CN1839680A - 抗芜菁花叶病毒Hc－Pro基因转化榨菜的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过Hc－Pro基因转化获得抗芜菁花叶病毒榨菜的方法，将经过2次继代培养的子叶诱导的愈伤组织作为转化受体；将带有Hc－Pro基因的根癌农杆菌培养液与愈伤组织共培养；将转化后的愈伤组织在加有抗生素的培养基上进行不断筛选，然后进行分化和植株再生。与现有技术相比，本发明的有益效果是：Hc－Pro基因的转化是在细胞水平上进行的，提高了转化效率和转基因植株的遗传稳定性，避免了嵌合转基因植株的产生；获得的是带有的Hc－Pro基因植株。

Description

抗芜菁花叶病毒Hc-Pro基因转化榨菜的方法

技术领域

本发明涉及一种生物工程领域，特别涉及一种抗芜菁花叶病毒Hc-Pro基因转化榨菜的方法。

背景技术

榨菜是我国的重要蔬菜作物之一，它畅销全国，远销世界各地。病毒病是榨菜的主要病害，发生比较普遍。病毒病是由芜菁花叶病毒和黄瓜花叶病毒所引起，其中芜菁花叶病毒(TuMV)是最为突出的问题之一。历史上的流行年份，大面积平均病株率在20％以上，重病地区和田块高达50％以上，甚至全田菜头无收。近年来在我国的主要榨菜产区连年发生，更有逐年加重的趋势。因此，各地要求解决榨菜病毒病的呼声相当强烈，榨菜抗病毒病材料的培育显得尤为迫切和重要。

植物育种学研究表明，通过传统的有性杂交方法可以获得抗病毒新品种，但是首先要求用于杂交的亲本是抗源材料。而大量研究表明：榨菜包括芥菜所有品种、品系均无对TuMV的抗性材料。我们进行了长期的芥菜种质资源收集和抗病品种的筛选，至今未能找到良好抗源材料。因此，要从自然资源中寻找抗源材料，来培育抗病品种显得困难重重。

植物基因工程技术的出现，给病毒病的防治带来了新希望。将植物病毒的核酸成份或以病毒为作用目标的DNA片段导入宿主植物，已经成功地得到了对病毒侵染具有抗性的植株。例如将病毒外壳蛋白(Coat Protein，CP)基因转入烟草，获得了延迟发病的抗病毒基因烟草，这一研究引起了世界各地科学家关注。对转化外壳蛋白(CP)基因的研究也因此取得了很大地进展。但就其抗病毒机制，大部分观点是源于病原物获得的抗病性抗性，即病毒侵染植物的循环中，病毒基因产物在不适宜的时间，以不适宜的数量和方式表达，从而干扰病毒的侵染能力。但是，CP基因在一些作物上效果不明显，甚至没有。近年来的分子学研究表明，植物对病毒的抗性不是由于过量表达外源基因的结果，而是由转录后沉默产生过程中的RNA分子所介导的，因此也称之为RNA介导的病毒抗性。Hc-Pro(helper component-proteinase)是一个在马铃薯Y病毒侵染循环中起作用的多功能蛋白，属于马铃薯Y病毒属的一类RNA病毒，因此，Hc-Pro基因比CP基因的作用更直接，效果更明显。通过在榨菜上转化Hc-Pro基因，可获得抗芜菁花叶病毒的榨菜材料，这对榨菜生产及种质资源创新具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种高效的Hc-Pro基因转化榨菜获得抗芜菁花叶病毒的方法。

为了解决上述问题，本发明是通过以下技术方案实现的：一种通过Hc-Pro基因转化获得抗芜菁花叶病毒榨菜的方法，依次包括以下步骤：

(1)将经过2次继代培养的子叶诱导的愈伤组织作为转化受体；

(2)将带有Hc-Pro基因的根癌农杆菌培养液与愈伤组织共培养；

(3)将转化后的愈伤组织在加有抗生素的培养基上进行不断筛选，然后进行分化和植株再生。

步骤(1)中的2次继代培养依次包括以下步骤：

(1)将榨菜种子用自来水冲洗后用75％医用酒精搅拌灭菌1min，蒸馏水冲洗3次后在1％NaClO水溶液中搅拌15min，无菌水冲洗4-5次，在超净工作台上将种子播于MS+0.1mg/L BA播种培养基上，于23-25℃下黑暗处培养。

(2)发芽后在同样温度下16h/d连续光照培养。

(3)将8天苗龄的无菌苗子叶切成2mm左右小片放入愈伤组织诱导培养基23-25℃暗处培养。

步骤(2)在24℃下进行共培养2天。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：Hc-Pro基因的转化是在细胞水平上进行的，提高了转化效率和转基因植株的遗传稳定性，避免了嵌合转基因植株的产生；获得的是带有的Hc-Pro基因植株。

附图说明

图1为本发明的质粒含串连Hc-Pro基因和抗除草剂Bar基因；

图2为本发明的转化植株的分子学鉴定；

图2中：1-Marker，2-对照(无任何模板)，3-质粒DNA，4-对照(非转化DNA)，5-8-转化株DNA；

图3为本发明的转化植株的分子学鉴定；

图3中：1-Marker，2-对照(无任何模板)，3-质粒DNA，4-对照(非转化DNA)，5-8-转化株DNA；

图4为本发明的田间接种鉴定和ELASA分析；

图4中：CK1-阴性对照；CK2-阳性对照；CK3，CK4-正常材料对照；CK5，CK6-转化后无目的基因材料对照；1-5-含有目的基因材料。

具体实施方式

本发明的方法主要步骤是：首先通过诱导子叶获得转化受体愈伤组织，用带有Hc-pro基因的根癌农杆菌侵染愈伤组织，然后将农杆菌侵染过的愈伤组织放入共培养培养基进行共培养。之后，愈伤组织经过筛选、分化和生根最终获得再生植株。

实施例1：

本实施例中以多年自交的榨菜雄性不育系和保持系为材料，取7-8天的无菌种子苗子叶进行愈伤组织的诱导。

本实施例中所使用的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株是EHA105(Plh-IR)(购自浙江大学生物所)。质粒含串连Hc-Pro基因和抗除草剂Bar基因(如图1)。

愈伤组织的诱导：将籽粒饱满的经过多年自交榨菜种子(浙江大学蔬菜所)用自来水冲洗后用75％医用酒精搅拌灭菌1min，蒸馏水冲洗3次后在1％NaClO水溶液中搅拌15min，无菌水冲洗4-5次，在超净工作台上将种子播于MS+0.1mg/L BA播种培养基上。23-25℃下黑暗处发芽后在同样温度下16h/d连续光照培养。将8天苗龄的无菌苗子叶切成2mm左右小片放入愈伤组织诱导培养基(I)23-25℃暗处培养，每隔16d继代一次，将继代2次的愈伤组织作为转化受体，转化时愈伤组织已经培养的总时间为48天。

工程菌液的准备及侵染：挑取农杆菌EHA105(Plh-IR)单菌落接种于15mL含100mg/L壮观酶素的YEB液培养基中，28℃下振荡培养过夜。第二天用感染培养基(III)将过夜培养的农杆菌培养物稀释至OD₆₀₀约为0.1，用以侵染共培养后的榨菜愈伤组织。继代2次的愈伤组织在菌液中浸泡10min，期间不断在28℃下以100rpm速度振荡，浸泡时间是10min。

Hc-Pro基因转化农杆菌EHA105(Plh-IR)具体的操作步骤是按照(Methodsin Enzymology)，1987.153：292-305所提供的方法。

农杆菌与外植体共培养：将农杆菌侵染过的愈伤组织放入共培养培养基(IV)在24℃下进行共培养2天。

筛选、分化及生根：共培养后，将愈伤组织分散在加有选择压(BASTA和头孢霉素)的筛选培养基(V)中筛选两次，然后转到加有400mg/L的头孢霉素的分化培养基(II)中分化。分化出的芽在加有300mg/L头孢霉素1/2MS培养基中生长至3-4片真叶，进而在加有300mg/L头孢霉素的生根培养基中(VI)生根。以上培养温度为25℃左右，愈伤组织的诱导和筛选都是在黑暗条件下进行的，从愈伤组织的分化开始进入光照培养，光照强度为50μmol·s^-1·m^-2，光照时间为16h/d。

表1各种培养基组成

培养基类型	成份
		诱导培养基I	MS基本培养基+0.25mg/L NAA+0.25mg/L 2，4-D+0.5mg/L BA
分化培养基II	MS基本培养基+0.2mg/L NAA+2mg/L BA
		感染培养基III	1/2MS基本培养基(液体，无琼脂，pH5.2)
共培养培养基IV	MS基本培养基+0.25mg/L NAA+0.25mg/L 2，4-D+0.5mg/L BA
		筛选培养基V	I型培养基+0.15％BASTA+400mg/L头孢霉素
生根培养基VI	1/2MS基本培养基+0.1mg/L NAA

转化植株的分子学鉴定：

分子生物学鉴定：本实施例中选取通过愈伤组织再生的植株叶片提取DNA进行PCR和Sounthern blot检测。

经检测，在转化植株中扩增到了与质粒DNA大小一致的基因Hc-Pro及筛选标记基因Bar的片断(图2、图3)。而同样的片断没有在非转化植株以及不含任何模板的扩增体系中得到。由此可知，质粒的T-DNA已经进入了榨菜受体的基因组。

田间接种鉴定和ELASA分析：取纯化过的芜菁花叶病毒接种的已有明显表现症状的烟草新叶，用磷酸缓冲液研磨提取病毒。将提取液以摩擦接种的方法接种于榨菜(对照及转化株)新叶上。放置于隔离蚜虫的温室。取接种芜菁花叶病毒10d的对照及转化材料的新叶1克，进行ELASA分析。结果表明含有目的基因的植株较对照植株芜菁花叶病毒含量明显偏低，虽然没有达到完全阴性，但对病毒病有一定的抗性，并且其病毒病症状表现对照有较大差异(图4)。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

                             序列表

SEQ ID NO：1

1    gtcacaagat tgtgcacttt agtgcagcag gagccaactt ctggaaaggc tttgacagat

61   gttttctcgc ataccgtagt gacaatcgcg agcatacatg ctattcaggg ttagatgtta

121  ctgagtgcgg cgaagtggca gcactgatgt gtttggctat gttcccatgc ggaaagataa

181  cctgccctga ctgtgtaaca gatagtgagc tatcccaagg acaagcaagc ggaccatcta

241  tgaagcacag gttaacgcag ctgcgcgatg tcatcaagtc aagctaccca cgcttcaagc

301  atgcagtgca gatactggac aggtatgagc aatcactgag cagtgcaaac gagaactacc

361  aagatttcgc agaaatccag agtataagcg atggagttga gaaagctgca ttcccacacg

421  tcaacaagct aaacgcaata ttgatcaaag gggccacagc gacaggggag gaattctcgc

481  aggccacgaa gcatttactc gagatagcac gatacctgaa gaacagaact gagaacattg

541  agaagggttc actgaagtcc tttcgcaaca agatttccca gaaagcgcac atcaacccaa

601  cactaatgtg cgataaccag ctcgatagaa atggaaattt catatggggt gagagaggat

661  accatgcaaa acgattcttc agcaactact ttgaaataat cgatccaaag caaggctaca

721  cccaatacga gacaagagtg gtaccaaatg ggtcacggaa acttgcaatc ggcaaactaa

781  tagtcccaac gaacttcgaa gttttaagag accagatgaa aggcgaaccg gtagaaccat

841  acccagtaac agtcgagtgt gtgagcaagt tacagggtga cttcgtccat gcatgttgtt

901  gtgtaacaac agaatcaggc gacccagtct tgtctgaaat aaaaatgcca accaaacacc

961  acctagtgat tggcaacagc ggcgatccaa agtacataga tctccctgag atcgaggaga

1021 ataaaatgta catagcaaaa gaaggttatt gttacatcaa catcttccta gctatgctag

1081 tgaatgtcaa ggaatcgcag gcaaaggagt tcacgaaagt tgttagggac aaactagttg

1141 gcgaacttgg caagtggccc actctgttag atgtagcaac cgcttgttat ttcctgaagg

1201 tattttaccc agacgttgct aacgccgaat tgccacgcat gttagtggat cataagacaa

1261 agataattca tgtcgttgat tcatatgggt cactgtcaac tggatatcac gtccttaaga

1321 caaacactgt ggaacaactc attaaattca cgagatgcaa tttggaatca agcttgaagc

1381 actaccgcgt cggaggaaca gagtgggagg acactcatgg agccagcaac atagatgatc

1441 cacagttgg

Claims (3)

1、一种通过Hc-Pro基因转化获得抗芜菁花叶病毒榨菜的方法，其特征在于依次包括以下步骤：

(1)将经过2次继代培养的子叶诱导的愈伤组织作为转化受体；

(2)将带有Hc-Pro基因的根癌农杆菌培养液与愈伤组织共培养；

(3)将转化后的愈伤组织在加有抗生素的培养基上进行不断筛选，然后进行分化和植株再生。

2、根据权利要求1所述的Hc-Pro基因转化获得抗芜菁花叶病毒榨菜的方法，其特征在于：步骤(1)中的2次继代培养依次包括以下步骤：

(1)将榨菜种子用自来水冲洗后用75％医用酒精搅拌灭菌1min，蒸馏水冲洗3次后在1％NaClO水溶液中搅拌15min，无菌水冲洗4-5次，在超净工作台上将种子播于MS+0.1mg/L BA播种培养基上，于23-25℃下黑暗处培养；

(2)发芽后在同样温度下16h/d连续光照培养；

(3)将8天苗龄的无菌苗子叶切成2mm左右小片放入愈伤组织诱导培养基23-25℃暗处培养。

3、根据权利要求1所述的Hc-Pro基因转化获得抗芜菁花叶病毒榨菜的方法，其特征在于：步骤(2)在24℃下进行共培养2天。

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