MX2014007070A

MX2014007070A - Microbios que promueven el crecimiento vegetal y uso de estos.

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Publication number: MX2014007070A
Application number: MX2014007070A
Authority: MX
Inventors: Janne S Kerovuo; David T Bullis; Christopher J Grandlic; Ryan Mccann
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2011-12-13
Filing date: 2012-12-13
Publication date: 2014-08-08
Also published as: RU2014128552A; CA2860848A1; EP2790513B1; AU2012352161B2; CA2860848C; PH12014501282A1; ZA201404047B; WO2013090628A1; JP2015502751A; MX358751B; CA3105047C; CA3105047A1; CA3202904A1; EP3598899B1; AU2012352161A1; JP2018011600A; UA117340C2; EP3598899A2; BR112014014000A2; CN104168771B

Abstract

Se proporcionan cepas microbianas, composiciones y métodos de uso de estos para mejorar el crecimiento y/o rendimiento de una planta; también se proporcionan materiales y métodos para presentar, inhibir, o tratar el desarrollo de patógenos vegetales o enfermedades fitopatogénicas; la descripción también proporciona plantas de origen no natural y derivados de estas tales como plantas infectadas de manera artificial con cepas microbianas de la invención.

Description

MICROBIOS QUE PROMUEVEN EL CRECIMIENTO VEGETAL Y USOS DE ÉSTOS Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional 61/570,237, presentada el 13 de Diciembre de 2011 , que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia, incluyendo todas las tablas, figuras y reivindicaciones.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al ámbito de la agricultura sostenible. Específicamente, la descripción proporciona composiciones microbianas y métodos útiles para la producción de plantas de cultivo. En particular, las composiciones y métodos descritos en la presente son útiles para mejorar el crecimiento de plantas y/o suprimir el desarrollo de patógenos de plantas y enfermedades patogénicas.

Incorporación de listado de secuencias El material en el listado de secuencias adjunto se incorpora a la presente solicitud su totalidad mediante esta referencia. El archivo adjunto, llamado "SGI1540_1WO_CRF_OF_SL_ST25.txt", se creó el 13 de diciembre de 2012 y es de 20 KB. Puede accederse a los archivos utilizando Microsoft Word en una computadora con el sistema operativo Windows.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La microflora que rodea las plantas es muy diversa, incluyendo bacterias, hongos, levadura, algas. Algunos de estos microorganismos pueden ser perjudiciales para las plantas, y a veces se denominan patógenos, mientras que otros son beneficiosos para las plantas porque favorecen el crecimiento vegetal y la productividad de cultivos. Los avances recientes en la microbiología del suelo y la biotecnología vegetal han dado como resultado un aumento interesante en el uso de agentes microbianos en la agricultura, horticultura, silvicultura y gestión ambiental. En particular, una cantidad de microorganismos que se sabe que están presentes en el nicho ecológico del suelo, conocido generalmente como rizosfera o rizoplano, han recibido una atención considerable con respecto a su capacidad de favorecer el crecimiento vegetal. De hecho, la tierra de rizosfera representa un depósito adecuado de microbios para el aislamiento potencial de microbios beneficiosos. La rizosfera vegetal puede contener miles de millones de microorganismos en un gramo de tierra. En teoría, los inoculantes microbianos, sin intervención humana, tienen una tasa de supervivencia y una eficacia bajas en su entorno natural del suelo, debido a las unidades formadoras de colonias insuficientes por gramo de tierra. Por lo tanto, desde 1960, se ha desarrollado una cantidad de biofertil izantes que tienen una concentración de potencial de inoculo de colonias aumentado, y se han comercializado en un intento de reducir la necesidad de fertilizantes químicos.

Además, la investigación llevada a cabo en los últimos años ha demostrado que los microorganismos pueden usarse como agentes de control biológico para aumentar la productividad y eficiencia agrícola. Estos estudios han demostrado que varios microorganismos son capaces de eliminar los patógenos vegetales y/o de complementar el crecimiento vegetal, por lo tanto ofrecen una alternativa atractiva a los pesticidas químicos que son menos favorables debido a su impacto potencialmente negativo en la salud humana y en la calidad ambiental.

Los microorganismos que pueden colonizar las raíces de las plantas y estimular el crecimiento vegetal son conocidos en general como microorganismos promotores del crecimiento vegetal (PGPM, por sus siglas en inglés). En las dos décadas pasadas se han descrito muchas especies de PGPM que tienen una influencia positiva en el crecimiento de una variedad de plantas de cultivo. Los PGPM son a menudo simbiontes de plantas mayores, y son capaces de mejorar el potencial adaptativo de sus hospedadores a través de una cantidad de mecanismos, tal como fijación de nitrógeno molecular, la movilización de nutrientes de suelos resistentes a la descomposición (por ejemplo, hierro, fósforo, azufre, etc.), la síntesis de fitohormonas y vitaminas, y la descomposición de materiales vegetales en suelos que a menudo aumentan la materia orgánica del suelo. También determinados microbios pueden facilitar el crecimiento vegetal mediante el control de especies microbianas patogénicas para las plantas (es decir, fitopatógenos). Por ejemplo, algunos microbios beneficiosos pueden controlar la descomposición de la raíz en plantas, mediante la competencia con los hongos por espacio en la superficie de la raíz de la planta. En otros casos, la competencia entre varias cepas microbianas en la microflora natural de la planta puede estimular el crecimiento de la raíz y aumentar la absorción de nutrientes minerales y agua para mejorar el rendimiento de la planta. Por lo tanto, pueden desarrollarse biofertilizantes como productos basados en microorganismos que viven naturalmente en el suelo. Al aumentar la población de microorganismos beneficiosos en el suelo a través de inoculación artificial, estos microorganismos del suelo pueden potenciar su actividad biológica y, por lo tanto, proporcionarle a las plantas nutrientes importantes y factores beneficiosos que mejoren su crecimiento.

La inoculación de plantas cultivadas con PGPM se ve generalmente como un abordaje agrícola prometedor, porque permite que se controlen las plagas sin el uso de pesticidas en cantidades altas. Dado el crecimiento en la preocupación por la calidad del agua subterránea y de la exposición de los alimentos a pesticidas, se hacen necesarias alternativas biológicas. Por lo tanto, el desarrollo de un tratamiento biológico compatible con fertilizantes y pesticidas o incluso la reducción de la cantidad de estos compuestos químicos podría ser un avance significativo en la industria agrícola. Se ha establecido que la estimulación del crecimiento vegetal por medio de PGPM se relaciona a menudo de manera cercana con la capacidad de los PGPM de colonizar las raíces de las plantas. Sin embargo, se le ha prestado relativamente poca atención al desarrollo de procedimientos de selección eficaces para obtener cepas microbianas con la capacidad de controlar la colonización de las raíces. La falta de dichos procedimientos de selección ralentiza el estudio de la simbiosis bacteriana vegetal, y la implementación de los PGPM en la agricultura.

Por lo tanto, existe una necesidad continua de identificar nuevos PGPM y/o evaluar su compatibilidad con los productos existentes para la gestión de cultivos disponibles comercialmente. Además, se necesita investigación adicional para comparar cepas de cultivo puras con cepas mixtas complementarias de microorganismos que forman consorcios sinérgicos. Dichos consorcios mixtos pueden tener un potencial mayor para un rendimiento consistente con una capacidad competitiva en diferentes condiciones ambientales y de crecimiento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En la presente se proporcionan cepas y cultivos microbianos. También se proporcionan composiciones microbianas y los métodos de uso para mejorar el crecimiento y/o rendimiento de una planta. También se proporcionan métodos de tratamiento de semillas de plantas mediante el uso de composiciones microbianas descritos en la presente. Además, se proporcionan métodos para prevenir, inhibir o tratar el desarrollo de patógenos vegetales o el desarrollo de enfermedades fitopatogénicas. La descripción también proporciona variedades vegetales de origen no natural que son variedades infectadas artificialmente con un endófito microbiano de la invención. También se proporcionan semillas, tejido reproductor, tejido vegetativo, tejido regenerativo, partes de la planta o progenie de la planta de origen no natural. La descripción proporciona adicionalmente un método para preparar composiciones agrícolas.

En un aspecto, la presente descripción proporciona cepas microbianas aisladas, cultivos aislados de estas, cultivos biológicamente puros de estas y cultivos enriquecidos de estas. En determinadas modalidades preferidas de este aspecto, la cepa microbiana puede ser SGI-003-H11 (depositada como NRRL B-50483); SGI-020-A01 (depositada como NRRL B-50484); SGI-026-G06 (depositada como NRRL B-50485); SGI-026-G07 (depositada como NRRL B-50486), o una cepa derivada de alguna de dichas cepas. En algunas otras modalidades preferidas, la cepa microbiana puede comprender una secuencia de nucleótidos o aminoácidos que exhiba al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % o al menos 99,5 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de nucleótidos y/o secuencias de aminoácidos de 16S ribosómico y/o recA en el listado de secuencias. En algunas modalidades, la cepa microbiana también tiene una actividad que promueve el crecimiento vegetal como se describe en la presente.

También se proporcionan composiciones microbianas que incluyen una cepa microbiana de la invención o un cultivo de esta. Tales composiciones microbianas de acuerdo con algunas modalidades preferidas puede comprender una cantidad agrícolamente eficaz de un compuesto o composición adicional, en el cual el compuesto o composición adicional puede ser un fertilizante, un acaricida, un bactericida, un fungicida, un insecticida, un microbicida, un nematicida o un pesticida. En algunas otras modalidades preferidas, las composiciones microbianas pueden incluir adicionalmente un portador. En aún otras modalidades preferidas, el portador puede ser una semilla vegetal. En determinadas modalidades de este aspecto, la composición microbiana se prepara como una formulación que puede ser una emulsión, un coloide, un polvo, un granulo, un sedimento, limaduras, un aerosol, una emulsión o una solución. En algunas otras modalidades preferidas, las composiciones microbianas pueden ser formulaciones de recubrimiento de semillas. En todavía otro aspecto, también se proporcionan semillas vegetales que están recubiertas con una composición microbiana de acuerdo con la presente invención.

En otro aspecto, se proporcionan métodos para tratar semillas vegetales. Dichos métodos incluyen exponer o poner en contacto las semillas vegetales con una cepa microbiana de acuerdo con la presente invención o un cultivo de esta.

En otro aspecto de la invención, se proporcionan en la presente métodos para mejorar el crecimiento y/o el rendimiento de una planta. En algunas modalidades, dicho método implica aplicar una cantidad eficaz de una cepa microbiana de acuerdo con la presente invención o un cultivo de esta a la planta, o a los alrededores de la planta. En algunas otras modalidades, el método implica cultivar una cepa microbiana de acuerdo con la presente invención o un cultivo de esta en un medio de cultivo o el suelo de una planta hospedadora antes de o a la vez que ocurre el crecimiento de la planta hospedadora en dicho medio de cultivo o suelo. En modalidades preferidas, la planta puede ser una planta de maíz o una planta de trigo. En algunas otras modalidades, la cepa microbiana o cultivo de esta puede establecerse como un endófito en la planta.

En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos para prevenir, inhibir o tratar el desarrollo de un patógeno vegetal. Dichos métodos incluyen cultivar una cepa microbiana de acuerdo con la invención o un cultivo de esta en un medio de cultivo o el suelo de una planta hospedadora antes de o a la vez que ocurre el crecimiento de la planta hospedadora en dicho medio de cultivo o suelo. En algunas modalidades preferidas, el patógeno vegetal puede ser un microorganismo del género Colletotríchum, Fusaríum, Gibberella, Monographella, Penicillium o Stagnospora. En algunas modalidades particularmente preferidas, el patógeno vegetal puede ser Colletotríchum graminicola, Fusaríum graminearum, Gibberella zeae, Monographella nivalis, Penicillium sp. o Stagnospora nodurum.

Otro aspecto adicional de la invención proporciona métodos para prevenir, inhibir o tratar el desarrollo de una enfermedad patogénica en una planta. Dichos métodos implican la aplicación a la planta, o a los alrededores de la planta, de una cantidad eficaz de una cepa microbiana de acuerdo con la invención o un cultivo de esta. En algunas modalidades preferidas, la cepa microbiana o cultivo de esta se puede aplicar al suelo, una semilla, una raíz, una flor, una hoja, una parte de la planta o a la planta entera.

Otro aspecto adicional de la invención proporciona plantas de origen no natural. Las plantas de origen no natural se infectan artificialmente con una cepa microbiana de la invención o un cultivo de esta. En modalidades adicionales de este aspecto se proporcionan semillas, tejido reproductor, tejido vegetativo, tejido regenerativo, partes de plantas y progenie de las plantas de origen no natural.

Otro aspecto de la invención proporciona métodos para preparar una composición agrícola. Dichos métodos implican inocular la cepa microbiana de acuerdo con la presente invención o un cultivo de esta en o sobre un sustrato y permitir su crecimiento.

En otro aspecto la invención proporciona una cepa aislada, un cultivo aislado de esta, un cultivo biológicamente puro de esta o un cultivo enriquecido de un microorganismo del género Pantoea. En una modalidad el microorganismo comprende una secuencia de ADN o una secuencia de aminoácidos que codifican un gen de ARNr 16S o una proteína recA que tiene al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93%, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % o al menos 99,5 % de identidad de secuencia con una secuencia que codifica el gen de ARNr 16S o la proteína recA descritos en el listado de secuencias. En otra modalidad la invención proporciona un género de microorganismos que comprende cualquiera de las secuencias de ADN o secuencias de aminoácidos descritas anteriormente y que mejoran el crecimiento y/o el rendimiento de una planta, como se describe en la presente.

Estos y otros objetos y características de la invención se volverán más evidentes a partir de la descripción detallada de la invención y las reivindicaciones.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A menos que se defina de otra forma, todos los términos de la técnica, notaciones y otros términos o terminología científica empleada en la presente tienen los significados comúnmente comprendidos por los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. En algunos casos, se definen en la presente términos con significados comúnmente comprendidos con fines de claridad y/o para hacer una referencia específica, y la inclusión de tales definiciones en la presente no debe ser necesariamente interpretada como una representación de diferencia sustancial respecto a lo que generalmente se entiende en la técnica. Muchas de las técnicas y procedimiento descritos o mencionados en la presente se entienden y emplean comúnmente usando metodología convencional por los expertos en la técnica.

La forma en singular "un", "una" y "el/la" incluye referencias en plural a menos que el contexto claramente lo indique de otra manera. Por ejemplo, el término "una célula" incluye una o más células, e incluye mezclas de estos.

Bactericida: el término "bactericida", tal como se usa en la presente, se refiere a la capacidad de una composición o sustancia de aumentar la mortalidad o inhibir la tasa de crecimiento de bacterias.

Control biológico: el término "control biológico" y su forma abreviada "biocontrol", como se usa en la presente, se define como el control de un patógeno o insecto o cualquier organismo no deseado mediante el uso de al menos un segundo organismo que no sea un ser humano. Un ejemplo de mecanismo conocido de control biológico es el uso de microorganismos que controlan la descomposición de la raíz al ocupar el espacio que ocuparían los hongos en la superficie de la raíz, o microorganismos que inhiben el crecimiento o matan el patógeno. La "planta hospedadora" en el contexto de control biológico es la planta que es susceptible a la enfermedad causada por el patógeno. En el contexto del aislamiento de un organismo, tal como una bacteriana o especie fúngica, de su ambiente natural, la "planta hospedadora" es una planta que sustenta el crecimiento de la bacteria u hongo, por ejemplo, una planta de una especie de la cual la bacteria u hongo es un endófito.

Una "cantidad eficaz", tal como se usa en la presente, es una cantidad suficiente para producir resultados beneficiosos o deseados. Un cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones. En términos de tratamiento, inhibición o protección, una cantidad eficaz es la cantidad suficiente para mejorar, estabilizar, revertir, ralentizar o retrasar la evolución de la infección o enfermedad objetivo. La expresión "microorganismo eficaz" usada en la presente con referencia a un microorganismo, se pretende que signifique que la cepa de la presente exhibe un grado de promoción del crecimiento vegetal y/o del rendimiento o un grado de inhibición de una enfermedad patogénica que excede, en un nivel estadísticamente significativo, el de un control no tratado. En algunas instancias, la expresión "una cantidad eficaz" se usa en la presente en referencia a una cantidad de un tratamiento microbiano que es necesaria para obtener un resultado beneficioso o deseado en relación con el que ocurre en un control sin tratar en condiciones adecuadas de tratamiento, como se describe en la presente. Para los fines de la presente descripción, la tasa real de aplicación de una formulación líquida usualmente variará entre un mínimo de alrededor de 1 x 103 a alrededor de 1 x 1010 células viables/ml_ y preferentemente de alrededor de 1 x 106 a alrededor de 5 x 109 células viables/mL. En la mayoría de las condiciones, las cepas de la invención descritas en los ejemplos más adelante, serán eficazmente óptima con tasas de aplicación en el intervalo de alrededor de 1 X 106 a 1 X 109 células viables/ml_, asumiendo un modo de aplicación que lograría un contacto sustancialmente uniforme de al menos alrededor del 50 % de los tejidos vegetales. Si los microorganismos se aplican como formulación sólida, la tasa de aplicación debería controlarse para lograr una cantidad similar de células viables por área de unidad de superficie de tejido vegetal, como la obtenida mediante las tasas antemencionadas de tratamiento líquido. Típicamente, las composiciones microbianas de la presente invención son biológicamente efectivas cuando se administran a una concentración en exceso de 106 UFC/g (unidades formadoras de colonias por gramo), preferentemente en exceso de 107 UFC/g, más preferentemente 108 UFC/g y más preferentemente a 109 UFC/g.

Composición: Se pretende que "composición" signifique una combinación de agente activo y al menos otro compuesto, portador o composición, que puede ser inerte (por ejemplo, un agente detectable o etiqueta o portador líquido) o activo, tal como un fertilizante.

Una "planta de control", tal como se usa en la presente descripción, proporciona un punto de referencia para medir cambios en el fenotipo de la planta de la presente, puede ser cualquier célula vegetal, semilla, componente vegetal, tejido vegetal, órgano vegetal o planta entera adecuados. Una planta de control puede comprender, por ejemplo, (a) una planta o célula de tipo salvaje, es decir, del mismo genotipo que el material de partida para la alteración genética que dio como resultado la planta o célula de la presente; (b) una planta o célula del genotipo que el material de partida pero que ha sido transformada con una construcción nula (es decir, una construcción que no tiene un efecto conocido en el rasgo de interés, tal como una construcción que comprende un gen indicador); (c) una planta o célula que es un segregante no transformado entre la progenie de una planta o célula de la presente; (d) una planta o célula que es genéticamente idéntica a la planta o célula de la presente pero que no está expuesta al mismo tratamiento (por ejemplo, tratamiento con fertilizante) que la planta o célula de la presente; (e) la planta o célula de la presente en sí, bajo condiciones en las cuales el gen de interés no se expresa; o (f) la propia planta o célula de la presente, en condiciones en las cuales no se ha expuesto a un tratamiento particular tal como, por ejemplo, un fertilizante o una combinación de fertilizantes y/u otros químicos.

Cultivo, cultivo aislado, cultivo biológicamente puro y cultivo enriquecido: Tal como se usa en la presente, una cepa aislada de un microbio es una cepa que ha sido retirada de su entorno natural. Como tal, el término "aislado" no refleja necesariamente la extensión en la cual el microbio ha sido purificado. Pero en diferentes modalidades un cultivo "aislado" ha sido purificado al menos 2x o 5x o 10x o 50x o 100x del material en bruto del cual fue aislado. Como ejemplo no taxativo, si un cultivo se aisla del suelo como material en bruto, el organismo puede ser aislado a una extensión en la cual su concentración en una cantidad dada de material purificado o parcialmente purificado (por ejemplo, tierra) es al menos 2x o 5x o 10x o 50x o 100x que en el material en bruto original. Un "cultivo sustancialmente puro" de la cepa del microbio se refiere a un cultivo que sustancialmente no contiene otros microbios que la cepa o cepas deseadas de microbios. En otras palabras, un cultivo sustancialmente puro de una cepa de microbios está sustancialmente libre de otros contaminantes, que pueden incluir contaminantes microbianos, así como contaminantes químicos no deseados. Además, tal como se usa en la presente, una cepa "biológicamente pura" se pretende que signifique la cepa separada de materiales con los que se asocia normalmente en la naturaleza. Nótese que una cepa asociada con otras cepas, o con compuestos o materiales con los cuales no se encuentre normalmente en la naturaleza, se denomina de todos modos como "biológicamente pura". Un monocultivo de una cepa particular está, por supuesto, "biológicamente puro". En diferentes modalidades, un cultivo "biológicamente puro" ha sido purificado al menos 2x o 5x o 10x o 50x o 100x del material con el que se asocia normalmente en la naturaleza. Como ejemplo no taxativo, si un cultivo se asocia normalmente con el suelo en la naturaleza, el organismo puede ser biológicamente puro a una extensión en la cual su concentración en una cantidad dada de material purificado o parcialmente purificado con el que se asocia normalmente en la naturaleza (por ejemplo, tierra) es al menos 2x o 5x o 10x o 50x o 100x que en el material no purificado original. Tal como se usa en la presente, el término "cultivo enriquecido" de una cepa microbiana aislada se refiere a un cultivo microbiano donde la población microbiana total del cultivo contiene más del 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de la cepa aislada.

Cultivar: El término "cultivar", tal como se usa en la presente, se refiere a la propagación de organismos en medios de varios tipos.

Tal como se usa en la presente, un "endófito" es un endosimbionte que vive dentro de una planta durante al menos parte de su vida sin causar una enfermedad evidente. Los endófitos pueden transmitirse ya sea verticalmente (directamente de progenitor a progenie) u horizontalmente (de individuo a individuo no relacionado). Los endófitos fúngicos transmitidos verticalmente son típicamente asexuados y se transmiten desde la planta progenitora hasta la progenie por medio de penetración de la hifa fúngica en las semillas de la planta hospedadora. Los endófitos bacterianos también pueden transferirse verticalmente desde semillas hasta plántulas (Ferreira et ál., FEMS Microbiol. Lett. 287:8-14, 2008). Por el contrario, los endófitos transmitidos horizontalmente son típicamente sexuales, y se transmiten por medio de esporas, y pueden expandirse por medio del viento y/o vectores insectos. Los endófitos microbianos de plantas de cultivo han recibido atención considerable respecto a su capacidad de controlar tanto la enfermedad y la infestación por insectos, así como su potencial para promover el crecimiento vegetal.

Patógeno fúngico: A los efectos de esta invención se entiende que el uso del término patógeno fúngico u hongo se pretende que incluya tanto la etapa sexual (telemorfa) de este organismo como también la etapa asexual (anamorfa), también mencionadas como etapas fúngicas perfecta e imperfecta, respectivamente. Por ejemplo, la etapa anamorfa de Fusaríum graminearum es Gibberella zeae.

Fungicida: Tal como se usa en la presente, "fungicida" se refiere a la capacidad de una composición o sustancia de disminuir la tasa de crecimiento de hongos o de aumentar la mortalidad de los hongos.

Mutante: Tal como se usa en la presente, el término "muíante" o "variante" en referencia a un microorganismo se refiere a una modificación de la cepa progenitora en la cual la actividad biológica deseada es similar a la expresada por la cepa progenitora. Por ejemplo, en el caso de Burkholdena, la "cepa progenitora" se define en la presente como la cepa original de Burkholdena antes de la mutagénesis. Los mutantes o variantes pueden ocurrir en la naturaleza sin la intervención del ser humano. También se pueden obtener mediante una variedad de métodos y composiciones conocidos para los expertos en la técnica. Por ejemplo, una cepa progenitora puede ser tratada con un químico tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, etilmetanosulfona, o mediante radiación usando rayos gamma, X o radiación ultravioleta, o mediante otros medios conocidos por los expertos en la técnica.

Nematicida: El término "nematicida", tal como se usa en la presente, se refiere a la capacidad de una sustancia o composición de aumentar la mortalidad o inhibir la tasa de crecimiento de nemátodos.

Patógeno: El término "patógeno" tal como se usa en la presente se refiere a un organismo tal como un alga, un arácnido, una bacteria, un hongo, un insecto, un nemátodo, una planta parásita, un protozoario, una levadura o un virus capaz de producir una enfermedad en una planta o animal. El término "fitopatógeno" tal como se usa en la presente se refiere a un organismo patogénico que infecta la planta.

Porcentaje de identidad de secuencia: la "porcentaje de identidad de secuencia", tal como se usa en la presente, se determina mediante la comparación de dos secuencias alineadas ubicadas de manera óptima, en una ventana de comparación definida por la longitud de la alineación local entre las dos secuencias. La secuencia de aminoácidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (por ejemplo, huecos o excedentes) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. La alineación local de dos secuencias únicamente incluye segmentos de cada secuencia que se consideran los suficientemente similares, de acuerdo con un criterio que depende de un logaritmo usado para llevar a cabo la alineación (por ejemplo BLAST). El porcentaje de identidad de secuencia se calcula determinando el número de posiciones en la que la base de ácido nucleico o residuo de aminoácido aparece en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100. La alineación óptima de secuencias para su comparación se puede llevar a cabo mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Add. APL. Math. 2:482, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (J Mol. Biol. 48:443, 1970); mediante la búsqueda para el método de similitud de Pearson y Lipman (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988), mediante implementaciones heurísticas de estos algoritmos (NCBI BLAST, WU-BLAST, BLAT, SIM, BLASTZ), o mediante inspección. Dado que se han identificado dos secuencias para su comparación, GAP y BESTFIT se emplean preferentemente para determinar su alineación óptima. Típicamente, se utilizan los valores por defecto para la ponderación de huecos de 5,00 y 0,30 para la longitud de ponderación de hueco. El término "identidad de secuencia sustancial" entre secuencias polinucleótidos o polipéptidos se refiere a polinucleótidos o polipéptidos que comprenden una identidad de secuencia que es al menos 50 %, preferentemente al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, más preferentemente al menos 85 %, más preferentemente al menos 90 %, incluso más preferentemente al menos 95 %, y más preferentemente al menos 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de sustancia comparada con una secuencia de referencia usando los programas. Además, la homología de secuencia o la similitud de secuencia en pares, tal como se usa se refiere al porcentaje de residuos que son similares entre dos secuencias alineadas. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido bien definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

La consulta de ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos se pueden buscar contra secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos de la invención que se encuentran en bases de datos públicas o privadas. Dichas búsquedas se pueden realizar usando el programa de herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI BLAST v 2.18). El programa NCBI BLAST está disponible en Internet a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Típicamente se pueden utilizar los siguientes parámetros para NCBI BLAST: Las opciones de filtro se establecen en "por defecto", la Matriz de Comparación se establece como "BLOSUM62", el Costo de Hueco se establece como "Existencia: 11 , Extensión: 1", la longitud de palabra se establece como 3, la Expectativa (umbral E) se establece como 1e-3, y la longitud mínima para la alineación local se establece como 50 % de la longitud de secuencia de consulta. La identidad y similitud de secuencia puede determinarse usando el software GenomeQuest™ (Gene-IT, Worcester Mass., EUA).

El término "plaga" tal como se usa en la presente se refiere a un organismo no deseado que puede incluir, de modo no taxativo, bacterias, hongos, plantas (por ejemplo, malezas), nemátodos, insectos y otros animales patógenos. "Pesticida", tal como se utiliza en la presente, se refiere a la capacidad de una sustancia o composición de disminuir la tasa de crecimiento de una plaga, es decir, un organismo no deseado, o de aumentar la mortalidad de una plaga.

Progenie: Tal como se usa en la presente, "progenie" incluye descendientes de una planta particular o de una línea de plantas. La progenie de una planta de la invención incluye semillas formadas en F2, F3, F4, F5, F6 y generaciones subsiguientes de plantas, o semillas formadas en BC-i , BC2, BC3, y generaciones subsiguientes de plantas, o semillas formadas en F1BC1, F1BC2, F1BC3, y generaciones subsiguientes de plantas. La designación F^ se refiere a la progenie de una cruza entre dos progenitores que son genéticamente diferentes. Las designaciones F2, F3, F4, F5 y F6 se refieren a generaciones subsiguientes de progenie autopolinizada o polinizada por una planta del mismo híbrido de una planta F-i .

Variante: tal como se usa en la presente en referencia a un ácido nucleico y polipéptido, el término "variante" se usa en la presente para denominar una molécula de polipéptido, proteína o polinucleótido con algunas diferencias, generadas sintética o naturalmente, en sus secuencias de aminoácidos o ácido nucleico, en comparación con un polipéptido o polinucleótido de referencia, respectivamente. Por ejemplo, estas diferencias incluyen sustituciones, inserciones, eliminaciones o cualesquiera combinaciones deseadas de dichos cambios en un polipéptido de referencia o polipéptido. Las variantes de polipéptidos y proteínas pueden consistir adicionalmente en cambios en la carga y/o modificaciones postraduccionales tal como glicosilación, metilación, fosforilación, etc.).

El término "variante", cuando se usa en la presente en referencia a un microorganismo, es una cepa microbiana que tiene características identificadoras de las especies a la que pertenece, mientras que tiene al menos una variación de secuencia de nucleótidos o un rasgo diferente identificable con respecto a la cepa progenitora, donde el rasgo es genético (hereditario). Por ejemplo, para una cepa 020_A01 de Bacillus thunngiensis que tiene actividad que promueve el del crecimiento vegetal, los rasgos identificares incluyen 1) la capacidad de inhibir el desarrollo de fitopatógenos fúngicos, incluyendo Fusarium graminearum, Gibberella zeae, Stagnospora nodurum, Colletotrichum graminicola; 2) la capacidad de mejorar el rendimiento del trigo; y 3) tener un gen de ARNr 16S con una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia mayor que 95 %, mayor que 96 %, mayor que 97 %, mayor que 98 % o mayor que 99 % al gen de ARNr 16S de Bacillus thuringiensis 020_A01 ; puede utilizarse para confirmar una variante como Bacillus thunngiensis 020_A01.

Rendimiento: Tal como se usa en la presente, el término "rendimiento" se refiere a la cantidad de material vegetal cosechable o producto derivado de plantas, y se define normalmente como el producto medible de valor económico de un cultivo. Para plantas de cultivo, "rendimiento" también significa la cantidad de material cosechable por acre o unidad de producción. El rendimiento se puede definir en términos de cantidad o calidad. El material cosechado puede variar de cultivo a cultivo, por ejemplo, pueden ser semillas, biomasa por encima del suelo, raíces, frutos, fibras de algodón y otras partes de plantas, o cualquier producto derivado de plantas que sea de valor económico. El término "rendimiento" también comprende potencial de rendimiento, que es el rendimiento máximo obtenible. El rendimiento puede depender de una cantidad de componentes de rendimiento, que pueden monitorearse por medio de determinados parámetros. Estos parámetros son conocidos para los expertos en la técnica y varían de cultivo a cultivo. El término "rendimiento" también comprende el índice de cosecha, que es la relación entre la biomasa cosechada sobre la cantidad total de biomasa.

Todas las publicaciones y las solicitudes de patente citadas en la presente memoria descriptiva se incorporan a la presente mediante esta referencia en la misma medida como si cada publicación o solicitud de patente individual se indicara específica e individualmente como incorporada a la presente mediante esta referencia.

No se admite que ninguna de las referencias constituya técnica previa. La discusión de las referencias establece lo que sus autores afirman, y los solicitantes se reservan el derecho a cuestionar la precisión y pertinencia de los documentos citados. Se entenderá claramente que, aunque haya una cantidad de publicaciones de la técnica previa mencionadas en la presente, estas referencias no constituyen una admisión de que ninguno de estos documentos forme parte del conocimiento general común de la técnica.

La discusión de los métodos generales proporcionada en la presente se pretende que tenga únicamente fines ilustrativos. Otros métodos y modalidades alternativas serán evidentes para los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción.

Microorganismos promotores del crecimiento vegetal Diversos microorganismos asociados a plantas pueden impactar de manera positiva en la salud y fisiología vegetal en una variedad de maneras. Estos microbios beneficiosos se mencionan generalmente como microorganismos promotores del crecimiento vegetal (PGPM). El término "actividad que promueve el crecimiento vegetal", tal como se usa en la presente, comprende una amplia variedad de propiedades vegetales mejoradas, incluyendo, por ejemplo de modo no taxativo, fijación de nitrógeno mejorada, desarrollo de las raíces mejorado, área de hoja aumentada, rendimiento vegetal aumentado, germinación de semillas aumentada, fotosíntesis aumentada o un aumento de la biomasa acumulada de la planta. En varias modalidades la mejora es un aumento de al menos 10 % o un aumento de al menos 25 % o un aumento de al menos 50 % o un aumento de al menos 75 % o un aumento de al menos 100 % en la propiedad que se está midiendo. Por lo tanto, como ejemplos no taxativos, los microbios pueden producir un aumento de porcentaje antemencionado en la fijación de nitrógeno, o un aumento de porcentaje antemencionado en el peso de raíces total, o en el área de hoja o en el rendimiento de producto vegetal (por ejemplo, un aumento de porcentaje antemencionado en el peso de producto vegetal), o un aumento de porcentaje antemencionado de semillas que germinan dentro de los 10 días o 14 días o 30 días, o la tasa de fotosíntesis (por ejemplo, determinada por el consumo de C02) o la biomasa acumulada de la planta (por ejemplo, determinada por el peso de la planta). El producto vegetal es el producto - usual pero no necesariamente - un producto alimenticio producido por una planta. El rendimiento puede determinarse usando cualquier método conveniente, por ejemplo, busheles o libras de producto vegetal producido por acre de plantación. A la fecha, se han descrito cepas aisladas de más de dos docenas de géneros de microorganismos que tienen actividad que promueve el crecimiento vegetal y/o actividad de biocontrol, y nuevos géneros y especies con actividades similares se siguen descubriendo. Adicionalmente, dentro de algunos géneros bacterianos, se han identificado múltiples especies y subespecies de agentes de biocontrol y pueden encontrarse en muchas escalas espaciales, desde el nivel global hasta el nivel de granjas, e incluso en plantas individuales. Además, se ha descrito que algunos aislados microbianos individuales pueden exhibir actividad de biocontrol y/o que promueva el crecimiento vegetal, no solo en las plantas o cultivos de los que se obtuvieron sino también en otros cultivos. Esto indica la naturaleza general de algunos genotipos, especialmente de aquellos con una distribución geográfica amplia. Como se discutió anteriormente, si se introducen en cantidades suficientes y si son activos durante un tiempo suficiente, una población microbiana individual puede tener un impacto significativo en la salud de la planta.

Se han propuesto algunos mecanismos para proporcionar una explicación para el impacto positivo de los PGPM en la mejora del crecimiento vegetal. Los efectos beneficiosos de los microorganismos en el crecimiento vegetal pueden ser directos o indirectos.

El término "microorganismo promotor del crecimiento vegetal directo", a los efectos de esta descripción, se refiere a un microorganismo que puede mejorar el crecimiento vegetal en la ausencia de patógenos. Como se discute con más detalle a continuación, los ejemplos de promoción de crecimiento vegetal directo incluyen (a) biofertilización, (b) estimulación del crecimiento de la raíz, (c) rizorremed ¡ación, y (d) control del estrés vegetal. Adicionalmente, varios PGPM han demostrado que promueven el crecimiento vegetal indirectamente mediante mecanismos de control biológico, es decir, por la reducción del nivel de enfermedad, por ejemplo antibiosis, inducción de la resistencia sistémica, y competición con patógenos por nutrientes y nichos.

Biofertilizantes: Los fertilizantes microbianos le suministran nutrientes a la planta y por lo tanto pueden promover el crecimiento vegetal en la ausencia de presión de patógeno. Los ejemplos no taxativos de aislados microbianos que pueden promover directamente el crecimiento vegetal y el rendimiento incluyen bacterias fijadoras de N2, como especies de Bradyrhizobium y Rhizobium que mediante la fijación simbiótica de nitrógeno pueden formar nodulos en las raíces de plantas leguminosas, en las que convierten N2 atmosférico en amoníaco que a diferencia del N2 atmosférico, se puede usar por la planta como fuente de nitrógeno. Otros ejemplos incluyen especies de Azospirillum, que son fijadores de N2 autónomos que pueden fertilizar y aumentar el rendimiento de cultivos de cereales tales como trigo, sorgo, y maíz. A pesar de la capacidad de fijación de N2 de Azospirillum, el aumento de rendimiento causado por la inoculación por Azospirillum se atribuye generalmente al desarrollo elevado de raíces y por lo tanto a las tasas elevadas de absorción de agua y minerales. A este respecto, varias rizobacterias como Azotobacter spp. han demostrado ser capaces de producir un amplio conjunto de fitohormonas (por ejemplo, auxinas, citoquininas) y enzimas (por ejemplo, pectinasa). Se ha demostrado que muchas de estas fitohormonas y enzimas están íntimamente involucradas en el proceso de infección de las asociaciones simbióticas entre plantas y bacterias que tienen una influencia reguladora en la nodulación por Rhizobium.

En muchos casos, los PGPM también pueden afectar el crecimiento y desarrollo vegetal modificando la absorción de nutrientes. Pueden alterar las tasas de absorción de nutrientes, por ejemplo, por efectos directos en las raíces, por efectos en el ambiente que a su vez modifican el comportamiento de la raíz, y compitiendo directamente por nutrientes (Gaskin et ál., Agrícult. Ecosyst. Environ. 12: 99-1 16, 1985). Algunos de los factores por los que los PGPM pueden jugar un papel importante en la modificación de la eficiencia del uso de nutrientes en el suelo incluyen, por ejemplo, geometría de la raíz, solubilidad del nutriente, disponibilidad del nutriente mediante la producción de la forma iónica compatible con la planta, división de los nutrientes en la planta y eficiencia en su utilización. Por ejemplo, un nivel bajo de fosfato soluble puede limitar el crecimiento de las plantas. Algunos microbios que promueven el crecimiento vegetal son capaces de solubilizar el fosfato a partir de fosfatos unidos inorgánicos u orgánicos, facilitando de esa manera el crecimiento vegetal. Varias enzimas de origen microbiano, tales como fitasas, fosfonatasas, C-P liasas y fosfatases no específicas, liberan fósforo soluble a partir de compuestos orgánicos en el suelo. Por ejemplo, se ha descubierto que una solubilización elevada de fósforo inorgánico en el suelo mejora la absorción de fósforo en plántulas de cañóla usando Pseudomonas putida así como también una elevada absorción de azufre y oxidación de azufre (Grayston y Germida, Can. J. Microbio!. 37: 521-529, 1991; Banerjee, Phytochemicals and Health, vol. 15, mayo 18, 1995).

Fitoestimuladores: Algunos microorganismos pueden producir sustancias que estimulan el crecimiento vegetal en la ausencia de patógenos. Por ejemplo, la producción de hormonas vegetales es una característica de muchos microorganismos asociados con las plantas. Para las cinco fitohormonas clásicas, es decir, auxina, etileno, ácido abscísico, citoquinina, y giberelina, se ha demostrado que la síntesis como un metabolito secundario para al menos una especie de hongos y/o bacteriana (para una revisión, ver, por ejemplo, Kim et ál., Appl. Environ. Microbiol., Vol. 77, 5:1548-1555, 2011). Algunos microorganismos también pueden producir metabolitos secundarios que afectan la producción de fitohormonas en las plantas. Probablemente, el ejemplo más conocido es la hormona auxina, que puede promover el crecimiento de las raíces. Otros ejemplos incluyen pseudomonas que han demostrado que producen ácido acético indol (AAI) y que mejoran las cantidades de AAI en plantas, causando un impacto profundo en la producción de biomasa vegetal (Brown, Annual Rev. Phytopathology, 68: 181-197, 1974). Por ejemplo, Tien et ál. (Applied Environmental Microbio!., 37:1016-1024, 1979) demostró que la inoculación de soluciones de nutrientes alrededor de las raíces de mijo perla con Azospiríllum brasiliense causó un aumento en el peso de la raíz y tallo, una cantidad elevada de raíces laterales, y se cubrieron todas las raíces laterales densamente con pelos radicales. Las plantas a las que se les suministraron combinaciones de AAI, giberilinas y quinetinas mostraron un aumento en la producción de raíces laterales similares a las que causa la Azospirilla. A pesar de que la importancia biológica de estas fitohormonas y materiales tipo hormonas vegetales no se comprende en su totalidad, la actividad de estimulación de crecimiento de estos microorganismos se atribuye comúnmente a la producción de estos materiales.

Además, otras hormonas así como también determinados compuestos orgánicos volátiles (VOC, por sus siglas en inglés) y el cofactor pirrolquinolina quinona (PQQ) también estimulan el crecimiento vegetal. Por ejemplo, algunas rizobacterias, tales como cepas de especies bacterianas B. subtilis, B. amyloliquefaciens, y Enterobacter cloacae promueven el crecimiento vegetal liberando VOC. Se ha observado el nivel más alto de promoción de crecimiento con 2,3-butanodiol y 3-hidroxi-2-butanona (también llamado acetoína) como provocadores de la resistencia sistémica inducida. El cofactor PQQ ha sido descrito como un promotor de crecimiento vegetal que actúa como un antioxidante en las plantas. Algunos informes sugieren que el efecto puede ser indirecto porque el PQQ es un cofactor de varias enzimas, por ejemplo, involucrado en la actividad antifúngica e inducción de resistencia sistémica.

Controladores del estrés: Los microorganismo promotor del crecimiento vegetal que contienen la enzima ácido 1-aminociclopropano-1-carboxilíco (ACC) deaminasa facilitan el crecimiento vegetal y desarrollo bajando los niveles de etileno de la planta. Dichos microorganismos absorben el precursor de etileno ACC y lo convierten en 2-oxobutanoato y NH3. Se ha demostrado que diferentes tipos de estrés se han atenuado por los productores ACC deaminasa, tales como, por ejemplo, el estrés causado por efectos de bacterias fitopatogénicas, estrés causado por hidrocarburos poliaromáticos, estrés causado por metales pesados tales como Ca2+ y Ni2+, y estrés causado por sal y sequías.

Además, se ha demostrado que varias cepas de PGPM que causaban aumentos en el rendimiento de papas producen sideróforos extracelulares que se unen a Fe3+, haciendo que esté menos disponible para determinado miembro de la microflora natural (Kloepper et ál., Nature 286: 885-886, 1980). Estas rizobacterias excretan cofactores microbianos quelantes de hierro de alta afinidad y peso molecular bajo que específicamente mejoran su adquisición de hierro mediante la unión a los receptores sideróforos unidos a la membrana. Uno de los sideróforos producidos por algunas pseudomonas PGPM es conocido como pseudobactina que inhibe el crecimiento de Erwinia cartovora (organismo que causa la pudrición blanda de la papa) (ver, por ejemplo, Kloepper et ál., Current Microbiol. 4: 317-320, 1980). Las adiciones de la pseudobactina al medio de crecimiento inhibieron la infección de podredumbre blanda y también redujo el número de hongos patógenos en la planta de la papa junto con un aumento significativo en el rendimiento de la papa. La mayoría de la evidencia que respalda la teoría de sideróforo del control biológico por PGPM proviene del trabajo con pioverdinas, una clase de sideoforos que comprende los pigmentos fluorescentes de las pseudomonas fluorescentes [Demange et ál., en Iron Transport in Microbes, Plants and Animáis (Winkleman et ál., eds.), pp 167-187, 1987]. De acuerdo con la teoría de sideróforo, las pioverdinas demuestran determinada especificidad de cepa funcional que se debe al reconocimiento selectivo de receptores de sideróforos de membrana externa (Bakker et al., So/7 Biology and Biochemistry 9: 443-450, 1989).

Cultivos aislados de la invención Tal como se describe más detalladamente en la sección de Ejemplos de la presente descripción, los Solicitantes han descubierto varios microorganismos novedosos que son promotores efectivos del crecimiento vegetal y el rendimiento vegetal. En muchos casos, los microorganismos aislados también son eficaces para suprimir el desarrollo de varias enfermedades patógenas de plantas. Los aislados microbianos se seleccionaron de un grupo de aproximadamente 5000 cepas microbianas obtenidas de muestras ambientales recolectadas de varias ubicaciones a lo largo de Estados Unidos. La selección inicial de los microorganismos se basó en la capacidad de los microorganismos de colonizar las raíces de las plantas y para producir compuestos químicos y enzimas que se consideran importantes para su interacción con las plantas. Los microorganismos también se sometieron a un ensayo biológico para analizar su capacidad de suprimir el desarrollo de varios fitopatógenos fúngicos en un ensayo de antagonismo in vitro. Luego, los microorganismos microbianos seleccionados se sometieron a ensayo biológico en estudios de invernadero en variedades de trigo y maíz comercial para analizar la capacidad de que las cepas microbianas promuevan el crecimiento vegetal y para analizar su capacidad de preservar el potencial de rendimiento de semillas.

Los análisis taxonómicos determinaron adicionalmente que los microorganismos representativos descritos en la presente descripción están íntimamente relacionados con las bacterias de género Bacillus, Burkholdería, Herbaspiríllum, Pantoea, y Pedobacter.

Depósito de material biológico Los cultivos purificados de cepas microbianas descritas en la presente descripción se depositaron en la Colección de Cultivos del Servicio de Investigación Agrícola ubicado en 1815 N. University Street, Peoría, IL 61604, EUA (NRRL) de conformidad con el Tratado de Budapest a los efectos del procedimiento en materia de patentes y las regulaciones de este (Tratado de Budapest). Los números de acceso de estos depósitos son los siguientes: TABLA 1 Aislados microbianos v números de acceso correspondiente Las cepas microbianas se han depositado en condiciones que aseguran que el acceso al cultivo estará disponible, mientras que esta solicitud de patente se encuentre pendiente, para quien designe con este derecho el Encargado de Patentes y Marcas de conformidad con el artículo 1.14, título 37 del CFR [Código de reglamentos federales] y el artículo 122, título 35 del USC [Código de los Estados Unidos]. Los depósitos representan básicamente cultivos puros de las cepas depositadas. Los depósitos están disponibles según lo requiera la legislación extranjera en materia de patentes en los países donde se presentan los equivalentes a la presente solicitud o su progenie. Sin embargo, debe entenderse que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para poner en la práctica el objeto de la invención en menoscabo de los derechos de patente otorgados mediante acciones gubernamentales.

Los microorganismos preferidos de la presente invención presentan todas las características identificatorias de las cepas depositadas y, en particular, las características identificatorias de que son capaces de promover el crecimiento vegetal y/o el rendimiento como se describe en la presente, y las características identificatorias de que son capaces de suprimir el desarrollo de fitopatógenos fúngicos como se describe en el presente. En particular, los microorganismos preferidos de la presente invención hacen referencia a los microorganismos depositados tal como se describe anteriormente, y cepas derivadas de estos.

Composiciones microbiológicas Las composiciones microbiológicas de la presente invención que comprenden las cepas microbianas aisladas o cultivos de estas pueden encontrarse en una variedad de formas, inclusive, de modo no taxativo, cultivos inmóviles, cultivos enteros, solución de células, micelio y/o hifas almacenadas (en particular, soluciones de glicerol), tiras de agar, tapones de agar almacenados en glicerol/agua, soluciones liofilizadas y soluciones secas tales como liofilizado o micelio secado en papel de filtro o semillas de grano. Tal como se define en la presente, se entiende que "cultivo aislado" o los equivalentes gramaticales, según se emplean en esta descripción y en la técnica, quiere decir que el cultivo al que se hace referencia es un cultivo de fluido, sedimento, raspado, muestra en seco, liofilizado o sección (por ejemplo, hifa o micelio); o un soporte, contenedor, o medio tal como una placa, papel, filtro, matriz, pajilla, pipeta o punta de pipeta, fibra, aguja, gel, hisopo, tubo, recipiente, partícula, etc. que contiene un único tipo de organismo. En la presente invención, un cultivo aislado de un antagonista microbiano es un fluido de cultivo o un raspado, sedimento, preparación en seco, liofilizado o sección del microorganismo, o un soporte, contenedor o medio que contiene el microorganismo, en ausencia de otros organismos.

La presente descripción proporciona adicionalmente composiciones que contienen al menos una cepa microbiana aislada o cultivos de esta de la presente invención y un portador. El portador puede ser cualquiera de uno o más de una cantidad de portadores que confieren una variedad de propiedades tales como mayor estabilidad, humectabilidad, dispersabilidad, etc. Los agentes humectantes tales como tensoactivos naturales o sintéticos, que pueden ser tensoactivos no iónicos o iónicos, o una combinación de estos se puede incluir en una composición de la invención. Las emulsiones de agua en aceite también se pueden utilizar para formular una composición que incluya al menos un microorganismo aislado de la presente invención (véase, por ejemplo, la patente estadounidense N.° 7,485,451 , la cual se incorpora a la presente mediante esta referencia). Las formulaciones adecuadas que se pueden preparar incluyen polvos humedecibles, gránulos, geles, tiras de agar o sedimentos, espesantes y similares, partículas microencapsuladas, y similares, líquidos tales como fluidos acuosos, suspensiones acuosas, emulsiones de agua en aceite, etc. La formulación puede incluir productos en grano o legumbre (por ejemplo, grano de tierra o porotos, caldo o harina derivados del grano o porotos), almidón, azúcar o aceite. El portador puede ser un portador agrícola. En determinadas modalidades preferidas, el portador es una semilla, y la composición se puede aplicar o usar como recubrimiento sobre la semilla o dejar que sature a la semilla.

En algunas modalidades, el portador agrícola puede ser la tierra o un medio de crecimiento vegetal. Otros portadores agrícolas que se pueden utilizar incluyen agua, fertilizantes, aceites con base en vegetales, humectantes o combinaciones de estos. De manera alternativa, el portador agrícola puede ser un sólido, tal como tierra diatomácea, marga, sílice, alginato, arcilla, bentonita, vermiculita, vainas, otros productos animales y vegetales o combinaciones, que incluyen gránulos, sedimentos o suspensiones. Las mezclas de cualquiera de los ingredientes antemencionados también se consideran portadores, tales como de modo no taxativo, pesta (harina y arcilla de caolín), sedimentos a base de agar o harina en marga, arena o arcilla, etc. Las formulaciones pueden incluir fuentes alimenticias para los organismos cultivados, tal como cebada, arroz, u otros materiales biológicos como semilla, partes de planta, bagazo de caña de azúcar, cáscaras o cañas a partir del procesamiento del grano, material de la planta sobre la tierra (por ejemplo, "desechos de jardín") o madera de los desechos de un sitio de construcción, aserrín o pequeñas fibras del reciclaje de papel, tela o madera. Otras formulaciones adecuadas serán conocidas para los expertos en la técnica.

En la forma líquida, por ejemplo, las soluciones o suspensiones, los microorganismos de la presente invención se pueden mezclar o suspender en agua o en soluciones acuosas. Los diluyentes o portadores líquidos adecuados incluyen agua, soluciones acuosas, destilados de petróleo u otros portadores líquidos.

Las composiciones sólidas se pueden preparar mediante la dispersión de microorganismos de la invención en un portador sólido adecuadamente dividido, tal como turba, trigo, salvado, vermiculita, arcilla, talco, bentonita, tierra diatomácea, tierra de batán, suelo pasteurizado, y similares. Cuando dichas formulaciones se utilizan como polvos humectables, se puede emplear agentes dispersantes biológicamente compatibles tales como agentes dispersantes y emulsionantes no iónicos, aniónicos, anfotéricos o catión icos.

En una modalidad preferida, las composiciones contempladas en la presente mejoran el crecimiento y el rendimiento de las plantas de cultivo, tales como trigo, cebada, avena, y maíz y, cuando se utiliza en cantidades suficientes, actúa como fertilizante microbiano. Estas composiciones, de manera similar a los demás agentes biofertilizantes, tienen un alto margen de seguridad ya que normalmente no quema ni daña la planta.

Tal como se describe en mayor detalle en la presente descripción, mejorar el crecimiento vegetal y el rendimiento vegetal se puede realizar mediante la aplicación de uno o más composiciones microbiológicas de la presente invención a una planta hospedadora o partes de una planta hospedadora. Las composiciones se pueden aplicar en una cantidad eficaz para mejorar el crecimiento o rendimiento vegetal relacionado con un control sin tratamiento. Los constituyentes activos se utilizan en una concentración suficiente para mejorar el crecimiento de la planta objetivo cuando se aplica a la planta. Como será evidente para un experto en la técnica, las concentraciones eficaces pueden variar en función de factores tales como: (a) el tipo de la planta o materia prima agrícola; (b) el estado fisiológico de la planta o materia prima agrícola; (c) la concentración de patógenos que afectan la planta o materia prima agrícola; (d) el tipo de daño de la enfermedad a la planta o materia prima agrícola; (e) condiciones climáticas (por ejemplo, temperatura, humedad); y (f) la etapa de la enfermedad vegetal. De acuerdo con la presente invención, las concentraciones normales son aquellas mayores que 1 X 102 UFC/mL de portador. Las concentraciones preferidas se encuentran en el intervalo de alrededor de 1 x 104 a alrededor de 1 x 109 UFC/mL, tales como las concentraciones que se encuentran dentro del intervalo de 1 x 106 a 1 x 108 UFC/mL. Las concentraciones más preferidas con aquellas de alrededor de 37.5 a alrededor de 150 mg de masa bacteriana seca por mililitro de portador (composición líquida) o por gramo de portador (formulación seca).

En algunas modalidades, la cantidad de uno o más de los microorganismos en las composiciones de la presente invención pueden variar en función de la formulación final así como también el tamaño o el tipo de planta o semilla utilizada. Preferentemente, el uno o más microorganismo en las composiciones están presentes en aproximadamente 2 % p/p a aproximadamente 80 % p/p de la formulación total. Más preferentemente, el uno o más microorganismo empleados en las composiciones es aproximadamente 5 % p/p a aproximadamente 65 % p/p y más preferentemente aproximadamente 10 % p/p a aproximadamente 60 % p/p en peso de la formulación total.

Tal como lo entenderán los expertos en la técnica, las composiciones microbiológicas de la invención se pueden aplicar en las plantas objetivo usando una variedad de métodos convencionales tales como espolvoreo, recubrimiento, inyección, frotación, con rodillo, inmersión, pulverización o cepillado, o cualquier otra técnica adecuada que no dañe significativamente las plantas objetivo a ser tratadas. Los métodos particularmente preferidos incluyen la inoculación del medio de crecimiento o suelo con suspensiones de células microbianas y el recubrimiento de las semillas de las plantas con células microbianas y/o esporas.

Normalmente, las composiciones de la invención son químicamente inertes; por lo tanto son básicamente compatibles con cualquier constituyente del programa de aplicación. También se pueden utilizar en combinación con sustancias que afectan el crecimiento vegetal, tales como fertilizantes, reguladores del crecimiento vegetal, y similares, siempre que dichos compuestos o sustancias sean biológicamente compatibles. También se pueden utilizar en combinación con agentes pesticidas activos biológicamente compatibles como, por ejemplo, herbicidas, nematicidas, fungicidas, insecticidas, y similares.

Cuando se usan como biofertilizantes en sus formulaciones comercialmente disponibles y en las formas de uso, preparadas a partir de estas formulaciones, las capas microbianas activas y las composiciones de acuerdo con la presente invención pueden estar adicionalmente presentes en la forma de una mezcla con sinergistas. Los sinergistas son compuestos mediante los cuales se incrementa la actividad de las composiciones activas sin que sea necesario que el sinergista agregado sea activo en sí mismo.

Cuando se usan como biofertilizantes en sus formulaciones comercialmente disponible y en sus formas de uso, preparados a partir de estas formulaciones, las cepas microbianas activas y las composiciones de acuerdo con la invención pueden además estar presentes en la forma de una mezcla con inhibidores que reducen la degradación de las composiciones activas después de la aplicación en el hábitat de la planta, en la superficie de partes de las plantas o en los tejidos de la planta.

Las cepas microbianas activas y las composiciones de acuerdo con la invención, como tales o en sus formulaciones, también se pueden usar como una mezcla con fertilizantes, acaricidas, bactericidas, fungicidas, insecticidas, microbicidas, nematicidas, pesticidas conocidos o combinaciones de cualquiera de estos, por ejemplo, a fin de ampliar el espectro de acción o impedir el desarrollo de resistencias a pesticidas de este modo. En muchos casos, dan como resultado efectos sinérgicos, es decir, la actividad de la mezcla puede superar la actividad de los componentes individuales. También se contempla una mezcla con otros compuestos activos conocidos, tales como reguladores del crecimiento, protectores y/o semioquímicos.

En una modalidad preferida de la presente invención, las composiciones pueden incluir adicionalmente al menos un fertilizante químico o biológico. La cantidad de al menos un fertilizante químico o biológico empleado en las composiciones puede variar en función de la formulación final así como también el tamaño de la planta y la semilla a tratar. Preferentemente, el al menos un fertilizante químico o biológico empleado es alrededor de 0.1 % p/p a alrededor de 80 % p/p con base en la formulación total. Más preferentemente, el al menos un fertilizante químico o biológico está presente en una cantidad de alrededor de 1 % p/p a alrededor de 60 % p/p y más preferentemente alrededor de 10 % p/p a alrededor de 50 % p/p.

Las composiciones microbiológicas de la presente invención incluyen preferentemente al menos un fertilizante biológico. Los fertilizantes biológicos de ejemplo que son adecuados para su uso en la presente y que se pueden incluir en una composición microbiológica de acuerdo con la presente invención para promover el crecimiento y el rendimiento vegetal incluyen microbios, animales, bacterias, hongos, material genético, planta y productos naturales de organismos vivos. En estas composiciones, el microorganismo de la presente invención se halla aislado antes de la formulación con un organismo adicional. Por ejemplo, los microbios como por ejemplo, pero de modo no taxativo, especies de Achromobacter, Ampelomyces, Aureobasidium, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Beauvería, Bradyrhizobium, Candida, Chaetomium, Cordyceps, Cryptococcus, Dabaryomyces, Delñia, Erwinia, Exophilia, Gliocladium, Herbaspirillum, Lactobacillus, Mariannaea, Microccocus, Paecilomyces, Paenibacillus, Pantoea, Pichia, Pseudomonas, Rhizobium, Saccharomyces, Sporobolomyces, Stenotrophomonas, Streptomyces, Talaromyces, y Trichoderma se pueden proporcionar en una composición con los microorganismos de la presente invención. El uso de composiciones microbiológicas de acuerdo con la presente invención en combinación con los microorganismos microbianos divulgados en la solicitud de patente estadounidense n.° US20030172588A1, US20030211119A1 ; patente estadounidense n.° 7,084,331 ; 7,097,830; 7,842,494; Solicitud PCT n.° WO2010109436A1 también es particularmente preferida.

En una modalidad preferida de la presente invención, las composiciones pueden incluir adicionalmente al menos un pesticida químico o biológico. La cantidad de al menos un pesticida químico o biológico empleado en las composiciones puede variar en función de la formulación final así como también el tamaño de la planta y la semilla a tratar. Preferentemente, el al menos un pesticida químico o biológico empleado es alrededor de 0.1 % p/p a alrededor de 80 % p/p con base en la formulación total. Más preferentemente, el al menos un pesticida químico o biológico está presente en una cantidad de alrededor de 1 % p/p a alrededor de 60 % p/p y más preferentemente alrededor de 10 % p/p a alrededor de 50 % p/p.

Una variedad de pesticidas químicos es evidente para un experto en la técnica y se pueden utilizar. Los pesticidas químicos de ejemplo incluyen los que se encuentran en las clases de carbamato, organofosfato, organoclorado, y piretroide. También incluye agentes de control químico tales como, de modo no taxativo, benomil, bórax, captafol, captán, chorotalonil, formulaciones que contienen cobre; formulaciones que contienen diclona, dicloran, yodo, cinc; fungicidas que inhiben la biosíntesis de ergosterol tales como de modo no taxativo blasticidina, cimoxanilo, fenarimol, flusilazol, folpet, imazalil, iprodiona, maneb, mancozeb, metalaxilo, oxicarboxina, miclobutanil, oxitetraciclina, PCNB, pentaclorofenol, procloraz, propiconazol, quinometionato, arsenito de sodio, DNOC de sodio, hipoclorito de sodio, fenilfenato de sodio, estreptomicina, azufre, tebuconazol, terbutrazol, tiabendazol, tiofanato de metilo, triadimefón, triciclazol, triforina, validamicina, vinclozolin, zineb y ziram.

Las composiciones microbiológicas de la presente invención incluyen preferentemente al menos un pesticida biológico. Los pesticidas biológicos de ejemplo que son adecuados para su uso en la presente y que se pueden incluir en una composición microbiológica de acuerdo con la presente invención para prevenir una enfermedad patogénica de la planta que incluye microbios, animales, bacterias, hongos, material genético, planta y productos naturales de organismos vivos. En estas composiciones, el microorganismo de la presente invención se halla aislado antes de la formulación con un organismo adicional. Por ejemplo, los microbios tales como, de modo no taxativo, especies de Ampelomyces, Aureobasidium, Bacillus, Beauvería, Candida, Chaetomium, Cordyceps, Cryptococcus, Dabaryomyces, Erwinia, Exophilia, Gliocladium, Maríannaea, Paecilomyces, Paenibacillus, Pantoea, Pichia, Pseudomonas, Sporobolomyces, Talaromyces y Trichoderma, se pueden proveer en una composición, de manera particular se prefieren los microorganismos de la presente invención, con cepas fúngicas del género Muscodor. El uso de las composiciones microbiológicas de acuerdo con la presente invención en combinación con los antagonistas microbianos descritos en la patente estadounidense N.° 7,518,040; la patente estadounidense N.° 7,601 ,346; la patente estadounidense N.° 6,312,940 también se prefiere de manera particular.

Los ejemplos de hongos que se pueden combinar con composiciones y cepas microbianas de la presente invención, en una composición incluyen, de modo no taxativo, Muscodor species, Aschersonia aleyrodis, Beauvería bassiana ("muscarina blanca"), Beauveria brongniartii, Chladosporíum herbarum, Cordyceps clavulata, Cordyceps entomorrhiza, Cordyceps facis, Cordyceps gracilis, Cordyceps melolanthae, Cordyceps militarís, Cordyceps myrmecophila, Cordyceps ravenelii, Cordyceps sinensis, Cordyceps sphecocephala, Cordyceps subsessilis, Cordyceps unilateralis, Cordyceps variabilis, Cordyceps washingtonensis, Culicinomyces clavosporus, Entomophaga grylli, Entomophaga maimaiga, Entomophaga muscae, Entomophaga praxibulli, Entomophthora plutellae, Fusarium laterítium, Hirsutella citríformis, Hirsutella thompsoni, Metarhizium anisopliae ("muscarina verde"), Metarhizium flaviride, Muscodor albus, Neozygitesfloridana, Nomuraea rileyi, Paecilomyces farinosus, Paecilomyces fumosoroseus, Pandora neoaphidis, Tolypocladium cylindrosporum, Verticillium lecanii, Zoophthora radicans, y especies micorrizales tales como Lacearía bicolor. Otras especies micopesticidas serán evidentes para los expertos en la técnica.

La presente invención también proporciona métodos para el tratamiento de una planta mediante la aplicación de cualquiera de una variedad de formulaciones habituales en una cantidad eficaz ya sea al suelo (es decir, en el surco), a una parte de la planta (es decir, mojar) o a la semilla antes de plantarla (es decir, recubrimiento de la semilla o abono). Las formulaciones habituales incluyen soluciones, concentrado emulsionable, polvos humectables, concentrado de suspensión, polvos solubles, gránulos, concentrado de suspensión-emulsión, materiales naturales y sintéticos impregnados con el compuesto activo, y cápsulas de liberación controlada muy finas en sustancias poliméricas. En determinadas modalidades de la presente invención, las composiciones microbianas son formuladas en polvos que están disponibles ya sea en una formulación lista para su uso o se mezclan entre sí al momento del uso. En cualquiera de estas modalidades, el polvo se puede mezclar con el suelo antes o en el momento de la plantación. En una modalidad alternativa, uno o ambos de ya sea el agente promotor de crecimiento vegetal o el agente de biocontrol es una formulación líquida que se mezcla al momento del tratamiento. Un experto en la técnica entiende que una cantidad eficaz de las composiciones de la invención depende de la formulación final de la composición así como del tamaño de la planta o el tamaño de la semilla a ser tratada.

Dependiendo de la formulación final y el método de aplicación, uno o más aditivos adecuados también pueden introducirse a las composiciones de la presente invención. Pueden agregarse adhesivos, tal como carboximetilcelulosa y polímeros naturales y sintéticos en la forma de polvos, gránulos o látex, tal como goma arábiga, quitina, alcohol polivinílico y acetato de polivinilo, así como fosfolípidos naturales, tal como cefalinas y lecitinas, y fosfolípidos sintéticos, a las composiciones de la presente.

En una modalidad preferida, las composiciones microbiológicas están formuladas en una solución, emulsión o suspensión individual y estable. Para las soluciones, los compuestos químicos activos se disuelven típicamente en solventes antes de que se agregue el agente biológico. Los solventes líquidos adecuados incluyen aromáticos a base de petróleo, tal como xileno, tolueno o alquilnaftalenos, hidrocarburos alifáticos, tal como ciclohexano o parafinas, por ejemplo fracciones de petróleo, aceites minerales y vegetales, alcoholes, tal como butanol o glicol así como sus éteres y ésteres, cetonas, tal como metil etil cetona, metil isobutil centona o ciclohexanona, solvente altamente polares, tal como dimetilformamida y dimetil sulfóxido. Para emulsiones y suspensiones, el medio líquido es agua. En una modalidad, el agente químico y el agente biológico se suspenden en líquidos separados y se mezclan al momento de la aplicación. En una modalidad preferida de suspensión, el agente químico y agente biológico se combinan en una formulación pronta para su uso que presenta una vida útil razonablemente larga. En el uso, el líquido puede pulverizarse o puede aplicarse foliarmente como por pulverización o en el surco al momento de plantar el cultivo. La composición líquida puede introducirse en una cantidad eficaz en la semilla (es decir, recubrimiento de semilla o abono) o en el suelo (es decir, en el surco) antes de la generación de la semilla o directamente en el suelo en contacto con las raíces mediante la utilización de una variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, de modo no taxativo, irrigación por goteo, rociadores, inyección en el suelo o mediante el empapado del suelo.

Opcionalmente, se pueden agregar estabilizadores y amortiguadores, incluyendo sales de metales alcalinos y alcalinotérreos y ácidos orgánicos, tal como ácido nítrico y ácido ascórbico, ácidos inorgánicos, tal como ácido clorhídrico o ácido sulfúrico. También pueden agregarse biocidas y pueden incluirse formaldehídos o agentes de liberación de formaldehído, y derivados de ácido benzoico, tal como ácido p-hidroxibenzoico.

Patógenos Los expertos en la técnica reconocerán que los métodos y composiciones de acuerdo con la presente invención en principio pueden ser aplicados para inhibir el desarrollo de cualquier patógeno vegetal o cualquier enfermedad fitopatogénica. No se pretende que la invención se limite a tipos de cultivo particulares o tipos de células. Por ejemplo, las células microbianas que se someten a formas complejas de diferenciación, filamentación, esporulación, etc., también se pueden usar para los métodos y composiciones de la presente invención.

Los ejemplos de enfermedades fitopatogénicas que son adecuadas para las aplicaciones de los métodos y materiales de la presente invención incluyen, de modo no taxativo, enfermedades causadas por una amplia gama de hongos patógenos. Los métodos de la presente invención se aplican preferentemente contra hongos patógenos que son importantes o interesantes para la agricultura, horticultura, biomasa vegetal para la producción de moléculas de biocombustible y otros químicos, y/o silvicultura. Las especies de Pseudomonas patógenas (por ejemplo, Pseudomonas solanacearum), Xylella fastidiosa; Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris, Erwinia amylovora, especies de Fusarium, especies de Phytophthora (por ejemplo, P. infestans), especies de Botrytis, especies de Leptosphaeria, líneas de pimiento (Ascomycota) y royas (Basidiomycota), etc., tienen un interés particular.

Los ejemplos no taxativos de patógenos vegetales de interés incluyen, por ejemplo, Acremonium strictum, Agrobacterium tumefaciens, Alternaría altemata, Alternaría solani, Aphanomyces euteiches, Aspergillus fumigatus, Athelia rolfsii, Aureobasidium pullulans, Bipolaris zeicola, Botrytis cinérea, Calonectría kyotensis, Cephalosporium maydis, Cercospora medicaginis, Cercospora sojina, Colletotrichum coccodes, Colletotrichum fragaríae, Colletotrichum graminicola, Coniella diplodiella, Coprínopsis psychromorbida, Corynespora cassiicola, Curvularía pallescens, Cylindrocladium crotalariae, Diplocarpon earíianum, Diplodia gossyina, Diplodia spp., Epicoccum nigrum, Erysiphe cichoracearum, Fusarium graminearum, Fusaríum oxysporum, Fusarium oxysporum f.sp. tuberosi, Fusarium proliferatum var. proliferatum, Fusarium solani, Fusarium verticillioides, Ganoderma boninense, Geotrichum candidum, Glomerella tucumanensis, Guignardia bidwellii, Kabatiella zeae, Leptosphaerulina briosiana, Leptotrochila medicaginis, Macrophomina, Macrophomina phaseolina, Magnaporthe grísea, Magnaporthe oryzae, Microsphaera manshurica, Monilinia fructicola, Mycosphaerella fijiensis, Mycosphaerella fragariae , Nigrospora oryzae, Ophiostoma ulmi, Pectobacterium carotovorum, Pellicularia sasakii (Rhizoctonia solani), Peronospora manshurica, Phakopsora pachyrhizi, Phoma foveata, Phoma medicaginis, Phomopsis longicolla, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora erythroseptica, Phytophthora fragariae, Phytophthora infestans, Phytophthora medicaginis, Phytophthora megasperma, Phytophthora palmivora, Podosphaera leucotricha, Pseudopeziza medicaginis, Puccinia graminis subsp. Tritici (UG99), Puccinia sorghi, Pyricularia grísea, Pyricularia oryzae, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia zeae, Rosellinia sp., Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotinina trífoliorum, Sclerotium rolfsii, Septoria glycines, Septoria lycopersici, Setomelanomma turcica, Sphaerotheca macularís, Spongospora subterránea, Stemphylium sp, Synchytrium endobioticum, Thecaphora (Angiosorus), Thielaviopsis, Tilletia indica, Trichoderma viride, Ustilago maydis, Verticillium albo-atrum, Verticillium dahliae, Verticillium dahliae, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas oryzae pv. oryzae.

En una modalidad preferida de la presente invención, los métodos y materiales de la invención son útiles para inhibir el desarrollo de patógenos Aspergillus fumigatus, Botrytis cinérea, Cerpospora betae, Colletotríchum sp., Curvularía spp., Fusarium sp., Ganoderma boninense, Geotríchum candidum, Gibberella sp., Monographella sp., Mycosphaerella fijiensis, Phytophthora palmivora, Phytophthora ramorum, Penicillium sp., Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Rhizopus spp., Schizophyllum spp., Sclerotinia sclerotiorum, Stagnospora sp., Verticillium dahliae, o Xanthomonas axonopodis. En una modalidad particularmente preferida, los métodos y materiales de la invención se pueden usar para inhibir el desarrollo de varios patógenos vegetales de importancia comercial, incluyendo Fusarium graminearum NRRL-5883, Monographella nivalis ATCC MYA-3968, Gibberella zeae ATCC-16106, Stagnospora nodurum ATCC-26369, Colletotríchum graminicola ATCC-34167, y patógenos Penicillium sp.

Formulación de recubrimiento de semillas En una modalidad particularmente preferida, las composiciones microbianas de la presente invención se formulan como un tratamiento de semillas. Se contempla que las semillas puedan cubrirse sustancialmente de manera uniforme con una o más capas de las composiciones microbianas divulgadas en la presente usando métodos convencionales de mezcla, pulverización o una combinación de estos a través del uso de equipamiento de aplicación de tratamiento que se diseña y fabrica específicamente para aplicar de manera precisa, segura y eficiente los productos de tratamiento de semillas a las semillas. Dicho equipamiento utiliza varios tipos de tecnología de recubrimiento tal como recubridores rotatorios, recubridores de tambor, técnicas de lecho fluidizado, de lechos con salida a chorro, rociadores rotatorios o una combinación de estos. Los tratamientos para semillas líquidos tal como los de la presente invención pueden aplicarse por medio ya sea de un disco rotatorio "atomizador" o una boquilla pulverizadora que distribuye de forma pareja el tratamiento de semilla en las semillas mientras se mueve a lo largo de un patrón de pulverización. Preferentemente, la semilla luego se mezcla o se precipita durante un período de tiempo adicional para lograr la distribución adicional del tratamiento y el secado. Las semillas pueden estar imprimadas o no antes del recubrimiento con las composiciones de la invención para aumentar la uniformidad de germinación y surgimiento. En una modalidad alternativa, una formulación de polvo seco puede colocar de forma medida en las semillas en movimiento y se deja mezclar hasta que se distribuye por completo.

Otro aspecto de la invención proporciona semillas tratadas con las composiciones microbianas de la presente. Una modalidad proporciona semillas que tienen al menos parte del área de superficie recubierta con una composición microbiológica de acuerdo con la presente invención. En una modalidad específica, las semillas tratadas con microorganismos tienen una concentración de esporas microbianas o una concentración de células microbianas de alrededor de 106 a alrededor de 109 por semilla. Las semillas también pueden tener más esporas o células microbianas por semilla, tal como, por ejemplo 1010, 1011 o 1012 esporas por semilla. Las esporas microbianas y/o las células pueden recubrir libremente las semillas o, preferentemente, pueden formularse en una composición líquida o sólida antes de recubrir las semillas. Por ejemplo, una composición sólida que comprende los microorganismos puede prepararse por mezclado de un portador sólido con una suspensión de las esporas hasta que los portadores sólidos están impregnados con la suspensión de esporas o células. Esta mezcla puede entonces secarse para obtener las partículas deseadas.

En algunas otras modalidades, se contempla que las composiciones microbianas sólidas o líquidas de la presente invención contengan adicionalmente agentes funcionales capaces de proteger las semillas de los efectos dañinos de herbicidas seleccionados, tal como carbono activado, nutrientes (fertilizantes) y otros agentes capaces de mejorar la germinación y la calidad de los productos o una combinación de estos.

Los métodos y composiciones de recubrimiento de semillas conocidos en la técnica pueden ser particularmente útiles cuando se modifican mediante la adición de una de las modalidades de la presente invención. Dichos métodos y aparatos de recubrimiento para su aplicación se describen en, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.° 5,918,413; 5,554,445; 5,389,399; 4,759,945; y 4,465,017. Se describen composiciones de recubrimiento de semillas, por ejemplo, en las solicitudes de patente estadounidense n.° US20100154299, patente estadounidense n.° 5,939,356; 5,876,739, 5,849,320; 5,791,084, 5,661 ,103; 5,580,544, 5,328,942; 4,735,015; 4,634,587; 4,372,080, 4,339,456; y 4,245,432, entre otras.

Puede agregarse una variedad de aditivos a las formulaciones de tratamiento de semillas que comprenden las composiciones de la invención. Se pueden agregar aglutinantes, e Incluyen aquellos compuestos preferentemente de un polímero adhesivo que puede ser natural o sintético sin efecto fitotóxico en la semilla que se va a recubrir. El aglutinante puede seleccionarse de acetatos de polivinilo; copolímeros de acetato de polivinilo; copolímeros de acetato de etilenvinilo (EVA); alcoholes polivinílicos; copolímeros de alcohol polivinílico; celulosas, incluyendo etilcelulosas, metilcelulosas, hidroximetilcelulosas, hidroxipropilcelulosas y carboximetilcelulosa; polivinilpirrolidonas; polisacáridos, incluyendo almidón, almidón modificado, dextrinas, maltodextrinas, alginato y quitosanos; grasas; aceites; proteínas, incluyendo gelatina y zeínas; goma arábiga; goma laca; cloruro de vinilideno y copolímeros de cloruro de vinilideno; lignosulfonatos de calcio; copolímeros de acrílico; polivinilacrilatos; óxido de polietileno; polímeros y copolímeros de acrilamida; acrilato de polihidroxietilo, monómeros de metilacrilamida; y policloropreno.

Puede emplearse cualquiera de una variedad de colorantes, incluyendo cromóforos orgánicos clasificados como nitroso, nitro, azo, incluyendo monoazo, bisazo y poliazo; acridina, antraquinona, azina, difenilmetano, indamina, indofenol, metina, oxazina, ftalocianina, tiazina, tiazol, triarilmetano, xanteno. Otros aditivos que se pueden agregar, incluyendo oligonutrientes tal como sales de hierro, manganeso, boro, cobre, cobalto, molibdeno y cinc. Puede aplicarse un polímero u otro agente de control de polvo para conservar el tratamiento en la superficie de la semilla.

En algunas modalidades específicas, además de células microbianas y las esporas, los recubrimientos pueden comprender adicionalmente una capa de adherente. El adherente debería ser no tóxico, biodegradable y adhesivo. Los ejemplos de dichos materiales incluyen, de modo no taxativo, acetatos de polivinilo; copolímeros de acetatos de polivinilo; alcoholes polivinílicos; copolímeros de alcoholes polivinílicos; celulosas, tal como metilcelulosas, hidroximetilcelulosas e hidroximetilpropil celulosas; dextrinas; alginatos; azúcares; melaza; polivinilpirrolidonas; polisacáridos; proteínas; grasas; aceites; goma arábiga; gelatinas; jarabes; y almidones. Pueden encontrarse más ejemplos en, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7,213,367 y en la solicitud de patente estadounidense n.° US20100189693.

También pueden incluirse varios aditivos, tal como adherentes, dispersantes, tensoactivos y nutrientes, e ingredientes amortiguadores, en la formulación de tratamiento de semillas. Otros aditivos de tratamiento de semillas convencionales incluyen, de modo no taxativo, agentes de recubrimiento, agentes humectantes, agentes amortiguadores y polisacáridos. Se puede agregar al menos un portador agrícolamente aceptable a la formulación de tratamiento de semillas tal como agua, sólidos o polvos secos. Los polvos secos pueden derivar de una variedad de materiales, tal como carbonato de calcio, yeso, vermiculita, talco, humus, carbón activado y varios compuestos de fósforo.

En algunas modalidades, la composición de recubrimiento de semillas puede comprender al menos un relleno que es un componente natural o sintético, orgánico o inorgánico, con el cual se combinan los componentes activos para facilitar su aplicación sobre la semilla. Preferentemente, el relleno es un sólido inerte tal como arcillas, silicatos naturales o sintéticos, sílice, resinas, ceras, fertilizantes sólidos (por ejemplo, sales de amonio), minerales del suelo naturales, tal como caolinas, arcillas, talco, cal, cuarzo, atapulgita, montmorillonita, bentonita o tierras diatomáceas, o minerales sintéticos, tal como sílice, alúmina o silicatos, en particular silicatos de aluminio o magnesio.

La formulación de tratamiento de semillas puede incluir adicionalmente uno o más de los siguientes ingredientes: otros pesticidas, incluyendo compuestos que actúan únicamente debajo del suelo; fungicidas, tal como captán, tiram, metalaxilo, fludioxonilo, oxadixilo e isómeros de cada uno de estos materiales, y similares; herbicidas, incluyendo compuestos seleccionados de glifosato, carbamatos, tiocarbamatos, acetamidas, triazinas, dinitroanilinas, éteres de glicerol, piridazinonas, uracilos, fenoxis, ureas y ácidos benzoicos; protectores herbicidas tal como benzoxazina, derivados de benzhidrilo, ?,?-dialil dicloroacetamida, varios compuestos de dihaloacilo, oxazolidinilo y tiazolidinilo, etanona, compuestos de anhídrido naftalico, y derivados de oxima; fertilizantes químicos; fertilizantes biológicos; y agentes de biocontrol tales como bacterias de origen natural o recombinantes y hongos de los géneros Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Tríchoderma, Glomus, Gliocladium y hongos micorrizales. Estos ingredientes pueden agregarse como una capa separada en la semilla o, alternativamente, pueden agregarse como parte de la composición de recubrimiento de semillas de la invención.

Preferentemente, la cantidad de composición novedosa o de otros ingredientes usados en el tratamiento de semillas no debería inhibir la germinación de la semilla, o causar daño fitotóxico a la semilla.

La formulación que se usa para tratar la semilla en la presente invención puede estar en forma de suspensión; emulsión; suspensión de partículas en un medio acuoso (por ejemplo, agua); polvo humectable; gránulos humectables (fluido seco); y gránulos secos. Si se formula en una suspensión, la concentración del ingrediente activo en la formulación es preferentemente alrededor de 0.5 % a alrededor de 99 % en peso (p/p), preferentemente 5-40 % o formulado de otra manera por los expertos en la técnica.

Como se mencionó anteriormente, otros ingredientes convencionales inactivos o inertes pueden incorporarse en la formulación. Dichos ingredientes incluyen, de modo no taxativo: agentes adhesivos; los agentes de dispersión, tal como metilcelulosa, por ejemplo, sirven como dispersante/agentes adhesivos combinados para su uso en tratamientos de semillas; alcohol polivinílico; lecitina, dispersantes poliméricos (por ejemplo, polivinilpirrolidona/acetato de vinilo); espesantes (por ejemplo, espesantes en arcilla para mejorar la viscosidad y reducir la sedimentación de suspensiones de partículas); estabilizantes de emulsión; tensoactivos; compuestos anticongelantes (por ejemplo, urea), tintes, colorantes y similares. Se pueden encontrar más ingredientes inertes útiles para la presente invención en McCutcheon's, vol. 1 , "Emulsifiers and Detergente", MC Publishing Company, Glen Rock, N.J., EUA, 1996. Se pueden encontrar ingredientes inertes adicionales útiles para la presente invención en McCutcheon's, vol. 2, "Functional Materials", MC Publishing Company, Glen Rock, N.J., EUA, 1996.

Las formulaciones de recubrimiento de la presente invención pueden aplicarse a las semillas por medio de una variedad de métodos, incluyendo, de modo no taxativo, mezcla en un recipiente (por ejemplo, una botella o bolsa), aplicación mecánica, precipitación, pulverización e inmersión. Puede utilizarse una variedad de materiales activos o inertes para poner en contacto las semillas con composiciones microbianas de acuerdo con la presente invención, tal como materiales de recubrimiento de película convencionales, incluyendo, de modo no taxativo, materiales de recubrimiento de película a base de agua, tal como SEPIRET™ (Seppic, Inc., N.J.) y OPACOAT™ (Berwind Pharm. Services, P.A.).

La cantidad de composición de acuerdo con la presente invención que se utiliza para el tratamiento de la semilla variará dependiendo del tipo de semilla y del tipo de ingredientes activos, pero el tratamiento comprenderá poner en contacto las semillas con una cantidad agrícolamente eficaz de la composición inventiva. Como se discutió anteriormente, una cantidad eficaz significa la cantidad de composición inventiva que es suficiente para producir resultados beneficiosos o deseados. Un cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones.

Además de la capa de recubrimiento, la semilla puede tratarse con uno o más de los siguientes ingredientes: otros pestlcidas, incluyendo fungicidas y herbicidas; protectores herbicidas, fertilizantes y/o agentes de biocontrol. Estos ingredientes pueden agregarse como una capa separada o alternativamente pueden agregarse en la capa de recubrimiento.

Las formulaciones de recubrimiento de semillas de la presente invención pueden aplicarse a las semillas usando una variedad de técnicas y máquinas, tal como técnicas de lecho fluidizado, el método de molino de rodillos, tratadores de semillas rotoestáticos y recubridores de tambor.

También pueden ser útiles otros métodos, tal como lechos con salida a chorro.

Pueden separarse por tamaño las semillas antes del recubrimiento. Luego del recubrimiento, las semillas comúnmente se secan y se transfieren a una máquina para separarlas por tamaño. Dichos procedimientos son conocidos en la técnica.

También se puede recubrir las semillas tratadas con microorganismos con una película de segundo recubrimiento para proteger el recubrimiento. Dichos segundos recubrimientos son conocidos en la técnica y pueden aplicarse usando técnicas de recubrimiento de película de tambor y lecho fluidizado.

En otra modalidad de la presente invención, las composiciones de acuerdo con la presente invención pueden introducirse en una semilla mediante el uso de acondicionamiento métrico sólido. Por ejemplo, la cantidad de una composición de la invención puede mezclarse con un material de matriz sólido y luego la semilla puede colocarse en contacto con el material de matriz sólido durante un período para permitir que la composición se introduzca en la semilla. La semilla puede entonces separarse de manera óptima del material de matriz sólido y almacenarse o utilizarse, o la mezcla de material de matriz sólido más la semilla pueden almacenarse o plantarse directamente. Los materiales de matriz sólido que son útiles para la presente invención incluyen poliacrilamida, almidón, arcilla, sílice, alúmina, tierra, arena, poliurea, poliacrilato o cualquier otro material capaz de absorber o adsorber la composición de la invención durante un tiempo y liberar esa composición en la semilla. Es útil asegurarse de que la composición de la invención y el material de matriz sólido son compatibles entre sí. Por ejemplo, el material de matriz sólido debería elegirse de manera que pueda liberar la composición a una velocidad razonable, por ejemplo, durante un período de minutos, horas o días.

En principio, cualquier semilla vegetal capaz de germinar para formar una planta puede tratarse de acuerdo con la invención. Las semillas adecuadas incluyen aquellas de cereales, café, cultivos de coles, cultivos de fibras, flores, frutas, legumbres, cultivos de aceite, árboles, cultivos de tubérculos, verduras, así como otras plantas de las especies monocotiledóneas y dicotiledóneas. Preferentemente se recubren semillas de cultivo, incluyendo, de modo no taxativo, semillas de poroto, zanahoria, maíz, algodón, pastos, lechuga, maní, morrón, papa, colza, arroz, centeno, sorgo, soja, remolacha azucarera, girasol, tabaco y tomate. Más preferentemente, se recubren semillas de cebada o trigo (especialmente trigo o trigo de invierno) con las composiciones de la presente invención.

Preparación de las composiciones microbianas de acuerdo con la presente invención Los cultivos de microorganismos pueden prepararse para su uso en las composiciones microbianas de la invención usando técnicas de secado estático y fermentación líquida estándares conocidas en la técnica. El crecimiento se lleva comúnmente a cabo en un biorreactor.

Un biorreactor se refiere a cualquier dispositivo o sistema que sustenta un entorno biológicamente activo. Como se describe en la presente, un biorreactor es un recipiente en el cual se cultivan microorganismos, incluyendo microorganismos de la presente invención. Un biorreactor puede ser de cualquier forma o tamaño adecuados para el cultivo de microorganismos. Un biorreactor puede tener un tamaño en el rango de 10 mL hasta litros por metro cúbico y puede estar hecho de acero inoxidable o cualquier otro material adecuado como se conoce y utiliza en la técnica. El biorreactor puede ser un reactor de tipo por lotes, uno del tipo de alimentación por lotes o un biorreactor de tipo continuo (por ejemplo, un reactor de agitación continua). Por ejemplo, un biorreactor puede ser un quimiostato conocido y usado en la técnica de la microbiología para cultivar y cosechar microorganismos. Puede obtenerse un biorreactor de cualquier proveedor comercial (ver también Bioreactor System Design, Asenjo y Merchuk, CRC Press, 1995).

Para operaciones a baja escala se puede utilizar un biorreactor por lotes, por ejemplo, para evaluar y desarrollar nuevos procesos, y para los procesos que no pueden convertirse en operaciones continuas.

Los microorganismos cultivados en un biorreactor pueden suspenderse o inmovilizarse. El cultivo en el biorreactor es generalmente en condiciones aeróbicas a temperaturas y pH adecuados para el crecimiento. Para los organismos de la invención, el crecimiento celular se puede lograr a temperaturas entre 5 y 37 °C, con la temperatura preferida en el intervalo de 15 a 30 °C, 15 a 28 °C, 20 a 30 °C o 15 a 25 °C. El pH del medio nutriente puede variar entre 4.0 y 9.0, pero el intervalo operativo preferido es, en general, ligeramente ácido o neutro a pH 4.0 a 7.0, o 4.5 a 6.5, o pH 5.0 a 6.0. Típicamente, el rendimiento máximo de células se obtiene a las 20-72 horas después de la inoculación.

Las condiciones óptimas para el cultivo de microorganismos de esta invención dependerán, por supuesto, de la cepa particular. Sin embargo, en virtud de las condiciones aplicadas en el proceso de selección y requisitos generales de la mayoría de los microorganismos, un experto en la técnica será capaz de determinar nutrientes y condiciones esenciales. Los microorganismos típicamente se cultivarían en cultivos líquidos aeróbicos en medios que contienen fuentes de carbono, nitrógeno y sales inorgánicas que pueden ser asimiladas por microorganismos y ser soporte de un crecimiento celular eficiente. Las fuentes de carbono preferidas son hexosas, tal como glucosa, pero pueden sustituirse con otras fuentes que son asimiladas fácilmente, tal como los aminoácidos. Pueden utilizarse muchos materiales inorgánicos y proteináceos como fuentes de nitrógeno en los procesos de cultivo. Las fuentes de nitrógeno preferidas son los aminoácidos y la urea, pero otros incluyen amoníaco gaseoso, sales inorgánicas de nitrato y amonio, vitaminas, purinas, pirimidinas, extracto de levadura, extracto de ternera, proteosa peptona, soja molida, hidrolizado de caseína, solubles de destilados y similares. Entre los minerales inorgánicos que pueden incorporarse en el medio nutriente están las sales comunes que son capaces de producir calcio, cinc, hierro, manganeso, magnesio, cobre, cobalto, potasio, sodio, molibdato, fosfato, sulfato, cloruro, borato y iones similares. Sin limitarse a este, se prefiere el uso de medio líquido de dextrosa y papa para las cepas fúngicos y premezcla de caldo R2A para cepas bacterianas.

Variedades de plantas novedosas También se proporciona, en otro aspecto de la presente invención, una planta de novedosa mediante la introducción artificial de un endófito microbiano de la invención en una planta que está libre de microorganismos endofíticos. En algunas modalidades de este aspecto, el endófito microbiano introducido en la planta puede ser un microorganismo endofítico que tiene una actividad que promueve el crecimiento vegetal, una actividad de control biológico o una combinación de ambas actividades. Se conocen en la técnica una variedad de métodos que se descubrió previamente que eran eficaces para la introducción de un endófito microbiano en una especie de pasto cereal. Los ejemplos de dichos métodos incluyen los descritos en la solicitud de patente estadounidense N.° 20030195117A1 , solicitud de patente estadounidense N.° 20010032343A1 y la patente estadounidense N.° 7,084,331 , entre otras. Será evidente para los expertos en la técnica que muchos de los métodos antemencionados pueden ser útiles para producir una planta novedosa de la invención.

Después de la infección artificial, se prefiere que una secuencia de ADN del microorganismo endofítico aislado esté amplificada mediante PCR y el microogranismo se confirma al llevar a cabo una búsqueda de homología para el ADN amplificado. Preferentemente se prefiere que el gen extraño que expresa un medio identificable se introduzca en el microorganismo endofítico antemencionado, y la presencia de colonización del microorganismo endofítico antemencionado que infecta la planta se confirma mediante el medio identificable antemencionado, usando el gen extraño.

Plantas adecuadas para los métodos de la invención En principio, los métodos y composiciones de acuerdo con la presente invención pueden implementarse con cualquier especie de planta. Las especies de plantas monocotiledóneas, así como dicotiledóneas, son particularmente adecuadas. Los métodos y composiciones se usan preferentemente con plantas que son importantes o interesantes para la agricultura, horticultura, para la producción de biomasa usada en la producción de moléculas de combustible líquido y otros químicos, y/o en la silvicultura.

Por lo tanto, la invención se puede utilizar en un amplio rango de plantas, preferentemente plantas superiores de las clases Angiospermae y Gymnospermae. Las plantas de las subclases de Dicotylodenae y Monocotyledonae son particularmente adecuadas. Las plantas dicotiledóneas pertenecen a los órdenes de Aristochiales, Asterales, Bátales, Campanulales, Capparales, Caryophyllales, Casuarínales, Celastrales, Cornales, Diapensales, Dilleniales, Dipsacales, Ebenales, Encales, Eucomiales, Euphorbiales, Fabales, Fágales, Gentianales, Geraniales, Haloragales, Hamamelidales, iniciales, Juglandales, Lamíales, Laurales, Lecythidales, Leitneríales, Magniolales, Málvales, Myricales, Myrtales, Nymphaeales, Papeverales, Piperales, Plantaginales, Plumbaginales, Podostemales, Polemoniales, Polygalales, Polygonales, Primulales, Proteales, Rafflesiales, Ranunculales, Rhamnales, Rosales, Rubiales, Salicales, Santales, Sapindales, Sarraceniaceae, Scrophulariales, Theales, Trochodendrales, Umbellales, Urticales y Viólales. Las plantas monocotiledóneas pertenecen a los órdenes de Alismatales, Arales, Arecales, Bromeliales, Commelinales, Cyclanthales, Cyperales, Eriocaulales, Hydrocharítales, Juncales, Lilliales, Najadales, Orchidales, Pandanales, Poales, Restionales, Triuridales, Typhales y Zingiberales. Las plantas que pertenecen a las clases de Gymnospermae son Cycadales, Ginkgoales, Gnetales y Piñales.

Las especies adecuadas pueden incluir miembros de los géneros Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberís, Beta, Bixa, Brassica, Caléndula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucúrbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Eríanthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Sécale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Unióla, Veratrum, Vinca, Vitis y Zea.

Los métodos y composiciones de la presente invención se utilizan preferentemente en plantas que son importantes o interesantes para la agricultura, horticultura, biomasa para la producción de moléculas de biocombustible y otros químicos, y/o silvicultura. Los ejemplos no taxativos incluyen, por ejemplo, Panicum virgatum (pasto varilla), Sorghum bicolor (sorgo, pasto sudan), Miscanthus giganteus (miscanthus), Saccharum sp. (caña de energía), Populus balsamifera (poplar), Zea mays (maíz), Glycine max (soja), Brassica napus (cañóla), Tríticum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (algodón), Oryza sativa (arroz), Helianthus annuus (girasol), Medicago sativa (alfalfa), Beta vulgarís (remolacha azucarera), Pennisetum glaucum (mijo perla), Panicum spp., Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Andropogon gerardii (tallo azul matorralero), Pennisetum purpureum (pasto elefante), Phalaris arundinacea (altramuz amarillo), Cynodon dactylon (grama común), Festuca arundinacea (festuca alta), Spartina pectinata (hierba cable de pradera), Arundo donax (caña gigante), Sécale cereale (centeno), Salix spp. (sauce), Eucalyptus spp. (eucaliptus), Tríticosecale spp. (tríticum-trigo X centeno), Bambú, Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (Jatropha), Ricinus communis (ricino), Elaeis guineensis (palma de aceite), Phoenix dactylifera (palma datilera), Archontophoenix cunninghamiana (palma rey), Syagrus romanzoffiana (palma reina), Linum usitatissimum (lino), Brassica júncea, Manihot esculenta (mandioca), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca saliva (lechuga), Musa paradisiaca (banana), Solanum tuberosum (papa), Brassica olerácea (brócoli, coliflor, coles de Bruselas), Camellia sinensis (té), Fragaria ananassa (frutilla), Theobroma cacao (cacao), Coffea arábica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (ananá), Capsicum annum (pimienta picante y dulce), Allium cepa (cebolla), Cucumis meló (melón), Cucumis sativus (pepino), Cucúrbita máxima (zapallo), Cucúrbita moschata (zapallo), Spinacea olerácea (espinaca), Citrullus lanatus (sandía), Abelmoschus esculentus (quimbombó), Solanum melongena (berenjena), Papaver somniferum (amapola), Papaver oriéntale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis saliva, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Coichicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Dioscorea spp., Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berberís spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sínica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum (Huperzia serrata), Lycopodium spp., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp., Caléndula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, Tanacetum parthenium, Parthenium argentatum (guayule), Hevea spp. (caucho), Mentha spicata (menta), Mentha piperita (mint), Bixa orellana, Alstroemería spp., Rosa spp. (rosa), Dianthus caryophyllus (clavel), Petunia spp. (petunia), Poinsettia pulchem'ma (poinsettia), Nicotiana tabacum (tabaco), Lupinus albus (lupino blanco), Unióla paniculata (avena), bentgrass (Agrostis spp.), Populus tremuloides (temblón), Pinus spp. (pino), Abies spp. (abeto), Acer spp. (arce), Hordeum vulgare (barley), Poa pratensis (cebada), Lolium spp. (raigrás), Phleum pratense (fleo) y coniferas. Las plantas de interés que se cultivan para la producción de energía, llamados cultivos de energía, tal como cultivos de energía a base de celulosa, tal como Panicum virgatum (pasto varilla), Sorghum bicolor (sorgo, pasto sudan), Miscanthus giganteus (miscanthus), Saccharum sp. (caña de energía), Populus balsamifera (poplar), Andropogon gerardii (tallo azul matorralero), Pennisetum purpureum (pasto elefante), Phalarís arundinacea (altramuz amarillo), Cynodon dactylon (grama común), Festuca arundinacea (festuca alta), Spartina pectinata (hierba cable de pradera), Medicago sativa (alfalfa), Arundo donax (caña gigante), Sécale cereale (centeno), Salix spp. (sauce), Eucalyptus spp. (eucaliptus), Triticosecale spp. (tríticum-trigo X centeno), y Bambú; y cultivos de energía a base de almidón, tal como Zea mays (maíz) y Manihot esculenta (mandioca); y cultivos de energía a base de azúcar, tal como Saccharum sp. (caña de azúcar), Beta vulgarís (remolacha azucarera), y Sorghum bicolor (L.) Moench (sorgo dulce); y cultivos de energía que producen biocombustibles, como Glycine max (soja), Brassica napus (cañóla), Helianthus annuus (girasol), Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (Jatropha), Ricinus communis (ricino), Elaeis guineensis (pama de aceite africana), Elaeis oleífera (palma de aceite americana), Cocos nucífera (coco), Camelina sativa (lino silvestre), Pongamia pinnata (Pongam), Olea europaea (oliva), Linum usitatissimum (lino), Crambe abyssinica (col de Abisinia) y Brassica júncea.

La discusión de los métodos generales proporcionada en la presente se pretende que tenga únicamente fines ilustrativos. Otros métodos y modalidades alternativas serán evidentes para los expertos en la técnica al examinar esta descripción, y deben incluirse dentro del espíritu y el ámbito de esta solicitud.

Debe también entenderse que los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Aislamiento de microorganismos a partir de muestras ambientales Identificación de rizobacterias que forman esporas usando un método de raíces sonicadas v diluciones en serie.

Los siguientes microorganismos se aislaron usando un método de "raíces sonicadas, diluciones en serie" como se describe a continuación: los aislados SGI-026-G06 y SGI-026-G07 se aislaron de una muestra de pasto de aguja; el aislado SGI-041-B03 se aisló a partir de una muestra de centeno silvestre; y el aislado SGI-020-A01 se aisló de tejidos de raíces cultivadas en una muestra de tierra compuesta.

Un procedimiento de enriquecimiento se desarrolló para identificar específicamente las rizobacterias que forman esporas. A grandes rasgos, los extractos de raíces sonicados se trataron con calor para eliminar las células vegetativas y luego se colocaron en placas con medio de enriquecimiento. Los microorganismos que sobrevivieron el tratamiento con calor y formaron colonias se consideraron formadores de esporas. Se descubrió que este método era particularmente eficaz para seleccionar bacterias gram-positivas. Las muestras nuevas de raíces se usaron como material de partida para estos enriquecimientos. Las secciones finas que se encuentran en la punta de las raíces son las más nuevas, pueden tener una densidad de filamentos de raíz alta y típicamente tienen densidades altas de rizobacterias. Se utilizó una hoja estéril para cortar estas áreas de las raíces en segmentos de 5 - 10 cm, que se lavaron en agua milliQ estéril para retirar las partículas grandes de tierra. Cuando era necesario, se logró un lavado más estricto mediante la colocación de las raíces en un tubo Falcon de 50 mL con 25 mL de 1 x solución salina amortiguada con fosfato (es decir, amortiguador PBS) y se mezcló vigorosamente durante 1 minuto. Cada muestra de raíz se suspendió subsiguientemente en 20 mL de amortiguador PBS estéril y se sometió a sonicación en hielo durante intervalos de 1 minuto a 8 watts, utilizando un desmembrador sónico Fisher Scientific. Para el tratamiento con calor, típicamente se transfiere 1 mL de la suspensión celular de raíces sonicadas a un tubo Eppendorf estéril, se incubó en un baño de agua a 80 °C durante 20 minutos. Las suspensiones celulares tratadas con calor se dejaron enfriar hasta temperatura ambiente antes de diluirlas en serie a concentraciones de 10"1, lO-2, 10"3, 10"4, 10'5, 10"6 y 10'7. 100 pL de cada dilución múltiplo de 10 se colocaron en placas de cultivo que contenían un medio microbiológico solidificado con agar y 100 mg/L de cicloheximida para inhibir el crecimiento de hongos. En algunos casos fue necesario llegar a cabo una dilución de 1/10 o 1/100 antes de colocar en placas para obtener la densidad de UFC adecuada para recoger las colonias. Las colonias aisladas se recogieron usando puntas de pipetas estériles, se colocaron en placas de microtitulación de 96 pocilios, cada una contenía 150 pL de 2 x de medio YT líquido por pocilio. Las placas de microtitulación se incubaron durante 1-2 días a 30 °C para obtener una densidad celular alta para una caracterización y archivo adicional.

Aislamiento de bacterias que forman biopelículas.

Los siguientes aislados microbianos se aislaron usando un método de "formador de biopelículas" como se describe a continuación: el aislado SGI-003-H11 se aisló a partir de una muestra de raíz de planta de Yucca; el aislado SGI-034-C09 se aisló a partir de una muestra de raíz de pasto; y el aislado SGI-034-E10 se aisló a partir de una muestra de planta de perifollo verde.

Método formador de biopelículas: En este procedimiento, las bacterias que forman biopelículas se aislaron a partir de segmentos de raíces sonicadas, como se describe en Fall et ál. (Syst. Appl. Microbiol. 27,372-379, 2004). Como se describió anteriormente, las bacterias de las biopelículas en la superficie de una raíz son típicamente bacterias colonizadoras de la raíz muy eficaces. En general, cuando dichas bacterias están presentes en densidades altas, pueden tener una influencia significativa en la salud de la planta y pueden excluir competitivamente los patógenos invasores. A grandes rasgos, la sonicación se utilizó para retirar las células bacterianas y fúngicas que se acoplan ligeramente a la raíz, dejando atrás solamente aquellos microbios que se adherían fuertemente a la superficie de la raíz. Tanto las bacterias formadoras de biopelículas gram -positivas y gram-negativas se seleccionaron utilizando este método.

Las muestras nuevas de raíces se usaron como material de partida para estos enriquecimientos. Las secciones finas en la punta de las raíces eran los tejidos más nuevos, tenían una densidad de filamentos de raíz alta y típicamente tenían densidades altas de rizobacterias. Se utilizó una hoja estéril para cortar estas áreas de las raíces en segmentos de 5 - 10 cm, que se lavaron colocándolas en un tubo Falcon de 50 mL con 25 mL 1 x de PBS y se mezclaron vigorosamente durante 1 minuto. Los desechos del lavado se dejaron asentar, y luego se utilizaron fórceps estériles para transferir los segmentos de raíz lavados a tubos Falcon de 50 mL rellenados con 25 mL 1 x de PBS, y se sometieron a sonicación en hielo usando un desmembrador sónico Fisher Scientific durante dos intervalos de 30 segundos con una pausa de 30 segundos entre pulsos. Las muestras de raíces sonicadas se transfirieron a placas de Petri plásticas estériles y se dejaron secar completamente sin tapa dentro de un gabinete de bioseguridad. Cada segmento de raíz se colocó luego en una placa de CMA separada que contenía agar al 1 % (10 g/L de digestión de caseína, 10 g/L de manitol, 10 g/L de agar). A veces, se utilizaron fórceps estériles para colocar el segmento de raíz en el medio de agar. Las placas se incubaron subsiguientemente a 37°C y se monitorearon para verificar el crecimiento microbiano. Típicamente, luego de 1-2 días, emergieron múltiples crecimientos microbianos de las raíces y pasaron al medio CMA. Una punta de pipeta estéril se utilizó para recoger los crecimientos con morfologías únicas a lo largo del segmento y cada uno de estos crecimientos se transfirió al centro de la placa de CMA que contenía 0.3 % de agarosa. Las placas de CMA se incubaron subsiguientemente durante 1-2 días a 37 °C y se monitorearon para verificar el crecimiento. Comúnmente, los aislados que forman biopelículas exhibieron crecimiento dendrítico en este medio.

Se utilizó un asa estéril para transferir la biomasa y purificar por estrías cada aislado de las placas de CMA en placas de CMKA (agar al 2 %, 1.2 g/L de K2HP04). El medio de CMKA restringe el crecimiento de biopelículas y permite recoger las colonias individuales para archivarlas.

EJEMPLO 2 Crecimiento v almacenamiento de los aislados microbianos Las bacterias aisladas se almacenaron como un cultivo puro. Se transfirió una colonia bacteriana a un recipiente que contenía medio líquido de caldo R2A (Tecknova) y se dejó cultivar a 30 °C con agitación a 250 rpm durante dos días. Luego, el cultivo se transfirió a recipientes que contenían 15 % de glicerol y se almacenaron a -80 °C.

EJEMPLO 3 Extracción, secuenciación v taxonomía de ADN Se transfirió una alícuota de 20 µ? de suspensión celular bacteriana a una placa de PCR de 96 pocilios que contenía 20 µ? de 2x amortiguador de lisis (Tris HCI 100 mM, pH 8.0, EDTA 2 mM, pH 8.0, SDS al 1%, 400 pg/mL de proteinasa K). Las condiciones de lisis fueron las siguientes: incubación a 55 °C durante 30 minutos, seguida de incubación a 94 °C durante 4 minutos. Se utilizó una alícuota de producto de lisis como la fuente de la plantilla de ADN para la amplificación por PCR.

Para la amplificación de la región de ADNr 16S, cada mezcla de PCR se preparó en una reacción de volumen final de 20 µ? que contenía 4 µ? de la reacción de lisis bacteriana, 2 µ? de cada cebador de PCR, Tween-20 al 6 % y 10 µ? de 2x ImmoMix (Bioline USA Inc, Taunton, MA). Los cebadores usados para la amplificación de PCR fueron M13-27F (5 -TGTAAAACGACGGCCAGTTAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' SEQ ID NO: 8) y 1492R M13 con cola (5'- CAGGAAACAGCTATGACCGGTTACCTTGTTACGACTT-3'; SEQ ID NO: 9). La PCR se llevó a cabo en un termociclador personal PCT-200 (MJ-Research, MA, EUA) de la siguiente manera: 94 °C durante 10 minutos; 94 °C durante 30 segundos, 52 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 75 segundos durante 30 ciclos; 72 °C durante 10 minutos. Una alícuota de 2 µ? de cada producto de PCR se agregó a gel de agarosa al 1.0 % para confirmar la presencia de una única banda del tamaño esperado. Las bandas positivas se aislaron, purificaron y se enviaron para la secuenciación por PCR. La secuenciación fue llevada a cabo en sentido directo e inverso por el J. Craig Venter Institute en San Diego, California, utilizando tecnologías 454.

La búsqueda de homología para la secuencia de nucleótidos determinada se llevó a cabo la base de datos DDBJ/GenBank/EMBL. Más adelante, la relación filogénica de la secuencia de nucleótidos de los 16 genes de ARNr se analizó entre las cepas bacterianas aisladas descritas en la presente, bacterias del género y especie que muestran homologías de secuencia altas con respecto a las cepas bacterianas aisladas, y otras variedades amplias de géneros y especies de microorganismos, usando el programa ClustalW de creación de árboles filogénicos. La identidad y similitud de secuencia también se determinó usando el software GenomeQuest™ (Gene-IT, Worcester Mass. EUA). El resultado del análisis de secuencia reveló que los aislados bacterianos SGI-003_H11 , SGI-020_A01 , SGI-026_G06, SGI-026_G07, SGI-034_C09, SGI-034_E10, SGI-041_B03 puden considerarse relacionados con las especies de Pantoea agglomerans, Bacillus thuringiensis, Burkholderia metallica, Burkholderia vietnamiensis, Bacillus pumilus, Herbaspirillum sp., Pedobactersp., respectivamente, basándose en > 98 % de las homologías de secuencia de cada una de las 16 secuencias de ARNr con los microorganismos respectivos.

EJEMPLO 4 Características bioquímicas de los aislados bacterianos Las bacterias aisladas se estudiaron adicionalmente para verificar propiedades importantes en su interacción con las plantas. Las propiedades estudiadas incluyen la fijación de nitrógeno, secreción de sideróforos, solubilización de fósforo inorgánico, producción de ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC) deaminasa, producción de 2,3 butanodiol, y la producción de auxina de hormona de crecimiento vegetal. Los resultados de los ensayos bioquímicos in vitro se muestran en la Tabla 2.

Fijación de nitrógeno: Las suspensiones celulares bacterianas se estriaron en un medio sólido de la siguiente composición que no incluía una fuente de nitrógeno: 4.0 g/L de KOH; 0.5 g/L de K2HP0 ; 0.2 g/L de MgS04-7H20; 0.1 g/L de NaCI; 0.02 g/L de CaCI2; 0.005g/L de FeS04-7H20; 0.002 g/L de NaMo04-2H20; 0.01 g/L de MnS04-7H20; 5.0 g/L de ácido málico; 0.1 - 1.0 g/L de goma gellan; y opcionalmente azul de bromotimol al 0.5 % v/v, pH 7.0. Las concentraciones de goma gellan y agar pueden variar según sea necesario para lograr el espesor medio deseado; típicamente se utilizó 0.5 g/L. Se incubaron las estrías a 30 °C durante 2 - 5 días. Estas placas se monitorearon a diario y se seleccionaron las colonias cuando aparecían. En algunos casos, se permitieron períodos de crecimiento más largos (hasta dos semanas o más) para capturar aislados de crecimiento lento. Estas placas de estriado se utilizaron para recoger las colonias usando puntas de pipetas con barrera de aerosol de 20 o 200 L en placas de cultivo celular de 96 pocilios, rellenas con 150 L/pocillo de medio 2YT. De manera alternativa, se recogieron colonias de los aislados directamente en medio libre de N para confirmar su capacidad de crecimiento libres de N. Los resultados, como se resumen en la Tabla 2, indicaron que solamente el aislado SGI-026-G07 mostró actividad de fijación de nitrógeno en niveles detectables.

Secreción de sideróforo: Este ensayo se utilizó para identificar aislados bacterianos que producían sideróforos, que son compuestos quelantes de Fe3+ con afinidad alta, in vitro. Típicamente, los aislados bacterianos se cultivaron en medio mínimo que estaba esencialmente libre de Fe. Todos los artículos de vidrio utilizados durante este ensayo se lavaron con ácido y se enjuagaron tres veces con agua milliQ para retirar el Fe residual que podría alterar los resultados del ensayo. La composición del medio MM9 fue la siguiente: 0.5g/L de K2HP04; 1.0g/L de NH4CI; 0.2g/L de MgS04 H20; 0.5g/L de NaCI; 7.55g/L de PIPES Buffer; 10.0g/L de glucosa; 2.5g/L de ácido glucónico; 2.5g/L de ácido málico; 0.5 g/L de casaminoácidos. El medio se ajustó a pH 7.0 con KOH 5 N y se esterilizó utilizando un filtro de 0.2 µ? (Corning).

Este ensayo se realizó típicamente en un formato de alto rendimiento usando una estación de manipulación de líquidos Beckman FX y placas de cultivo celular de 96 pocilios con 150 pL de medio de cultivo MM9 por pocilio. Los cultivos y medios se distribuyeron y transfirieron de manera aséptica usando una herramienta de aguja autoclave en una cubierta de flujo laminar. Luego de la transferencia, se incubaron 30°C durante 5 días. Luego de la incubación, los sobrenadantes del cultivo se cultivaron mediante centrifugación usando una placa de filtro de 0.22 µ? de 96 pocilios. Se transfirieron diez microlitros de sobrenadante filtrado de cada pocilio a una placa de ensayo Falcon. Se preparó una curva estándar usando desferrioxamina (DFO) diluida en medio MM9. Se agregaron doscientos microlitros de la solución de ensayo CAS [HDTMA 10 mM, solución de Fe(lll): FeCI3.6H20 1 mM, HCI 10 mM, CAS 2 mM] a cada uno de los sobrenadantes y pociflos estándares, seguido por incubación a temperatura ambiente durante 20-30 minutos. La absorbancia de la solución de ensayo CAS de color azul a 630 nm (SpectroMax M2) es inversamente proporcional a la concentración de sideróforos en cada pocilio (es decir, la solución de ensayo debería cambiar a un naranja intenso con mayores cantidades de sideróforos).

Solubilización de fósforo inorgánico: La capacidad de los aislados bacterianos de solubilizar fosfato mineral in vitro se evaluó de la siguiente manera. Las bacterias que se iban a a someter a prueba se estriaron en un medio de cultivo de agar fosfato [5.0g/L de hidroxilapatita - Ca10(PO4)5(OH)2; 1.0g/L de NH4CI; 0.2g/L de MgS04 H20; 0.5g/L de NaCI; 0.01 g/L de FeS0 -7H20; 0.01 g/L de Na2Mo04-7H20; 0.01 g/L de MnS04-7H20; 5.0g/L de glucosa; 2.5g/L de ácido glucónico; 2.5 g/L de ácido málico; 0.5g/L casaminoácidos; 20.0g/L de goma gellan; pH 7.2)], y se monitoreó su crecimiento diariamente. El medio de cultivo tenía una apariencia opaca debido a la presencia de fosfato de calcio. Se podría observar el crecimiento bacteriano y la pérdida de color del medio si la bacteria tiene la capacidad de disolverse del fosfato de calcio. Los aislados que tienen la capacidad de solubilizar el fosfato en fase mineral producirían un halo transparente en el medio opaco que rodea la colonia. Como está resumido en la Tabla 2, no se pudo detectar la capacidad para solubilizar el fosfato mineral en cualquiera de los microorganismos analizados como se determinó por el ensayo in vitro descrito en la presente.

Producción de ACC deaminasa: Uno de los principales mecanismos utilizados por la rizobacteria promotora del crecimiento vegetal (PGPM) para facilitar el crecimiento y el desarrollo vegetal es disminuir los niveles de etileno mediante la deaminación de ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC), el precursor inmediato de etileno en las plantas. La ACC deaminasa cataliza la hidrólisis de ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC) en a-ketobutirato y amoníaco. La presencia del producto a-ketobutirato puede determinarse indirectamente mediante una reacción con 2, 4-dinitrofenilhidrazina en HCI para formar un derivado de fenilhidrazona. Luego de la adición de NaOH, la cantidad de fenilhidrazona en solución se puede determinar mediante espectrofotometría midiendo su absorbancia a 540 nm (Penrose y Glick, Physiol Plant. Mayo; 118:10-1 , 2003). Este ensayo se realizó típicamente en un formato de alto rendimiento usando placas de cultivo celular de 96 pocilios. Cada pocilio contenía 150 pL de medio de cultivo de sales DF complementado con 2.0 g/l (NH4)2S04. Los cultivos y medios se distribuyeron y transfirieron de manera aséptica usando una herramienta de aguja autoclave en una cubierta de flujo laminar. Luego de la transferencia, se incubaron 30 °C durante 2 días. Luego de alcanzar la turbiedad, se transfieren los cultivos por segunda vez usando una herramienta de aguja estéril bajo una cubierta de flujo laminar en placas de 96 pocilios que contenían 150 pL por pocilio de medio de cultivo de sales DF complementados con 5mM de ACC como la única fuente de nitrógeno, seguido por una incubación de 4 días a 30 °C. La absorbancia de cada cultivo a 600 nm se midió usando un espectrofotómetro. Los aislados que exhibieron un crecimiento fuerte bajo estas condiciones (OD >0.2) se llevaron al siguiente paso para someterlos a ensayos adicionales para analizar la actividad de ACC deaminasa como está descrito en Penrose y Glick, 2003, supra.

Los resultados de las pruebas, como se resume en la Tabla 2, indicaron que los siguientes aislados produjeron cantidades significativas de ACC deaminasa: SGI-003-H11 , SGI-026-G06, SGI-026-G07, y SGI-041-B03.

Producción de 2.3-butanodiol: La capacidad de que los aislados bacterianos sinteticen 2,3-butanodiol in vitro se evaluó como sigue a continuación usando espectroscopia de masa y cromatografía de gas capilar como se describe en Ryu et ál. (Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 100:4927-4932, 2003). Este ensayo se realizó típicamente en un formato de alto rendimiento usando placas de cultivo celular de 96 pocilios con 150 pL de medio de cultivo de sales DF por pocilio. También se puede usar un titer-tek cuando se prepara una gran cantidad de placas para escaneos primarios de conjuntos grandes de aislados. Los cultivos y medios se distribuyeron y transfirieron de manera aséptica usando una herramienta de aguja autoclave en una cubierta de flujo laminar. Luego de la transferencia, se incubaron 30 °C durante 5 días. Luego de la incubación, los sobrenadantes del cultivo se cultivaron mediante centrifugación usando una placa de filtro de 0,22 µ? de 96 pocilios. Se transfirieron cincuenta microlitros de sobrenadante filtrado de cada pocilio a los pocilios correspondientes de una placa profunda de 96 pocilios que contenía 450 pL de metanol al 50% por pocilio usando una pipeta con múltiples canales L200 y sellado con un cierre de placa adhesivo, seguido de ensayo de cuantificación de 2,3-butanodiol usando el protocolo descrito por Ryu et ál. (2003, supra). Los resultados de las pruebas, como se resume en la Tabla 2, indicaron que los siguientes aislados produjeron cantidades significativas de 2,3-butanediol: SGI-003-H11 , SGI-034-C09, y SGI-041-B03.

Producción de auxina: Las auxinas son hormonas que pueden afectar directamente el crecimiento vegetal. Este ensayo fue realizado para determinar si los aislados bacterianos produjeron auxinas, ya que se conoce que muchas rizoesferas y aislados bacterianos endofíticos tienen vías bioquímicas que sintetizan la auxina del ácido ¡ndol-3-acético (IAA) y sus derivados. Generalmente triptófano es un precursor en esta síntesis; y por lo tanto, este ensayo cuantificó la producción de AAI (auxina) a partir de los aislados bacterianos cultivados en un medio complementado con una concentración baja de triptófano de aminoácido.

Este ensayo se realizó típicamente en un formato de alto rendimiento usando placas de cultivo celular de 96 pocilios con 150 µ?_ de medio de cultivo de sales YT por pocilio. Cuando se preparó una gran cantidad de placas para escaneos primarios de conjuntos grandes de aislados se usó un titer-tek. Los cultivos y medios se distribuyeron y transfirieron de manera aséptica usando una herramienta de aguja autoclave en una cubierta de flujo laminar. Luego de la transferencia, se incubaron 30 °C durante 5 días. Luego de la incubación, los sobrenadantes del cultivo se cultivaron mediante centrifugación usando una placa de filtro de 0.22 µ? de 96 pocilios. Se transfirieron diez microlitros de sobrenadante filtrado de cada pocilio a una placa de ensayo Falcon. Se agregaron doscientos microlitros de solución de ensayo Saikowsky (Gordon and Weber, Plant Physiol. 26:192-195, 1951) para cada uno de los sobrenadantes y pocilios estándares, seguido por la incubación a temperatura ambiente durante 15-20 minutos. La reacción se monitoreó mediante la absorbancia de la placa en el SpectroMax m2 a 535 nm mientras el cambio de color de la solución de ensayo de Saikowsky de amarillo a púrpura/rosado era proporcional a la concentración de auxina (AAI) en cada pocilio. Los resultados de las pruebas, como se resume en la Tabla 2, indicaron que los siguientes aislados produjeron cantidades significativas de fitohormonas auxina: SGI-003-H11 , SGI-020-A01 , SGI-034-C09, SGI-034-C09, y SGI-041-B03.

TABLA 2 Características bioquímicas de los aislados bacterianos (ND: no detectable) EJEMPLO 5 Actividad de control biológico de los aislados bacterianos contra fitopatógenos fúngicos Se usó un ensayo de antagonismo in vitro para evaluar la capacidad de las cepas bacterianas aisladas de suprimir el desarrollo de varios patógenos fúngicos vegetales, incluyendo Fusarium graminearum NRRL-5883, Monographella nivalis ATCC MYA-3968, Gibberella zeae ATCC- 16106, Stagnospora nodurum ATCC-26369, Colletotrichum graminicola ATCC-34167, y un patógeno de Penicillium sp. El ensayo se realizó en un medio de agar papa dextrosa (APD). Se cultivaron cepas aisladas de bacterias en agar caldo de soja tríptica (TSBA 5) durante 24 h antes de su uso.

Para cada patógeno fúngico, se produjo un inoculo conidial mediante la exposición de la hifa a una colonia en crecimiento activo del hongo y trasferir los hilos de hifa al medio de agar PDA. Después de incubar las placas durante 7 días a 25°C usando un fotoperíodo de 12 h/día, se lavaron las placas de PDA de los conidios usando amortiguador fosfato débil (amortiguador fosfato al 0.004 %, pH 7.2, con 0.019 % de MgCI2). Inmediatamente se pulverizó una suspensión de conidios fúngicos en el amortiguador de fosfato débil (aproximadamente 1 ? 105 conidios/mL) sobre la superficie de agar, y las placas pulverizadas luego fueron incubadas a 25°C por 48-72 h antes de usar en las pruebas de antagonismos.

Para iniciar las pruebas de antagonismo, células de cepas microbianas aisladas se inocularon puntualmente a distancias iguales dentro del perímetro de la placa. Luego de cinco días, las cepas bacterianas se evaluaron como positivas a la antibiosis cuando existía un área transparente visible (es decir, zona de inhibición del crecimiento) que carecía de crecimiento micelial alrededor del perímetro de las colonias microbianas. Los resultados de los ensayos de antagonismos, como se resumen en la Tabla 3, demostraron que cada uno de los microorganismos divulgados en la presente inhibieron el desarrollo de varios fitopatógenos fúngicos, incluyendo Fusaríum graminearum, Monographella nivalis, Gibberella zeae, Stagnospora nodurum, Colletotrichum graminicola, Penicillium sp.

TABLA 3 Actividad de control biológico de los aislados bacterianos contra fitopatógenos fúngicos.

EJEMPLO 6 Mejora del potencial de rendimiento del trigo Se estudiaron los efectos de la inoculación bacteriana en el rendimiento y crecimiento vegetal en un invernadero con aislado SGI-020- A01. Las suspensiones de células microbianas se prepararon de la manera que sigue. Medio 2YT, o medio de cultivo similar, los cultivos de caldo se inocularon a partir de soluciones madre de glicerol aisladas o placas de estriado. Típicamente, antes de su uso en la cámara de crecimiento, invernadero, o campo, los cultivos bacterianos se iniciaron 48-72 horas para permitir que los cultivos alcanzaran la fase exponencial tardía. Los aislados que presentan mayores tiempos de duplicación se iniciaron de forma anticipada. Los cultivos se incubaron a 30 °C en un agitador giratorio a 200 rpm. Luego del crecimiento, las células se sedimentaron a 10,000 x g durante 15 min a 4 °C y se volvieron a suspender en 10 mM de amortiguador de MgS04 (pH 7.0). Las densidades celulares se normalizaron para cada aislado en una base de UFC/mL. Típicamente, las suspensiones de -109 UFC/mL se prepararon para cada aislado y se transportaron sobre hielo en el sitio de inoculación. Las inoculaciones se realizaron diluyendo estas suspensiones celulares 1/20 en agua de riego hasta una densidad final de 5 x 107 UFC/mL. Para ensayos en recipientes de 1 litro, se distribuyeron 20 mL de esta suspensión celular diluida uniformemente sobre la superficie de cada recipiente por duplicado.

La prueba de invernadero se llevó a cabo con suelo de campo con una deficiencia de nutrientes. Luego de remover desechos y rocas grandes, el suelo del campo se mezcló bien para asegurar la homogeneidad. Luego del llenado, se presionó el suelo de cada uno de los recipientes ~2 cm para una capa de siembra firme. Se sembraron las semillas de una variedad cultivada de trigo comercial (trigo harinero; Howe Seeds, Inc.) en recipientes de 1 litro que contenían medio de tierra de campo (plásticos con diámetro estrecho de 10.5 cm x 12.5 cm ). Se distribuyeron uniformemente dos gramos de semillas de trigo harinero (aproximadamente 70 semillas) en cada recipiente y se aplicaron y pulverizaron uniformemente 50 ml_ de tierra de campo sobre la capa de las semillas. Luego de la aparición uniforme del coleóptilo de trigo y la posterior aparición de la primera hoja, la población de la planta se inoculó con 20 mL de 109 UFC/mL de SGI-020-A01. Las plantas de controles negativos recibieron únicamente 20 mL de amortiguador del inoculo. Se realizó cada condición en 8 superficies de duplicación, cada una conteniendo cuatro recipientes de 1 litro (n=4 por superficie). Las superficies se distribuyeron aleatoriamente en cuatro bloques experimentales. Las semillas y plantas se mantuvieron en un invernadero por 60 días a temperatura ambiente (en el intervalo de 8°C a aproximadamente 22°C) con ciclos de luz diurna de aproximadamente 11.5 h luz solar/12 horas de oscuridad a lo largo de toda la prueba. Las plantas se regaron uniformemente por el fondo para un nivel de hidratación adecuado dependiendo de la temperatura y etapa del crecimiento. Aproximadamente 30 días después de la siembra, se apilaron y ataron aproximadamente 70 individuos por recipiente para evitar la contaminación cruzada y para minimizar los efectos de ubicación debido a que la variación en las plantas cayera en otros recipientes. Aproximadamente 60 días después de la siembra, las plantas se dejaron secar para prepararlas para la cosecha. Se cosecharon las cabezas de trigo aproximadamente 80 días después de la siembra. Cada cabeza de trigo se retiró cortando justo debajo de la cabeza. Se agruparon las cabezas de trigo dentro de cada duplicación de recipiente, y se pesaron, y luego se usaron para estimar un potencial de rendimiento. El mismo día se cosecharon todas las plantas de la población y se cosecharon los tratamientos en orden aleatorio para eliminar grandes diferencias en el tiempo entre la cosecha entre los tratamientos. Como resultado, las plantas de trigo tratadas con el aislado SGI-020-A01 presentaron un 40 % de aumento en el potencial de rendimiento comparado a las plantas no tratadas de control (2.95 gramos/recipiente comparado con 2.10 gramos/recipiente). Las desviaciones estándares y promedio se documentaron en todos los 8 duplicados y se realizó un ANOVA (Análisis de la Varianza). La eficacia del aislado microbiano SGI-020-A01 para mejorar el potencial de rendimiento del trigo se cuantificó analizando el rendimiento en peso de las cabezas de trigo para cada duplicado de recipiente. Los valores p <.05 se consideraron significativos.

EJEMPLO 7 Mejora de la producción de biomasa en el maíz Se estudiaron los efectos de la inoculación bacteriana en el rendimiento y crecimiento vegetal en un experimento de invernadero con cada uno de los siguientes aislados bacterianos: SGI-034-C09, SGI-034-E10, SGI-003-H11, SGI-041-B03, SGI-026-G06, y SGI-026-G07. Las pruebas de invernadero se llevaron a cabo con tierra de campo con una deficiencia de nutrientes. Luego de remover desechos y rocas grandes, la tierra del campo se mezcló bien con tierra del recipiente (70:30) para asegurar la homogeneidad. Luego del llenado, se presionó la tierra de cada uno de los recipientes ~2 cm para una capa de siembra firme. Las semillas de una variedad cultivada comercial (Dow AgroSciences) se sembraron en recipientes de 1 litro (recipientes estrechos de 10.5 cm * 12.5 cm) cada uno conteniendo medio de tierra. Dos granos de maíz se distribuyeron uniformemente en cada recipiente con el embrión hacia arriba, seguido de la aplicación de 50 mL de suelo de campo, que se dispersó uniformemente sobre la capa de la semilla. Luego de la germinación, se descartó una plántula por recipiente cuando fue necesario para que cada recipiente tuviera solo una planta.

Luego de la aparición uniforme del coleóptilo del maíz y la posterior aparición de la primera hoja, se inoculó la población de la planta con ~20 mL de 109 UFC/ml de un aislado microbiano seleccionado del grupo de SGI-034-C09, SGI-034-E10, SGI-003-H11 , SGI-041-B03, SGI-026-G06, y SGI-026-G07. Las suspensiones de células microbianas se prepararon de la manera que se describe en el Ejemplo 6 anterior. Las plantas de controles negativos recibieron únicamente 20 mL de amortiguador del inoculo.

Se realizó cada condición en 8 superficies de duplicación, cada una conteniendo dos recipientes de 1 litro (n=2 por superficie). Las superficies se distribuyeron aleatoriamente en cuatro bloques experimentales. Las semillas y plantas se mantuvieron en un invernadero por 60 días a temperatura ambiente (en el intervalo de 8 °C a aproximadamente 22 °C) con ciclos de luz diurna de aproximadamente 11.5 h luz solar/12 horas de oscuridad a lo largo de toda la prueba. Las plantas se regaron uniformemente por el fondo para un nivel de hidratación adecuado dependiendo de la temperatura y etapa del crecimiento. Se cosecho la biomasa del maíz que estaba sobre el suelo aproximadamente 60 días después de la siembra.

El mismo día se cosecharon todas las plantas de la población y se cosecharon los tratamientos en orden aleatoria para eliminar grandes diferencias en el tiempo entre la cosecha entre los tratamientos. Las plantas de maíz se analizaron por la diferencia en su biomasa total. Como está documentado en la Tabla 4, las plantas de maíz tratadas con cada uno de los aislados microbianos mostraron un aumento importante en la biomasa total como se comparó con las plantas no tratadas de control. Las desviaciones estándares y promedio se documentaron en todos los 8 duplicados y se realizó un ANOVA (Análisis de la Varianza).

TABLA 4 Eficacia de los aislados microbianos en la mejora de la biomasa total de la planta EJEMPLO 8 Tratamiento de recubrimiento de semillas de trigo y maíz Los experimentos de tratamiento de semillas a pequeña escala se realizaron de acuerdo con un procedimiento descrito en Sudisha et ál. (Phytoparasitica, 37:161-169, 2009) con pocas modificaciones. En general, se elaboró una solución madre de biopolímero agregando 1 gramos de polvo de goma arábiga (MP Biomedical) a 9 mL de agua y mezclando hasta su homogeneidad. Los cultivos turbios de células microbianas con crecimiento activo o preparaciones de esporas microbianas se lavaron con PBS y se ajustaron a un OD600 de ~5.0. Tres mL de suspensión de células ajustadas se sedimentaron mediante centrifugación en un tubo Falcon de 50 mL. Se decantó el sobrenadante resultante, se reemplazó con 3 mL de solución madre de biopolímero y la suspensión resultante se mezcló completamente. Típicamente, se agregaron aproximadamente 25 g de semillas al tubo Falcon y se agitaron vigorosamente o sometieron a vórtice para asegurar una distribución uniforme de la suspensión de goma/célula. Las semillas recubiertas se diseminaron en recipientes para pesaje de plástico para secarlas en una cubierta de flujo laminar hasta que dejaron de ser pegajosas, generalmente 3 horas con agitado periódico. Las semillas recubiertas se almacenaron a 4 °C y se analizaron periódicamente para evaluar su estabilidad. Se recubrieron y analizaron una variedad de semillas de trigo y de semillas de maíz de la manera descrita anteriormente, incluyendo variedades de trigo harinero común Briggs, Faller, Glenn, Hank, RB07, Samson; variedades de trigo harinero de invierno Jerry, McGill, Overland; y la variedad de semillas de maíz DKC62-61 así como también variedades cultivadas comerciales de maíz (Dow AgroSciences).

La evaluación de viabilidad en los microbios usados en la formulación de recubrimiento de semillas se realizó usando un método de recuento de placa estándar. Típicamente, se analizó una cantidad predeterminada de semillas recubiertas para evaluar la presencia de microbios viables lavando las semillas en una alícuota de amortiguador adecuado y plantando cantidades equivalentes de amortiguador en el medio de agar de nutrientes. Se determinaron las unidades viables formadoras de colonias luego de 1-4 días de incubación a 30 °C. El test de viabilidad demostró que entre 1 ? 104 y 4 ? 107 de unidades viables formadoras de colonias por semilla estaban presentes luego de aproximadamente cinco semanas de almacenamiento a 4 °C. Cuando las semillas se recubrieron con esporas microbianas, la viabilidad de la mayoría de los microbios analizados se mantuvo estable por al menos cuatro meses, incluyendo en múltiples envíos interestatales en Estados Unidos, entrando y saliendo de contenedores refrigerados. Cuando se almacenaron refrigeradas (4°C) los microbios sobrevivieron en el recubrimiento de la semilla con poca pérdida de viabilidad en los períodos de prueba. Los resultados indicaron que las semillas recubiertas con composiciones descritas en la presente se pueden almacenar refrigeradas por mayores períodos y demostraron que los microbios pueden sobrevivir durante períodos con temperaturas más altas para su distribución. Además, se analizó la tasa de germinación de las semillas recubiertas y se determinó que era esencialmente idéntica a las semillas de control, que eran semillas recubiertas únicamente con goma arábiga o semillas no recubiertas.

EJEMPLO 9 Formulación de estado sólido de las composiciones microbianas Esta sección describe una formulación ejemplar de fertilizante microbiano donde la bacteria de acuerdo con la presente invención está encapsulada y el fertilizante está en forma sólida. Las perlas de alginato se preparan de la siguiente manera: Se agrega un mililitro de glicerol al 30 % a una solución de alginato de sodio al 1 , 1.5 o 2 %, dependiendo de las propiedades de alginato (proporción M/G) para obtener un volumen final de 25 mL. Se sedimentaron mediante centrifugación las células bacterianas de un cultivo de 250 mL obtenido de uno de los aislados bacterianos de la invención o de una combinación de dos o más aislados, luego se lavan con una solución salina (NaCI al 0.85 %, p/v), se suspendieron en 25 mL de mezcla de alginato, y se mezclaron completamente. Luego se agrega gota a gota esta suspensión celular en una solución acuosa al 1.5 o 2 % (p/v) estéril enfriada previamente de CaC en agitación suave para obtener las perlas bacterianas de alginato. Las perlas se dejan endurecer durante 2-4 horas a temperatura ambiente. Las perlas se recolectaron con tamizado y se lavaron varias veces con agua estéril y se almacenaron a 4 °C. Para preservar la formulación, las perlas húmedas frescas se pueden congelar a alrededor de -80 °C antes de la liofilización a alrededor de -45 °C durante 15 horas. Las perlas secas liofilizadas se almacenaron en recipientes adecuados, tales como botellas de vidrio estériles.

Para estimar los conteos viables, se pueden liberar las bacterias encapsuladas de las perlas mediante la resuspensión de 100 mg de perlas en solución salina amortiguada con fosfato (pH 7.0) durante 30 minutos seguida de homogeneización. El número total de bacterias liberadas está determinado por el método de recuento de placas estándar luego de la incubación a 30°C durante 48 h. En intervalos de un mes, las densidades celulares en las perlas se enumeran usando métodos similares.

EJEMPLO 10 Compatibilidad de las composiciones microbianas con fungicidas comerciales Dado que las preocupaciones ambientales en el uso de pesticidas en la agricultura están en aumento, las alternativas biológicas se perciben inevitables. Sin embargo, las nuevas formulaciones biológicas también deben permitir que los organismos sobrevivan y expresen su impacto beneficioso específico. Los fungicidas químicos generalmente son tóxicos, no solo para los microorganismos perjudiciales sino también para los beneficiosos. Sin embargo, la capacidad de supervivencia de estos agentes microbianos puede haber mejorado cuando se aplican en menores tasas.

En el presente estudio, el material portador a base de turba se usa para la inoculación del fungicida tratado y la semilla de cultivo simples. La capacidad de tolerancia del fungicida se evalúa generalmente de la siguiente manera: a) las semillas simples inoculadas con bacterias se cultivan en medios de crecimiento bacterianos adecuados tales como placas de agar tripticasa de soja (TSA; Triptona 15 g/L; Soytone 5 g/L, cloruro de sodio 5 g/L, y agar 15 g/L) b) semillas inoculadas con bacterias tratadas con fungicidas cultivadas en placas de TSA comunes, y c) semillas inoculadas con bacterias tratadas con fungicidas en compartimientos de crecimiento. Típicamente, se usan tres concentraciones de fungicidas en cada uno de los experimentos: la dosis recomendada por los fabricantes y dos dosis menores (a 75 % y 50 % de la dosis recomendada). Las semillas inoculadas con bacterias tratadas con fungicidas se almacenan luego de la inoculación y se usan en diferentes intervalos de tiempo (2 h, 4 h y 6 h) para examinar el impacto en la germinación de la semilla. Se monitorea la presencia de las bacterias y la germinación de semillas en placas de petri. Para el estudio del compartimiento de crecimiento, se utilizan las semillas (con dosis recomendadas) tratadas con fungicidas, y se midió la raíz y el largo del hipocótilo a los 7 días del crecimiento de la plántula.

Algunos aislados rizobacteriales de la invención son compatibles con varios fungicidas usados comúnmente como se determinó por el crecimiento bacteriano en las placas de TSA enriquecidas con fungicida. En general, tanto las semillas tratadas con fungicida como las simples, recubiertas con turba inoculada no muestran una variación significativa en la germinación en comparación con el control no inoculado. Además, se observan los efectos de promoción de crecimiento en el largo total de las plántulas y las raíces en todos los tratamientos rizobacteriales en comparación con los controles no inoculados.

EJEMPLO 11 Desarrollo de variedades cultivadas de origen no natural v programa de cultivo Las bacterias endofíticos de la presente invención se introducen en plantas de cultivo, incluyendo cereales, de diversos genotipos y origen geográfico, que carecen de dichos hongos endofíticos, para crear combinaciones de plantas y endófitos con mejores características agronómicas, utilizando los procedimientos análogos a los conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en la solicitud de patente estadounidense N.° 20030195117A1 ; solicitud de patente estadounidense N.° 20010032343A1; y patente estadounidense N.° 7,084,331 , entre otras. Por lo tanto, se pueden crear combinaciones sintéticas de plantas y endófitos determinadas y se pueden seleccionar en un programa de desarrollo de cultivo/variedad cultivada en función de su capacidad para formar y mantener una combinación de beneficio mutuo que da como resultado un beneficio agronómico. La clasificación de las características agronómicas de la combinación también se puede utilizar en dicho programa de cultivo. Estas características pueden incluir, de modo no taxativo, tolerancia a la sequía, acumulación a la biomasa, resistencia a la infección de los insectos, palatabilidad para el ganado (por ejemplo, herbívoros), facilidad de reproducción y rendimiento de las semillas, entre otros. Dichas combinaciones pueden diferir en los niveles de acumulación de los metabolitos microbianos que son tóxicos para las plagas y malezas, incluyendo niveles de alcaloide del ergot, niveles de lolina, niveles de peramina o niveles de lolitrem, a la vez que presentan características agronómicas deseadas de las plantas de cultivo, incluyendo la resistencia a la alimentación o infección con insectos, resistencia al estrés abiótico, palatabilidad para el ganado, acumulación de biomasa, facilidad de reproducción y rendimiento de las semillas, entre otros rasgos.

EJEMPLO 12 Estudio de rendimiento Las semillas de maíz (Zea mayé) se recubrieron con tratamientos microbianos diferentes y se sembraron en un campo preparado. Cada tratamiento se repitió 5 veces en un diseño en bloque completo y aleatorio. Un único duplicado consistió en cuatro lechos (filas) de 9.15 metros de largo, se sembraron 60 semillas (a 15.24 centímetros de separación) en cada lecho. A efectos de la observación, los datos se tomaron solamente de las dos filas del medio.

La aparición de la planta se registró dos veces como se muestra en la Tabla 5 a continuación como el porcentaje de plantas en el duplicado que había brotado. Diez plantas en las dos filas del medio de cada parcela se etiquetaron con una cinta plástica para registrar las medidas de la planta, tales como la altura de la planta, la medida de clorofila, peso de la planta, etc.

Las alturas de las plantas (midiendo la punta de la hoja más alta/larga) registrada 31 y 56 días luego de su plantación indicaron que la altura de la planta entre los tratamientos no fue significativamente diferente. La mayoría de las plantas estaban secas y las hojas se habían encogido al día 110 luego de su plantación, por lo tanto, en algunos casos, las plantas parecían (medían) menos que en las mediciones anteriores, pero en general, la altura de la planta no fue diferente entre los tratamientos. Se midió en contenido de clorofila en la 5a semana después de la plantación (en unidades SPAD) desde las hojas más bajas (aproximadamente 60 cm por encima del suelo) y las hojas más altas (la segunda hoja totalmente expandida desde la punta) de diez plantas etiquetadas de cada parcela. El contenido de clorofila entre los tratamientos no fue significativamente diferente. Se cosechó el cultivo el día 110 y 111. Se cortaron diez plantas etiquetadas de cada parcela a nivel del suelo y las partes que estaban sobre el suelo se pesaron (peso total de la planta o WPtWt), se retiraron las mazorcas del maíz y se midió el largo del choclo (largo de la mazorca con granos) (región rellena de granos comercializables únicamente), luego los granos se removieron del choclo y se pesaron para obtener el peso de grano por mazorca (KnlWt/ear).

Poco después de terminada la cosecha manual de 10 plantas por parcela, se trajo un cosechador mecánico, Gleaner® K2 (Allis-Chalmers Mfrg, Milwaukee, Wl). Esta máquina removió manualmente las plantas restantes de las dos filas del medio de cada parcela, los granos se removieron de los choclos, y se midió el peso y humedad del grano (10 mazorcas + cosecha mecánica). El rendimiento total proyectado con un contenido de humedad del 15.5 % (kilogramos de grano de maíz por hectárea) basado en el peso (kg.) de granos (incluye granos de choclos cosechados a máquina + granos cosechados a mano) fue de 11 ,618.53 kilogramos por hectárea o 161.22 hectolitros por hectárea para SGI-003-H11 {Pantoea agglomerans). Este fue el rendimiento más alto entre los tratamientos de todos los organismos y fue significativamente diferente de los tratamientos para Bacillus amyloliquefaciens SGI-015_F03. El otro con alta producción fue el tratamiento con Bacillus thuringiensis SGI-020_A01.

En conclusión, todas las plantas en los diferentes tratamientos emergieron y crecieron de manera similar en las condiciones del campo proporcionadas con la misma cantidad de fertilizante, herbicidas pre-emergencia (con extracción de malezas manualmente más tarde en la temporada), e irrigación semanal durante la temporada templada y de crecimiento, y el control de plagas, especialmente de gusano elotero. Siendo todas las condiciones iguales, el tratamiento con SGI-003-H11 (Pantoea agglomerans) produjo el mayor rendimiento comparado con el tratamiento de control, sin microbios. Por lo tanto, 003_H1 1 produjo un rendimiento de aproximadamente 17 % mayor que el grupo de control. Por lo tanto, en varias modalidades de la aplicación de la invención de una cantidad eficaz de un organismo de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en la presente produce al menos un rendimiento del 10 % o al menos 12.5 % o al menos 15 % o alrededor de 17 % mayor que un grupo de control, que en algunas modalidades se puede determinar por kilogramos de producto vegetal (por ejemplo, mazorcas de maíz) por hectárea o hectolitros de producto vegetal por hectárea. Los organismos enumerados en la Tabla 5 son SGI-003-H11 (Pantoea agglomerans); SGI-015-F03 (Bacillus amyloliquefaclens); y SGI-020-A01 {Bacillus thuringiensis).

TABLA 5 Organismo Aparición Aparición Altura Altura Altura Fecha 6/20 6/24 7/11 8/5 9/28 Control 97.00 94.50 103.64 277.22 267.82 SGI-003-H11 89.50 93.34 103.32 273.58 272.04 SGI-015-F03 95.67 96.67 105.02 282.02 276.08 SGI-020-A01 94.83 95.33 102.04 268.94 264.80 Organismo Hoja más alta Hoja más baja WPtWt Largo de la mazorca granos Fecha 7/18 7/18 9/28 9/28 Control 43.24 60.85 493.24 14.98 SGI-003-H11 44.17 59.43 494.92 14.29 SGI-015-F03 44.90 63.96 473.40 14.45 SGI-020-A01 46.45 63.84 488.30 14.20 Organismo Peso del Peso del 10 10 grano/mazorca(g) grano/mazorca(lb) mazorcas+máquina mazorcasn Fecha 9/28 9/28 9/29 9/29 Control 168.62 0.37 157.81 8837.63 SGI-003- 171.96 0.38 185.15 10368.14 H11 SGI-015- 156.24 0.34 161.17 9025.62 F03 SGI-020- 158.68 0.35 163.09 9133.16 A01 Se han descrito una cantidad de modalidades de la invención.

Sin embargo, se comprenderá que los elementos de las modalidades descritas en la presente se pueden combinar para realizar modalidades adicionales y que se pueden realizar varias modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Por consiguiente, otras modalidades, alternativas y equivalentes se encuentran dentro del alcance de la invención, tal como se describe y reivindica en la presente.

Los encabezados dentro de la solicitud solamente se presentan a efectos de la comodidad del lector y no limitan de modo alguno el alcance de la invención o sus modalidades.

Todas las publicaciones y las solicitudes de patente citadas en la presente memoria descriptiva se incorporan a la presente a modo de referencia en la misma medida que si cada publicación o solicitud de patente individual se indicara específica e individualmente como incorporada a la presente mediante esta referencia.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un cultivo enriquecido de una cepa microbiana que consiste en una cepa SGI-003-H11.

2. - Un cultivo aislado de una cepa microbiana que consiste en una cepa SGI-003-H1 .

3. - Un cultivo biológicamente puro de una cepa microbiana que consiste en una cepa SGI-003-H 11.

4. - Una cepa microbiana aislada que comprende una secuencia de ADN que presenta al menos un 85 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de nucleótidos en el listado de secuencias; y además donde dicha cepa microbiana tiene una actividad que promueve el crecimiento vegetal.

5. - Una composición que comprende una cepa microbiana o cultivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y una cantidad agrícolamente eficaz de un compuesto o composición que se selecciona del grupo que consiste en un fertilizante, un acaricida, un bactericida, un fungicida, un insecticida, un microbicida, un nematicida, y un pesticida.

6. - Una composición que comprende una cepa microbiana o cultivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y un portador.

7. - La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque dicho portador es una semilla de planta.

8.- La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque dicha composición es una formulación de recubrimiento de semilla.

9.- La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque dicha composición se prepara como una formulación seleccionada del grupo que consiste en una emulsión, un coloide, un polvo, un gránulo, un sedimento, limaduras, un aerosol, una emulsión y una solución.

10.- Una semilla de una planta que tiene un recubrimiento que comprende una composición de la reivindicación 8.

11. - Un método para tratar una semilla de una planta, dicho método comprende una etapa que implica exponer o poner en contacto dicha semilla de planta con una cepa microbiana o cultivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

12. - Un método para mejorar el crecimiento y/o rendimiento de una planta, dicho método comprende aplicar una cantidad eficaz de una cepa microbiana o cultivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 a la planta, o a los alrededores de la planta.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicha cepa microbiana o cultivo se cultiva en un medio de cultivo o el suelo de una planta hospedadora antes de o a la vez que ocurre el crecimiento de la planta hospedadora en dicho medio de cultivo o suelo.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicha planta es una planta de maíz o una planta de trigo.

15.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicha cepa microbiana o cultivo se establece como un endófito en dicha planta.

16. - Un método para prevenir, inhibir o tratar el desarrollo de un patógeno vegetal, dicho método comprende cultivar una cepa microbiana o cultivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en un medio de cultivo o suelo de una planta hospedadora antes o a la vez que ocurre el crecimiento de la planta hospedadora en dicho medio de cultivo o suelo.

17. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicho patógeno vegetal se selecciona del grupo que consiste en los organismos Colletotríchum, Fusaríum, Gibberella, Monographella, Penicillium y Stagnospora.

18. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicho patógeno vegetal se selecciona del grupo que consiste en Colletotríchum graminicola, Fusaríum graminearum, Gibberella zeae, Monographella nivalis, Penicillium sp. o Stagnospora nodurum.

19. - Un método para prevenir, inhibir o tratar el desarrollo de una enfermedad patogénica vegetal, dicho método comprende aplicar una cantidad eficaz de una cepa microbiana o cultivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 a la planta, o a los alrededores de la plata.

20. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque dicha cepa microbiana o cultivo se aplica al suelo, una semilla, una raíz, una flor, una hoja, una parte de la planta o a toda la planta.

21. - Una planta de origen no natural que es una planta infectada artificialmente con una cepa microbiana o cultivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

22.- Semilla, tejido reproductor, tejido vegetativo, tejido regenerativo, partes de la planta o progenie de la planta de origen no natural de la reivindicación 21.

23.- Un método para preparar una composición agrícola, dicho método comprende inocular una cepa microbiana o cultivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en o sobre un sustrato y permitir que dicha cepa microbiana o cultivo crezca a una temperatura de 1-37 °C hasta obtener una cantidad de células o esporas de al menos 102-103 por mililitro o por gramo.