KR20080105437A

KR20080105437A - 버크홀데리아 씨비엠비40 균주, 씨비피비-에이치오디 균주및 씨비피비-에이치아이엠 균주, 및 이를 이용한식물생장촉진방법

Info

Publication number: KR20080105437A
Application number: KR1020070053022A
Authority: KR
Inventors: 사동민; 김충우; 임우종; 김경아; 이이
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2007-05-31
Filing date: 2007-05-31
Publication date: 2008-12-04

Abstract

본 발명은 신규한 버크홀데리아 (Burkholderia sp.) CBMB40 균주, CBPB-HOD 균주 및 CBPB-HIM 균주, 및 이를 이용한 식물생장촉진방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 공중 질소를 고정하고, 토양 내 불용성 인산을 가용화시키며, 식물생장촉진 호르몬 (IAA, Cytokinin) 및 N-아실-호모세린-락톤 (N-acyl-homoserine-lactone, AHL)을 생산하여 식물의 생장을 촉진하고 내병성을 증진시키는 버크홀데리아 CBMB40 균주, CBPB-HOD 균주 및 CBPB-HIM 균주, 및 이를 이용한 식물생장촉진방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 식물생장촉진 균주들은 식물의 생산성 및 내병성을 증가시키므로, 미생물 비료제 등의 미생물 제제로 유용하게 사용될 수 있다.

버크홀데리아 CBMB40, 버크홀데리아 CBPB-HOD, 버크홀데리아 CBPB-HIM, 식물생장촉진 호르몬, N-아실-호모세린-락톤

Description

버크홀데리아 씨비엠비40 균주, 씨비피비-에이치오디 균주 및 씨비피비-에이치아이엠 균주, 및 이를 이용한 식물생장촉진방법 {Burkholderia sp. CBMB40 STRAIN, CBPB-HOD STRAIN AND CBPB-HIM STRAIN, AND METHOD FOR ENHANCING PLANT GROWTH USING THE SAME}

도 1은 본 발명의 신규한 버크홀데리아 CBMB40 균주의 병원균에 대한 길항작용을 분석한 결과 이다.

도 2 및 3은 본 발명의 신규한 버크홀데리아 CBMB40 균주, CBPB-HOD 균주 및 CBPB-HIM 균주가 분비하는 AHL을 TLC로 분석한 결과이다.

도 4는 본 발명의 신규한 버크홀데리아 CBMB40 균주, CBPB-HOD 균주 및 CBPB-HIM 균주에 의한 캐놀라 종자의 뿌리 생장 및 뿌리 정착화를 분석한 그래프이다.

본 발명은 신규한 버크홀데리아 CBMB40 균주, CBPB-HOD 균주 및 CBPB-HIM 균 주, 및 이를 이용한 식물생장촉진방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 공중 질소를 고정하고, 토양 내 불용성 인산을 가용화시키며, 식물생장촉진 호르몬 및 AHL을 생산하여 식물의 생장을 촉진하고 내병성을 증진시키는 버크홀데리아 CBMB40 균주 및 이를 이용한 식물생장촉진방법에 관한 것이다.

토양미생물을 이용한 농작물의 재배는 콩과식물에서 광범위하게 이루어지고 있다. 이러한 농작물의 재배에 주로 사용되는 미생물로는 라이조비움 (Rhizobium)이 있는데, 이 균주에 의해 콩과식물이 감염되면 뿌리혹 (root nodule)을 형성하고 기체상의 질소 (N₂)를 수소와 결합된 상태의 암모니아 (NH₃)로 전환시키는 질소고정 (nitrogen fixiation)이 이루어지게 되며, 이러한 질소고정은 농업적으로 대단히 중요한 의미를 갖는다. 즉, 시비를 하지 않은 토양의 경우 질소 결핍은 당연한 결과이나 이와 같은 토양 조건하에서 뿌리혹을 가진 콩과식물은 질소 결핍의 문제점을 스스로 해결하여 질소가 결핍되어 식물이 생장할 수 없는 토양 조건하에서도 생육이 가능하다 (Stacey et al., Mol. Plant-Microbe Interact. 4:332-340, 1991).

토양미생물 중에서 기주식물과 공생관계를 갖지 않으면서 식물의 생장을 촉진시키는 미생물은 1980년 Kloepper 등에 의해서 밝혀진 식물 생장-촉진 리조박테리아 (Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR))가 있다. 상기의 균주에는 공중 질소를 고정하는 아조스피릴럼 속균 (Azospirrilum (Okon, 1985)), 슈도모나스 속균 (Pseudomonas (Kloepper 등, 1980)), 바실러스 속균 (Bacillus (Backman 등, 1994)) 등이 대표적인 미생물로 포함된다. 이러한 식물생장촉진 미생물은 공중 질소의 고정 (Boddy와 Dobereiner, 1995), 식물생장촉진 호르몬의 생산, 식물의 양분 흡수 촉진 (Hallmann 등, 1997) 및 식물병 발생 억제 (Pleban 등, 1995) 등 여러 가지 기능에 의해서 식물의 생장을 돕는 것으로 알려져 있다.

버크홀데리아 (Burkholderia) 속의 균주들 약 30종 이상으로 구성되며 매우 광범위한 생태적 지위를 차지하고 있다. 이들은 토양으로부터 인간의 호흡기까지 편재해 있으므로, 이러한 버크홀데리아와 식물의 상호작용은 오래 전부터 연구되어 왔다.

숙주 정착화 (host colonization) 및 병원성에 중요한 세균의 기능은 일반적으로 세포 밀도에 의존적이고, 고밀집도에서의 세균 세포간 의사전달인 쿼럼센싱 (quorum sensing)과 매우 밀접하게 연관되어 있다.

세균들은 온도, pH, 양분 등 여러 가지 환경 변화에 적응하여 생활한다. 세균들이 서로 의사소통하며 유기적인 협력체로서 단체적으로 행동할 수 있는 능력은 외부의 위협적인 환경으로부터 자신을 보호하는데 있어 뚜렷한 장점을 가진다. 이러한 세포간 의사전달에 사용되는 언어는 오토인듀서 (autoinducer)라고 하는 저분자량 물질에 기초를 두고 있다. 오토인듀서의 사용을 통하여 세균은 그 밀집도에 따른 자신들의 행동을 조절 할 수 있다 (Fuqua et al., J. Bacteriol. 176:269-275, 1994; 및 Shaw et al., PNAS 94:6036-6041, 1997).

N-아실-호모세린-락톤 (N-acyl-homoserine-lactone, AHL)을 매개로 하는 신호전달 메카니즘은 많은 병원성 세균에 광범위하게 존재하여 그 기작이 매우 유사 하기 때문에 새로운 항-감염요법으로 각광받고 있다 (Finch et al., J. Antimicrob. Chemother. 42:569-571, 1998). 신호전달 체계 교란을 위한 방법은 신호전달 물질 자체의 생성을 억제하거나 이미 생성된 신호전달 체계를 교란하는 방법에 초점이 맞추어져 있다.

농업에서 비료는 작물의 수량을 결정짓는 중요한 농자재이다. 그러나, 지나치게 많이 사용할 경우, 하천수의 부영양화, 지하수의 수질오염, 토양양분의 불균형, 및 작물의 생육불량 등의 원인으로 작용하여 작물의 수량감소는 물론 작물의 품질하락을 야기할 수 있다. 그러나, 산업의 발달 및 다양화로 인해 농경지 면적이 감소되고 있기 때문에 작물의 생산성을 높이기 위한 비료의 사용은 불가피한 것이며, 이에 따라 기존의 화학비료보다 미생물을 이용한 친환경적인 기능성 농자재의 개발을 위한 관심이 높아지고 있다.

이에 본 발명자들은, 공중 질소를 고정하는 능력을 가지며, 토양 내 불용성 인산을 가용화시키는 신규한 버크홀데리아 CBMB40 균주, CBPB-HOD 균주 및 CBPB-HIM 균주를 벼로부터 분리 및 동정하였고, 본 발명의 신규한 균주들이 토양 내 불용성 인산을 가용화시키고, 식물의 생장을 촉진하는 호르몬을 분비하여 식물의 생장을 촉진시키는 기능을 갖고 있으며, 상기 균주가 분비하는 AHL로 인해 식물병에 대한 저항성 (내병성)을 증진시키는 기능도 갖는다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은, 공중질소 고정, 토양 내 불용성 인산의 가용화, 식물생장촉진 호르몬의 분비, 식물의 내병성에 관여하는 N-아실-호모세린-락톤 (N-acyl-homoserine-lactone, AHL)의 분비 및 식물생장을 촉진하는 신규한 버크홀데리아 (Burkholderia sp.) CBMB40 균주, CBPB-HOD 균주 및 CBPB-HIM 균주를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 균주를 유효성분으로 하는 미생물 제제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 이용하여 식물의 생장을 촉진하고 식물의 내병성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 식물의 생장을 촉진하고 식물병에 대한 저항성 (내병성)을 증진시키는 서열번호 1 내지 3의 염기서열을 갖는 버크홀데리아 (Burkholderia sp.) CBMB40 균주, CBPB-HOD 균주 및 CBPB-HIM 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 하는 미생물 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 이용하여 식물의 생장을 촉진하고 내병성을 증진시키는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 버크홀데리아 (Burkholderia sp.) CBMB40 균주, CBPB-HOD 균주 및 CBPB-HIM 균주는 공중질소 고정, 토양 내 불용성 인산을 가용화, 식물생장촉진 호르몬의 분비 및 N-아실-호모세린-락톤 (N-acyl-homoserine-lactone, AHL)의 분비를 통해 식물의 발아 및 생장을 촉진하고 식물의 내병성을 증대시키는 특징이 있다. 본 발명의 버크홀데리아 CBMB40 균주, CBPB-HOD 균주 및 CBPB-HIM 균주는 28℃, pH 6.8에서 최적 생장을 보인다.

본 발명의 일실시예에서는 버크홀데리아 CBMB40 균주, CBPB-HOD 균주 및 CBPB-HIM 균주의 식물생장 호르몬 분비 여부, 인산 가용화 정도, 1-아미노사이클로프로판-1-카복실산(ACC) 디아미네이즈 활성을 확인하였으며, 그 결과 본 발명의 균주는 ACC 디아미네이즈 활성을 가지고 있어 질소원으로서 ACC를 사용할 수 있으므로, 질소가 결핍된 상황에서도 식물이 생장할 수 있음을 확인하였고, 식물의 생장을 촉진하는 호르몬인 IAA (인돌아세트산 또는 옥식이라고 함)의 분비를 촉진하며, 인산을 가용화시킴을 확인하였다.

또한, 버크홀데리아 CBMB40 균주의 병원균에 대한 길항작용 여부를 확인한 결과, 어위니아 카로토보라 (Erwinia carotovora)의 생장을 억제함을 확인하였다.

또한, 본 발명의 균주들이 식물 내병성에 관여하는 N-아실-호모세린-락톤 (N-acyl-homoserine-lactone, AHL)을 분비하는지를 각 균주들로부터 AHL을 추출하여 생물 검정과 결합된 TLC를 수행하여 확인하였으며, 그 결과 본 발명의 균주들은 식물 내병성에 관여하는 AHL을 분비하는 것으로 나타났다.

본 발명은 또한 본 발명의 버크홀데리아 CBMB40 균주, CBPB-HOD 균주 및 CBPB-HIM 균주 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 균주를 유효성분으로 포함하는, 식물의 생장을 촉진하고 식물의 내병성을 증진시키는 미생물 제제를 제공한다. 본 발명에 의한 미생물 제제는 통상적인 방법으로 식물생장촉진용으로 제형화할 수 있으며 건조분말 형태 또는 액상비료 형태로 제조할 수 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는 화학비료를 대체하기 위한 식물생장촉진 생물비료로 제형화할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 버크홀데리아 CBMB40 균주, CBPB-HOD 균주 및 CBPB-HIM 균주를 이용하여 식물의 생장을 촉진시키고 식물병에 대한 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다. 상기 식물의 생장을 촉진하는 방법으로는 상기 균주들을 배양한 배양액 및 상기 균주들을 이용한 미생물 제제를 종자나 식물에 침지하거나 관주, 즉, 분무하여 수행할 수 있다. 침지하는 방법의 경우, 배양액 및 제제를 식물체 주변의 토양에 붓거나 또는 종자를 배양액 및 제제에 담가둘 수 있다. 분무할 경우에는 당해 분야에 널리 공지된 기술로 식물체에 줄줄 흐르도록 살포할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 생장을 촉진하며 내병성을 증대 시킬 수 있는 식물로는 대부분의 모든 식물이 포함될 수 있으며, 특히 벼, 토마토, 카놀라, 고추 등에 효과적이다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 반드시 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

균주의 분리 및 동정

<1-1> 벼로부터 균주의 분리

벼 (Oryza sativa L.)에 서식하고 있는 균주를 분리하기 위하여, 벼를 마쇄한 후 0.5%의 메탄올이 유일한 탄소원으로 첨가된 암모늄 미네랄 염 최소 배지 (AMS)를 이용하여 Holland 및 Polacco (1992)이 제시한 방법으로 균주들을 분리하였다.

<1-2> 분리된 균주의 동정

유니버설 프라이머 fD1 및 rP2 (문헌 [W.G. Weisberg et al., J. Bacteriol. 173:697-703, 1991] 참조)를 이용하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 상기 선별된 유산균의 16S rDNA의 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 상기 미생물 중 하나의 16S rDNA 염기서열은 버크홀데리아 비에트나미엔시스 (Burkholderia vietnamiensis)의 16S rDNA 염기서열과 99% 동일함을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명자들은 상기 균주를 "버크홀데리아 (Burkholderia sp.) CBMB40 균주"로 명명하였고, 이를 농업생명공학연구원에 2006년 1월 23일자로 기탁하였다 (기탁번호: KACC-91210P).

또한, 나머지 2가지 미생물의 16S rDNA 염기서열은 버크홀데리아 파이로시니아 (Burkholderia pyrrocinia)의 16S rDNA 염기서열과 95.2% 동일함을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명자들은 상기 균주들을 각각 "버크홀데리아 (Burkholderia sp.) CBPB-HOD 균주 및 CBPB-HIM 균주"로 명명하였고, 이를 농업생명공학연구원에 2006년 1월 23일자로 기탁하였다 (기탁번호: KACC-91312P 및 KACC-91311P).

<시험예 1>

버크홀데리아 CBMB40 균주, CBPB-HOD 균주 및 CBPB-HIM 균주가 분비하는 식물생장 호르몬 (IAA) 측정

본 발명의 균주들이 식물생장 호르몬 (IAA)을 분비하는지를 측정하기 위하여, Bric 등 (1991)의 방법에 따라 상기 실시예 1에서 분리된 균주들의 IAA 생성능을 측정하였다.

구체적으로, 실시예 1의 균주들을 각각 100 ㎍/㎖의 L-트립토판 (tryptophan)이 첨가된 50 ㎖의 DF 최소염 배지 (DF minimal salt medium)에 접종하여 28℃에서 4일 동안 배양한 다음, 배양액을 10,000 rpm으로 15분 동안 원심분리하여 2 ㎖의 상층액을 시험관에 옮기고, 100 ㎕의 10 mM 오르쏘인산 (orthophosphoric acid) 및 4 ㎖의 Salkowski's 시약 (50 ㎖의 35% HClO₄에1 ㎖의 0.5 M FeCl₃·6H₂O 첨가)을 첨가하였다. 이를 상온에서 약 25분 동안 정치한 후, 분광광도계 (spectrophotometer, UV-1601, Shimadzu 사)를 이용하여 530 ㎚에서 흡광도를 측정한 다음, 표준물질인 인돌-3-아세트산 (indole-3-acetic acid (IAA), Sigma사, 미국)과 비교하여 IAA의 농도를 계산하였으며 (Ivanova et al. 2001), 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

균주	IAA 생성량 (㎍/㎖)
CBMB40	1.91 ± 0.18
CBPB-HOD	29.58 ± 2.10
CBPB-HIM	28.02 ± 1.33

<시험예 2>

버크홀데리아 CBMB40 균주, CBPB-HOD 균주 및 CBPB-HIM 균주의 인산 가용화 정도 측정

0.5 g의 Ca₃(PO₄)₂가 첨가된 피코브스카야 배지 (Pikovskaya's broth, 문헌 [R. I. Pikovskaya, Microbiologiya 17:362-370, 1948] 참조]) 100 ㎖를 250 ㎖ 용량의 플라스크에 넣고 pH를 7.0으로 조절한 후 121℃에서 멸균하였다. 상기 플라스크에 상기 실시예 1의 균주들을 각각 접종한 다음, 30℃, 120 rpm에서 배양하였다. 접종 후 7일째에 시료를 채취하고 상기 시료를 10,000×g로 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상기에서 수득한 상등액을 0.45 ㎛의 필터를 통과시켜 여과액을 수득하고 상기 여과액을 사용하여 인산 농도를 결정하였다. 가용화 인산의 농도는 몰리브덴 블루 측정법 (molybdenum blue method, 문헌 [J. Mruphy. et al., Anal. Chim. Acta. 27:31-36, 1962] 참조]에 의해 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

균주	가용화 인산 (㎍/㎖)
CBMB40	102.29 ± 0.72
CBPB-HOD	300.72 ± 32.23
CBPB-HIM	318.77 ± 22.64

<시험예 3>

버크홀데리아 CBMB40 균주, CBPB-HOD 균주 및 CBPB-HIM 균주의 1-아미노사이클로프로판-1-카복실산(ACC) 디아미네이즈 활성측정

본 발명의 균주들이 1-아미노사이클로프로판-1-카복실산 (ACC) 디아미네이즈의 활성이 있는지 확인하기 위하여, 실시예 1의 균주들을 각각 DF 최소염 배지에서 배양하였다. 이때, 질소원으로 ACC를 이용하는지 확인하기 위하여 3 mM의 ACC를 첨가하였다. 이후, ACC 디아미네이즈에 의해 ACC가 잘려져 생성되는 알파-케토부티레이트 (α-ketobutyrate)의 양을 540 nm의 흡광도에서 분광광도계를 이용하여 측정하였고 단백질의 농도는 Lowry et al.(O. H. Lowry. et al., J. Biol. Chem. 139:265-275, 1951)의 방법을 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

균주	ACC 디아미네이즈 활성
CBMB40	16.79 ± 0.00
CBPB-HOD	19.20 ± 1.90
CBPB-HIM	21.32 ± 0.99

<시험예 4>

버크홀데리아 CBMB40 균주의 병원균에 대한 길항작용 분석

본 발명의 CBMB40 균주가 병원균인 어위니아 카로토보라 (Erwinia carotovora)에 대해 길항작용을 하는지를 확인하기 위하여, 상기 병원균을 밤새 배양한 다음, 2% 아가가 첨가된 LB 플레이트에 스프레딩하였다.

CBMB40 균주를 대수 성장기까지 배양한 다음, 여과지 디스크를 상기 배양액에 충분히 담근 다음 건조하였다. 상기 디스크를 상기 LB 플레이트 위에 올린 다음, 24시간 후부터 세균이 사라지는 부분 (clearing zone)을 체크하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 이때, 대조군으로는 실시예 1 균주의 배양액 대신 LB 배지만을 적신 디스크를 올린 LB 플레이트를 사용하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 균주를 처리하면 E. 어위니아의 생장이 억제되므로, 본 발명의 균주를 사용하면 식물병에 대한 내병성을 증진시킬 수 있음을 확인하였다.

<시험예 5>

TLC 분석을 이용한 버크홀데리아 CBMB40 균주, CBPB-HOD 균주 및 CBPB-HIM 균주가 분비하는 AHL의 확인

<5-1> AHL 추출

실시예 1의 균주들을 LB 배지에 접종한 후 28℃에서 대수 성장기까지 배양한 다음, 4℃에서 10,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상등액을 모았다. 각 균주의 상등액 50 ㎖를 동량의 산성화된 에틸아세테이트 (에틸아세테이트 1 ℓ당 0.1 ㎖의 빙초산 첨가)로 두 번 추출한 다음, 추출한 유기상 (organic phase)을 모아서 무수 마그네슘 설페이트로 수분을 제거한 다음, 무수 마그네슘 설페이트를 거름종이에 걸러 제거하였다. 걸러진 추출액을 37℃의 회전 증발기를 이용하여 증발시킨 후, 잔여물을 200 ㎕의 산성화된 에틸아세테이트에 재현탁한 후, -20℃에서 보관하였다.

<5-2> TLC 분석

상기 <6-1>에서 준비된 추출물들을 당업계에 공지된 방법에 따라 TLC플레이트 분석방법으로 분석하였다 (문헌 [Shaw, P. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:6036-6041, 1997]).

구체적으로, 상기 각 추출물 5∼10 ㎕를 C₁₈ 역상 (reversed-phase) TLC 플레이트 (20×20 ㎝, 두께: 200 ㎛; RP-18 F_254S, Merk 사, 독일)에 로딩한 후, 메탄올/물 (60:40 v/v)로 색층분석을 전개하였다. 전개가 종료된 후, TLC 플레이트를 건조시킨 다음, 각각 지시균주인 크로모박테리움 바이오라세움 (Chromobacterium violaceum CV026, C. violaceum ATCC12472 (Robert J. C. McLean, Texas State University-San Marcos) 균주 또는 아그로박테리움 투메파시엔스 NT1 (Agrobacterium tumefaciens NT1 (traR, tra::lacZ749), Sylvia Jafra, Plant Research International 사) 균주를 포함하는 탑 아가 플레이트 위에 놓고 30℃에서 밤새 배양하였으며, 그 결과를 각각 도 2 및 3에 나타내었다.

이때, 상기 탑 아가 플레이트는 다음과 같이 제조하였다.

지시균주인 C. 바이오라세움 균주를 LB (Luria broth) 배지 (Difco 사, 미국)에 접종하여 30℃에서 배양하고, 지시균주인 A. 투메파시엔스 NT1 균주는 0.2% 만니톨이 첨가된 AB 최소배지에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양하였다.

배양된 균주들 각 1 ㎖를 LB 배지 및 ABM 배지 50 ㎖에 각각 접종하여 30℃에서 24시간 동안 120 rpm으로 진탕 배양하였다. 각 배양액을 X-Gal (60 ㎍/㎖, BioShop Canada 사, 캐나다)을 첨가한 100 ㎖ LB 배지 (0.7% 아가 (agar))와 X-Gal (60 ㎍/㎖)을 첨가한 100 ㎖ ABM 배지 (1.12% 아가)에 46℃에서 각각 접종한 뒤, 즉시 상기와 동일한 각각의 배지 (1.8% 아가) 표면에 부어 탑 아가 (top agar) 플레이트를 제조하였다.

그 결과, 지시균주로서 C. 바이오라세움 균주를 사용한 TLC 플레이트에서는, 본 발명의 CBMB40 균주, CBPB-HOD 균주 및 CBPB-HIM 균주 추출물에 대해 모두 합성 표준물질인 C₆-HSL (N-3-hexanoyl-DL-homoserine lactone, R_f=0.32) 및 C₈-HSL (N-octanoyl-DL-homoserine lactone, R_f=0.10)과 동일한 이동거리를 갖는 AHL을 확인할 수 있었으며, CBPB-HOD 균주의 경우에는, 합성 표준물질인 C₇-HSL (N-3-heptanoyl-DL-homoserine lactone, R_f=021)과 동일한 이동거리를 갖는 AHL을 확인하였다 (도 2),

또한, 지시균주로서 A. 투메파시엔스 NT1 균주를 사용한 TLC 플레이트에서는, 본 발명의 CBMB40 균주, CBPB-HOD 균주 및 CBPB-HIM 균주 추출물에 대해 모두 합성 표준물질인 C₆-HSL (R_f=0.32), C₇-HSL (R_f=0.21) 및 C₈-HSL (R_f=0.10)과 동일한 이동거리를 갖는 AHL을 확인할 수 있었으며, CBMB40 균주의 경우에는, 합성 표준물질인 C₁₀-HSL (N-decanoyl-DL-homoserine lactone, R_f=0.07)과 동일한 이동거리를 갖는 AHL을 생산함을 확인할 수 있었다 (도 3).

<시험예 6>

버크홀데리아 CBMB40 균주, CBPB-HOD 균주 및 CBPB-HIM 균주에 의한 식물생장촉진 효과

<6-1> 뿌리 생장 측정

본 발명의 균주들의 식물생장촉진효과를 측정하기 위해 각 균주를 중간 또는 대수증식기까지 LB 배지에서 배양한 다음, 상기 배양액을 5,000×g, 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 얻은 후, 이를 무균의 0.03M MgSO₄로 2회 세척한 후, 0.03 M MgSO₄에 재현탁하여 배양 배지를 제거하였다.

캐놀라의 종자를 70% 에탄올에 1분 동안 담근 후, 1% 소듐 하이포클로라이트 (NaOCl)에 넣은 다음, 10분 후에 용액을 멸균수로 여러번 세척하였다. 이를 상기 현탁액에 넣고 실온에서 4시간 동안 진탕 배양한 다음, 무균의 성장 파우치 (growth pouches, CYG^TM seed germination pouch, Mega International Manufacturer 사, 미국)에 넣고 성장 챔버에서 광과 암의 조건을 12시간씩 주는 조건으로 20±1℃에서 10일 동안 배양하여 뿌리의 생장을 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 이때, 대조군으로는 캐놀라의 종자에 균주 배양액을 처리하는 대신 0.03M MgSO₄를 처리한 것을 사용하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 신균주인 CBMB40 균주, CBPB-HOD 균주 및 CBPB-HIM 균주를 처리한 벼의 뿌리 생장은 대조군보다 우수하였다.

<6-2> 뿌리 정착화 확인

상기 <6-1>과 동일한 방법으로 캐놀라 종자를 7일 동안 배양한 다음, 뿌리를 무균상태로 제거한 다음 무게를 측정하였다. 상기 뿌리를 블렌딩한 다음, 멸균된 PBS에 현탁하였다. 상기 현탁액을 단계적으로 희석한 다음, 버크홀데리아에 선택적인 PCAT (Pseudomonas cepacia azelaic acid tryptamine) 아가 플레이트에 깔고 3일 동안 배양하였으며, 대조군으로는 균주 배양액을 처리하지 않은 종자의 뿌리를 사용하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 균주를 처리한 뿌리 현탁액이 처리된 플레이트에서는 지름 약 1 ㎜의 백색 콜로니들이 뿌리 1g 당 약 10¹¹ CFU의 농도로 자랐으므로, 본 발명의 균주는 뿌리에 정착하여 생장을 촉진시킴을 확인하였다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 신규한 버크홀데리아 CBMB40 균주, CBPB-HOD 균주 및 CBPB-HIM 균주는 공중 질소를 고정하는 능력이 있고, 식물생장촉진 호르몬의 분비를 촉진하며 식물 내병성에 관여하는 AHL을 분비한다. 따라서, 본 발명의 신규한 균주는 식물의 생장을 촉진시키는 효과와 더불어 식물이 병원균 또는 바이러스로부터 견뎌 낼 수 있는 내병성을 증진시키는 효과가 있어 이를 미생물 비료제의 제조에 사용하면 화학비료를 대체하여 작물의 성장 및 작물의 수확량을 증대시키는데 이용할 수 있다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Burkholderia sp. CBMB40 STRAIN, CBPB-HOD STRAIN AND CBPB-HIM STRAIN. AND METHOD FOR ENHANCING PLANT GROWTH USING THE SAME <130> DPP070118KR <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1366 <212> DNA <213> Burkholderia sp. CBMB40 <400> 1 gtggcgaacg ggtgagtaat acatcggaac atgtcctgta gtgggggata gcccggcgaa 60 agccggatta ataccgcata cgatctatgg atgaaagcgg gggaccttcg ggcctcgcgc 120 tatagggttg gccgatggct gattagctag ttggtggggt aaaggcctac caaggcgacg 180 atcagtagct ggtctgagag gacgaccagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 240 ctacgggagg cagcagtggg gaattttgga caatgggcga aagcctgatc cagcaatgcc 300 gcgtgtgtga agaaggcctt cgggttgtaa agcacttttg tccggaaaga aatccttggc 360 tctaatacag tcgggggatg acggtaccgg aagaataagc accggctaac tacgtgccag 420 cagccgcggt aatacgtagg gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgtgcg 480 caggcggttt gctaagaccg atgtgaaatc cccgggctca acctgggaac tgcattggtg 540 actggcaggc tagagtatgg cagagggggg tagaattcca cgtgtagcag tgaaatgcgt 600 agagatgtgg aggaataccg atggcgaagg cagccccctg ggccaatact gacgctcatg 660 cacgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc ctaaacgatg 720 tcaactagtt gttggggatt catttcctta gtaacgtagc taacgcgtga agttgaccgc 780 ctggggagta cggtcgcaag attaaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg 840 tggatgcgat nncaacgcga aaaaccttac ctacccttga catggtcgga atcctgaaga 900 gattcgggag tgctcgaaag agaaccggcg cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg 960 tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgtcctt agttgctacg 1020 caagagcact ctaaggagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaag 1080 tcctcatggc ccttatgggt agggcttcac acgtcataca atggtcggaa cagagggttg 1140 ccaacccgcg agggggagct aatcccagaa aaccgatcgt agtccggatt gcactctgca 1200 actcgagtgc atgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac 1260 gttcccgggt cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtgggtttta ccagaagtgg 1320 ctagtctaac cgcaaggagg acggtcacca cggtaggatt catgac 1366 <210> 2 <211> 1450 <212> DNA <213> Burkholderia sp. CBPB-HOD <400> 2 cagattgaac gctggcggca tgccttacac atgcaagtcg aacggcagca cgggtgcttg 60 cacctggtgg cgagtggcga acgggtgagt aatacatcgg aacatgtcct gtagtggggg 120 atagcccggc gaaagccgga ttaataccgc atacgatcta cggatgaaag cgggggacct 180 tcgggcctcg cgctataggg ttggccgatg gctgattagc tagttggtgg ggtaaaggcc 240 taccaaggcg acgatcagta gctggtctga gaggacgacc agccacactg ggactgagac 300 acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatttt ggacaatggg cgaaagcctg 360 atccagcaat gccgcgtgtg tgaagaaggc cttcgggttg taaagcactt ttgtccggaa 420 agaaatcctt ggttctaata tagccggggg atgacggtac cggaagaata agcaccggct 480 aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggtgcgag cgttaatcgg aattactggg 540 cgtaaagcgt gcgcaggcgg tttgctaaga ccgatgtgaa atccccgggc tcaacctggg 600 aactgcattg gtgactggca ggctagagta tggcagaggg gggtagaatt ccacgtgtag 660 cagtgaaatg cgtagagatg tggaggaata ccgatggcga aggcagcccc ctgggccaat 720 actgacgctc atgcacgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac 780 gccctaaacg atgtcaacta gttgttgggg attcatttcc ttagtaacgt agctaacgcg 840 tgaagttgac cgcctgggga gtacggtcgc aagattaaaa ctcaaaggaa ttgacgggga 900 cccgcacaag cggtggatga tgtggattaa ttcgatgcaa cgcgaaaaac cttacctacc 960 cttgacatgg tcggaatcct gctgagaggc gggagtgctc gaaagagaac cgatacacag 1020 gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080 gcaacccttg tccttagttg ctacgcaaga gcactctaag gagactgccg gtgacaaacc 1140 ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcctc atggccctta tgggtagggc ttcacacgtc 1200 atacaatggt cggaacagag ggttgccaac ccgcgagggg gagctaatcc cagaaaaccg 1260 atcgtagtcc ggattgcact ctgcaactcg agtgcatgaa gctggaatcg ctagtaatcg 1320 cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggtcttgt acacaccgcc cgtcacacca 1380 tgggagtggg ttttaccaga agtggctagt ctaaccgcaa ggaggacggt caccacggta 1440 ggattcatga 1450 <210> 3 <211> 1245 <212> DNA <213> Burkholderia sp. CBPB-HIM <400> 3 ctcagattga acgctggcgg catgccttac acatgcaagt cgaacggcag cacgggtgct 60 tgcacctggt ggcgagtggc gaacgggtga gtaatacatc ggaacatgtc ctgtagtggg 120 ggatagcccg gcgaaagccg gattaatacc gcatacgatc tacggatgaa agcgggggac 180 cttcgggcct cgcgctatag ggttggccga tggctgatta gctagttggt ggggtaaagg 240 cctaccaagg cgacgatcag tagctggtct gagaggacga ccagccacac tgggactgag 300 acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaatt ttggacaatg ggcgaaagcc 360 tgatccagca atgccgctgt gtgtgaagaa ggccttcggg ttgtaaagca cttttgtccg 420 gaaagaaatc cttggttcta atatagccgg gggatgacgg taccggaaga ataagcaccg 480 gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtgc gagcgttaat cggaattact 540 gggcgtaaag cgtgcgcagg cggtttgcta agaccgatgt gaaatccccg ggctcaacct 600 gggaactgca ttggtgactg gcaggctaga gtatggcaga ggggggtaga attccacgtg 660 tagcagtgaa atgcgtagag atgtggagga ataccgatgg cgaaggcagc cccctgggcc 720 aatactgacg ctcatgcacg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc 780 cacgccctaa acgatgtcaa ctagttgttg gggattcatt tccttagtaa cgtagctaac 840 gcgtgaagtt gaccgcctgg ggagtacggt cgcaagatta aaactcaaag gaattgacgg 900 ggacccgcac aagcggtgga tgatgtggat taattcgatg caacgcgaaa aaccttacct 960 acccttgaca tggtcggaat cctgctgaga ggcgggagtg ctcgaaagag aaccgataca 1020 caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080 agcgcaaccc ttgtccttag ttgctacgca agagcactct aaggagactg ccggtgacaa 1140 accggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc ctcatggccc ttatgggtag ggcttcacac 1200 gtcatacaat ggtcggaaca gagggttgcc aacccgcgag gggga 1245

Claims

식물의 생장을 촉진하고 식물병에 대한 저항성 (내병성)을 증진시키는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 버크홀데리아 (Burkholderia sp.) CBMB40 균주 (KACC-91210P).
식물의 생장을 촉진하고 식물병에 대한 저항성 (내병성)을 증진시키는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 버크홀데리아 (Burkholderia sp.) CBPB-HOD 균주 (KACC-91312P).
식물의 생장을 촉진하고 식물병에 대한 저항성 (내병성)을 증진시키는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 버크홀데리아 (Burkholderia sp.) CBPB-HIM 균주 (KACC-91311P).
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 식물이 벼, 토마토, 카놀라 및 고추로 이루어진 군 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 균주.
제 1 항의 버크홀데리아 CBMB40 균주 (KACC-91210P), 제 2 항의 버크홀데리아 CBPB-HOD 균주 (KACC-91312P), 버크홀데리아 CBPB-HIM 균주 (KACC-91311P) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 균주를 유효성분으로 함유하는 식물생장촉진 및 내병성 증진용 미생물 제제.
제 5 항에 있어서,

상기 미생물 제제가 화학비료 대체용 생물비료임을 특징으로 하는, 식물생장촉진 및 내병성 증진용 미생물 제제.
제 1 항의 균주, 제 2 항의 균주, 제 3 항의 균주 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택되는 균주 또는 제 5 항의 미생물 제제를 식물 또는 식물의 종자에 침지 또는 관주 처리하는 단계를 포함하는 식물생장촉진 및 내병성 증진방법.