYB305编码基因的同源基因序列如下所示：

NtMYB305a.1：

ATGGATAAAAAACCATGCAACTCTCAAGATGTTGAAGTAAGGAAAGGACCTTGGACTATGGAAGAGGATTTAATTCTCATTAACTACATTGCTAATCATGGTGAAGGTGTTTGGAATTCCTTAGCTAAATCTGCTGGTCTCAAACGTACTGGAAAAAGCTGTCGGCTCCGGTGGCTAAATTATCTCCGGCCTGATGTCCGGAGGGGAAATATTACACCTGAAGAACAACTTTTGATAATGGAACTGCATGCTAAGTGGGGAAACAGGTGGTCAAAAATTGCAAAGCATTTGCCTGGAAGAACAGATAATGAGATAAAGAACTATTGGAGGACAAGGATTCAGAAGCACATAAAGCAAGCAGAAAACATGAATGGACAAGCAGCTAATTCAGAGCAAAATGATCATCAAGAAGGAAGCAGTAGCCATATGTCGTCTGCTGGTCCAGCAGAGACTTACTCTCCAAGTTCATACTCTGCAAATATTGACACTACTTTTCAAGGCCCTTTTCTCACTGAAACAAATGACAACATTTGGAGCATGGAGGATATCTGGTCCATGCAATTGCTTAACGGCGATTAA(SEQ ID No.2)

NtMYB305a.2：

ATGGATAAAAAACCATGCAACTCTCAAGATGTTGAAGTGAGGAAAGGACCTTGGACTATGGAAGAGGATTTAATTCTCATTAACTACATTGCTAATCATGGTGAAGGTGTTTGGAATTCCTTAGCTAAATCTGCTGGTCTCAAACGTACCGGAAAAAGCTGTCGGCTCCGGTGGCTAAATTATCTCCGGCCTGATGTCCGGAGGGGAAATATTACACCTGAAGAACAACTTTTGATAATGGAACTGCATGCTAAGTGGGGAAACAGGTGGTCAAAAATTGCAAAGCATTTGCCAGGAAGAACAGATAACGAGATAAAAAACTATTGGAGGACAAGGATTCAGAAGCACATAAAGCAAGCAGAAAACATGAATGGACAAGTAGCTAATTCTGAGCAAAATGATCATCAAGAAGGAAGCAGTAGCCATATGTCGTCTGCTGGTCCGGCAGAGACTTACTCTCCAACTTCATACTCTGCGAATATTGACACTACTTTGCAAGGCCCTTTTCTCACTGAAACAAATGACAACATTTGGAGCATGGAGGATATCTGGTCCATGCAATTGCTTAACGGCGATTAA(SEQ ID No.3)

NtMYB305b.1：

ATGGATAAAAGAACATGCAATTCTCAAGATGTTGAAGTTAGGAAAGGTCCTTGGACTATGGAAGAAGATTTGATTCTCATCAATTACATAGCTAATCATGGTGATGGTGTTTGGAATTCCCTTGCTCGATCTGCTGGTCTCAAGCGTACTGGAAAAAGTTGTAGACTCCGGTGGCTAAACTATCTCCGGCCGGATGTTCGGAGGGGAAATATTACACCTGAAGAACAACTCTTGATTATGGAACTGCATGCCAAATGGGGAAATAAGTGGTCAAAAATTGCAAAGCATTTACCAGGAAGAACAGATAATGAGATAAAGAACTACTGGAGGACAAGGATTCAAAAGTACATTAAGCAAGCAGATCAAAGCATGAATATTAGACCATCATCAAATTCTGAGCACAACCATCATCAGCAAGCAAGCACAAGCCAAGCTTCTACTGGAAATAATACCATTGAAACCTACTCTCCACCATCTTACAATGGAAATAATATGGGCACTACTAATTTTCAGGCCAATTTTCCAGCTGAAACAAATGAAAATATTTGGAGCATGGAGGACCTTTGGTCCATGCAATTGCTTAATGATGCAACCAACTAA(SEQ ID No.4)

NtMYB305b.2：

ATGGATAATAAAAGAACATGCAATTCTCACGATGTTGAAGTTAGGAAAGGTCCTTGGACTATGGAAGAAGATTTGATTCTCATCAATTATATAGCTAATCATGGTGAAGGTGTTTGGAATTCCCTTGCTCGATCTGCTGGTCTGAAGCGTACCGGAAAAAGTTGTAGACTCCGGTGGCTAAACTATCTCCGGCCGGATGTTCGGAGGGGAAATATTACACCTGAAGAACAGCTCTTGATTATGGAACTGCATGCCAAATGGGGAAACAGGTGGTCAAAAATTGCAAAGCATTTGCCAGGAAGAACAGATAACGAGATAAAGAACTACTGGAGGACAAGGATTCAAAAGCACATTAAACAAGCAGATGAAGGCATGAATATTAGACCATCATCAAATTCTGAGAACAACCATCATCAACAAGCAAGCACAAGCCAAGTTTCTACTGAAAATAATACCATTGAAACCTACTCTCCATCATCTTACAATGGAAATAATATGGGCACAACTAATTTTCAGGCCAATTTTCCAGCTGAAACAAATGAAAATATTTGGAGCATGGAGGACCTTTGGTCCATGCAATTGCTTAATGATGCAACCAACTAA(SEQ ID No.5)

其余步骤同实施例1-4。

上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院烟草研究所

<120> 烟草转录因子NtMYB305及其在调控烟草烟碱生物合成中的应用

<141> 2021-04-09

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 569

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggataaaa aaccatgcaa ctctcaagat gttgaagtga ggaaaggacc ttggactatg 60

gaagaggatt taattctcat taactacatt gctaatcatg gtgaaggtgt ttggaattcc 120

ttagctaaat ctgctggtct caaacgtacc ggaaaaagct gtcggctccg gtggctaaat 180

tatctccggc ctgatgtccg gaggggaaat attacacctg aagaacaact tttgataatg 240

gaactgcatg ctaagtgggg aaacaggtgg tcaaaaattg caaagcattt gcctggaaga 300

acagataatg agataaagaa ctattggagg acaaggattc agaagcacat aaagcaagca 360

gaaaacatga atggacaagc agctaattca gagcaaaatg atcatcaaga aggaagcagt 420

agccatatgt cgtctgctgg tccagcagag acttactctc caagttcata ctctgcaaat 480

attgacacta cttttcaagg cccttttctc actgaaacaa atgacaacat ttggagcatg 540

gaggatatct ggtccatgca attgcttaa 569

<210> 2

<211> 579

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggataaaa aaccatgcaa ctctcaagat gttgaagtaa ggaaaggacc ttggactatg 60

gaagaggatt taattctcat taactacatt gctaatcatg gtgaaggtgt ttggaattcc 120

ttagctaaat ctgctggtct caaacgtact ggaaaaagct gtcggctccg gtggctaaat 180

tatctccggc ctgatgtccg gaggggaaat attacacctg aagaacaact tttgataatg 240

gaactgcatg ctaagtgggg aaacaggtgg tcaaaaattg caaagcattt gcctggaaga 300

acagataatg agataaagaa ctattggagg acaaggattc agaagcacat aaagcaagca 360

gaaaacatga atggacaagc agctaattca gagcaaaatg atcatcaaga aggaagcagt 420

agccatatgt cgtctgctgg tccagcagag acttactctc caagttcata ctctgcaaat 480

attgacacta cttttcaagg cccttttctc actgaaacaa atgacaacat ttggagcatg 540

gaggatatct ggtccatgca attgcttaac ggcgattaa 579

<210> 3

<211> 579

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggataaaa aaccatgcaa ctctcaagat gttgaagtga ggaaaggacc ttggactatg 60

gaagaggatt taattctcat taactacatt gctaatcatg gtgaaggtgt ttggaattcc 120

ttagctaaat ctgctggtct caaacgtacc ggaaaaagct gtcggctccg gtggctaaat 180

tatctccggc ctgatgtccg gaggggaaat attacacctg aagaacaact tttgataatg 240

gaactgcatg ctaagtgggg aaacaggtgg tcaaaaattg caaagcattt gccaggaaga 300

acagataacg agataaaaaa ctattggagg acaaggattc agaagcacat aaagcaagca 360

gaaaacatga atggacaagt agctaattct gagcaaaatg atcatcaaga aggaagcagt 420

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attgacacta ctttgcaagg cccttttctc actgaaacaa atgacaacat ttggagcatg 540

gaggatatct ggtccatgca attgcttaac ggcgattaa 579

<210> 4

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggataaaa gaacatgcaa ttctcaagat gttgaagtta ggaaaggtcc ttggactatg 60

gaagaagatt tgattctcat caattacata gctaatcatg gtgatggtgt ttggaattcc 120

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gatcaaagca tgaatattag accatcatca aattctgagc acaaccatca tcagcaagca 420

agcacaagcc aagcttctac tggaaataat accattgaaa cctactctcc accatcttac 480

aatggaaata atatgggcac tactaatttt caggccaatt ttccagctga aacaaatgaa 540

aatatttgga gcatggagga cctttggtcc atgcaattgc ttaatgatgc aaccaactaa 600

<210> 5

<211> 603

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggataata aaagaacatg caattctcac gatgttgaag ttaggaaagg tccttggact 60

atggaagaag atttgattct catcaattat atagctaatc atggtgaagg tgtttggaat 120

tcccttgctc gatctgctgg tctgaagcgt accggaaaaa gttgtagact ccggtggcta 180

aactatctcc ggccggatgt tcggagggga aatattacac ctgaagaaca gctcttgatt 240

atggaactgc atgccaaatg gggaaacagg tggtcaaaaa ttgcaaagca tttgccagga 300

agaacagata acgagataaa gaactactgg aggacaagga ttcaaaagca cattaaacaa 360

gcagatgaag gcatgaatat tagaccatca tcaaattctg agaacaacca tcatcaacaa 420

gcaagcacaa gccaagtttc tactgaaaat aataccattg aaacctactc tccatcatct 480

tacaatggaa ataatatggg cacaactaat tttcaggcca attttccagc tgaaacaaat 540

gaaaatattt ggagcatgga ggacctttgg tccatgcaat tgcttaatga tgcaaccaac 600

taa 603

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggataaaa aaccatgcaa c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atcgccgtta agcaattgca t 21

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaagcggccg catggataaa aaaccatgca ac 32

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaaggcgcgc catcgccgtt aagcaattgc at 32

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaaccatgga taaaaaacca tgcaa 25

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaactcgaga tcgccgttaa gcaattgca 29

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaaccatgga taaaaaacca tgcaac 26

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaactcgaga gcaattgcat ggaccagata 30

<210> 14

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctgcacgttg taatgaattt ttaactatta tattatatcg agttgcgccc tccactc 57

<210> 15

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gagtggaggg cgcaactcga tataatataa tagttaaaaa ttcattacaa cgtgcag 57

Claims

1.烟草转录因子NtMYB305，其特征在于，所述烟草转录因子NtMYB305的编码基因如SEQID NO:1所示；该编码基因的同源基因NtMYB305a.1、NtMYB305a.2、NtMYB305b.1、NtMYB305b.2分别由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示核苷酸序列组成。

2.含有如权利要求1所述的编码基因及其同源基因的表达载体。

3.如权利要求1所述的烟草转录因子NtMYB305在调控烟草烟碱生物合成中的应用。

4.如权利要求1所述的编码基因及其同源基因在调控烟草烟碱生物合成中的应用。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，用于培育高烟碱含量的转基因烟草品种。

6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，用于培育低烟碱含量的转基因烟草品种。