CN110093441A - 一种快速筛选烟草种子转基因阳性株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速筛选烟草转基因阳性株的方法，技术要点如下：成熟的转基因烟草收种时，直接剪下果荚采收，保护果荚不被破坏，在超净工作台内，将果荚撕开直接将种子均匀播撒至培养基上；培养基组分为：Murashige and Skoog(MS)2.215g/L+琼脂8g/L+潮霉素18mg/L，pH值为5.8；培养至2周，观察烟草苗的生长高度，此时的幼苗长势会出现高、低等差异，选择生长较快、植株高、有真叶的苗进行假植移栽。并进行后续PCR阳性鉴定，该方法阳性筛选率达91％。本发明的优点是成本低、操作简单、快速高效。其他抗性标记进行筛选也可借鉴该方法。

Description

一种快速筛选烟草种子转基因阳性株的方法

技术领域

本发明涉及一种快速筛选烟草种子转基因阳性株的方法，属于烟草转基因育种检测技术领域。

背景技术

转基因技术也叫基因重组技术，是指利用人工方法将某些外源基因转移到生物基因组中，使目的基因稳定表达并获得目的性状的技术(薛菲等,2014,吉林蔬菜,39-41)。自1983年首例转基因烟草培育成功以来，该技术相继用于番茄、马铃薯和棉花等的转化，并取得了成功，目前转基因工程技术在各领域都有快速发展。利用转基因的育种技术手段，与传统育种技术相比，有效的提高了农作物的产量，增强了农作物抗多种病虫害的能力，使得农作物的品种更加高产和优质，提高了农业生产的产量及经济效益，并显著加快了育种的进程；在医疗和医药领域也有着广阔的应用前景(骆翔等,2014,中国农学通报,30234-240)。

转基因技术已成为生物技术研究的核心领域，是植物基因功能解析和农作物遗传改良的重要手段之一。目前以抗虫、抗病等为目的的转基因烟草研究已取得丰硕的成果，有些品种已商业化或大田种植，在病虫害的防治方面发挥了重要作用。同时烟草作为重要的模式植物，在生物技术转基因的研究中起着非常重要的作用，目前烟草转基因技术非常成熟，应用广泛。在植物转基因过程中，转基因后代通常根据表达载体上的选择标记进行筛选，目前常用的选择标记有抗卡那霉素的NPTII基因、抗潮霉素的HPT基因和抗除草剂的Bar基因等(屈聪玲等,2017,山西农业科学45,1376-1380)。

通常在收到转基因T0代种子之后，为了筛选到纯合转基因植株，首先需要利用50％次氯酸钠或15％双氧水对种子进行消毒处理，然后在含有相应抗生素的培养基上筛选。种子进行消毒处理时，需要反复进行清洗，尤其在种子量多的情况下，消毒处理过程就会很繁琐，种子会有损失，时间掌握不好还会降低出芽率，而且消毒不彻底容易染菌。

发明内容

本发明旨在提供一种快速筛选烟草种子转基因阳性株的方法，主要针对含有潮霉素(Hyg)抗性标记的转基因烟草，从而弥补现有技术的不足。

本发明所提供的筛选烟草种子转基因阳性株的方法，包括如下的步骤：

1)对待检测的成熟的烟草，直接剪下果荚采收，将果荚撕开直接将将待检测的种子均播撒至培养基上进行萌发，其中使用的培养基组分如下：Murashige and Skoog(MS)2.215g/L、琼脂8g/L、潮霉素18mg/L，pH值为5.8；萌发生长培养环境为26℃，相对湿度60％，2000勒克斯光照16h/日；

2)在组织培养室培养至2周，确定生长快、植株高、有真叶的苗为转基因阳性株。

对步骤2)的有真叶的苗进行假植移栽，并进行后续PCR阳性鉴定；

其中PCR阳性鉴定的引物对信息如下：

上游引物F：5'-ATGATGATGGGTCAAGATGAG-3'(SEQ ID NO:1)，

下游引物R：5'-GCTGAACTTGTGGCCGTTTAC-3'(SEQ ID NO:2)，

反应体系为20μL，包括Taq DNA聚合酶10μL、引物F 1μL、引物R 1μL、模版DNA 2μL、去离子水6μL；

反应条件为：95℃3min；30cycle(95℃30s；58℃30s；72℃30s)；72℃10min。

本发明方法操作简单快速，无需对种子进行消毒处理，经试验验证，使用的1/2MS培养基不含蔗糖，培养基内含有抗生素，加上果荚天然的保护作用，无需消毒，也不易染菌，其最佳的潮霉素筛选浓度为18mg/L。该方法操作简单、快速、高效，省去消毒处理步骤，种子萌发快，生长周期缩短，尤其适合大规模的转基因种子筛选。

附图说明

图1：转基因烟草收种的照片

图2：不同浓度潮霉素的筛选图

图3：转基因苗筛选比较图

图4：转基因烟草PCR鉴定电泳图

具体实施方式

本发明提供一种快速简便，不需要对种子消毒处理的筛选转基因烟草植株的方法。不需要使用次氯酸钠或过氧化氢进行种子消毒处理，通过使用1/2MS培养基，潮霉素筛选浓度为18mg/L，直接播撒种子进行筛选培养。本发明方法省去了消毒处理过程，快速简便，尤其适合大规模的转基因种子筛选。

以下通过具体实施范例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1

(1)正常烟草植株收种时，一般将种子收集于种子袋中，在本发明方法中，针对成熟的转基因烟草植株，在收种用于后代阳性植株筛选时，注意只需剪下果荚完整保存，不要破坏果荚(如图1)。针对剩余种子，可在种子袋及管中正常保存。

(2)配制筛选培养基，其组分为：MS2.215g/L+琼脂8g/L，潮霉素的筛选浓度分别为0mg/L、5mg/L、10mg/L、18mg/L、20mg/L，pH值为5.8。种子不需要进行消毒处理，在超净工作台内，将收集的转基因烟草果荚，轻轻撕开一小口，直接将种子均匀播撒至培养基上。在组织培养室培养至2周，生长培养环境：26℃，相对湿度60％，2000勒克斯光照16h/日。

如图2和图3所示，在培养基中潮霉素的筛选浓度为18mg/L时，同一培养皿的幼苗长势会出现高、低等差异，差异非常明显，选择生长较快、植株高或有真叶的苗进行PCR阳性鉴定发现，阳性率高达91％(图3)；但是在潮霉素的筛选浓度分别为0mg/L、5mg/L、10mg/L时，植株长势较好，差异不是特别明显；在浓度20mg/L时植株长势有差异，但是出苗率明显降低。经试验验证，本发明方法中潮霉素的最佳筛选浓度为18mg/L。

(3)配制筛选培养基，其组分为：MS 2.215g/L+琼脂8g/L+潮霉素18mg/L，在组织培养室培养至2周，观察烟草苗的生长高度，此时同一培养皿的幼苗长势会出现高、低等差异，选择生长较快、植株高或有真叶的苗进行假植移栽(如图3)，并进行后续PCR阳性鉴定，来验证本发明方法的准确性。

(4)对筛选出的100株烟苗进行PCR阳性鉴定，使用目的基因和载体的交叉引物进行检测，上游引物F：5'-ATGATGATGGGTCAAGATGAG-3'，下游引物R：GCTGAACTTGTGGCCGTTTAC，扩增产物长度约为960bp。使用全式金TaqDNA聚合酶进行PCR反应，反应体系为20μL，包括Taq DNA聚合酶10μL、引物F 1μL、引物R 1μL、模版DNA 2μL、去离子水6μL。反应条件为：95℃3min；30cycle(95℃30s；58℃30s；72℃30s)；72℃10min。经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，100株中有91株为阳性植株，表明本发明的筛选方法的阳性率高达91％(如图4)。

实验表明，该方法比常规种子消毒处理方法操作简单、快速、高效，不需要进行种子消毒处理，以及点种等稍复杂的步骤，节约时间，缩短了植株生长周期，无论小量筛选还是大规模筛选，均适用。其他抗性标记进行筛选时亦可借鉴该方法。

序列表

<110> 中国农业科学院烟草研究所

<120> 一种快速筛选烟草种子转基因阳性株的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgatgatgg gtcaagatga g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctgaacttg tggccgttta c 21

Claims (6)

1.一种筛选烟草种子转基因阳性株的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)对待检测的成熟的烟草，直接剪下果荚采收，将果荚撕开直接将将待检测的种子均播撒至培养基上进行萌发，其中使用的培养基组分如下：Murashige and Skoog 2.215g/L、琼脂8g/L、潮霉素18mg/L，pH值为5.8；

2)在组织培养室培养至2周，确定生长快、植株高、有真叶的苗为转基因阳性株。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中萌发生长培养环境为26℃，相对湿度60％，2000勒克斯光照16h/日。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中的有真叶的苗进行假植移栽，并进行PCR阳性鉴定。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的PCR阳性鉴定的引物对中上游引物F的序列为SEQ ID NO:1，下游引物R的序列为SEQ ID NO:2。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的PCR阳性鉴定的反应体系为20μL，包括Taq DNA聚合酶10μL、引物F 1μL、引物R 1μL、模版DNA 2μL、去离子水6μL。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的PCR阳性鉴定的反应条件为：95℃3min；30cycle(95℃30s；58℃30s；72℃30s)；72℃10min。