CN102796739B - TuMV-CP基因片段介导的RNAi载体在培育抗TuMV转基因植物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了TuMV-CP基因片段介导的RNAi载体在培育抗TuMV转基因植物中的应用。本发明保护序列表的序列4所示的RNA片段及其编码序列。所述RNA分子可以干扰芜菁花叶病毒RNA的复制，从而抑制芜菁花叶病毒。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中表达所述RNA分子，得到对芜菁花叶病毒抗性高于所述出发植物的转基因植物。本发明对于培育抗芜菁花叶病毒植物（特别是十字花科植物）具有重大价值。
Description
技术领域
本发明涉及TuMV-CP基因片段介导的RNAi载体在培育抗TuMV转基因植物中的应用。
背景技术
芜菁花叶病毒（TuMV）属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）。病毒粒子呈弯曲线形，长约720nm，宽约15～20nm，由95%的外壳蛋白和5%的RNA构成。病毒核酸为单链正义RNA，约由10000个核苷酸组成。病毒寄主范围广泛，在人工接种条件下，可侵染43科156属，超过318种双子叶植物及部分单子叶植物。
马铃薯Y病毒属内大多数病毒寄主范围狭窄，但TuMV寄主范围却很宽，侵染许多重要经济作物，特别是包括白菜、甘蓝、油菜等在内的许多十字花科蔬菜和油料饲料作物，是仅次于黄瓜花叶病毒（CMV）侵染大田蔬菜最重要的病毒。油菜是我国主要的油料作物。近年来，在我国油菜主产区病毒病发生有日益加重流行趋势。发病田块发病率一般为20%～30%，重的发病率在50%以上，造成油菜籽产量的重大损失，病毒病的发生同时还导致油菜籽品质降低。我国白菜因TuMV危害平均每年造成5%的产量损失，有些年份减产10%以上，病害严重的地块几乎绝收。
抗芜菁花叶病毒病一直是我国芸薹属作物抗病育种的攻关目标之一。由于芸薹属作物中广谱抗性基因的匮乏，寻找有效、稳定的抗病毒基因，一直是遗传育种研究的重要目标。
发明内容
本发明的目的是提供TuMV-CP基因片段介导的RNAi载体在培育抗TuMV转基因植物中的应用。
本发明保护序列表的序列4所示的RNA片段（可为双链RNA也可为单链RNA）。所述RNA片段可以干扰芜菁花叶病毒RNA的复制，从而抑制芜菁花叶病毒。
本发明还保护序列表的序列3所示的双链DNA片段（序列表的序列4所示的RNA片段反转录得到的cDNA片段，CP基因片段）。
本发明还保护一种含有特异DNA片段的质粒；所述特异DNA片段包括DNA片段Ⅰ、DNA片段Ⅱ和位于所述DNA片段Ⅰ和所述DNA片段Ⅱ之间的间隔片段；所述DNA片段Ⅰ和所述DNA片段Ⅱ反向互补；所述DNA片段Ⅰ如序列表的序列3所示。
所述特异DNA片段自上游至下游可依次包括如下元件：启动子、所述DNA片段Ⅰ、所述间隔片段、所述DNA片段Ⅱ和终止子。
所述质粒可为将所述特异DNA片段插入植物表达载体pBBBasta的多克隆位点（如XmaI）得到的重组质粒。所述质粒可为将所述特异DNA片段顺时针正向插入植物表达载体pBBBasta的多克隆位点（如XmaI）得到的重组质粒。
所述植物表达载体pBBBasta可为将序列表的序列6所示的双链DNA分子插入载体pBBR1MCS-2的SspI酶切位点，取代质粒pBBR1MCS-2的SspI酶切位点之间的小片段得到的重组质粒。
所述特异DNA片段具体可为用限制性内切酶NotI酶切重组质粒pHannibal+CP377RNAi得到的约3.71kb的DNA片段。所述重组质粒pHannibal+CP377RNAi为在pHannibal载体的XhoI和KpnI酶切位点之间插入所述DNA片段Ⅰ，ClaI和XbaI酶切位点之间插入所述DNA片段Ⅱ得到的重组质粒。
本发明还保护所述RNA分子、所述DNA分子或以上任一所述质粒可用于在培育抗芜菁花叶病毒的转基因植物中的应用。
本发明还保护所述RNA分子、所述DNA分子或以上任一所述质粒在制备芜菁花叶病毒抑制剂中的应用。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中表达所述RNA分子，得到对芜菁花叶病毒抗性高于所述出发植物的转基因植物。所述“在出发植物中表达权利要求1所述RNA分子”的实现方式具体如下：将所述质粒导入出发植物。所述出发植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为十字花科植物，更具体可为拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥。
本发明还保护一种芜菁花叶病毒抑制剂，它的活性成分为所述RNA分子、所述DNA分子或以上任一所述质粒。
以上任一所述芜菁花叶病毒具体可为芜菁花叶病毒BJ-C4株系。
尽管本发明只用了BJ-C4株系进行了抗病接种鉴定，但所述RNA序列是基于多个芜菁花叶病毒株系的保守序列，具有广谱性，所以对其它芜菁花叶病毒株系也具有相同的抑制效果。
本发明对于培育抗芜菁花叶病毒植物（特别是十字花科植物）具有重大价值。
附图说明
图1为重组质粒pHannibal+CP377RNAi的结构示意图。
图2为重组质粒pBBBTu-CP377的结构示意图。
图3为双酶切验证pHannibal+CP377RNAi载体；1：pHannibal载体；2：重组质粒pHannibal+CP377(-)；3：重组质粒pHannibal+CP377RNAi；M：1Kb plus DNA ladder。
图4为酶切验证重组质粒pBBBTu-CP377；A:Mlu I酶切重组质粒pBBBTu-CP377B:EcoRI酶切重组质粒pBBBTu-CP377。
图5为部分幼苗PCR鉴定的结果；1：哥伦比亚生态型拟南芥；2-17：待鉴定的幼苗；M：100bp plus DNA ladder。
图6为转基因拟南芥的抗病鉴定-表型观察。
图7为转基因拟南芥的抗病鉴定-半定量PCR；1-6：鉴定6K1基因；7-12：鉴定SAND基因；1，7：空白对照；2，8：哥伦比亚生态型拟南芥；3，9：4-2株系；4，10：4-6株系；5，11：13-2株系；6，12：30-1株系；M：100bp plus DNA ladder。
图8为转基因拟南芥的抗病鉴定-荧光定量PCR。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
哥伦比亚生态型拟南芥（Col-0）：购自Arabidopsis Biological Resource Center。
限制性内切酶XmaI购自NEB公司，其余限制性内切酶购自Takara公司。定量PCR试剂购自Takara公司。Fast pfu DNA Polymerase，Easy Taq酶和各类分子量标记购自全式金公司。连接酶购自Promega公司。Trizol提取液购自Invitrogen公司。M-MLV反转录酶购自Takara公司。质粒小提试剂盒和PCR纯化试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。胶回收试剂盒购自Axygen公司。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
芜菁花叶病毒BJ-C4株系（即引用文献中的“TuMV-C4”；GenBank:HQ446217中的毒株名为BJ-C4；是北京地区TuMV主要的流行强致病株系）：中国农业科学院蔬菜花卉所；参考文献：冯兰香、徐玲、刘佳、钮心格、李秀生，北京地区大白菜芜菁花叶病毒株系的鉴定，中国蔬菜，1988，4:11-13；公众可从北京农业生物技术研究中心获得。
pHannibal载体（即引用文献中的“The vector pHANNIBAL”）：公众可从CSIRO（http://www.csiro.au/pi）获得；参考文献：Wesley S V,Helliwell C A,Smith NA.Construct design for efficient,effective and high-throughput genesilencing in plants[J].The Plant Journal,2001,27(6):581-590。
农杆菌GV3101:pMP90，又称农杆菌GV3101(pMP90)，即引用文献中的Agrobacterium strain GV3101(pMP90)：公众可从北京农业生物技术研究中心获得；参考文献：Koncz,C.and Schell,J.(1986)The promoter of TL-DNA gene5 controlsthe tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type ofAgrobacterium binary vector.Mol.Gen.Genet.204,383-396。
质粒pBBR1MCS-2（即引用文献中的“vector pBBR1MCS-2）：公众可以从北京农业生物技术研究中心获得；参考文献：Kovach ME,Elzer PH,Hill DS,Robertson GT，Farris MA,Roop RM 2nd,Peterson KM.Four new derivatives of thebroad-host-range cloning vector pBBR1MCS,carrying differentantibiotic-resistance cassettes.Gene.1995 Dec1;166(1):175-6。
质粒pDHB321.1：公众可以从北京农业生物技术研究中心获得；参考文献：BlockMD,Botterman J,Vandewiele M,Dockx J,Thoen C,GosseléV,Movva NR,ThompsonC,Montagu MV,Leemans J.Engineering herbicide resistance in plants byexpression of a detoxifying enzyme.EMBO J.1987 Sep;6(9):2513-8。
实施例1、具有抑制芜菁花叶病毒功能的片段的发现
对GenBank登录的122个TuMV株系进行序列比对，发现芜菁花叶病毒的CP基因（CP基因如序列表的序列2所示，编码序列表的序列1所示的外壳蛋白）存在保守区，在该保守区内最终确定了377bp的片段（命名为CP377片段，如序列表的序列3所示，为序列表的序列2所示CP基因的自5’末端第446-822位核苷酸），预期通过该片段编码的RNA抑制芜菁花叶病毒。CP377片段转录的RNA为序列表的序列4所示的单链RNA。
实施例2、RNAi表达载体的构建
一、植物表达载体pBBBasta的构建
植物表达载体pBBBasta（简称pBBBasta载体）载体的构建方法如下：
1、用限制性内切酶SacI酶切质粒pDHB321.1，回收约2100bp的片段（SacI酶切之间的序列如序列表的序列6所示，含“LB-bar表达框-RB”）。也可直接人工合成两端带有SacI酶切位点的序列表的序列6所示的双链DNA分子，然后用限制性内切酶SacI酶切，回收约2100bp的片段（含“LB-bar表达框-RB”，SacI酶切位点之间的如序列如序列表的序列6所示）。
2、用限制性内切酶SspI酶切质粒pBBR1MCS-2，回收约4440bp的片段（含卡那霉素抗性基因的骨架）。
3、将步骤1回收的约2100bp的片段补平，与步骤2回收的约4440bp的片段连接，得到pBBBasta载体。根据测序结果，对pBBBasta载体进行结构描述如下：在质粒pBBR1MCS-2的SspI酶切位点插入了序列表的序列6所示的双链DNA分子。
二、RNAi表达载体的构建
1、合成序列表的序列3所示的双链DNA分子。
2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，采用CP377F和CP377R组成的引物对，采用高保真酶Fastpfu DNA Polymerase作为DNA聚合酶，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
CP377 F：5'-CCGCTCGAGTCTAGATAAACGGAATGTGGGTGATGAT-3'；
CP377 R：5'-GGGGTACCATCGATGTCCTCGGTCGTATGCCTCTC-3'。
CP377F和CP377R中，下划线标注酶切识别序列，其中“TCTAGA”为限制性内切酶XbaI的酶切识别序列，“ATCGAT”为限制性内切酶ClaI的酶切识别序列，“CTCGAG”为限制性内切酶Xho I的酶切识别序列，“GGTACC”为限制性内切酶KpnI的酶切识别序列。
PCR扩增条件：95℃ 2min；95℃ 20s、52℃ 20s、72℃ 15s，35个循环；72℃ 5min。
通过1.5%的琼脂糖电泳纯化回收PCR扩增产物（约406bp）。
3、用限制性内切酶Xba I和Cla I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶Xba I和Cla I双酶切pHannibal载体，回收载体骨架（约5.81kb）。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pHannibal+CP377(-)。
6、用限制性内切酶Xho I和Kpn I双酶切步骤2的PCR扩增产物，得到酶切产物。
7、用限制性内切酶Xho I和Kpn I双酶切重组质粒pHannibal+CP377(-)，回收载体骨架（约6.18kb）。
8、将步骤6的酶切产物和步骤7的载体骨架连接，得到重组质粒pHannibal+CP377RNAi。根据测序结果，对重组质粒pHannibal+CP377RNAi进行结构描述如下：在pHannibal载体的Xho I和Kpn I酶切位点之间插入了正义RNA片段的编码序列（即序列表的序列5所示的双链DNA分子），Cla I和Xba I酶切位点之间插入了反义RNA片段的编码序列（即与序列表的序列5自5’末端第7至383反向互补的双链DNA分子）。重组质粒pHannibal+CP377RNAi的结构示意图见图1。
9、用限制性内切酶NotI酶切重组质粒pHannibal+CP377RNAi，回收约3.71kb的DNA片段（该DNA片段命名为DNA片段甲；该DNA片段自上游至以下依次包括CaMV35S启动子、正义RNA片段的编码序列、间隔内含子序列、反义RNA片段的编码序列和OCS终止子；该DNA片段两端均为粘末端），采用Klenow大片段和dGTP，在DNA片段的粘性末端添补2个G。
10、用限制性内切酶Xma I酶切植物表达载体pBBBasta，回收约6.56kb的DNA片段（两端均为粘末端），采用Klenow大片段和dCTP，在DNA片段的粘性末端添补2个C。
11、将步骤9得到的DNA片段和步骤10得到的DNA片段连接，得到重组质粒pBBBTu-CP377（又称RNAi表达载体）。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下：在植物表达载体pBBBasta的Xma I酶切位点顺时针正向插入了DNA片段甲。重组质粒pBBBTu-CP377的结构示意图见图2。重组质粒pBBBTu-CP377在宿主中转录后得到序列表的序列4所示的双链RNA分子。
二、RNAi表达载体的构建过程中的酶切鉴定
1、用限制性内切酶Xho I、Xba I分别双酶切pHannibal载体、重组质粒pHannibal+CP377(-)和重组质粒pHannibal+CP377RNAi，然后进行琼脂糖凝胶电泳。结果见图2。pHannibal载体酶切成约829bp和约4995bp的两个片段，重组质粒pHannibal+CP377(-)酶切成约1194bp和约4995bp的两个片段，重组质粒pHannibal+CP377RNAi酶切成约1571bp和约5001bp的两个片段。酶切鉴定结果表明，重组质粒pHannibal+CP377RNAi构建成功。结果见图3。
2、用限制性内切Mlu I或限制性内切酶EcoR I酶切重组质粒pBBBTu-CP377，然后进行琼脂糖凝胶电泳。结果见图4。
因pBBBasta载体本身有一个Mlu I酶切位点，DNA片段甲有一个Mlu I酶切位点，酶切后显示2条带的为阳性克隆。根据酶切条带大小判断DNA片段甲为顺时针正向插入还是反向插入。DNA片段甲正向插入得到的重组质粒的酶切条带为约6494bp和约3780bp（图4A），DNA片段甲反向插入得到的重组质粒的酶切条带为约9733bp和约541bp。结果表明，DNA片段甲为正向插入。
限制性内切酶EcoR I酶切显示3条带的为阳性克隆。根据酶切条带大小判断DNA片段甲为顺时针正向插入还是反向插入。DNA片段甲正向插入得到的重组质粒的酶切条带为约7955bp、约1477bp和约842bp（图4B），DNA片段甲反向插入得到的重组质粒的酶切条带为约7375bp、约1477bp和约1422bp。结果表明，DNA片段甲为正向插入。
实施例3、转基因植物的获得和鉴定
一、转基因植物的获得
1、将重组质粒pBBBTu-CP377导入农杆菌GV3101:pMP90，得到重组农杆菌。
2、通过花序浸渍法(Clough,S.J.,and Bent,A.F.(1998).Floral dip:asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant J 16,735-743.)将重组农杆菌导入哥伦比亚生态型拟南芥，得到T0代种子。
3、收获T0代植株自交得到的种子，播种后长出T1代幼苗，在幼苗长出两片子叶后喷洒浓度为1-2‰(体积比)的Basta除草剂，可以存活并继续生长的植株即为T1代阳性植株。共获得64株T1代阳性植株。
4、取T1代阳性植株剪取叶片进行如下分子鉴定：提植株叶片的基因组DNA，用CP377F和CP377R组成的引物对对来自各个样本进行PCR鉴定（约406bp），PCR鉴定为阳性的植株即转基因植株。共获得53株PCR鉴定阳性的植株。部分幼苗PCR鉴定的结果见图5。
5、收获PCR鉴定阳性的T1代植株自交得到的种子，播种后长出T2代幼苗，在幼苗长出两片子叶后喷洒浓度为1-2‰(体积比)的Basta除草剂，对于某个T1代植株来说，如果其T2代幼苗对于Basta除草剂的抗性呈现3:1分离比（抗性即存活，无抗性即死亡），则该T1代植株为单拷贝植株。共获得30株单拷贝植株。
6、将鉴定为单拷贝植株的T1代植株得到的T2代植株分别单株自交并收获种子，播种后长出T3代幼苗，在幼苗长出两片子叶后喷洒浓度为1-2‰(体积比)的Basta除草剂，对于某个T2代植株来说，如果其T3代植株对于Basta除草剂均为抗性，该T2代植株为纯合的转基因植株，该T2代植株及其子代为纯合的转基因株系。
T0代种子经筛选后获得的T1代阳性株为各自独立的转基因株系（如4#株系、13#株系、30#株系等）。如果一株杂合的T1代植株自交获得N株纯合的转基因T2代植株，所以该N株植株的遗传背景完全一致，属于同一个转基因株系。该N株植株及其各自的后代为姐妹系（如4#株系中存在4-2株系、4-5株系和4-6株系三个姐妹系）。
共获得8个纯合的独立转基因株系。
二、转空载体植物的获得
1、用限制性内切酶Not I酶切pHannibal载体，回收约2.96kb的DNA片段，采用Klenow大片段和dGTP，在DNA片段的粘性末端添补2个G。
2、用限制性内切酶XmaI酶切植物表达载体pBBBasta，回收约6.56kb的DNA片段（两端均为粘末端），采用Klenow大片段和dCTP，在DNA片段的粘性末端添补2个C。
3、将步骤1得到的DNA片段和步骤2得到的DNA片段连接，得到对照质粒。
4、用对照质粒代替重组质粒pBBBTu-CP377进行步骤一，得到转空载体植株。
三、转基因拟南芥的抗病鉴定
将3个纯合的转基因植株株系（4#株系、13#株系和30#株系）的T2代植株的种子进行鉴定，将转空载体植株的T3代植株的种子和哥伦比亚生态型拟南芥的种子作为对照，进行相同的鉴定，每个株系16棵苗，具体步骤如下：
1、将种子播种于人工气候室，待植株长至8-10片叶莲座期时，通过人工摩擦接种芜菁花叶病毒BJ-C4株系，每棵苗接种两片较大叶片，摩擦接种几分钟后立即用清水冲洗叶片，接种苗在人工气候室中网罩隔离观察。
2、从接种开始计时，20天后的照片见图6（A、B、C）。哥伦比亚生态型拟南芥逐渐变黄死亡；而3个转基因株系的植株除部分叶片发黄较严重外，整株仍很健壮，且能继续抽苔结实。转空载体植株的表型与哥伦比亚生态型拟南芥的表型一致。接种40天后，哥伦比亚生态型拟南芥和转空载体植株全部死亡，3个转基因株系的存活率均为100%。
四、转基因拟南芥的病毒检测
将3个转基因植株株系（4-2株系、4-6株系、13-2株系和30-1株系）的T2代植株的种子进行鉴定，将转空载体植株的T3代植株的种子和哥伦比亚生态型拟南芥的种子作为对照，进行相同的鉴定，每个株系16棵苗，具体步骤如下：
1、将种子播种于人工气候室，待植株长至8-10片叶莲座期时，通过人工摩擦接种芜菁花叶病毒BJ-C4株系，每棵苗接种两片较大叶片，摩擦接种几分钟后立即用清水冲洗叶片，接种苗在人工气候室中网罩隔离观察。
2、从接种开始计时，20天后，取各株系的非接种叶片，提取总RNA并反转录为cDNA。
3、以步骤2得到的cDNA为模板，以拟南芥SAND基因（At2G28390）为内参，以TuMV的6K1基因为检测对象，进行半定量分析。
扩增6K1基因的引物对如下：
6K1 F：5'-GCAAAGAGACAGTCCGAGCAA-3'；
6K1 R：5'-CTGATGGTAGACTGTAGGTTCCAC-3'。
扩增SAND基因的引物对如下（靶序列约298bp）：
SAND F：5'-AAGGCAGGAAATCACCAGGT 
-3'；
SAND R：5'-TTAACGCATATGGAAGGGGAAGAC-3'。
内参引物根据SAND家族设计，其上游引物跨过内含子（一条下划线是外显子a，两条下划线是外显子b），以避免因基因组DNA污染所造成的影响。
所设计的引物经NCBI的BLAST检测。
半定量PCR反应程序：94℃ 5min；94℃ 30s、57℃ 30s、72℃ 30s，20次循环；72℃ 7min。
PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
结果见图7。在内参基因表达量差不多一致的时候，哥伦比亚生态型拟南芥内能检测到病毒的大量存在，而在3个转基因株系植株内几乎检测不到病毒的复制，说明转基因植株体内病毒RNA的积累量明显少于哥伦比亚生态型拟南芥。转空载体对照植株内的病毒RNA积累量与哥伦比亚生态型拟南芥基本一致。
4、以步骤2得到的cDNA为模板，以拟南芥SAND基因（At2G28390）为内参，以TuMV的6K1基因为检测对象，进行荧光定量PCR。
扩增6K1基因的引物对和扩增SAND基因的引物对同步骤3。
荧光定量PCR反应程序：95℃ 30秒;95℃ 5秒，57℃ 30秒，72℃ 30秒，40个循环。
用TuMV的6K1基因的相对转录水平表征病毒的相对积累量，结果见图8。与半定量PCR分析结果相同。在哥伦比亚生态型拟南芥内能检测到大量病毒。相对于哥伦比亚生态型拟南芥，4个转基因株系内检测到病毒的积累量微乎其微。转空载体对照植株内的病毒RNA积累量与哥伦比亚生态型拟南芥基本一致。结果表明，通过将RNAi表达载体导入植物，可以抑制TuMV，从而大大提高植物对TuMV的抗性。
Claims (7)
1.序列表的序列4所示的RNA片段在培育抗芜菁花叶病毒的转基因植物中的应用，所述植物为拟南芥。
2.序列表的序列3所示的DNA片段在培育抗芜菁花叶病毒的转基因植物中的应用，所述植物为拟南芥。
3.含有特异DNA片段的质粒，所述特异DNA片段自上游至下游依次为如下元件：启动子、DNA片段Ⅰ、间隔片段、DNA片段Ⅱ和终止子；所述DNA片段Ⅰ和所述DNA片段Ⅱ反向互补；所述DNA片段Ⅰ如序列表的序列3所示。
4.权利要求3所述质粒在培育抗芜菁花叶病毒的转基因植物中的应用，所述植物为拟南芥。
5.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将权利要求3中所述质粒导入出发植物中表达权利要求1中所述RNA片段，得到对芜菁花叶病毒抗性高于所述出发植物的转基因植物；所述出发植物为拟南芥。
6.序列表的序列4所示的RNA片段、序列表的序列3所示的DNA片段、权利要求3所述质粒在制备芜菁花叶病毒抑制剂中的应用。
7.一种芜菁花叶病毒抑制剂，它的活性成分为权利要求3所述的质粒。
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