CN113151075B

CN113151075B - 一种解淀粉芽孢杆菌or2-30菌株及其应用

Info

Publication number: CN113151075B
Application number: CN202110381933.XA
Authority: CN
Inventors: 谢珊珊; 江海洋; 万文坤; 甘雨恬; 赵玲玲; 文佳佳
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2021-04-09
Filing date: 2021-04-09
Publication date: 2022-02-15
Anticipated expiration: 2041-04-09
Also published as: CN113151075A

Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌OR2‑30菌株及其应用，属于微生物技术领域，解淀粉芽孢杆菌OR2‑30菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏日期为2021年1月21日，保藏编号为CGMCCNo.21698。本发明的解淀粉芽孢杆菌OR2‑30菌株对油菜菌核病菌、玉米小斑病菌、玉米茎基腐病菌和水稻细菌性条斑病菌表现出广谱拮抗活性，对生物胁迫下玉米根系分泌物表现出更强的趋化性和群集运动能力，具有很好的应用前景。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌OR2-30菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种解淀粉芽孢杆菌OR2-30菌株及其应用。

背景技术

芽孢杆菌(Bacillus spp.)是一类典型的植物根际促生细菌，能够促进植物生长或提高植物抗病性，对环境友好。芽孢杆菌与植物之间存在着非常复杂的互作进程：首先植物通过根系向根际环境分泌糖类、有机酸类、氨基酸类和脂肪酸类等根系分泌物，这些根系分泌物不仅为根际促生细菌提供营养物质和能源，还能够作为信号分子来吸引某些微生物；当芽孢杆菌感受到根系分泌物中的信号分子后，通过趋化运动向植物根部移动和聚集，到达植物根表后，移动型的芽孢杆菌细胞停止游动并分化成生物膜型细胞，随后生物膜结构逐步成熟，芽孢杆菌在植物根际形成微菌落；芽孢杆菌在植物根际成功定殖后，一方面分泌生长素、分裂素、亚精胺等物质促进植物生长，另一方面通过分泌抗菌物质、竞争营养和空间位点以及激活诱导系统抗性等方式防治植物病害，而在芽孢杆菌与植物互作的进程中，芽孢杆菌必须在植物根际成功定殖才能对植物起到促进生长或抗病的效果。

植物在遭受生物胁迫时会改变其根系分泌物组分来特异性吸引某些微生物。如番茄遭受到丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pathovar tomato)PstDC3000侵染时，根系会大量分泌L-苹果酸来特异性吸引有益细菌枯草芽孢杆菌FB17。当芽孢杆菌的趋化受体感知到植物根系分泌的信号分子后，促使下游CheA激酶进行磷酸化修饰，随后磷酸化的CheA激酶将磷酸基团转移给CheY，磷酸化的CheY再与鞭毛马达蛋白结合，促使其完成趋化反应。随后芽孢杆菌顺应趋化信号通过群集运动等方式前往植物根际。当芽孢杆菌运动到根际适宜的位置之后，就开始分泌粘性基质形成复杂多样的生物膜群落，成功在根际定殖。因此，趋化性和群集运动是芽孢杆菌在植物根际定殖的先决条件。

微生物农药在田间的施用效果不稳定，主要受限于菌体在根际的定殖情况。而芽孢杆菌在根际的定殖能力主要取决于趋化性、群集运动和生物膜形成能力。因此，筛选出对生物胁迫下植物根系分泌物表现出更强趋化性、群集运动能力的拮抗菌株，为开发效果稳定的微生物农药打下基础，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种解淀粉芽孢杆菌OR2-30菌株及其应用，对生物胁迫下玉米根系分泌物表现出更强趋化性、群集运动能力，同时具有广谱拮抗活性的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)OR2-30。

本发明采用以下技术方案来实现：

本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌OR2-30菌株，BacillusamyloliquefaciensOR2-30，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路，保藏日期为2021年1月21日，保藏编号为CGMCCNo.21698。

该解淀粉芽孢杆菌OR2-30菌株革兰氏阳性菌，杆状，能运动，在LB培养基上的单菌落为圆形，白色，表面光滑，平坦；gyrB基因序列为SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了上述解淀粉芽孢杆菌OR2-30菌株在制备植物广谱抗菌药物中的应用。

作为本发明的进一步优化方案，所述植物广谱抗菌药物指对油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、玉米茎基腐病菌(Fusarium moniliforme) 或水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)具有拮抗活性的药物。

本发明还提供了上述植物广谱抗菌药物，包括所述菌株和串珠镰孢菌侵染后的玉米根系分泌物。

作为本发明的进一步优化方案，利用串珠镰孢菌侵染后的玉米根系分泌物促进所述菌株在根际定植。

本发明还提供了一种植物广谱抗菌药物的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)：制备串珠镰孢菌侵染后的玉米根系分泌物；

步骤(2)：制备OR2-30菌悬液；

步骤(3)：将等体积步骤(1)和步骤(2)制备的产物混匀，得植物广谱抗菌药物。

作为本发明的进一步优化方案，步骤(1)具体包括以下步骤：

步骤(11)：制备串珠镰孢菌孢子悬浮液：在新活化的串珠镰孢菌平板边缘打出直径为0.7cm的菌碟，取若干菌碟于绿豆汤培养基中，28℃、200rpm震荡培养2-3天，过滤，3800g离心5min，去上清，用无菌水清洗、调整，加入Tween-20制成串珠镰孢菌孢子悬浮液；

步骤(12)：玉米根系分泌物收集：用注射器在生长2周左右的玉米茎基部刺1mm 深的伤口，在伤口处滴加串珠镰孢菌孢子悬浮液，保湿培养3天取出整株玉米，冲洗，将根部置于无菌水中，4℃黑暗放置24h，冷冻干燥机制成冻干粉，即获得串珠镰孢菌侵染后的玉米根系分泌物。

作为本发明的进一步优化方案，步骤(2)具体包括以下步骤：

步骤(21)：将如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌OR2-30菌株在LB固体培养基上活化，37℃培养12h，获得单菌落；

步骤(21)：挑取单菌落转接至LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡培养12h，获得初始OR2-30菌悬液；

步骤(23)：用LB液体培养基将初始OR2-30菌悬液稀释至约OD₆₀₀＝1，以1％比例转接到新的LB液体培养基中，37℃震荡培养2h，再用LB液体培养基将OR2-30菌悬液稀释至约OD₆₀₀＝0.2，以1％比例转接到新的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀＝1，获得解淀粉芽孢杆菌OR2-30菌悬液。

本发明的有益效果是：本发明所述的解淀粉芽孢杆菌OR2-30对油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、玉米茎基腐病菌(Fusarium moniliforme)或水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)均表现出拮抗活性，抑制率分别达到57％、57％、62％和29％。OR2-30菌株对串珠镰孢菌侵染后的玉米根系分泌物表现出更强趋化性，趋化指数达到5.67，同时，串珠镰孢菌侵染后的玉米根系分泌物能增强OR2-30菌株的群集运动能力。

附图说明

图1为解淀粉芽孢杆菌OR2-30在LB培养基上的菌落图片。

图2为解淀粉芽孢杆菌OR2-30基于gyrB基因序列构建的系统发育树。

图3为解淀粉芽孢杆菌OR2-30对油菜菌核病菌、玉米小斑病菌、玉米茎基腐病菌和水稻细菌性条斑病菌的抑菌效果。(其中A为对玉米茎基腐病菌的拮抗效果；B为对玉米小斑病菌的拮抗效果；C为对油菜菌核病菌的拮抗效果；D为对水稻细菌性条斑病菌的拮抗效果)

图4为解淀粉芽孢杆菌OR2-30对串珠镰孢菌侵染后的玉米根系分泌物和正常生长的玉米根系分泌物趋化性。

图5为串珠镰孢菌侵染后的玉米根系分泌物和正常生长的玉米根系分泌物对解淀粉芽孢杆菌OR2-30群集运动能力的影响。其中A为培养36h时OR2-30菌株的群集运动图片(1：正常生长的玉米根系分泌物+OR2-30菌悬液；2：串珠镰孢菌侵染后的玉米根系分泌物 +OR2-30菌悬液)；B为OR2-30培养8h、16h、24h和36h时swarming半径折线图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明，

实施例1

1、材料

本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。

2、方法

2.1解淀粉芽孢杆菌OR2-30菌株的分离纯化

本发明的解淀粉芽孢杆菌OR2-30是从玉米根际通过稀释涂板法和平板划线法分离纯化获得的，分离方法为：取10g根际土放入带有玻璃珠的90mL生理盐水中，180r/min震荡30min，将锥形瓶置于90℃水浴锅加热20min，制成土壤悬液，吸取100μL土壤悬液于900μL无菌水中得到10-1稀释液，按此方法依次获得10-2和10-3稀释液，分别吸取 100μL 10-2、10-3倍稀释液涂布于LB固体培养基平板上，37℃恒温培养24h后，挑取 LB固体培养基上不同形态的菌落于LB固体培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况，然后采用平板划线法，纯化细菌菌株，分别编号保存并进行菌种筛选，获得编号为 OR2-30的菌株，如图1所示，为OR2-30菌株在LB固体培养基上的菌落图片。

2.2解淀粉芽孢杆菌OR2-30菌株的鉴定

提取OR2-30的基因组，采用gyrB引物进行PCR扩增，扩增产物测序后通过NCBI 数据库在线比对，利用MEGA软件构建系统发育树。

gyrB引物序列为：

上游引物：5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCR TCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3’；

下游引物：5’-GAAGTCATCATGA CCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTT YGA-3’；

其中，R、N、Y为兼并碱基，R表示A/G，N表示A/G/C/T，Y表示C/T。

OR2-30扩增产物序列如SEQ ID NO.1所示。

如图2所示，OR2-30与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyliquefaciens)相似度最高，因此将 OR2-30归入解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyliquefaciens)，命名为解淀粉芽孢杆菌OR2-30菌株。

2.3解淀粉芽孢杆菌OR2-30的抑菌效果

(1)对病原真菌的拮抗活性

取出保存的油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis) 和玉米茎基腐病菌(Fusarium moniliforme)菌碟，用挑针接种到PDA平板中央，放入25℃恒温培养箱中培养7天后，重新打菌碟接种到新的PDA平板上，待菌丝长至整个平板的 1/2后取出备用。

将冰箱中保存的解淀粉芽孢杆菌OR2-30在LB固体培养基上活化，挑取单菌落于LB液体培养基中37℃、200rpm震荡培养12h，获得菌悬液，待用。

在油菜菌核病菌、玉米小斑病菌和玉米茎基腐病菌PDA平板边缘打直径为0.7cm的菌碟(取指示菌边缘生长旺盛的菌丝块)，分别接种在新的PDA平板中央，在距离菌块2.5cm处，呈“十”字形分布的四个接种点，放上直径4mm的滤纸小圆片，取OR2-30菌悬液10μl 点在滤纸片中央，对照为LB培养基，每个处理重复3次，放入26℃恒温培养箱中培养2-3 天后，取出观测并记录抑菌圈大小。

(2)对水稻细菌性条斑病菌的拮抗活性

将水稻细菌性条斑病菌在NA固体培养基上活化，挑取单菌落接种到装有20ml NA液体培养基的三角锥形瓶中，28℃、200rpm震荡培养48h，待用。

在培养皿中先加入20mL冷却至55℃左右的NA培养液，再加入500μl上述水稻细菌性条斑病菌菌悬液，轻轻摇匀后即可制成一个含菌板，用无菌牙签将解淀粉芽孢杆菌OR2-30 点接在含菌板上，28℃恒温培养48h后，记录抑菌圈直径。

(3)结论

如图3所示，解淀粉芽孢杆菌OR2-30对油菜菌核病菌、玉米小斑病菌、玉米茎基腐病菌和水稻细菌性条斑病菌均表现出拮抗活性，抑制率分别达到57％、57％、62％和29％。

2.4解淀粉芽孢杆菌OR2-30对玉米根系分泌物的趋化性

(1)串珠镰孢菌孢子悬浮液制备

在新活化的串珠镰孢菌平板边缘打直径为0.7cm的菌碟，取10块左右菌碟于绿豆汤培养基中，28℃、200rpm震荡培养2-3天；用2层纱布对培养好的绿豆汤培养液进行过滤，3800g离心5min，去上清，用无菌水清洗2次，最终用无菌水调整至10⁶/ml，加入终浓度为0.001％Tween-20制成孢子悬浮液。

(2)玉米根系分泌物收集

用注射器在生长2周左右的玉米茎基部刺1mm深的伤口，在伤口处滴加10μL串珠镰孢菌孢子悬浮液，保湿培养3天后，取出整株玉米，在自来水下进行冲洗，随后用蒸馏水冲洗4次，将根部置于无菌水中(80g/L)4℃黑暗放置24h，冷冻干燥机制成冻干粉，分别收集正常生长和串珠镰孢菌侵染3d后的玉米根系分泌物。

(3)趋化性检测

以1mL注射器作为趋化性试验的毛细管，吸取100μL(0.02g/mL)根系分泌物，并将注射器针头插入含有100μL菌悬液的移液枪头细口端，使根系分泌物与菌悬液充分接触，室温无菌条件下静置2h后，从菌悬液中小心取出注射器针头，对注射器中的根系分泌物采用平板稀释涂布法进行细菌计数，37℃条件下培养24h，计算移动到根系分泌物中的菌落数，趋化指数为串珠镰孢菌侵染后的玉米根系分泌物中OR2-30菌落数/正常生长玉米根系分泌物中OR2-30菌落数。

(4)结论

如图4所示，OR2-30菌株对串珠镰孢菌侵染后的玉米根系分泌物表现出更强趋化性，趋化指数达到5.67。

2.5根系分泌物对解淀粉芽孢杆菌OR2-30群集运动能力的影响

在LB固体培养基上活化OR2-30菌株，37℃培养12h；用无菌牙签挑取单菌落转接至LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡培养12h；用LB液体培养基将OR2-30菌悬液稀释至约OD₆₀₀＝1，以1％比例转接到新的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡培养2h；再用LB液体培养基将OR2-30菌悬液稀释至约OD₆₀₀＝0.2，以1％比例转接到新的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡培养至OD₆₀₀＝1，备用。

分别取200μL上述OR2-30菌悬液与200μL正常生长的玉米根系分泌物和200μL串珠镰孢菌侵染后的玉米根系分泌物混匀，37℃、90rpm震荡60min。在事先准备好0.7％琼脂LB平板上，在平板中央分别滴加5μL含有正常生长玉米根系分泌物的OR2-30菌液和5μL含有串珠镰孢菌侵染后玉米根系分泌物的OR2-30菌液，37℃培养定期记录菌落扩展半径。

如图5所示，与正常生长的玉米根系分泌物相比，串珠镰孢菌侵染后的玉米根系分泌物能增强解淀粉芽孢杆菌OR2-30菌株的群集运动能力。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 一种解淀粉芽孢杆菌OR2-30菌株及其应用

<141> 2021-04-09

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1176

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)

<400> 1

gtcgtcattg gtgttgtgag cggatatgag tatccggcgg tcttcacggt gtagggcatc 60

cgtcgtaacg ccttgtcgac cactcttgac gttacggttc atcgtgacgg aaaaatccat 120

tatcaggcgt acgagcgcgg tgtacctgtg gccgatcttg aagtgatcgg cgaaactgat 180

agaccggaac gattcgcatt cgttccggcc cggaattttc aagaaacaac tgtatatgac 240

tagatctgct tcaaaccggg tccgggaatg gccttcctga caaaaggcgt taacatcacg 300

attgaagaca aacgtgaagg acaagaacgg aaaaacgagt accactacga aggcggaatc 360

aaaagctatg ttgagtactt aaaccgttcc aaagaagtcg ttcatgaaga gccgatttat 420

atcgaaggcg agaaagacgg cataacggtt gaagttgcat tgcaatacaa cgacagctat 480

acaagcaata tttattcttt cacaaataat atcaacacat acgaaggcgg cacgcacgag 540

gccggattta aaaccggtct gacccgtgtc ataaacgact atgcaagaag aaaagggatt 600

ttcaaagaaa atgatccgaa tttaagcggg gatgatgtga gagaagggct gactgccatt 660

atttcaatta agcaccctga tccgcaattc gaagggcaga cgaaaaccaa gctcggcaac 720

tccgaagcga gaacgatcac tgatacgctg ttttcttctg cgctggaaac attccttctt 780

gaaaatccgg actcagcccg caaaatcgtt gaaaaaggtt taatggccgc aagagcgcgg 840

atggcggcga aaaaagcccg ggaattgacc cggcgcaaaa gtgcgcttga gatttccaat 900

ctgccgggca aactggcgga ctgttctttt aaagatccga gcatttccga gctgtatatc 960

gtagagggtg actctgcggg cggatcagcg aaacagggac gggaccgtca tttccaagcc 1020

attctgccgc tgcgcggtaa gattctgaac gttgagaaag ccagacttga taagattctc 1080

tcaaacaatg aggtcagatc aatgatcacg gccctcggaa caggaatcgg agaagatttt 1140

aatcttgaaa aagcgcgtta tcagagcagg tagata 1176

Claims

1.一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）OR2-30菌株，其特征在于，该菌株的微生物保藏编号为CGMCCNo.21698。

2.一种如权利要求1所述的菌株在制备植物广谱抗菌药物中的应用，其特征在于，所述植物广谱抗菌药物指对油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）、玉米茎基腐病菌（Fusarium moniliforme）或水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola）具有拮抗活性的药物。

3.一种植物广谱抗菌药物，包括串珠镰孢菌（Fusarium moniliforme）侵染后的玉米根系分泌物和如权利要求1所述的菌株。

4.一种如权利要求3所述植物广谱抗菌药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤（1）：制备串珠镰孢菌侵染后的玉米根系分泌物；

步骤（2）：制备解淀粉芽孢杆菌OR2-30菌悬液；

步骤（3）：将步骤（1）和步骤（2）制备的产物混匀，得植物广谱抗菌药物。

5.根据权利要求4所述的一种植物广谱抗菌药物的制备方法，其特征在于，步骤（1）具体包括以下步骤：

a：制备串珠镰孢菌孢子悬浮液：在新活化的串珠镰孢菌平板边缘打出菌碟，取若干菌碟于绿豆汤培养基中，28 ℃、200 rpm震荡培养2-3天，过滤离心去上清，用无菌水清洗、调整，加入Tween-20制成串珠镰孢菌孢子悬浮液；

b：玉米根系分泌物收集：用注射器在生长2周左右的玉米茎基部刺伤口，在伤口处滴加串珠镰孢菌孢子悬浮液，保湿培养3天取出整株玉米，冲洗，将根部置于无菌水中，4℃黑暗放置24 h，冷冻干燥机制成冻干粉，即获得串珠镰孢菌侵染后的玉米根系分泌物。

6.根据权利要求4所述的一种植物广谱抗菌药物的制备方法，其特征在于，步骤（2）具体包括以下步骤：

A：将如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌OR2-30菌株在LB固体培养基上活化，37 ℃培养12 h，获得单菌落；

B：挑取单菌落转接至LB液体培养基中，37 ℃、200 rpm震荡培养12 h，获得初始OR2-30菌悬液；

C：用LB液体培养基将初始OR2-30菌悬液稀释至约OD₆₀₀=1，1%比例转接到新的LB液体培养基中，37 ℃震荡培养2 h，再用LB液体培养基将OR2-30菌悬液稀释至约OD₆₀₀=0.2，1%比例转接到新的LB液体培养基中，37 ℃震荡培养至OD₆₀₀=1，获得解淀粉芽孢杆菌OR2-30菌悬液。