CN106577219A - 一种植物转基因种子筛选方法 - Google Patents

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刘真真
苗爽
闵康侃
杨玲
胡海涛
张维林
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Abstract

本发明公开了一种植物转基因种子筛选方法：在无菌培养皿中放置一张或多张无菌滤纸，加入含抗生素的1/2Ms培养液，使每一张无菌滤纸都被溶液湿润；含抗生素的1/2Ms培养液中，1/2Ms培养液为不添加有机物与蔗糖的1/2Ms培养液；将待筛选种子不消毒或者用酒精消毒后，播种在无菌培养皿中的滤纸表面上，经培养出现表型分离，筛选出阳性植株。本发明配制特殊的/2Ms培养液用于筛选转基因种子，培养液中的营养成分能充分供应种子生长，在后续幼苗移栽后，生长速率和植物株高均与传统培养基培养方法没有差异，解决了采用含有抗生素水来筛选种子导致的植株生长缓慢的弊端，同时又保留了水系培养液培养的快速、高效、简洁，而且成本低的优点。

Description

一种植物转基因种子筛选方法
技术领域
本发明属于转基因技术，特别的，属于一种植物转基因种子筛选方法。
背景技术
随着植物转基因技术被广泛应用于现代生物技术研究及农业生产中，如何快速、便捷、高通量的筛选与种植转基因植物是其中的一个重要环节。
传统方法是将T0代种子播种于含相应抗生素的培养基中，生长至表型分离时，即阳性植株呈正常绿色，阴性株则出现黄化。然而此法有部分缺陷：首先，需制备培养基并湿热灭菌，倒制平板时加抗生素。继续生长至适宜苗龄时，移出阳性植株，是目前较为普遍的方法。整个过程较为繁琐，用时长，能源成本较高，同时对无菌操作技术也有较高要求；其次，将组培苗移至营养土中时，在去除粘附于根系上的培养基时会损伤根，导致组培苗成活率显著降低；第三，种子消毒必须彻底，与清水相比，在培养基中的长时间培养更易导致污染。有鉴于此，需要开发快速、高效与简洁的播种及筛选转基因种子技术。
中国专利CN 103651078A采用含有抗生素水湿润滤纸替代传统培养基的方式，有效解决了上述三点不足。虽然此法解决了多个缺陷，然而，该方法仍然导致了一些新问题：移栽小苗虽然成活率高，但相比按照传统1/2Ms培养基平板培养(中移出的苗，生长速率偏慢，株高相对矮小。我们推测由于用水代替培养基，在萌发后小苗生长过程中，无法摄取充足的营养，导致生长发育受到一定的延滞。
发明内容
为了克服含有抗生素水湿润滤纸替代传统培养基导致植株生长缓慢的新问题，本发明提供一种新型的植物转基因种子筛选技术，采用新的转基因种子播种培养基，它有效解决了新方法所致的植株生长缓慢的弊端，而且筛选方法快速、高效、简洁。
本发明采用的技术方案是：
一种植物转基因种子筛选方法，所述方法包括以下步骤：
(1)在无菌培养皿中放置一张或多张无菌滤纸，加入含抗生素的1/2Ms培养液，使每一张无菌滤纸都被溶液湿润；
(2)将待筛选种子不消毒或者用酒精消毒后，播种在无菌培养皿中的滤纸表面上；
所述的种子为T1代烟草种子或T1代拟南芥转基因种子。
所述方法还可以包括步骤(3)：播种后的种子进行黑暗培养2～3天发芽后再进行光照培养4～5天，培养至出现表型分离，长出绿色叶子即为阳性转基因幼苗，出现黄化的为阴性幼苗，即筛选得到阳性植株。
所述步骤(3)优选按以下步骤操作：播种后的种子处于黑暗环境，温度24±1℃，湿度为60％-75％下黑暗培养2-3天进行发芽；
对种子进行黑暗培养至种子萌发至刚露出胚根，且胚根的长度为1-3毫米时，进行光照培养，光照培养的条件为：温度24±1℃、光照强度2000Lux，光周期为16h，直至转基因幼苗长出两片绿色子叶且阴性对照出现黄化后，即呈现表型分离，可筛选出阳性幼苗。
筛选出来的阳性幼苗后续进行移栽，一般转基因幼苗长出两片绿色子叶且阴性对照出现黄化后进行移栽，移栽时将将阳性幼苗播于营养土中，盖上保鲜膜以减少水分蒸发，继续光照培养，培养条件为：温度24±1℃、光照强度20000Lux，光周期为16h。
所述步骤(1)中，含抗生素的1/2Ms培养液中，抗生素为潮霉素或卡钠霉素，可分别用于筛选含抗潮霉素或抗卡钠霉素基因的转基因种子。
进一步，当种子为T1代烟草种子的时候，其中该转基因种子中部分种子含有抗潮霉素的基因，步骤(1)的含抗生素的1/2Ms培养液中，抗生素为潮霉素。
当种子为T1代拟南芥种子的时候，其中该转基因种子中部分种子含有抗卡钠霉素的基因，步骤(1)的含抗生素的1/2Ms培养液中，抗生素为卡钠霉素。
本发明中，含抗生素的1/2Ms培养液的用量是使每克无菌滤纸含6～7mL含抗生素的1/2Ms培养液。
进一步，所述抗生素为潮霉素时，潮霉素的浓度为20mg/L。
所述抗生素为卡钠霉素时，卡钠霉素的浓度为75mg/L。
进一步，所述含抗生素的1/2Ms培养液中，1/2Ms培养液为不添加有机物与蔗糖的1/2Ms培养液，进一步，所述不添加有机物与蔗糖的1/2Ms培养液的配方如下表1所示：
表1不添加有机物与蔗糖的1/2Ms培养液配方
所述步骤(2)中，将待筛选种子不消毒或者用酒精消毒，不消毒的种子可以直接播种，在一些优选的实施方式中，也可以将待筛选种子用酒精消毒后播种，所述酒精消毒是将种子用体积分数75％酒精消毒30秒～1分钟，无菌水冲洗2～4次，即得到酒精消毒后的种子用于播种。
本发明方法中，待筛选种子不需要次氯酸钠消毒处理。
申请人经过多次实验，发现不添加有机物与蔗糖的1/2Ms培养基对种子萌发与小苗生长无任何影响。是否添加蔗糖和有机物是不需种子消毒的关键环节。如果采用正常的1/2Ms培养基，种子不经消毒，3天后即现可见的微生物污染；如果采用不含蔗糖与有机的特殊培养基，则在8天时，转基因与非转基因苗有明显区别表型时，培养基中未现肉眼可见的污染。
本发明中，T1代种子是目标基因被插入到组织或细胞基因组中获得的转基因苗的当代种子，例如，当通过组织培养的方法，对某个植物的愈伤组织进行农杆菌介导法把某个目的外源基因插入到该植物的组织细胞中的基因序列中的某一个位置，然后通过培养获得小苗，该小苗为T0代苗，T0代苗的种子为T1代种子。在T1代的种子中，有些含有目的基因，有的不含有目的基因。另外，在进行目的基因转化中，可以把一些抗抗生素的基因与目的基因连接，如果转化的种子中含有抗生素基因，就表示目的基因也被包含在该转基因植物的种子中，当然，单独的抗潮霉素或卡钠霉素的基因也可以被转入到植物中。常用的筛选标记为抗潮霉素或卡钠霉素的基因，这些基因的序列为现有公知的技术，转基因植物的获得方法也是本领域的公知技术。
本发明的有益效果在于，配制含有抗生素的不添加有机与蔗糖的1/2Ms培养液用于筛选转基因种子，培养液中的营养成分能充分供应种子生长，在后续幼苗移栽后，生长速率和植物株高均与传统培养基培养方法没有差异，即后期生长发育不会受到影响，解决了CN 103651078 A采用含有抗生素水来筛选种子导致的植株生长缓慢的弊端，同时又保留了水系培养液培养的快速、高效、简洁，而且成本低的优点。
本发明方法综合了传统培养基培养和CN 103651078 A采用含有抗生素水筛选的各自的优点，克服了两者各自的缺陷，比传统培养基培养方法快速高效，比CN 103651078 A方法对植物生长无影响，而且无需消毒操作，操作更加简便。
具体实施方式
现以潮霉素抗性转基因烟草种子为例来对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。
表1不含有机物与蔗糖的1/2Ms培养液配方
实施例1：潮霉素抗性转基因烟草种子T1代的筛选(采用正常消毒法)
1.实验材料
含无菌滤纸的无菌培养皿、1.0mL无菌枪头(剪去枪头顶端)、1.5mL无菌离心管。
2.种子的播种步骤如下(所有操作步骤均在非超净工作台上完成)：
①取待鉴定种子，除去残留的植物组织，倒入1.5mL无菌离心管中，加入1mL的75％乙醇处理30sec；
②弃去75％乙醇，加次氯酸钠消毒15min，用无菌蒸馏水洗涤5次；弃蒸馏水；
③提供含无菌滤纸的培养皿；
④用不添加有机物与蔗糖的1/2Ms(潮霉素的浓度为20mg/L)营养液3.8mL将培养皿内的无菌滤纸打湿；使每克无菌滤纸含7ml的营养液
⑤用无菌1.0mL枪头将种子均匀播种于上述培养皿中的无菌纸表面上；
⑥置培养皿于暗处，培养2-3d，待种子萌发。温度24±1℃，湿度为60％-75％
⑦发芽后光照培养4-5天出现表型分离移栽。光照培养的条件为：温度24±1℃、光照强度2000Lux，光周期为16h，
阳性植株的移栽
待种子萌发至刚露出胚根后，光照培养2-4d，培养的条件为：温度24±1℃、光照强度20000Lux，光周期为16h，直至转基因幼苗长出两片绿色子叶且阴性对照出现黄化后，将叶片呈绿色的幼苗播于营养土中，盖上保鲜膜以减少水分蒸发，继续光照培养，培养条件为：温度24±1℃、光照强度20000Lux，光周期为16h。
结果
由于T1代转基因烟草种子为杂合体种子，经抗生素筛选后发生分离，一般来讲，对于单拷贝的转基因株系，其分离比例大约为3:1，平均200颗烟草T1代种子出现绿叶，48颗种子出现黄化，另有5颗种子没有正常发芽。
在出现明显的区别时，转基因植株叶片呈绿色，根更长(平均1.3cm)，而阴性植株则正好相反，根较短(平均0.4cm)，叶色发黄。
说明不添加有机物与蔗糖的1/2Ms是可以成功筛选转基因植株的，但是对植株后期生长是否有影响，需要进一步评估。
实施例2：三种播种方法对植株萌发率与后期生长的影响
为了评估3种方法(传统方法、CN 103651078A方法、与本专利申请所用方法(实施例1))对后期生长的影响，分别用3种方法筛选转基因材料，当有明显表型分离时，各移栽幼苗30棵，对比移栽成活率、15与30天株高，发现在移栽时成活率均达到95％以上，方差分析没有显著差异，但是在15天时，传统方法和实施例1的平均株高2.8与2.76cm，而CN103651078A方法是2.1cm，在30天时，传统方法和实施例1的平均株高11.01与11.25cm，CN103651078A的株高4.6cm，传统方法和实施例1平均株高差异不显著，而与CN 103651078A方法均存在差异显著性。表明对于发芽后植株后期的生长发育，本发明采用的不添加有机物与蔗糖的1/2Ms培养液与传统培养基培养方法相当，对植株的生长与发育没有影响。并且明显优于优于CN 103651078A采用的清水滤纸培养。
所述传统方法的播种培养方法是：
①取待鉴定种子，除去残留的植物组织，倒入1.5mL无菌离心管中，加入1mL的75％乙醇处理1分钟；
②弃去75％乙醇，加次氯酸钠消毒15min，用无菌蒸馏水洗涤5次；弃蒸馏水；
③将种子播种于1/2Ms培养基上，其中潮霉素的浓度为40mg/L
④黑暗培养2-3d，待种子萌发。
⑤发芽后光照培养4-5天出现表型分离移栽。
所述CN 103651078A方法的播种培养方法如下
①取待鉴定种子，除去残留的植物组织，倒入1.5mL无菌离心管中，加入1mL的75％乙醇处理30sec；
②弃去75％乙醇，加次氯酸钠消毒15min，用无菌蒸馏水洗涤5次；弃蒸馏水；
③提供含无菌滤纸的培养皿；
④用潮霉素的浓度为40mg/L的溶液将培养皿内的无菌滤纸打湿；使每克无菌滤纸含7ml的溶液
⑤用无菌1.0mL枪头将种子均匀播种于上述培养皿中的无菌纸表面上；
⑥置培养皿于暗处，培养2-3d，待种子萌发。温度24±1℃，湿度为60％-75％
⑦发芽后光照培养4-5天出现表型分离移栽。光照培养的条件为：温度24±1℃、光照强度2000Lux，光周期为16h，
实施例3：Ms营养液中是否加蔗糖与有机对不消毒的T1代烟草种子萌发率、污染率与筛选效果的影响。
提供含无菌滤纸的无菌培养皿，提供蒸馏水作为溶剂配制的40mg/ml含潮霉素的溶液，将配制的全1/2Ms(Ⅰ)、无蔗糖1/2Ms(Ⅱ)、无有机1/2Ms(Ⅲ)与无蔗糖和有机的1/2Ms(Ⅳ)稀释潮霉素至终浓度20mg/l，分别用上述4种含潮霉素的1/2Ms溶液3.8ml将培养皿内的无菌滤纸充分湿润，使每克无菌滤纸含7ml的营养液，每种营养液平行做5个培养皿。未消毒的种子直接播种，黑暗培养2～3d，在胚根露出时统计发芽率。待种子萌发至刚露出胚根后，光照培养2-4d后，统计绿叶和黄化叶数目，污染的数目，并计算比率。培养的条件为：温度24±1℃、光照强度20000Lux，光周期为16h)。其他的条件和步骤与实施例1相同。结果如下表2所示：
表2：不同营养液对烟草T1代转基因种子发芽和筛选结果影响
所述无蔗糖1/2Ms(Ⅱ)中，是在无蔗糖和有机的1/2Ms(Ⅳ)的基础上添加50mg/L肌醇，0.25mg/L维生素B3，0.05mg/L维生素B1，0.25mg/L维生素B6，1mg/L甘氨酸
所述无有机1/2Ms(Ⅲ)中，是在无蔗糖和有机的1/2Ms(Ⅳ)的基础上添加30g/L的蔗糖。
从表2中可以看出，在1/2Ms溶液中，添加蔗糖和有机对于不完全消毒的种子在筛选过程中是否污染非常关键。在全组分1/2Ms作为筛选培养液中，当播种3天后，几乎在种子接触滤纸的部位，全部出现较深色的斑点，而滤纸空白处(无种子的位置)则没有，表明污染来源于种子而不是操作环境。微生物的生长需有碳源，如果1/2Ms中不添加蔗糖/葡萄糖与有机等含碳物质，势必会抑制或减少微生物生长。考虑到种子与组织再生不同的是：种子在发芽后可利用无机物与光照合成所需的糖与有机物，因此不添加糖类与有机物，对种子的萌发与生长没有影响。实验结果表明，在不添加任何糖类与有机的条件下，转基因材料出现明显区别于非转基因材料特征表型时，只有极少数的种子出现污染。这一结果表明，对种子不消毒直接播种是可以鉴定转基因植株的。当然，有时候需要延长小苗的生长时，最好用75％酒精消毒30-60sec，无菌水洗2-4遍，但无需次氯酸钠消毒。
实施例4：潮霉素抗性转基因烟草种子T1代的筛选(仅用酒精消毒)
根据实施例3的结果，发现如果种子不经过消毒程序，虽相比全营养条件下污染率低很多，可还是会出现一定的污染。同时也发现，污染仅出现于与种子接触部位，说明污染来源于种子，而不是空气。其二，空气中虽然有一定的污染源，但可能比种子表面所携带的少很多，在较短时间内，且营养不充分的条件下无法增殖。从上述结果和分析来看，在自然实验桌面，而不是超净工作台上，应该可满足播种的无菌操作要求。
依据正常的程序，种子消毒首先需要酒精消毒30秒至1分钟，然后次氯酸钠消毒15分钟，由于次氯酸钠氧化性强，消毒结束后需要用无菌水清洗4-5遍，整个过程需要20分钟，在播种过程中是一个比较耗时的步骤。如果删除种子消毒过程中次氯酸钠消毒步骤，可明显提高效率。由实施例3结果可知，在这种特殊培养基条件下，可有效减少污染几率。因此我们尝试种子仅用酒精消毒，然后用无菌水清洗的方式观察是否可有效抑制污染。
实施的具体步骤为：
1.实验材料
含无菌纸巾的无菌培养皿、1.0mL无菌枪头(剪去枪头顶端)、1.5mL无菌离心管。
不含蔗糖与有机的1/2Ms(含潮霉素20mg/L)的培养基
2.种子的播种步骤如下(所有操作步骤均在非超净工作台上完成)：
①取待鉴定种子，除去残留的植物组织，倒入1.5mL无菌离心管中，加入1mL的75％乙醇处理1min；
②弃去75％乙醇，用无菌蒸馏水1ml分别洗涤1次，2次、3次与4次；弃蒸馏水；
③提供含无菌滤纸的培养皿；
④添加含有潮霉素的的1/2Ms(不含蔗糖和有机，潮霉素的浓度为20mg/L)6ml，使每克无菌滤纸含7ml的潮霉素溶液；
⑤用无菌1.0mL枪头将种子均匀播种于上述培养皿中的无菌纸表面上；
⑥置培养皿于暗处，培养2-3d，待种子萌发。温度24±1℃，湿度为60％-75％
⑦发芽后光照培养4-5天出现表型分离。光照培养的条件为：温度24±1℃、光照强度2000Lux，光周期为16h
表3
通过实施例4结果，我们可以看出，酒精消毒后，只有无菌水清洗1次以上即对种子的萌发与小苗生长无影响。

Claims (8)

1.一种植物转基因种子筛选方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
(1)在无菌培养皿中放置一张或多张无菌滤纸，加入含抗生素的1/2Ms培养液，使每一张无菌滤纸都被溶液湿润；所述含抗生素的1/2Ms培养液中，1/2Ms培养液为不添加有机物与蔗糖的1/2Ms培养液；
(2)将待筛选种子不消毒或者用酒精消毒后，播种在无菌培养皿中的滤纸表面上。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法可以包括步骤(3)：播种后的种子进行黑暗培养2～3天发芽后再进行光照培养4～5天，培养至出现表型分离，长出绿色叶子即为阳性转基因幼苗，出现黄化的为阴性幼苗，即筛选得到阳性植株。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的待筛选种子为T1代烟草种子或T1代拟南芥转基因种子。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，含抗生素的1/2Ms培养液中，抗生素为潮霉素或卡钠霉素，可分别用于筛选含抗潮霉素或抗卡钠霉素基因的转基因种子。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述含抗生素的1/2Ms培养液中，抗生素为潮霉素时，潮霉素的浓度为20mg/L，含抗生素的1/2Ms培养液的用量是使每克无菌滤纸含6～7mL含抗生素的1/2Ms培养液；
所述抗生素为卡钠霉素时，卡钠霉素的浓度为75mg/L，含抗生素的1/2Ms培养液的用量是使每克无菌滤纸含6～7mL含抗生素的1/2Ms培养液。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(3)按以下步骤操作：播种后的种子处于黑暗环境，温度24±1℃，湿度为60％-75％下黑暗培养2-3天进行发芽
对种子进行黑暗培养至种子萌发至刚露出胚根，且胚根的长度为1-3毫米时，进行光照培养，光照培养的条件为：温度24±1℃、光照强度2000Lux，光周期为16h，直至转基因幼苗长出两片绿色子叶且阴性对照出现黄化后，即呈现表型分离，可筛选出阳性幼苗。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于筛选出来的阳性幼苗后续进行移栽，转基因幼苗长出两片绿色子叶且阴性对照出现黄化后进行移栽，移栽时将将阳性幼苗播于营养土中，盖上保鲜膜以减少水分蒸发，继续光照培养，培养条件为：温度24±1℃、光照强度20000Lux，光周期为16h。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述含抗生素的1/2Ms培养液中，1/2Ms培养液为不添加有机物与蔗糖的1/2Ms培养液；所述不添加有机物与蔗糖的1/2Ms培养液的配方为：NH4NO3 825mg/L；H3BO3 3.1mg/L；CuSO4·5H2O 0.012mg/L；KNO3 950mg/L；KI 0.41mg/L；ZnSO4·7H2O 4.36mg/L；KH2PO4 85mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.12mg/L；EDTA-Na2 18mg/L；CaCl2220mg/L；CoCl2·6H2O 0.012mg/L；FeSO4·7H2O 14mg/L；MgSO4·7H2O 185mg/L；MnSO4·4H2O11.3mg/L。
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