BR112014014000B1 - Composição compreendendo micróbios promotores de crescimento de plantas e métodos para o tratamento de uma semente de planta e para melhorar o crescimento e/ou rendimento de uma planta - Google Patents

Abstract

abstract microbial strains, compositions, and methods of use thereof to enhance the growth and/or yield of a plant are provided. also provided are materials and methods for presenting, inhibiting, or treating the development of plant pathogens or phytopathogenic diseases. the disclosure also provides non-naturally occurring plant and derivatives thereof such as plants artificially infected with a microbial strain of the invention. tradução do resumo resumo micróbios promotores de crecimento de plantas e usos dos mesmos são apresentadas cepas microbianas, composições e seus métodos de utilização para melhorar o crescimento e/ou rendimento de uma planta. são também fornecidos materiais e métodos para apresentar, inibir ou tratar o desenvolvimento de patógenos vegetais ou doenças fitopatogênicas. a divulgação também fornece plantas de ocorrência não-natural e seus respectivos derivados, tais como plantas artificialmente infectadas com uma cepa microbiana da invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO MICRÓBIOS PROMOTORES DE CRESCIMENTO DE PLANTAS E MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DE UMA SEMENTE DE PLANTA E PARA MELHORAR O CRESCIMENTO E/OU RENDIMENTO DE UMA PLANTA.

[001] Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. N°. 61/570,237 depositado em 13 de dezembro de 2011 e que é incorporado por referência em sua totalidade, incluindo todas as tabelas, figuras e reivindicações.

CAMPO DA INVENÇÃO [002] A presente invenção refere-se ao campo da agricultura sustentável. Especificamente, a descrição fornece composições microbianas e métodos úteis para a produção de espécies vegetais. Em particular, as composições e métodos divulgados neste documento são úteis para melhorar o crescimento de plantas e/ou suprimir o desenvolvimento de patógenos vegetais e doenças patogênicas.

INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA [003] O material nas listagens de sequência que acompanha é aqui incorporado por referência nesta patente. O arquivo acompanhando, chamado SGI1540_1WO_CRF_OF_SL_ST25.txt foi criado em 13 de dezembro de 2012 e tem 20 KB. Os arquivos podem ser acessados usando o Microsoft Word em um computador que usa o sistema operacional Windows.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [004] A microflora em torno de plantas é muito diversificada, incluindo bactérias, fungos, leveduras, algas. Alguns destes microorganismos podem ser nocivos para as plantas e são muitas vezes referidos como agentes patogênicos, enquanto outros podem ser benéficos às plantas, promovendo o crescimento de plantas e a produtividade da colheita. Avanços recentes em microbiologia do solo e

Segue-se folha 1a/83

Petição 870170044871, de 28/06/2017, pág. 5/13

1a/83 biotecnologia vegetal resultaram em um aumento do interesse no uso

Petição 870170044871, de 28/06/2017, pág. 6/13

2/83 gestão ambiental. Em particular, um número de micro-organismos conhecidos por estar presentes no nicho ecológico de solo, geralmente conhecido como rizosfera e rizoplano têm recebido atenção considerável no que diz respeito a sua capacidade de promover o crescimento das plantas. Na verdade, o solo da rizosfera representa um bom reservatório de micróbios para o isolamento potencial de micróbios benéficos. A rizosfera da planta pode conter bilhões de micro-organismos em um grama de solo. Em teoria, inoculantes microbianos, sem intervenção humana, têm uma taxa baixa de sobrevivência e eficácia em seu ambiente natural do solo por causa das unidades de formação insuficientes de colônia por grama de solo. Portanto, desde a década de 1960, um número de biofertilizantes que têm um aumento de concentração de potencial inóculo de colônia foi desenvolvido e comercializado na tentativa de reduzir a necessidade de fertilizantes químicos.

[005] Além disso, pesquisas realizadas nos últimos anos tem mostrado que os microrganismos podem ser usados como agentes de controle biológico para aumentar a eficiência e a produtividade agrícola. Estes estudos têm mostrado que vários micro-organismos são capazes de suprimir patógenos vegetais e/ou complementar o crescimento das plantas, oferecendo assim uma alternativa atraente para pesticidas químicos que são menos favorecidos por causa de seu impacto potencialmente negativo na qualidade da saúde humana e do meio ambiente.

[006] Os micro-organismos que podem colonizar as raízes das plantas e estimular o crescimento das plantas são geralmente conhecidos como micróbios promotores de crescimento de planta (PGPM). Nas últimas duas décadas, muitas espécies de PGPM tendo influência positiva sobre o crescimento de uma grande variedade de culturas de plantas têm sido relatadas. PGPM são frequentemente

3/83 simbiontes universais de plantas superiores e são capazes de aumentar o potencial adaptativo de seus hospedeiros através de uma série de mecanismos, tais como a fixação de nitrogênio molecular, a mobilização de nutrientes recalcitrantes do solo (por exemplo, de ferro, fósforo, enxofre etc.), a síntese de fitohormônios e vitaminas e a decomposição de materiais vegetais em solos que muitas vezes aumenta a matéria orgânica do solo. Também, certos micróbios podem facilitar o crescimento das plantas através do controle microbiano de espécies patogênicas para a planta (isto é, fitopatógenos). Por exemplo, alguns micróbios benéficos podem controlar o apodrecimento das raízes em plantas competindo com fungos por espaço na superfície da raiz da planta. Em outros casos, a competição entre várias cepas microbianas na microflora nativa da planta podem estimular o crescimento da raiz e aumentar a absorção de nutrientes minerais e água para aumentar o rendimento da planta. Portanto, biofertilizantes podem ser desenvolvidos como produtos à base de micro-organismos que vivem naturalmente no solo. Aumentando a população de micro-organismos benéficos no solo através de inoculação artificial, estes micro-organismos do solo podem aumentar a sua atividade biológica e, assim, fornecer para as plantas nutrientes importantes e fatores benéficos que melhoram o seu crescimento.

[007] A inoculação das plantas cultivadas com a PGPM é geralmente vista como uma abordagem agrícola promissora, pois isso permite que as pragas sejam controladas sem o uso de pesticidas em grandes quantidades. Como as preocupações ambientais a respeito da qualidade das águas subterrâneas, com exposição em excesso de fertilizantes e pesticidas no cultivo de alimentos, alternativas biológicas estão tornando-se necessárias. Assim, desenvolvendo o tratamento biológico compatível com fertilizantes e pesticidas, ou mesmo

4/83 reduzindo a quantidade destes compostos químicos poderia ser um avanço significativo na indústria agrícola. Foi estabelecido que a estimulação do crescimento de plantas pela PGPM é muitas vezes intimamente relacionado com a capacidade do PGPM para colonizar as raízes das plantas. No entanto, relativamente pouca atenção tem sido dada ao desenvolvimento de procedimentos de seleção eficientes para a obtenção de cepas microbianas com alta capacidade de colonização de raiz. A falta de tais procedimentos de seleção retarda o estudo da simbiose bacteriana vegetal e a implantação da PGPM na agricultura.

[008] Portanto, há uma necessidade permanente para a identificação de novo PGPM e/ou teste de sua compatibilidade com produtos de gestão de plantação disponíveis comercialmente existentes. Além disso, a investigação adicional também é necessária para comparar cepas de cultura pura versus cepas complementares mistas de microrganismos que formam consórcios sinérgicos. Tais consórcios mistos podem ter maior potencial de desempenho consistente com melhor capacidade competitiva sob diferentes condições ambientais e de crescimento.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [009] Culturas e cepas microbianas são fornecidas neste documento. Composições microbianas e métodos de utilização para melhorar o crescimento e/ou rendimento de uma planta também são fornecidos. São também fornecidos métodos para o tratamento de sementes da planta usando as composições microbianas divulgadas neste documento. Métodos para prevenção, inibição ou tratamento do desenvolvimento de patógenos vegetais ou o desenvolvimento de doenças fitopatogênicas são ainda fornecidos. A descrição também fornece variedades de plantas de ocorrências não naturais que são artificialmente infectadas com um endófito microbiano da invenção.

5/83

Semente, tecido reprodutivo, tecido vegetativo, tecidos regenerativos, partes da planta ou a descendência das variedades de plantas de ocorrências não naturais são também fornecidas. A descrição fornece ainda um método para a preparação de composições agrícolas.

[0010] Em um aspecto, a presente descrição fornece cepas microbianas isoladas, culturas isoladas respectivas, culturas biologicamente puras respectivas e culturas enriquecidas respectivas. Em determinadas modalidades preferenciais deste aspecto, a cepa microbiana pode ser SGI-003-H11 (depositado como NRRL B-50483); SGI-020-A01 (depositado como NRRL B-50484); SGI-026-G06 (depositado como NRRL B-50485); SGI-026-G07 (depositado como NRRL B-50486), ou uma tensão derivada de qualquer uma das cepas referidas. Em algumas outras modalidades preferenciais, a cepa microbiana pode compreender um nucleotídeo ou sequência de aminoácido que exibe pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% ou no mínimo uma sequência de identidade 99,5% de qualquer uma das sequências de nucleotídeos 16S ribossomal/recA ou de sequência de aminoácidos na Listagem de sequência. Em algumas modalidades da cepa microbiana também há uma atividade de promoção do crescimento de planta como descrito neste documento.

[0011] Composições microbianas que incluem uma cepa microbiana da invenção ou uma cultura respectivas são também fornecidas. Tais composições microbianas de acordo com algumas modalidades preferenciais podem incluir uma quantidade agronomicamente eficaz de um composto adicional ou composição, no qual o composto adicional ou composição pode ser um fertilizante, uma acaricida, um bactericida, fungicida, inseticida, um microbicida,

6/83 uma nematicida ou um pesticida. Em algumas outras modalidades preferenciais, as composições microbianas podem ainda incluir um transportador. Em ainda outras modalidades preferenciais, o transportador pode ser uma semente de planta. Em determinadas modalidades deste aspecto, a composição microbiana é preparada como uma formulação que pode ser uma emulsão, um coloide, um pó, um grânulo, uma pelota, um pó, um spray, uma emulsão ou uma solução. Em algumas outras modalidades preferenciais, as composições microbianas podem ser formulações de revestimento de sementes. Em outro aspecto, sementes de plantas que são revestidas com uma composição microbiana em conformidade com a presente invenção também são fornecidas.

[0012] Em outro aspecto, são fornecidos métodos para o tratamento de sementes de plantas. Tais métodos incluem expor ou entrar em contato com as sementes da planta com uma cepa microbiana de acordo com a presente invenção ou uma cultura respectiva.

[0013] Em outro aspecto da invenção, são fornecidos aqui métodos para melhorar o crescimento e/ou rendimento de uma planta. Em algumas modalidades, tal método envolve a aplicação de uma quantidade eficaz de uma cepa microbiana em conformidade com a presente invenção ou uma cultura respectiva para a planta, ou os arredores da planta. Em algumas outras modalidades, o método envolve o crescimento de uma cepa microbiana em conformidade com a presente invenção ou uma cultura mesmo, em um meio de crescimento ou o solo de uma planta hospedeira antes ou simultaneamente ao crescimento de plantas hospedeiras no referido meio de cultura ou solo. Em modalidades preferenciais, a planta pode ser uma planta de milho ou uma planta de trigo. Em algumas outras modalidades, a cepa microbiana ou cultura respectiva pode ser

7/83 estabelecida como um endófito na planta.

[0014] Em outro aspecto da presente invenção, são fornecidos métodos para prevenção, inibição ou tratamento do desenvolvimento de um patógeno vegetal. Tais métodos incluem o cultivo de uma cepa microbiana de acordo com a invenção ou uma cultura da mesma, em um meio de cultura ou o solo de uma planta hospedeira antes ou concomitante com o crescimento de plantas hospedeiras no referido meio de cultura ou solo. Em algumas modalidades preferenciais, o patógeno vegetal pode ser um micro-organismo do gênero Colletotrichum, Fusarium, Gibberella, Monographella, Penicillium, ou Stagnospora. Em algumas modalidades particularmente preferidas, o patógeno vegetal pode ser Colletotrichum gramnicola, Fusarium graminearum, Gibberella zeae, Monographella nivalis, Penicillium sp., ou Stagnospora nodurum.

[0015] Outro aspecto ainda da invenção fornece métodos para prevenção, inibição ou tratamento do desenvolvimento de doenças patógenas vegetais de uma planta. Tais métodos incluem a aplicação para a planta, ou para os arredores da planta, uma quantidade eficaz de uma cepa microbiana de acordo com a invenção ou uma cultura respectiva. Em algumas modalidades preferenciais, a cepa microbiana ou uma cultura respectiva pode ser aplicada ao solo, uma semente, uma raiz, uma flor, uma folha, uma parte da planta, ou a planta inteira.

[0016] Outro aspecto ainda da invenção fornece plantas de ocorrência não natural. As plantas de ocorrência não natural são artificialmente infectadas com uma cepa microbiana da invenção ou uma cultura respectivas. São fornecidos ainda em algumas modalidades deste aspecto: semente, tecido reprodutivo, tecido vegetativo, tecidos regenerativos, partes da planta e a descendência das plantas de ocorrência não natural.

[0017] Outro aspecto da invenção fornece métodos para a

8/83 preparação de uma composição agrícola. Tais métodos envolvem a inoculação da cepa microbiana de acordo com a presente invenção ou uma cultura respectiva no interior ou a um substrato e permitindo que ela cresça.

[0018] Em outro aspecto da invenção fornece uma cepa isolada, uma cultura isolada respectiva, uma cultura biologicamente pura respectiva e uma cultura enriquecida de um micro-organismo do gênero Pantoea. Em uma modalidade do micro-organismo compreende uma sequência de DNA ou sequência de aminoácidos que codifica para um gene de 16S rRNA ou uma proteína de recA, tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% de identidade de sequência para uma codificação de sequência do gene 16S rRNA ou proteína de recA divulgados na Listagem de sequência. Em outra modalidade a invenção fornece um gênero de microrganismos que compreende qualquer sequência de DNA ou sequência de aminoácidos descrita acima e que aumenta o crescimento e/ou rendimento de uma planta, conforme descrito neste documento.

[0019] Estes e outros objetos e recursos da invenção se tornarão mais plenamente aparentes a partir da seguinte descrição detalhada da invenção e das reivindicações.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0020] A menos que caso contrário definido, todos os termos da técnica, notações e outros termos científicos ou terminologia utilizada neste documento destinam-se a ter os significados comumente entendidos por aqueles versados na técnica a que pertence esta invenção. Em alguns casos, termos com significados comumente compreendidos são definidos neste documento para fins de

9/83 esclarecimento e/ou para pronta referência, e a inclusão de tais definições aqui necessariamente não deve ser interpretada para representar uma diferença substancial sobre o que é geralmente entendido na técnica. Muitas das técnicas e procedimentos descritos ou mencionados neste documento são bem compreendidas e comumente empregadas usando metodologia convencional por aqueles versados na técnica.

[0021] A forma singular uma, um e a incluem referências plural, a menos que o contexto expresse claramente o contrário. Por exemplo, o termo uma célula inclui uma ou mais células, incluindo as suas misturas.

[0022] Bactericida: o termo bactericida, como usado aqui, referese à capacidade de uma substância para aumentar a mortalidade ou inibir o crescimento de bactérias ou composição.

[0023] Controle biológico: o termo controle biológico e sua forma abreviada biocontrole, neste documento, é definido como o controle de um patógeno ou inseto ou qualquer outro organismo indesejável pelo uso de pelo menos um segundo organismo diferente do homem. Um exemplo dos mecanismos conhecidos de controle biológico é o uso de microrganismos que controlam o apodrecimento da raiz por fungos competindo com os fungos por espaço na superfície da raiz, ou micro-organismos que inibem o crescimento ou matam o patógeno. A planta hospedeira no contexto de controle biológico é a planta que é suscetível à doença causada pelo patógeno. No contexto de isolamento de um organismo, como uma bactéria ou espécies de fungos, do seu ambiente natural, a planta hospedeira é uma planta que suporta o crescimento da bactéria ou fungo, por exemplo, uma planta de uma espécie de bactéria ou fungo é um endófito.

[0024] Uma quantidade eficaz, como usado aqui, é uma quantidade suficiente para resultados de efeito benéfico ou desejado.

10/83

Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Em termos de tratamento, inibição ou proteção, uma quantidade eficaz é essa quantia suficiente para melhorar, estabilizar, inverter, retardar ou atrasar a progressão da infecção alvo dos estados de doença. A expressão micro-organismo eficaz aqui usada em referência a um micro-organismo destina-se a dizer que a tensão do objeto apresenta um grau de promoção do crescimento das plantas e/ou rendimento ou um grau de inibição de doenças patogênicas que excede, em um nível estatisticamente significativo, ou de um controle não tratado. Em alguns casos, a expressão uma quantidade eficaz é usada neste documento em referência a essa quantidade de tratamento microbiana que é necessária para obter um resultado benéfico ou desejado em relação ao que ocorre em um controle não tratado sob condições apropriadas de tratamento conforme descrito neste documento. Para fins da presente descrição, a taxa real de aplicação de uma formulação líquida geralmente irá variar de um mínimo de aproximadamente 1 e 10³ a aproximadamente 1 e 10¹⁰ células/mL viáveis e, de preferência, de aproximadamente 1 e 10⁶ a aproximadamente 5 e 10⁹ células/mL viáveis. Na maioria das condições, as cepas da invenção descrita nos exemplos abaixo seriam otimamente eficazes em taxas de aplicação na faixa de aproximadamente 1 e 10⁶ para 1 e 10⁹ células/mL viáveis, assumindo um modo de aplicação que iria conseguir contato substancialmente uniforme de pelo menos 50% dos tecidos da planta. Se os microrganismos são aplicados como uma formulação sólida, a taxa de aplicação deve ser controlada para resultar em um número comparável de células viáveis por unidade de área da superfície do tecido de planta como obtidas pelas taxas de tratamento líquido acima mencionadas. Em geral, as composições microbianas da presente invenção são biologicamente eficazes quando entregue em

11/83 concentrações superiores a 10⁶ CFU/g (unidades formadoras de colônia por grama), de preferência superiores a 10⁷ CFU/g, mais de preferência 10⁸ CFU/g, e mais, de preferência a 10⁹ CFU/g.

[0025] Composição: Uma composição destina-se a significar uma combinação de agente ativo e pelo menos um outro composto, transportador ou composição, que pode ser inerte (por exemplo, um agente detectável ou marcação ou transportador líquido) ou ativo, tal como um fertilizante.

[0026] A planta controle, como utilizado na presente descrição, fornece um ponto de referência para medir alterações no fenótipo do objeto planta, pode ser qualquer célula vegetal adequada, semente, componente da planta, tecido de planta, órgão de planta ou toda a planta. Uma planta de controle pode incluir, por exemplo, (a) uma planta do tipo selvagem ou uma célula, ou seja com o mesmo genótipo como matéria-prima para a alteração genética que resultou no objeto planta ou célula; (b) uma planta ou uma célula do genótipo como material primário, mas que foi transformada com uma construção nula (isto é, , uma construção que não tem nenhum efeito conhecido sobre a característica de interesse, como uma construção compreendendo um gene repórter); (c) uma planta ou uma célula que é um segregante não transformado entre os descendentes de um objeto planta ou célula; (d) uma planta ou uma célula que é geneticamente idêntica ao objeto planta ou célula, mas que não é exposta ao mesmo regime (isto é, , tratamento de fertilizante) como o objeto planta ou célula; (e) o objeto planta ou célula em si, nas condições em que o gene de interesse não é expresso; ou (f) objeto planta ou a célula em si, sob condições em que ela não foi exposta a um tratamento específico como, por exemplo, um fertilizante ou combinação de fertilizantes e/ou outros produtos químicos.

[0027] Cultura, cultura isolada, cultura biologicamente pura e

12/83 cultura enriquecida: Como usado aqui, uma cepa isolada de um micróbio é uma cepa que foi removida do seu meio natural. Como tal, o termo isolado não reflete necessariamente a extensão a que o micróbio foi purificado. Mas em diferentes modalidades uma cultura isolada foi purificada pelo menos 2x ou 5x ou 10x ou 50x ou 100x da matéria-prima da qual ela é isolada. Como um exemplo de não limitação, se uma cultura está isolada do solo como matéria-prima, o organismo pode ser isolado de forma que a sua concentração em uma determinada quantidade de material purificado ou parcialmente purificado (por exemplo, solo) é pelo menos 2x ou 5x ou 10x ou 50x ou 100x que, em matéria-prima original. Uma cultura substancialmente pura da cepa do micróbio refere-se a uma cultura que contém substancialmente nenhum outro micróbio que o da cepa desejada ou cepa dos micróbios. Em outras palavras, uma cultura substancialmente pura de uma cepa do micróbio é substancialmente isenta de outros contaminantes, que podem incluir contaminantes microbianos, bem como contaminantes químicos indesejáveis. Além disso, como usado aqui, uma cepa biologicamente pura destina-se a significar a tensão separada de materiais com os quais normalmente é associada na natureza. Nota-se que uma cepa associada com outras cepas, ou com compostos ou materiais que normalmente não são encontrados na natureza, ainda é definida como biologicamente pura. Uma monocultura de uma cepa particular é, naturalmente, biologicamente pura. Em diferentes modalidades uma cultura biologicamente pura foi purificada pelo menos 2x ou 5x ou 10x ou 50x ou 100x do material com o qual normalmente é associado na natureza. Como um exemplo não limitante, se uma cultura é normalmente associada com o solo na natureza, o organismo pode ser biologicamente puro de forma que a sua concentração em uma determinada quantidade de material purificado ou parcialmente

13/83 purificado com o qual normalmente é associado na natureza (por exemplo, solo) é pelo menos 2x ou 5x ou 10x ou 50x ou 100x que no material impuro original. Como usado aqui, o termo cultura enriquecida de uma cepa microbiana isolada refere-se a uma cultura microbiana que o total de população microbiana da cultura contém mais de 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de cepa isolada.

[0028] Cultivo: O termo 'cultivo,' como usado aqui, refere-se à propagação de organismos sobre ou em meios de vários tipos.

[0029] Como usado neste documento, um endófito é um endossibionte que vive dentro de uma planta pelo menos parte de sua vida sem causar doença aparente. Endófitos podem ser transmitidos tanto verticalmente (diretamente de pai para filho) ou horizontalmente (de indivíduo para indivíduo independente). Endófitos fúngicos transmissíveis verticalmente são normalmente assexuados e transmitem da planta materna à prole através de hifas fúngicas penetrando as sementes do hospedeiro. Bacterianos endófitos também podem ser transferidos verticalmente de sementes para mudas (Ferreira et al., FEMS Microbiol. Lett. 287:8-14, 2008). Por outro lado, endófitos transmitidos horizontalmente são tipicamente sexuais e transmitidos através de esporos que podem ser espalhados pelo vento e/ou insetos vetores. Microbianos endófitos de plantas de cultivo têm recebido atenção considerável no que diz respeito a sua capacidade de controlar a doença e infestação de insetos, bem como seu potencial para promover o crescimento das plantas.

[0030] Patógeno fúngico: Para fins da presente invenção entendese que o uso do termo patógeno fúngico ou fungo destina-se a incluir tanto o estágio sexual (teleomórfica) deste organismo e também a fase assexuada (anamórfica), também conhecido como os estágios fúngicos perfeito e imperfeito, respectivamente. Por exemplo, a fase anamórfica de Fusarium graminearum é Gibberella zeae.

14/83 [0031] Fungicida: Como usado aqui, fungicida refere-se a capacidade de uma composição ou substância para diminuir a taxa de crescimento de fungos ou aumentar a taxa de mortalidade de fungos.

[0032] Mutante: como usado aqui, o termo mutante ou variante, em referência a um micro-organismo refere-se a uma modificação da cepa parental em que a atividade biológica desejada é semelhante a que expressada pela cepa parental. Por exemplo, no caso de Burkholderia a estirpe parental é definida aqui como a cepa Burkholderia original antes da mutagênese. Mutantes ou variantes podem ocorrer na natureza sem a intervenção do homem. Eles também são obtidos por tratamento com ou por uma variedade de métodos e composições conhecidas por aqueles versados na técnica. Por exemplo, uma cepa parental pode ser tratada com um produto químico, tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, etilmetanosulfona, ou por irradiação usando irradiação gama, raio-x ou irradiação UV ou por outros meios conhecidos por aqueles versados na técnica.

[0033] Nematicida: o termo nematicida, como usado aqui, referese à capacidade de uma substância para aumentar a mortalidade ou inibir o crescimento de bactérias ou nematoides.

[0034] Patógeno: O termo patógeno neste documento refere-se a um organismo como uma alga, um aracnídeo, uma bactéria, um fungo, um inseto, um nematódeo, uma planta parasita, um protozoário, uma levedura ou um vírus capaz de produzir uma doença em uma planta ou animal. O termo fitopatógeno neste documento refere-se a um organismo patógeno que infecta uma planta.

[0035] Porcentagem de identidade de sequência: a porcentagem de identidade de sequência, como usado aqui, é determinada comparando duas sequências alinhadas localmente idealmente sobre uma janela de comparação definida pelo comprimento do alinhamento

15/83 local entre as duas sequências. A sequência de aminoácidos na janela de comparação pode compreender adições ou exclusões (p. ex., lacunas ou saliências) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou exclusões) para alinhamento ideal das duas sequências. O alinhamento local entre duas sequências inclui apenas os segmentos de cada sequência que são considerados suficientemente semelhantes de acordo com um critério que varia de acordo com o algoritmo usado para realizar o alinhamento (p. ex. BLAST). A porcentagem de identidade de sequência é calculada determinando o número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicar o resultado por 100. O alinhamento ideal de sequências para a comparação pode ser realizado pelo algoritmo de homologia local de Smith and Waterman (1981) Add.APL.Math.2:482, pelo algoritmo de alinhamento de homologia global de Needleman e Wunsch (J Mol. Biol. 48:443, 1970), pela busca de método de similaridade de Pearson e Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988), por implementações heurísticas desses algoritmos (NCBI BLAST, WU-BLAST, BLAT, SIM,BLASTZ), ou pela inspeção. Dado que duas sequências foram identificadas por comparação, GAP e BESTFIT de preferência são empregadas para determinar o alinhamento ideal. Normalmente, os valores-padrão de 5,00 para peso de lacuna e 0,30 para comprimento de peso de lacuna são usados. O termo identidade de sequência substancial entre polinucleotídeo ou sequências polinucleotídicas refere-se ao polinucleotídeo ou polipeptídeo compreendendo uma sequência de pelo menos 50% de identidade de sequência, de preferência pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, mais de preferência pelo

16/83 menos 85%, mais de preferência pelo menos 90%, ainda mais, de preferência pelo menos 95%, mais de preferência pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% da sequência identidade e comparado com uma sequência de referência usando os programas. Além disso, homologia de sequência emparelhadas ou similaridade da sequência, como usado refere-se à percentagem de resíduos que são semelhantes entre duas sequências alinhadas. As famílias resíduos de aminoácido que têm cadeias laterais semelhantes a resíduos de aminoácidos foram bem definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, o ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais apolares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

[0036] Sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos de consulta podem ser pesquisadas nas sequências de ácido nucleico ou aminoácido do objeto que está residindo nos bancos de dados públicos ou exclusivos. Tais pesquisas podem ser feitas usando o National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool (NCBI BLAST v 2.18). O programa de NCBI BLAST está disponível na internet do National Center for Biotechnology Information (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Normalmente, os seguintes parâmetros de NCBI BLAST podem ser usados: Opções de filtro definidas como padrão, a Matriz de Comparação definida como BLOSUM62, os Custos de Gap (lacuna) definidos como Existência:11, extensão: 1 , o tamanho da palavra definido como 3, o

17/83

Esperado (limiar E) definido como 1e-3 e o comprimento mínimo do alinhamento local definido como 50% do comprimento de sequência de consulta. Sequência de identidade e semelhança também podem ser determinadas usando o software GenomeQuest^TM (Gene-IT, Worcester Massachusetts EUA).

[0037] O termo pragas como usado neste documento refere-se a um organismo indesejável que pode incluir, mas não se limitando a, bactérias, fungos, plantas (por exemplo, as ervas daninhas), nematoides, insetos e outros animais patogênicos. Pesticida, como usado aqui, refere-se à capacidade de uma substância ou composição para diminuir a taxa de crescimento de uma praga, isto é, um organismo indesejável, ou para aumentar a taxa de mortalidade de uma praga.

[0038] Descendência: Como usado aqui, descendência inclui descendentes de uma determinada planta ou linhagem de planta. A descendência de uma planta do momento inclui sementes formadas em F₁,F₂, F₃, F₄, F₅, F₆ e subsequentes gerações de plantas, ou sementes formaram-se em BC1, BC2, BC3, e subsequentes gerações de plantas, ou sementes formaram-se em F₁BC₁, F₁BC₂, F₁BC₃, e subsequentes gerações de plantas. A designação F1 refere-se a descendência de um cruzamento entre dois pais que são geneticamente distintos. As designações F2, F3, F4, F5 e F6 referem-se às gerações subsequentes de descendência por auto- ou sibpolinização de uma planta F1.

[0039] Variante: como usado aqui em referência a um ácido nucleico e polipeptídeo, o termo variante é usado neste documento para denotar um polipeptídeo, uma molécula de proteína ou polinucleotídeo com algumas diferenças, gerado sinteticamente ou naturalmente, em seus aminoácidos ou sequências de ácidos nucleicos em comparação com um polipeptídeo de referência ou

18/83 polinucleotídeo, respectivamente. Por exemplo, essas diferenças incluem substituições, inserções, exclusões ou qualquer das combinações desejadas de tais mudanças em uma polipeptídeo de referência ou polipeptídeo. Variantes de polipeptídios e proteínas podem consistir ainda em mudanças na carga e/ou modificações póstraducionais (tais como glicosilação, metilação, fosforilação, etc.). [0040] O termo variante, quando utilizado neste documento em referência a um micro-organismo, é uma cepa microbiana tendo características de identificação da espécie a que pertence, tendo pelo menos uma variação de sequência de nucleotídeos ou traço identificavelmente diferente no que diz respeito a cepa parental, onde o traço é baseado geneticamente (hereditária). Por exemplo, para um de Bacillus thuringiensis 020_A01 cepa com uma atividade de promoção de crescimento de planta, traços identificáveis incluem 1) a capacidade de suprimir o desenvolvimento de fungos fitopatogênicos, incluindo Fusarium graminearum Gibberella zeae, Stagnospora nodurum, Colletotrichum gramnicola; 2) a capacidade de aumentar o rendimento da semente em trigo; e 3) com um gene 16S rRNA com sequência de nucleotídeos superior a 95%, superior a 96%, superior a 97%, superior a 98%, ou superior a 99% de identidade de sequência para o gene de 16S rRNA de Bacillus thuringiensis ; pode ser usada para confirmar uma variante como 020_A01 de Bacillus thuringiensis 020_A01.

[0041] Rendimento: Como usado aqui, o termo rendimento refere-se à quantidade de material vegetal cultivável ou produto de origem vegetal e normalmente é definido como o produto mensurável do valor econômico de uma colheita. Para plantas de cultivo rendimento também significa a quantidade de material colhido por acre ou unidade de produção. Rendimento pode ser definido em termos de quantidade ou de qualidade. O material de colheita pode

19/83 variar de cultura para cultura, por exemplo, podem ser sementes, acima de biomassa do solo, raízes, frutas, fibras de algodão, qualquer outra parte da planta, ou qualquer produto de origem vegetal, que é de valor econômico. O termo rendimento engloba também o potencial de rendimento, que é o rendimento máximo obtido. Rendimento pode ser dependente de um número de componentes do rendimento, que podem ser monitoradas por determinados parâmetros. Esses parâmetros são bem conhecidos por pessoas versadas na técnica e variam de cultura para cultura. O termo rendimento engloba também o índice de colheita, que é a relação entre a biomassa colhida sobre a quantidade total de biomassa.

[0042] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são incorporados neste documento por referência na mesma medida como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse indicado especificamente e individualmente para ser incorporado por referência.

[0043] Nenhuma admissão é feita de forma que qualquer referência constitua estado da técnica. A discussão das referências afirma que seus autores declaram, e os candidatos reservam o direito de contestar a exatidão e a pertinência dos documentos citados. Será claramente entendido que, embora um número de publicações do estado da técnica está referido neste documento, essa referência não constitui uma admissão de que qualquer um destes documentos faz parte do conhecimento geral comum na técnica.

[0044] A discussão sobre os métodos gerais dados neste documento destina-se apenas para fins ilustrativos. Outros métodos alternativos e modalidades serão evidentes para aqueles de versados na técnica após revisão de descrição.

Micro-organismos Promotores de Crescimento da Planta [0045] Diversos micro-organismos associados à planta podem

20/83 afetar positivamente a saúde e fisiologia da planta de várias maneiras. Estes micróbios benéficos são geralmente referidos como microorganismos promotores de crescimento da planta (PGPMs). O termo atividade promotora de crescimento da planta, como usado aqui, abrange uma ampla gama de propriedades melhoradas da planta, incluindo, por exemplo, sem limitação, melhoria da fixação do nitrogênio, melhoria do desenvolvimento da raiz, aumento da área foliar, aumento do rendimento vegetal, aumento da germinação de sementes, aumento da fotossíntese ou um aumento na biomassa acumulada da planta. Em várias modalidades, a melhora é de pelo menos 10% de aumento ou, pelo menos, 25% de aumento ou, pelo menos 50% de aumento ou, pelo menos, 75% de aumento ou, pelo menos, um aumento de 100% na propriedade sendo medido. Assim, como não limitação de exemplos, os micróbios podem produzir um aumento acima do percentual indicado na fixação do nitrogênio, ou um aumento acima do indicado, ou no peso total da raiz, ou da área foliar ou no rendimento de produto vegetal (por exemplo, um aumento acima do percentual indicado no peso do produto de planta, ou um aumento percentual de sementes que germinam dentro de 10 dias ou 14 dias ou 30 dias, ou a taxa de fotossíntese (por exemplo: determinado pelo consumo de CO2) ou acumulado da biomassa da planta (por exemplo, determinada pelo peso da planta). O produto vegetal é o item geralmente mas não necessariamente - um alimento produzido pela planta. O rendimento pode ser determinado usando qualquer método conveniente, por exemplo, alqueires ou libras de produto vegetal produzidos por hectare de plantio. Até a data, cepas isoladas de duas dúzias de gêneros de microrganismos foram relatadas pela atividade de promoção do crescimento de planta e/ou atividade de biocontrole, e novos gêneros e espécies com atividades semelhantes ainda estão sendo descobertas. Além disso, dentro de alguns gêneros de

21/83 bactérias, várias espécies e subespécies de agentes de biocontrole foram identificados e podem ser encontrados através de múltiplas escalas espaciais, do nível global ao nível da exploração e mesmo em plantas individuais. Além disso, tem sido relatado que alguns microbianos individuais isolados podem exibir biocontrole e/ou atividade de promoção de crescimento não só nas plantas ou culturas de que eles foram obtidos, mas também em outras culturas de plantas. Isto indica a natureza generalista de alguns genótipos, especialmente aqueles com uma distribuição geográfica ampla. Como discutido acima, se introduzido em número suficiente e ativo por um período suficiente, uma única população microbiana pode ter um impacto significativo sobre a saúde da planta.

[0046] Vários mecanismos têm sido postulados para fornecer uma explicação para o impacto positivo de PGPMs na melhoria do crescimento da planta. Os efeitos benéficos dos micro-organismos no crescimento das plantas podem ser direto ou indireto.

[0047] O termo micro-organismo promotor de crescimento da planta direto, para fins de descrição, refere-se a um micro-organismo que pode melhorar o crescimento da planta na ausência de agentes patogênicos. Como discutido em mais detalhes abaixo, exemplos de promoção de crescimento de planta direto incluem (a) biofertilização, (b) a estimulação do crescimento da raiz, (c) rizoremediação e (d) controle do estresse da planta. Além disso, foram relatados vários PGPMs para promover o crescimento de planta indiretamente através de mecanismos de controle biológico, isto é, reduzindo o nível da doença, por exemplo, antibiose, indução de resistência sistêmica e a competição com patógenos por nutrientes e nichos.

[0048] Biofertilizantes: Fertilizantes microbianos alimentam a planta com nutrientes e, assim, podem promover o crescimento da planta na ausência de pressão do patógeno. Exemplos de não

22/83 limitação dos microbianos isolados que diretamente podem promover crescimento da planta e de rendimento incluem espécies de bactéria fixadora de N₂ Rizobio e Bradirizobio que, através da fixação simbiótica do nitrogênio, podem formar nódulos nas raízes de plantas leguminosas, nas quais eles convertem N2 atmosférico em amônia que, em contraste, N2 atmosférico, de pode ser usado pela planta como fonte de nitrogênio. Outros exemplos incluem espécies de espécies de Azospiril, que são fixadores de N₂ de vida livre que podem fertilizar e aumentar o rendimento das culturas de cereais como trigo, sorgo e milho. Apesar da capacidade de fixação do N₂- Azospiril -, o aumento do rendimento causado por inoculação por Azospiril é muitas vezes atribuído ao aumento de desenvolvimento da raiz e, portanto, ao aumento das taxas de absorção de água e minerais. A este respeito, várias rizobactérias como Azotobacter spp. foram relatadas como capazes de produzir uma grande variedade de fitohormônios (por exemplo, auxinas, citocininas) e enzimas (por exemplo, pectinase). Muitos destes fito-hormônios e enzimas mostraram estar intimamente envolvidos no processo de infecção das associações simbióticas das bactérias-plantas que têm uma influência reguladora na nodulação de Rizobium.

[0049] Em muitos casos, PGPMs também podem afetar o crescimento das plantas e o desenvolvimento, modificando a absorção de nutrientes. Eles podem alterar as taxas de absorção de nutrientes, por exemplo, pelos efeitos diretos sobre as raízes, pelos efeitos sobre o meio ambiente, que por sua vez modificam o comportamento da raiz e competindo diretamente por nutrientes (Gaskin et al., Agricult. Ecosyst. Environ. 12: 99-116, 1985). Alguns fatores pelos quais a PGPM pode desempenhar um papel em modificar a eficiência de utilização de nutrientes em solos incluem, por exemplo, geometria da raiz, solubilidade do nutriente, disponibilidade de nutriente, produzindo

23/83 a forma de íon adequado das plantas, particionamento de nutrientes na planta e a eficiência de utilização. Por exemplo, um nível baixo de fosfato solúvel pode limitar o crescimento das plantas. Alguns micróbios promotores do crescimento da planta são capazes de solubilizar fosfato a partir de qualquer fosfato ligados orgânicos ou inorgânicos, facilitando o crescimento das plantas. Várias enzimas de origem microbiana, como fosfatases inespecíficas, fitases, fosfonatases e liases C-P, liberam o fósforo solúvel de compostos orgânicos no solo. Por exemplo, uma maior solubilização de fósforo inorgânico no solo foi encontrada para aumentar a absorção de fósforo em plântulas de canola usando Pseudomonas putida, bem como aumento da absorção oxidação de enxofre e o enxofre (Grayston and Germida, Can. J. Microbiol. 37: 521-529, 1991; Banerjee,

Phytochemicals and Health, vol. 15, May 18, 1995).

[0050] Fitoestimuladores: alguns microrganismos podem produzir substâncias que estimulam o crescimento da planta na ausência de patógenos. Por exemplo, a produção de hormônios vegetais é uma característica de muitos micro-organismos associados com a planta. Para todos os cinco fito-hormônios clássicos, isto é, auxina, etileno, ácido abscísico, citocinina e giberelina, síntese como um metabólito secundário foi demonstrada por pelo menos uma espécie bacteriana ou fúngica (para revisão, ver, por exemplo, Kim et al., Appl. Environ. Microbiol., Vol. 77, 5:1548-1555, 2011). Alguns microrganismos podem produzir metabólitos secundários que afetam a produção de fitohormônio nas plantas. Provavelmente, o exemplo mais conhecido é a auxina, hormônio que pode promover o crescimento da raiz. Outros exemplos incluem pseudomonas que têm sido relatados para a produção de ácido acético indol (IAA) e aumento das quantidades de IAA em plantas, tendo assim um profundo impacto na produção de biomassa vegetal Brown, Annual Rev. Phytopathology, 68:181-197,

24/83

1974). Por exemplo, Tien et al. (Applied Environmental Microbiol., 37:1016-1024, 1979) relataram que a inoculação de soluções de nutrientes ao redor de raízes de milheto com Azospirillum brasiliense resultou em aumento de peso de broto e de raiz, um aumento do número de raízes laterais, e todas as raízes laterais estavam densamente cobertas de pelos radiculares. Plantas alimentadas com combinações de IAA, giberelinas e quinetina mostraram um aumento na produção de raízes laterais similares àquela causada por Azospiril. Embora a importância biológica destes fitohormônios e materiais semelhantes a hormônios de planta não são totalmente compreendidos, a atividade estimuladora do crescimento destes microorganismos comumente é atribuído a sua produção destes materiais.

[0051] Em adição, outros hormônios, bem como certos compostos orgânicos voláteis (COV) e quinona pirrolquinolina de cofator (PQQ) também estimulam o crescimento da planta. Por exemplo, algumas rizobactérias, como cepas da espécie bacteriana B. subtilis, b. amiloliquefaciense Enterobacter cloacae, promovem o crescimento das plantas pela liberação de compostos orgânicos voláteis. O nível mais alto de promoção de crescimento tem sido observado com 2,3butanodiol e 3-hidroxi-2-butanona (também referido como acetoína) como elicitores de resistência sistêmica induzida. O cofator PQQ tem sido descrito como um promotor de crescimento da planta, que age como um antioxidante em plantas. Alguns relatórios sugerem que efeito pode ser indireto porque PQQ é um cofator de várias enzimas, , por exemplo, envolvidos na atividade antifúngica e indução de resistência sistêmica.

[0052] Controladores de estresse: micro-organismos promotores do crescimento de planta que contêm a enzima ácido 1aminociclopropano-1- carboxílico (ACC) deaminase facilitam o crescimento e desenvolvimento das plantas, diminuindo os níveis de

25/83 etileno das plantas. Tais microrganismos ocupam o precursor do etileno ACC e o convertem em 2-oxobutanoato e NH₃. Vários tipos de estresse foram relatados para serem aliviados por produtores ACC deaminase, tais como, por exemplo, estresse dos efeitos de bactérias fitopatogênicas, estresse de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, estresse de metal pesado como Ca^{2 +} e Ni²+ e estresse por sal e seca. [0053] Em adição, várias cepas de PGPM que induzem aumento de rendimento de batata foram relatadas para a produção extracelular de sideróforos que ligam Fe^{3 +}, tornando-o menos disponível para determinados membros da microflora natural (Kloepper et al., Nature 286: 885-886, 1980). Estas rizobactérias excretam baixo peso molecular, cofatores microbianos férrico-quelantes de alta afinidade que especificamente melhoram sua aquisição de ferro por ligar receptores de sideróforos ligados à membrana. Um dos sideróforos produzidos por alguns pseudomona PGPMs é conhecido como pseudobactin que inibe o crescimento de Erwinia cartovora (organismo causal para podridão-mole da batata) (Veja, por exemplo, Kloepper et al., Current Microbiol. 4: 317-320, 1980). Adições de pseudobactin para o meio de crescimento inibiram a infecção por podridão-mole e também reduziram o número de fungos patogênicos na planta de batata, juntamente com um aumento significativo no rendimento. A maioria das evidências para apoiar a teoria de sideróforo de controle biológico pela PGPM vem do trabalho com o pioverdines, uma classe de sideoforos que compreende os pigmentos fluorescentes de pseudomonas fluorescentes [Demange et al., in Iron Transport in Microbes, Plants and Animals (Winkleman et al., eds.), pp 167-187, 1987]. De acordo com a teoria de sideróforo, pioverdines demonstram certa especificidade funcional da cepa que é devida ao reconhecimento seletivo dos receptores de membrana exterior sideróforo (Bakker et al., Soil Biology and Biochemistry 19: 443-450,

26/83

1989).

Culturas isoladas da invenção [0054] Conforme descrito mais detalhadamente na seção exemplos da presente descrição, os depositantes descobriram vários micro-organismos novos que são eficazes promotores de crescimento das plantas e do rendimento da planta. Em muitos casos, os microorganismos isolados também são eficazes em suprimir o desenvolvimento de diversas doenças patogênicas vegetais. Os microbianos isolados foram selecionados de um total de aproximadamente 5.000 cepas microbianas obtidas a partir de amostras ambientais coletadas em vários locais nos Estados Unidos. A seleção inicial dos micro-organismos baseou-se na capacidade dos microrganismos para colonizar as raízes das plantas e a produção de compostos químicos e enzimas que são considerados importantes para a sua interação com as plantas. Os micro-organismos também foram bioanalisados pela sua capacidade de suprimir o desenvolvimento de vários fungos fitopatógenos em um ensaio de antagonismo in vitro. Micro-organismos microbianos selecionados foram então bioensaiados em estudos de estufa em trigo comercial e variedades de milho para a capacidade das cepas microbianas promover o crescimento das plantas e por sua capacidade de preservar o rendimento potencial da semente.

[0055] A análise taxonômica determinada ainda que microorganismos representativos descritos na presente descrição estão intimamente relacionados com os gêneros bacterianos Bacillus, Burkholderia, Herbaspirillum, Pantoea, e Pedobacter.

Depósito de Material biológico [0056] Culturas purificadas de cepas microbianas descritas na presente descrição foram depositadas em Agricultural Research Service Culture Collection localizada em 1815 N. University Street,

27/83

Peoria, IL 61604, EUA (NRRL) em conformidade com o Tratado de Budapeste para efeitos de processo de patente e os regulamentos de aplicação (Tratado de Budapeste). Números de adesão para estes depósitos são os seguintes:

Tabela 1: Microbianos isolados e de números de adesão correspondente

ID de Cepa	Número de Adesão	Taxonomia Provisória
SGI-003-H11	NRRL B-50483	Pantoea agglomerans 003_H11
SGI-020-A01	NRRL B-50484	Bacillus thuringiensis 020_A01
SGI-026-G06	NRRL B-50485	Burkholderia metallica 026_G06
SGI-026-G07	NRRL B-50486	Burkholderia vietnamiensis 026_G07

[0057] As cepas microbianas foram depositadas sob condições que garantem que o acesso à cultura estará disponível durante a pendência do presente pedido de patente para um determinado pelo Comissário de Patentes e marcas registradas para ter direito aos mesmos abaixo dos 37 C.F.R. §1.14 e 35 §122 U.S.C. Os depósitos representam substancialmente puras culturas das cepas depositadas. Os depósitos estão disponíveis conforme exigido pelas leis de patentes estrangeiras em países onde homólogos do objeto pedido ou seus descendentes são arquivados. No entanto, deve ser entendido que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para praticar a invenção do assunto em derrogação dos direitos de patente concedidos pela ação governamental.

[0058] Micro-organismos preferenciais da presente invenção têm todas as características de identificação das cepas depositadas e, em particular, as características de identificação de serem capaz de promover o crescimento das plantas e/ou rendimento conforme descrito neste documento e as características de identificação como sendo capaz de suprimir o desenvolvimento de fungo fitopatógeno como descreveram neste documento. Em particular, os micro

28/83 organismos preferenciais da presente invenção referem-se aos microrganismos depositados conforme descrito acima, e cepas deles derivados.

Composições microbiológicas [0059] As composições microbiológicas da presente invenção que compõem cepas microbianas isoladas ou culturas respectivas podem ser em uma variedade de formas, incluindo, mas não limitado a cultura em repouso, culturas completas, estoques armazenados de células, micélio e/ou hifas (particularmente estoques de glicerol), tiras de ágar, plugues de ágar armazenados em glicerol/água, estoques congelados secos e estoques liofilizado ou micélios secos sobre papel de filtro ou de sementes de cereais. Como definido em outro lugar neste documento, cultura isolada ou equivalentes gramaticais como usado na descrição e na técnica entende-se que a referida à cultura é um fluido de cultura, pelota, raspagem, amostra seca, liofilizado ou seção (por exemplo, as hifas ou micélios); ou um suporte, contêiner ou meio como uma placa, papel, filtro, matriz, palha, pipeta ou ponta de pipeta, fibra, agulha, gel, cotonete, tubo, frasco, partícula, etc. que contém um único tipo de organismo. Na presente invenção, uma cultura isolada de um antagonista microbiano é uma cultura fluida ou uma raspagem, pelota, preparação seca, liofilizado ou seção do micro-organismo, ou um suporte, recipiente ou meio que contém os micro-organismos, na ausência de outros organismos.

[0060] A presente descrição adicional fornece composições que contêm pelo menos um isolado de cepas microbianas ou culturas fracção de presente invenção e um porta-aviões. O transportador pode ser qualquer um ou mais de um número de transportadores que conferem uma variedade de propriedades, tais como aumento da estabilidade, molhabilidade, capacidade de dispersão, etc. agentes umectantes como tensoativos naturais ou sintéticos, que podem ser

29/83 não iônicos ou tensoativos iônicos ou uma combinação destes podem ser incluídos em uma composição da invenção. Emulsões de água em óleo também podem ser usadas para formular uma composição que inclui pelo menos um micro-organismo isolado da presente invenção (ver, por exemplo, Patente U.S. N° 7.485.451, incorporados por referência neste documento). Formulações adequadas que podem ser preparadas incluem pós molháveis, grânulos, géis, tiras de ágar ou pelotas, espessantes e afins, partículas microencapsuladas e afins, líquidos, tais como dispersíveis aquosos, suspensões aquosas, emulsões de água em óleo, etc. A formulação pode incluir produtos de grão ou vegetais (por exemplo, grão triturado ou feijão, caldo de carne ou farinha derivada de grão ou feijão), amido, açúcar, ou óleo. O transportador pode ser um transportador agrícola. Em determinadas modalidades preferenciais, o transportador é uma semente, e a composição pode ser aplicada ou revestida na semente ou deixada para saturar a semente.

[0061] Em algumas modalidades, o transportador agrícola pode ser de solo ou meio de crescimento de planta. Outros transportadores agrícolas que podem ser usados incluem água, fertilizantes, óleos à base de plantas, umectantes ou suas combinações. Alternativamente, o transportador agrícola pode ser um sólido, como terra diatomácea, barro, sílica, alginato, argila, bentonita, vermiculita, casos de semente, outra planta e produtos de origem animal ou combinações, incluindo grânulos, pelotas ou suspensões. Misturas de qualquer um dos ingredientes acima mencionados também são previstas como transportadores, tais como, mas não limitado a, pesta (argila de farinha e caulim), ágar-ágar ou pelotas de barro com base em farinha, areia ou argila, etc. formulações podem incluir fontes de alimento para os organismos cultivados, tais como cevada, arroz ou outros materiais biológicos, tais como sementes, partes de plantas, bagaço de cana,

30/83 cascos ou talos de processamento de grãos, terreno de material vegetal (restos culturais) ou madeira de refugo de canteiro de obra, serragem ou pequenas fibras de papel reciclado, tecido ou madeira. Outras formulações apropriadas serão conhecidas para aqueles versados na técnica.

[0062] Sob a forma líquida, por exemplo, soluções ou suspensões, os micro-organismos da presente invenção podem ser misturados ou suspensos em água ou em soluções aquosas. Diluentes líquidos apropriados ou transportadores incluem água, soluções aquosas, destilados de petróleo ou outros líquidos transportadores.

[0063] Composições sólidas podem ser preparadas por dispersar os micro-organismos da invenção em um transportador sólido apropriadamente dividido, como turfa, trigo, farelo, vermiculita, argila, talco, bentonita, terra diatomácea, terra de Fuller, solo pasteurizado e similares. Quando tais formulações são usadas como pós molháveis, agentes de dispersão biologicamente compatíveis, como não iônicos, aniônicos, anfotéricos ou catiônicos dispersantes e emulsionantes podem ser usados.

[0064] Em uma modalidade preferencial, as composições contempladas neste documento reforçam o crescimento e o rendimento de espécies vegetais, tais como trigo, cevada, aveia e milho e, quando usado em quantidades suficientes, para atuar como fertilizante microbiano. Estas composições, similarmente a outros agentes de biofertilizante, podem ter uma alta margem de segurança porque eles normalmente não queimam ou lesionam a planta.

[0065] Como descrito em detalhes em toda a presente descrição, a melhoria do crescimento da planta e o rendimento da planta podem ser efetuados por aplicação de uma ou mais das composições microbiológicas da presente invenção de uma planta hospedeira ou partes da planta hospedeira. As composições podem ser aplicadas em

31/83 uma quantidade eficaz para aumentar o crescimento de planta ou ceder em relação a um controle não tratado. Os constituintes ativos são usados em uma concentração suficiente para melhorar o crescimento da planta alvo quando aplicados à planta. Como será evidente para aqueles versados na técnica, concentrações eficazes podem variar dependendo de vários fatores, como, por exemplo, (a) o tipo de planta ou comodities agrícolas; (b) o estado fisiológico da planta ou comodities agrícolas; (c) a concentração de patógenos que afetam a planta ou comodities agrícolas; (d) o tipo de lesão da doença na planta ou comodities agrícolas; (e) clima (por exemplo, de temperatura, umidade); e a doença (f) a fase da planta. De acordo com a presente invenção, concentrações típicas são aqueles superiores a 1 e 10² CFU/mL do transportador. Uma gama de concentrações preferencial de aproximadamente 1 e 10⁴ para aproximadamente 1 e 10⁹ CFU/mL, tais como as concentrações que variam de 1 e 10⁶ a 1 e 10⁸ CFU/mL. Concentrações mais preferenciais são as provenientes de aproximadamente 37,5 para aproximadamente 150 mg de massa bacteriana seca por mililitro do transportador (composição líquida) ou por grama do transportador (formulação seca).

[0066] Em algumas modalidades, a quantidade de um ou mais dos micro-organismos nas composições da presente invenção pode variar dependendo da formulação final, bem como tamanho ou tipo de planta ou semente utilizada. De preferência, os um ou mais micro-organismos nas composições estão presentes em cerca de 2% p/p/para aproximadamente 80% p/p da formulação inteira. Mais preferível, os um ou mais microrganismos empregados nas composições é cerca de 5% p/p a aproximadamente 65% p/p e mais, preferencialmente cerca de 10% p/p, a aproximadamente 60% p/p em peso da formulação inteira.

[0067] Como será apreciado por aqueles versados na técnica, as

32/83 composições microbiológicas da invenção podem ser aplicadas para a planta alvo usando uma variedade de métodos convencionais, tais como polvilhar, revestir, injetar, friccionar, rolar, mergulhar, pulverizar, ou escovar ou qualquer outra técnica apropriada, que significativamente não vá ferir a planta alvo a ser tratada. Particularmente métodos preferidos incluem a inoculação do meio de crescimento ou de solo com suspensões de células microbianas e o revestimento de sementes com células microbianas e/ou esporos.

[0068] Normalmente, as composições da invenção são quimicamente inertes; portanto eles são compatíveis com substancialmente quaisquer outros constituintes da programação do pedido. Eles também podem ser usados em combinação com substâncias que afetam o crescimento das plantas, tais como fertilizantes, reguladores de crescimento de plantas e similares, desde que tais compostos ou substâncias sejam biologicamente compatíveis. Eles também podem ser usados em combinação com agentes ativos de pesticida biologicamente compatíveis como por exemplo, herbicidas, nematocidas, fungicidas, inseticidas e afins.

[0069] Quando usado como biofertilizantes em suas formulações disponíveis comercialmente e sob as formas de utilização, preparadas a partir destas formulações, as cepas microbianas ativas e composições de acordo com a presente invenção podem, além disso, estar presentes sob a forma de uma mistura com agentes sinérgicos. Agentes sinérgicos são compostos pelo qual a atividade das composições ativas é aumentada sem que seja necessário para o agente sinérgico adicionado estar ativo em si.

[0070] Quando usado como biofertilizantes em suas formulações disponíveis comercialmente e sob as formas de utilização, preparadas a partir destas formulações, as cepas microbianas ativas e composições de acordo com a invenção, além disso, podem estar

33/83 presentes sob a forma de uma mistura com inibidores que reduzem a degradação das composições ativas após a aplicação no habitat da planta, na superfície de partes de plantas ou em tecidos vegetais. [0071] As cepas microbianas ativas e composições de acordo com a invenção, tais como, ou em suas formulações, poderá também ser usada como uma mistura com fertilizantes conhecidos, acaricidas, bactericidas, fungicidas, inseticidas, microbicidas, nematicidas, pesticidas ou combinações de qualquer um, por exemplo em ordem para ampliar o espectro de ação ou evitar o desenvolvimento de resistência aos pesticidas desta forma. Em muitos casos, resultado de efeitos sinérgicos, isto é, a atividade da mistura pode exceder a atividade dos componentes individuais. Uma mistura com outros compostos ativos conhecidos, tais como reguladores de crescimento, agentes de proteção e/ou semiquímicos também é contemplada.

[0072] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, as composições podem ainda incluir pelo menos um fertilizante químico ou biológico. A quantidade de pelo menos um fertilizante químico ou biológico empregado nas composições pode variar dependendo da formulação final, bem como o tamanho da planta e semente a ser tratada. De preferência, pelo menos um fertilizante químico ou biológico empregado é cerca de 0,1% p/p, a cerca de 80% p/p baseada na formulação inteira. Mais, de preferência, pelo menos um fertilizante químico ou biológico está presente em uma quantidade de aproximadamente 1% p/p a aproximadamente 60% p/p e mais, de preferência aproximadamente 10% p/p, a aproximadamente 50% p/p.

[0073] As composições microbiológicas da presente invenção de preferência incluem pelo menos um adubo biológico. Exemplares fertilizantes biológicos que são adequados para uso neste documento e podem ser incluídos em uma composição microbiológica de acordo com a presente invenção para promover o crescimento das plantas e

34/83 de rendimento inclui micróbios, animais, bactérias, fungos, material genético, plantas e produtos naturais de organismos vivos. Nestas composições, o micro-organismo da presente invenção é isolado antes da formulação com um organismo adicional. Por exemplo, micróbios tais como, mas não limitados a espécie de Achromobacter, Ampelomyces, Aureobasidium,Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Beauveria, Bradyrhizobium, Candida, Chaetomium, Cordyceps, Cryptococcus, Dabaryomyces, Delftia, Erwinia, Exophilia,Gliocladium, Herbaspirillum, Lactobacillus, Mariannaea, Microccocus, Paecilomyces, Paenibacillus, Pantoea, Pichia, Pseudomonas, Rhizobium, Saccharomyces,Sporobolomyces, Stenotrophomonas, Streptomyces, Talaromyces, e Trichoderma podem ser fornecidos em uma composição com os micro-organismos da presente invenção. Uso das composições microbiológicos de acordo com a presente invenção em combinação com os micro-organismos microbianas, divulgadas nos Pedidos de Patente U.S. N^os US20030172588A1, US20030211119A1; Patentes U.S. N^os 7.084.331; 7.097.830; 7.842.494; Pedido PCT N° WO2010109436A1 são também particularmente preferidos.

[0074] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, as composições podem ainda incluir pelo menos um pesticida químico ou biológico. A quantidade de pelo menos um pesticida químico ou biológico empregado nas composições pode variar dependendo da formulação final, bem como o tamanho da planta e semente a ser tratada. De preferência, pelo menos um pesticida químico ou biológico empregado é aproximadamente de 0,1% p/p, a aproximadamente 80% p/p baseada na formulação inteira. Mais, de preferência, pelo menos um pesticida químico ou biológico está presente em uma quantidade de aproximadamente 1% p/p a aproximadamente 60% p/p e mais, de preferência aproximadamente 10% p/p, aproximadamente 50% p/p.

35/83 [0075] Uma variedade de pesticidas químicos é evidente para aqueles versados na técnica e pode ser usada. Exemplares pesticidas químicos incluem aqueles no carbamato, organofosforados, organoclorados e classes pretroide. Também estão incluídos os agentes químicos tais como, mas não limitando a, benomil, bórax, captafol, captan, chorotalonil, formulações contendo cobre; formulações contendo diclona, dicloran, iodo, zinco; fungicidas que inibem a biossíntese de ergosterol, tais como, mas não se limitando a blastididin, cimoxanil, fenarimol, flusilazol, folpete, imazalil, ipordione, manebe, manocozeb, metalaxil, oxicarboxin, miclobutanil, oxitetraciclina, PCNB, pentaclorofenol, procloraz, propiconazol, quinometionate, aresenita de sódio, sódio DNOC, hipoclorito de sódio, fenilfenato de sódio, estreptomicina, enxofre, tebuconazole, terbutrazole, tiabendazolel, tiofanato-metilo, triadimefão, triciclazol, triforina, validimicin, vinclozolina, zineb e zirame.

[0076] As composições microbiológicas da presente invenção de preferência incluem pelo menos um pesticida biológico. Exemplares pesticidas biológicos que são adequados para utilização neste documento e podem ser incluídos em uma composição microbiológica de acordo com a presente invenção para prevenir uma doença patogênica vegetal inclui micróbios, animais, bactérias, fungos, material genético, plantas e produtos naturais de organismos vivos. Nestas composições, o micro-organismo da presente invenção é isolado antes da formulação com um organismo adicional. Por exemplo, os micróbios tais como, mas não limitado a espécie de Ampelomyces, Aureobasidium, Bacillus, Beauveria, Candida, Chaetomium, Cordyceps, Cryptococcus, Dabaryomyces, Erwinia, Exophilia, Gliocladium, Mariannaea, Paecilomyces, Paenibacillus, Pantoea, Pichia, Pseudomonas, Sporobolomyces, Talaromyces, and Trichoderma podem ser fornecidos em uma composição com, os

36/83 micro-organismos da presente invenção, com cepas fúngicas de Muscodor sendo particularmente preferido. O uso das composições microbiológicos de acordo com a presente invenção em combinação com os antagonistas microbianos, divulgado na Patente U.S. N° 7.518.040; Patente U.S. N° 7.601.346; Patente U.S. N° 6.312.940 é também particularmente preferido.

[0077] Exemplos de fungos que podem ser combinados com as cepas microbianas e composições da presente invenção em uma composição incluem, sem limitação, espécie de Muscodor, Aschersonia aleyrodis, Beauveria bassiana (branco Muscarina), Beauveria brongniartii, Chladosporium herbarum, Cordyceps clavulata, Cordyceps entomorrhiza, Cordyceps facis, Cordyceps gracilis, Cordyceps melolanthae, Cordyceps militaris, Cordyceps myrmecophila, Cordyceps ravenelii, Cordyceps sinensis, Sphecocephala Cordyceps, Cordyceps subsessilis, Cordyceps unilateral, Cordyceps variabilis, Cordyceps washingtonensis, Culicinomyces clavosporus, Entomophaga grylli, Entomophaga maimaiga, Entomophaga muscae, Entomophaga praxibulli, Entomophthora plutellae, Fusarium lateritium, Hirsutella citriformis, Hirsutella thompsoni, Metarhizium anisopliae (Muscarina verde), Metarhizium flaviride, Muscodor albus, Neozygitesfloridana, Nomuraea rileyi, Paecilomyces farinosus, Paecilomyces fumosoroseus, Pandora neoaphidis, Tolypocladium cylindrosporum, Verticillium lecanii, Zoophthora radicans, e espécies micorrízicas como Laccaria bicolor. Outras espécies de micopesticida serão evidentes para aqueles versados na técnica.

[0078] A presente invenção também fornece métodos de tratar uma planta por aplicação de qualquer uma variedade de formulações habituais em uma quantidade eficaz para qualquer solo (ou seja, no sulco), ou uma parte da planta (isto é, regulador de crescimento) ou na

37/83 semente antes do plantio (isto é, semente revestimento ou curativo). Formulações habituais incluem soluções, concentrado para emulsão, pós molháveis, concentrado de suspensão, pós solúveis, grânulos, concentrado de suspensão-emulsão, materiais naturais e sintéticos, impregnados com composto ativo e cápsulas de liberação de controle em substâncias poliméricas muito finas. Em determinadas modalidades da presente invenção, as composições microbianas são formuladas em pós que estão disponíveis em qualquer uma formulação prontos para uso, ou são misturados no momento da utilização. Em cada modalidade, o pó pode ser misturado com o solo antes ou no momento do plantio. Em uma modalidade alternativa, um ou ambos de qualquer agente de promoção do crescimento planta, ou agente de biocontrole é uma formulação líquida que é misturada no momento do tratamento. Aqueles versados na técnica entendem que uma quantidade eficaz das composições inventivas depende da formulação final da composição, bem como o tamanho da planta ou do tamanho da semente a ser tratada.

[0079] Dependendo da formulação final e do método de aplicação, um ou mais aditivos adequados também podem ser introduzidos para as composições da presente invenção. Adesivos como carboximetilcelulose e polímeros naturais e sintéticos, sob a forma de pó, grânulos ou látex, tais como goma arábica, quitina, álcool polivinílico e acetato de polivinila, bem como fosfolipídios naturais, tais como cefalins e lecitinas e fosfolipídios sintéticos, podem ser adicionados para as composições presentes.

[0080] Em uma modalidade preferencial, as composições microbiológicas são formuladas em uma única, solução estável, ou emulsão ou suspensão. Para soluções, os compostos químicos ativos normalmente são dissolvidos em solventes antes que o agente biológico seja adicionado. Solventes líquidos adequados incluem

38/83 compostos aromáticos à base de petróleo, tais como o xileno, tolueno ou de alquilnaftalenos, hidrocarbonetos alifáticos, tais como cicloexano ou parafinas, por exemplo, frações de petróleo, minerais e óleos vegetais, álcoois, tais como butanol ou glicol, bem como seus éteres e ésteres, cetonas, tais como metil-etil-cetona, metil isobutil cetona ou ciclohexanona, solventes fortemente polares, tais como a dimetilformamida e dimetil sulfóxido. Para emulsão ou suspensão, o meio líquido é água. Em uma modalidade, o agente químico e o agente biológico são suspensos em líquidos separados e misturados no momento da aplicação. Em uma modalidade preferencial da suspensão, o agente químico e o agente biológico são combinados em uma formulação pronta para uso que exibe uma vida útil razoavelmente longa. Em uso, o líquido pode ser pulverizado ou pode ser aplicado via foliar como um pulverizador atomizado ou no sulco no momento do plantio da lavoura. A composição do líquido pode ser introduzida em uma quantidade eficaz na semente (i.e., de revestimento de semente ou compressa) ou no solo (isto é, no sulco) antes da germinação da semente ou diretamente no solo em contato com as raízes, utilizando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica incluindo, mas não limitados a, irrigação de gotejamento, borrifadores, injeção de solo ou encharcamento do solo.

[0081] Opcionalmente, estabilizadores e tampões podem ser adicionados, incluindo sais de metais alcalino-terrosos e ácidos orgânicos, tais como ácido cítrico e ácido ascórbico, ácidos inorgânicos, tais como o ácido clorídrico ou ácido sulfúrico. Biocidas também podem ser adicionados e podem incluir formaldeídos ou agentes liberadores de formol e derivados do ácido benzoico, tais como o ácido p-hidroxibenzoico.

Agentes Patogênicos [0082] Aquele versado na técnica irá reconhecer que os métodos e

39/83 as composições de acordo com a presente invenção em princípio podem ser aplicados para suprimir o desenvolvimento de qualquer patógeno vegetal ou quaisquer doenças fitopatogênicas. Não pretende-se que a invenção seja limitada a um determinado tipo de cultura ou tipos de células. Por exemplo, as células microbianas que passam por formas complexas de diferenciação, filamentação, esporulação, etc. também podem ser usadas para os métodos e as composições da presente invenção.

[0083] Exemplos de doenças fitopatogênicas que são adequados para aplicações dos métodos e materiais das invenções presentes incluem, mas não estão limitados a, doenças causadas por uma ampla gama de fungos patogênicos. Os métodos da presente invenção de preferência são aplicados contra fungos patogênicos que são importantes ou interessantes para agricultura, horticultura, plantas de biomassa para a produção de moléculas de biocombustíveis e outros produtos químicos e/ou florestal. De particular interesse são espécies patogênicas Pseudomonas (por exemplo, espécies Pseudomonas solanacearum), Xylella fastidiosa; Ralstonia solanacearum, Xanthomonascampestris, Erwinia amylovora, espécies Fusarium, espécies Phytophthora (por exemplo, P. infestans), espécies Botrytis, espécies Leptosphaeria, powdery mildews (Ascomycota) e rusts (Basidiomycota), etc.

[0084] Exemplos não limitantes de patógenos vegetais de interesse incluem, por exemplo, Acremonium strictum, Agrobacterium tumefaciens, Alternaria alternata, Alternaria solani, Aphanomyces euteiches, Aspergillus fumigatus, Athelia rolfsii, Aureobasidium pullulans, Bipolaris zeicola, Botrytis cinerea, Calonectria kyotensis, Cephalosporium maydis, Cercospora medicaginis, Cercospora sojina, Colletotrichum coccodes, Colletotrichum fragariae, Colletotrichum graminicola, Coniella diplodiella, Coprinopsis psychromorbida,

40/83

Corynespora cassiicola, Curvularia pallescens, Cylindrocladium crotalariae, Diplocarpon earlianum, Diplodia gossyina, Diplodia spp., Epicoccum nigrum, Erysiphe cichoracearum, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Fusarium oxysporum f. sp. tuberosi, Fusarium proliferatum var. proliferatum, Fusarium solani, Fusarium verticillioides, Ganoderma boninense, Geotrichum candidum, Glomerella tucumanensis, Guignardia bidwellii, Kabatiella zeae, Leptosphaerulina briosiana, Leptotrochila medicaginis, Macrophomina, Macrophomina phaseolina, Magnaporthe grisea, Magnaporthe oryzae, Microsphaera manshurica, Monilinia fructicola, Mycosphaerella fijiensis, Mycosphaerella fragariae, Nigrospora oryzae, Ophiostoma ulmi, Pectobacterium carotovorum, Pellicularia sasakii (Rhizoctonia solani), Peronospora manshurica, Phakopsora pachyrhizi, Phoma foveata, Phoma medicaginis, Phomopsis longicolla, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora erythroseptica, Phytophthora fragariae, Phytophthora infestans, Phytophthora medicaginis, Phytophthora megasperma, Phytophthora palmivora, Podosphaera leucotricha, Pseudopeziza medicaginis, Puccinia graminis subsp. Tritici (UG99), Puccinia sorghi, Pyricularia grisea, Pyricularia oryzae, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia zeae, Rosellinia sp., Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotinina trifoliorum, Sclerotium rolfsii, Septoria glycines, Septoria lycopersici, Setomelanomma turcica, Sphaerotheca macularis, Spongospora subterranea, Stemphylium sp, Synchytrium endobioticum, Thecaphora (Angiosorus), Thielaviopsis, Tilletia indica, Trichoderma viride, Ustilago maydis, Verticillium albo-atrum, Verticillium dahliae, Verticillium dahliae, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas oryzae pv. oryzae.

[0085] Em uma modalidade preferida da presente invenção, os métodos e materiais da invenção são úteis na supressão do desenvolvimento dos patógenos Aspergillus fumigatus, Botrytis

41/83 cinerea, Cerpospora betae, Colletotrichum sp., Curvularia spp., Fusarium sp., Ganoderma boninense, Geotrichum candidum, Gibberella sp., Monographella sp., Mycosphaerella fijiensis, Phytophthora palmivora, Phytophthora ramorum, Penicillium sp., Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Rhizopus spp., Schizophyllum spp., Sclerotinia sclerotiorum, Stagnospora sp., Verticillium dahliae, ou Xanthomonas axonopodis. Em uma modalidade particularmente preferida, os métodos e materiais inventivos podem ser usados para suprimir o desenvolvimento de vários patógenos vegetais de importância comercial, incluindo os patógenos Fusarium graminearum NRRL-5883, Monographella nivalis ATCC MYA-3968, Gibberella zeae ATCC-16106, Stagnospora nodurum ATCC-26369, Colletotrichum graminicola ATCC-34167, e Penicillium sp.

Formulação de revestimento de sementes [0086] Em uma modalidade particularmente preferida, as composições microbianas da presente invenção são formuladas como um tratamento de sementes. Está previsto que as sementes podem ser substancialmente uniformemente revestidas com uma ou mais camadas das composições microbianas divulgadas neste documento usando métodos convencionais de mistura, pulverização ou uma combinação das mesmas através do uso de equipamento de aplicação de tratamento que é especificamente projetado e fabricado para aplicar com precisão, com segurança e de forma eficaz produtos de tratamento de sementes nas sementes. Esse equipamento usa vários tipos de tecnologia de revestimento tais como revestidores rotativos, revestidores de tambor, técnicas de leito fluidizado, leitos de jorro, névoas rotativas ou uma combinação dos mesmos. Tratamentos de sementes líquidos tais como aqueles da presente invenção podem ser aplicados através de um disco atomizador giratório ou um bocal de pulverização que distribui uniformemente o tratamento de sementes na

42/83 semente, conforme esta se move, apesar do padrão de pulverização. Preferencialmente, a semente é então misturada ou agitada por um período de tempo adicional para atingir a distribuição de tratamento adicional e secagem. As sementes podem ser preparadas ou não preparadas antes do revestimento com as composições inventivas para aumentar a uniformidade de germinação e emergência. Em uma modalidade alternativa, uma formulação de pó seco pode ser medida na semente em movimento e permitida misturar até ser completamente distribuída.

[0087] Outro aspecto da invenção fornece sementes tratadas com as composições microbianas em questão. Uma modalidade fornece sementes tendo pelo menos parte da área de superfície revestida com uma composição microbiológica de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade específica, as sementes tratadas com microorganismo têm uma concentração de esporos microbianos ou concentração de células microbianas de cerca de 10⁶ a cerca de 10⁹ por semente. As sementes também podem ter mais esporos ou células microbianas por semente, tais como, por exemplo, 10¹⁰, 10¹¹ ou 10¹² esporos por semente. Os esporos e/ou células microbianos podem ser revestidos livremente nas sementes ou, preferencialmente, podem ser formulados em uma composição sólida ou líquida antes de serem revestidos nas sementes. Por exemplo, uma composição sólida compreendendo os micro-organismos pode ser preparada misturando um transportador sólido com uma suspensão dos esporos até os transportadores sólidos serem impregnados com a suspensão de esporos ou células. Esta mistura pode, então, ser seca para obter as partículas desejadas.

[0088] Em algumas outras modalidades, está previsto que as composições microbianas sólidas ou líquidas da presente invenção adicionalmente contêm agentes funcionais capazes de proteger as

43/83 sementes dos efeitos nocivos de herbicidas seletivos tais como carvão ativado, nutrientes (fertilizantes), e outros agentes capazes de melhorar a germinação e a qualidade dos produtos ou uma combinação dos mesmos.

[0089] Métodos e composições de revestimento de sementes que são conhecidos na técnica podem ser particularmente úteis quando são modificados pela adição de uma das modalidades da presente invenção. Tais métodos de revestimento e aparelhos para sua aplicação são divulgados, por exemplo, nas Patentes U.S. N^os 5.918.413; 5.554.445; 5.389.399; 4.759.945; e 4.465.017.

Composições de revestimento de sementes são divulgadas, por exemplo, no Pedido de Patente U.S. N° US20100154299, Patentes U.S. N^os 5.939.356; 5.876.739, 5.849.320; 5.791.084, 5.661.103; 5.580.544, 5.328.942; 4.735.015; 4.634.587; 4.372.080, 4.339.456; e 4.245.432, entre outros.

[0090] Uma variedade de aditivos pode ser adicionada às formulações de tratamento de sementes compreendendo as composições inventivas. Aglutinantes podem ser adicionados e incluem aqueles compostos preferencialmente de um polímero adesivo que pode ser natural ou sintético sem efeito fitotóxico sobre a semente a ser revestida. O aglutinante pode ser selecionado a partir de acetatos de polivinila; copolímeros de acetato de polivinila; copolímeros de etileno vinil acetato (EVA); alcoóis de polivinila; copolímeros de álcool de polivinila; celuloses, incluindo etilceluloses, metilceluloses, hidroximetilceluloses, hidroxipropilceluloses e carboximetilcelulose; polivinilpirrolidonas; polissacarídeos, incluindo amido, amido modificado, dextrinas, maltodextrinas, alginato e quitosanas; gorduras; óleos; proteínas, incluindo a gelatina e zeínas; gomas arábicas; gomas-laca; cloreto de vinilideno e copolímeros de cloreto de vinilideno; lignossulfonatos de cálcio; copolímeros acrílicos;

44/83 polivinilacrilatos; óxido de polietileno; polímeros e copolímeros de acrilamida; acrilato de poli-hidroxietila, monômeros de metilacrilamida; e policloropreno.

[0091] Qualquer um de uma variedade de corantes pode ser empregado, incluindo os cromóforos orgânicos classificados como nitroso; nitro; azo, incluindo monoazo, bisazo e poliazo; acridina, antraquinona, azina, difenilmetano, indamina, indofenol, metina, oxazina, ftalocianina, tiazina, tiazol, triarilmetano, xanteno. Outros aditivos que podem ser adicionados incluem oligonutrientes tais como sais de ferro, manganês, boro, cobre, cobalto, molibdênio e zinco. Um polímero ou outro agente de controle de pó pode ser aplicado para manter o tratamento na superfície da semente.

[0092] Em algumas modalidades específicas, além das células ou esporos microbianos, o revestimento pode adicionalmente compreender uma camada de aderentes. O aderente deve ser não tóxico, biodegradável, e adesivo. Exemplos de tais materiais incluem, mas não estão limitados a, acetatos de polivinila; copolímeros de acetato de polivinila; alcoóis de polivinila; copolímeros de álcool de polivinila; celuloses, tais como metil celuloses, hidroximetil celuloses, e hidroximetil propil celuloses; dextrinas; alginatos; açúcares; melaços; polivinil pirrolidonas; polissacarídeos; proteínas; gorduras; óleos; gomas arábicas; gelatinas; xaropes; e amidos. Mais exemplos podem ser encontrados, por exemplo, na Patente U.S. N° 7.213.367 e Pedido de Patente U.S. N° US20100189693.

[0093] Vários aditivos, tais como aderentes, dispersantes, tensoativos, e nutriente e ingredientes tampão, também podem ser incluídos na formulação de tratamento de sementes. Outros aditivos de tratamento de sementes convencionais incluem, mas não estão limitados a, agentes de revestimento, agentes umectantes, agentes tamponantes, e polissacarídeos. Pelo menos um transportador

45/83 agronomicamente aceitável pode ser adicionado à formulação de tratamento de sementes tais como água, sólidos ou pós secos. Os pós secos podem ser derivados de uma variedade de materiais tais como carbonato de cálcio, gesso, vermiculita, talco, húmus, carvão ativado, e vários compostos de fósforo.

[0094] Em alguma modalidade, a composição de revestimento de sementes pode compreender pelo menos um preenchimento que é um componente orgânico ou inorgânico, natural ou sintético, com o qual os componentes ativos são combinados para facilitar a sua aplicação na semente. Preferencialmente, o preenchimento é um sólido inerte tais como argilas, silicatos naturais ou sintéticos, sílica, resinas, ceras, fertilizantes sólidos (por exemplo, sais de amônio), minerais naturais do solo, tais como caulins, argilas, talco, cal, quartzo, atapulgita, montmorillonita, bentonita ou terras diatomáceas, ou minerais sintéticos, tais como sílica, alumina ou silicatos, em particular silicatos de alumínio ou magnésio.

[0095] A formulação de tratamento de sementes pode adicionalmente incluir um ou mais dos seguintes ingredientes: outros pesticidas, incluindo compostos que agem apenas abaixo do solo; fungicidas, tais como captan, thiram, metalaxil, fludioxonil, oxadixil, e isômeros de cada um desses materiais, e similares; herbicidas, incluindo compostos selecionados a partir de glifosato, carbamatos, tiocarbamatos, acetamidas, triazinas, dinitroanilinas, glicerol éteres, piridazinonas, uracilas, fenóxis, ureias, e ácidos benzoicos; protetores de herbicidas tais como benzoxazina, derivados de benzidrila, N,Ndialil dicloroacetamida, vários compostos de di-haloacila, oxazolidinila e tiazolidinila, etanona, compostos de anidrido naftálico, e derivados de oxima; fertilizantes químicos; fertilizantes biológicos; e agentes de biocontrole, tais como outras bactérias recombinantes ou de ocorrência natural e fungos dos gêneros Rhizobium, Bacillus,

46/83

Pseudomonas, Serratia, Trichoderma, Glomus, Gliocladium e fungos micorrízicos. Estes ingredientes podem ser adicionados como uma camada separada sobre a semente ou, alternativamente, podem ser adicionados como parte da composição de revestimento de sementes da invenção.

[0096] Preferencialmente, a quantidade da nova composição ou outros ingredientes usados no tratamento de sementes não deve inibir a germinação da semente, ou causar danos fitotóxicos à semente.

[0097] A formulação que é usada para tratar a semente na presente invenção pode estar sob a forma de uma suspensão; emulsão; pasta fluida de partículas no meio aquoso (por exemplo, água); pó molhável; grânulos molháveis (seco fluível); e grânulos secos. Se formulada como uma suspensão ou pasta fluida, a concentração do ingrediente ativo na formulação é preferencialmente de cerca de 0,5% a cerca de 99% em peso (p/p), preferencialmente de 5 a 40% ou como de outra forma formulada por aqueles versados na técnica.

[0098] Conforme mencionado acima, outros ingredientes inativos ou inertes convencionais podem ser incorporados na formulação. Tais ingredientes inertes incluem, mas não estão limitados a: agentes de aderência convencionais; agentes dispersantes tal como metilcelulose, por exemplo, servem como agentes dispersantes/de aderência combinados para uso em tratamentos de sementes; álcool de polivinila; lecitina, dispersantes poliméricos (por exemplo, polivinilpirrolidona/acetato de vinila); espessantes (por exemplo, espessantes de argila para melhorar a viscosidade e reduzir a sedimentação de suspensões de partículas); estabilizantes de emulsão; tensoativos; compostos anticongelantes (por exemplo, ureia), tintas, corantes, e similares. Além disso, ingredientes inertes úteis na presente invenção podem ser encontrados em McCutcheon's, vol. 1,

47/83

Emulsifiers and Detergents, MC Publishing Company, Glen Rock,

N.J., U.S.A., 1996. Ingredientes inertes adicionais úteis na presente invenção podem ser encontrados em McCutcheon's, vol. 2, Functional Materials, MC Publishing Company, Glen Rock, N.J., U.S.A., 1996.

[0099] As formulações de revestimento da presente invenção podem ser aplicadas às sementes por uma variedade de métodos, incluindo, mas não limitados a, mistura em um recipiente (por exemplo, uma garrafa ou saco), aplicação mecânica, agitação, pulverização, e imersão. Uma variedade de material ativo ou inerte pode ser usada para colocar em contato sementes com composições microbianas de acordo com a presente invenção, tais como materiais de revestimento de película convencionais, incluindo, mas não limitados a, materiais de revestimento de película à base de água tais como SEPIRET™ (Seppic, Inc., N.J.) e OPACOAT™ (Berwind Pharm. Services, P.A.).

[00100] A quantidade de uma composição de acordo com a presente invenção que é usada para o tratamento da semente variará dependendo do tipo de semente e do tipo de ingredientes ativos, mas o tratamento compreenderá colocar em contato as sementes com uma quantidade agronomicamente eficaz da composição inventiva. Conforme discutido acima, uma quantidade eficaz significa que a quantidade da composição inventiva é suficiente para afetar resultados benéficos ou desejados. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações.

[00101] Além da camada de revestimento, as sementes podem ser tratadas com um ou mais dos seguintes ingredientes: outros pesticidas incluindo fungicidas e herbicidas; protetores de herbicidas; fertilizantes e/ou agentes de biocontrole. Estes ingredientes podem ser adicionados como uma camada separada ou alternativamente podem ser adicionados na camada de revestimento.

[00102] As formulações de revestimento de sementes da presente

48/83 invenção podem ser aplicadas às sementes usando uma variedade de técnicas e máquinas, tais como técnicas de leito fluidizado, o método de moinho de rolo, desinfetantes de semente rotostáticos, e revestidores de tambor. Outros métodos, tais como leitos de jorro também podem ser úteis. As sementes podem ser pré-dimensionadas antes do revestimento. Após o revestimento, as sementes são normalmente secas e então transferidas para uma máquina de dimensionamento para o dimensionamento. Tais procedimentos são conhecidos na técnica.

[00103] Sementes tratadas por micro-organismo também podem ser envolvidas com um sobrerrevestimento de película para proteger o revestimento. Esses sobrerrevestimentos são conhecidos na técnica e podem ser aplicados usando leito fluidizado e técnicas de revestimento de película por tambor.

[00104] Em outra modalidade da presente invenção, as composições de acordo com a presente invenção podem ser introduzidas em uma semente pelo uso de iniciação de matriz sólida. Por exemplo, uma quantidade de uma composição inventiva pode ser misturada com um material de matriz sólida e em seguida a semente pode ser colocada em contato com o material de matriz sólida por um período para permitir que a composição seja introduzida na semente. A semente pode, em seguida, opcionalmente, ser separada do material de matriz sólida e armazenada ou usada, ou a mistura de material de matriz sólida mais as sementes pode ser armazenada ou plantada diretamente. Materiais de matriz sólida que são úteis na presente invenção incluem poliacrilamida, amido, argila, sílica, alumina, solo, areia, poliureia, poliacrilato, ou qualquer outro material capaz de absorver ou adsorver a composição inventiva por um tempo e liberar essa composição dentro da ou na semente. É útil certificar-se se a composição inventiva e o material de matriz sólida são

49/83 compatíveis uns com os outros. Por exemplo, o material de matriz sólida deve ser escolhido de modo que ele possa liberar a composição a uma taxa razoável, por exemplo, durante um período de minutos, horas, ou dias.

[00105] Em princípio, qualquer semente de planta capaz de germinar para formar uma planta pode ser tratada em conformidade com a invenção. Sementes adequadas incluem aquelas de cereais, café, colheitas de Brassica, colheitas de fibra, flores, frutas, leguminosas, oleaginosas, árvores, colheitas de tubérculos, vegetais, bem como outras plantas das espécies monocotiledôneas e dicotiledôneas. Preferencialmente, as sementes de colheita que são revestidas incluem, mas não estão limitadas a, sementes de feijão, cenoura, milho, algodão, gramíneas, alface, amendoim, pimenta, batata, canola, arroz, centeio, sorgo, soja, beterraba, girassol, tabaco e tomate. Preferencialmente, sementes de cevada ou trigo (trigo de primavera ou trigo de inverno) são revestidas com as presentes composições.

Preparação das composições microbianas de acordo com a presente invenção [00106] As culturas dos micro-organismos podem ser preparadas para uso nas composições microbianas da invenção usando técnicas de fermentação líquida e secagem estática padrão conhecidas na técnica. O crescimento é comumente realizado em um biorreator.

[00107] Um biorreator se refere a qualquer dispositivo ou sistema que suporte um ambiente biologicamente ativo. Conforme descrito neste documento um biorreator é um receptáculo em que microorganismos incluindo o micro-organismo da invenção podem ser crescidos. Um biorreator pode ser de qualquer formato ou tamanho apropriado para o crescimento de micro-organismos. Um biorreator pode variar de tamanho e escala de 10 mL por metros cúbicos de litro

50/83 e pode ser feito de aço inoxidável ou qualquer outro material apropriado, conforme conhecido e usado na técnica. O biorreator pode ser um biorreator tipo batelada, um biorreator tipo batelada alimentado ou um tipo contínuo (por exemplo, um reator agitado contínuo). Por exemplo, um biorreator pode ser um quimiostato conforme conhecido e usado na técnica de microbiologia para o crescimento e colheita de micro-organismos. Um biorreator pode ser obtido de qualquer fornecedor comercial (Vide também Bioreactor System Design, Asenjo & Merchuk, CRC Press, 1995).

[00108] Para operações de pequena escala, um biorreator de batelada pode ser usado, por exemplo, para testar e desenvolver novos processos, e para processos que não podem ser convertidos em operações contínuas.

[00109] Os micro-organismos cultivados em um biorreator podem ser suspensos ou imobilizados. O crescimento no biorreator é geralmente sob condições aeróbicas a temperaturas e pH adequados para o crescimento. Para os organismos da invenção, o crescimento celular pode ser obtido a temperaturas entre 5 e 37°C, com a temperatura preferida sendo na faixa de 15 a 30°C, de 15 a 28°C, 20 a 30°C, ou 15 a 25°C. O pH do meio nutritivo pode variar entre 4,0 e 9,0, mas a faixa de operação preferida é geralmente ligeiramente acídica à neutra em pH 4,0 a 7,0, ou 4,5 a 6,5, ou pH 5,0 a 6,0. Normalmente, o rendimento celular máximo é obtido em 20 a 72 horas após a inoculação.

[00110] Condições ideais para o cultivo dos micro-organismos desta invenção, certamente, dependerá da cepa específica. No entanto, em virtude das condições aplicadas no processo de seleção e requisitos gerais da maioria dos micro-organismos, uma pessoa versada na técnica seria capaz de determinar as condições e nutrientes essenciais. Os micro-organismos normalmente seriam crescidos em

51/83 culturas líquidas aeróbicas em meios que contêm fontes de carbono, nitrogênio, e sais inorgânicos que podem ser assimilados pelos microorganismos e favoráveis ao crescimento celular eficaz. Fontes de carbono preferidas são hexoses, tais como a glicose, mas outras fontes que são facilmente assimiladas tais como aminoácidos, podem ser substituídas. Muitos materiais inorgânicos e proteicos podem ser usados como fontes de nitrogênio no processo de crescimento. Fontes de nitrogênio preferidas são aminoácidos e ureia, mas outros incluem amônia gasosa, sais inorgânicos de nitrato e amônio, vitaminas, purinas, pirimidinas, extrato de levedura, extrato de carne, peptona proteose, farinha de soja, hidrolisados de caseína, solúveis em destilador, e similares. Entre os minerais inorgânicos que podem ser incorporados no meio nutritivo são sais habituais capazes de produzir cálcio, zinco, ferro, manganês, magnésio, cobre, cobalto, potássio, sódio, molibdato, fosfato, sulfato, cloreto, borato, e íons similares. Sem se limitar aos mesmos, o uso de meio líquido de batata dextrose para cepas fúngicas e pré-mistura de caldo R2A para cepas bacterianas é preferido.

Novas variedades de planta [00111] Além disso, é fornecida, em outro aspecto da presente invenção, uma nova planta criada artificialmente introduzindo um endófito microbiano da invenção em uma planta que é livre de microorganismos endofíticos. Em algumas modalidades deste aspecto, o endófito microbiano introduzido na planta pode ser um microorganismo endofítico tendo uma atividade de promoção do crescimento de planta, uma atividade de controle biológico, ou uma combinação de ambas as atividades. Uma variedade de métodos anteriormente considerados eficazes para a introdução de um endófito microbiano nas espécies de gramínea de cereal é conhecida na técnica. Exemplos de tais métodos incluem aqueles descritos no

52/83

Pedido de Patente U.S. N° 20030195117A1, Pedido de Patente U.S. N° 20010032343A1, e Patente U.S. N° 7.084.331, entre outros. Se tornará aparente para aqueles versados na técnica que muitos dos métodos acima mencionados podem ser úteis para a produção de uma nova planta da invenção.

[00112] Após a infecção artificial, é preferível que uma sequência de DNA do micro-organismo endofítico isolado seja amplificada por PCR e o endófito seja confirmado pela realização de uma busca de homologia para a sequência de DNA amplificada. Além disso, é preferível que um gene estrangeiro que expressa meios identificáveis seja introduzido no micro-organismo endofítico mencionado acima, e a presença da colonização do micro-organismo endofítico mencionado acima que infecta a planta seja confirmada pelos meios identificáveis acima usando o gene estrangeiro.

Plantas adequadas para os métodos da invenção [00113] Em princípio, os métodos e as composições de acordo com a presente invenção podem ser implantados para qualquer espécie de planta. Plantas monocotiledôneas, bem como plantas dicotiledôneas são particularmente adequadas. Os métodos e composições são preferencialmente usados com plantas que são importantes ou interessantes para agricultura, horticultura, para a produção de biomassa usada na produção de moléculas de combustível líquido e outros produtos químicos, e/ou florestais.

[00114] Desse modo, a invenção tem uso sobre uma ampla gama de plantas, preferencialmente plantas superiores pertencentes às classes de Angiospermae e Gymnospermae. Plantas das subclasses de Dicotylodenaee de Monocotyledonae são particularmente adequadas. Plantas dicotiledôneas pertencem às ordens das Aristochiales, Asterales, Batales, Campanulales, Capparales, Caryophyllales, Casuarinales, Celastrales, Cornales, Diapensales,

53/83

Dilleniales, Dipsacales, Ebenales, Ericales, Eucomiales, Euphorbiales, Fabales, Fagales, Gentianales, Geraniales, Haloragales, Hamamelidales, Illiciales, Juglandales, Lamiales, Laurales, Lecythidales, Leitneriales, Magniolales, Malvales, Myricales, Myrtales, Nymphaeales, Papeverales, Piperales, Plantaginales, Plumbaginales, Podostemales, Polemoniales, Polygalales, Polygonales, Primulales, Proteales, Rafflesiales, Ranunculales, Rhamnales, Rosales, Rubiales, Salicales, Santales, Sapindales, Sarraceniaceae, Scrophulariales, Theales, Trochodendrales, Umbellales, Urticales, e Violales. Plantas monocotiledôneas pertencem às ordens das Alismatales, Arales, Arecales, Bromeliales, Commelinales, Cyclanthales, Cyperales, Eriocaulales, Hydrocharitales, Juncales, Lilliales, Najadales, Orchidales, Pandanales, Poales, Restionales, Triuridales, Typhales, e Zingiberales. As plantas pertencentes à classe das Gymnospermae são Cycadales, Ginkgoales, Gnetales, e Pinales.

[00115] Espécies adequadas podem incluir membros do gênero Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale,

54/83

Triticum, Uniola, Veratrum, Vinca, Vitis, e Zea.

[00116] Os métodos e as composições da presente invenção são usados preferencialmente em plantas que são importantes ou interessantes para agricultura, horticultura, biomassa para a produção de moléculas de biocombustíveis e outros produtos químicos, e/ou florestais. Exemplos não limitantes incluem, por exemplo, Panicum virgatum (switchgrass), Sorghum bicolor (sorgo, Capim Sudão), Miscanthus giganteus (miscanto), Saccharum sp. (cana energética), Populus balsamifera (choupo), Zea mays (milho), Glycine max (soja), Brassica napus (canola), Triticum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (algodão), Oryza sativa (arroz), Helianthus annuus (girassol), Medicago sativa (alfafa), Beta vulgaris (beterraba sacarina), Pennisetum glaucum (milheto), Panicum spp., Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Andropogon gerardii (bluestem grande), Pennisetum purpureum (capim-elefante), Phalaris arundinacea (capim-amarelo), Cynodon dactylon (grama-bermudas), Festuca arundinacea (festuca alta), Spartina pectinata (espartina da pradaria), Arundo donax (cana gigante), Secale cereale (centeio), Salix spp. (salgueiro), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale spp. (triticum--trigo X centeio), Bamboo, Carthamus tinctorius (açafrão), Jatropha curcas (Jatropha), Ricinus communis (rícino), Elaeis guineensis (dendezeiro), Phoenix dactylifera (tamareira), Archontophoenix cunninghamiana(palmeira real), Syagrus romanzoffiana (jerivá), Linum usitatissimum (linho), Brassica juncea, Manihot esculenta (mandioca), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca saliva (alface), Musa paradisiaca (banana), Solanum tuberosum (batata), Brassica oleracea (brócolis, couve-flor, couve de bruxelas), Camellia sinensis (chá), Fragaria ananassa (morango), Theobroma cacao (cacau), Coffea arabica(café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (abacaxi), Capsicum annum (pimenta e pimentão),

55/83

Allium cepa (cebola), Cucumis melo (melão), Cucumis sativus (pepino), Cucurbita maxima (abóbora-menina), Cucurbita moschata (abóbora), Spinacea oleracea (espinafre), Citrullus lanatus (melancia), Abelmoschus esculentus (quiabo), Solanum melongena (berinjela), Papaver somniferum (papoula de ópio), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis saliva, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Coichicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Dioscorea spp., Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum (Huperzia serrata), Lycopodium spp., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp., Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, Tanacetum parthenium, Parthenium argentatum (guaiúle), Hevea spp. (borracha), Mentha spicata (menta), Mentha piperita (menta), Bixa orellana, Alstroemeria spp., Rosa spp. (rosa), Dianthus caryophyllus (cravo), Petunia spp. (Petúnia), Poinsettia pulcherrima (poinsétia) Nicotiana tabacum (tabaco), Lupinus albus (tremoceiro), Uniola paniculata (aveia), bentgrass (Agrostis spp.), Populus tremuloides (aspen), Pinus spp. (pinho), Abies spp. (abeto), Acer spp. (bordo), Hordeum vulgare (cevada), Poa pratensis (gramíneas), Lolium spp. (azevém), Phleum pratense (capim-derebanho), e coníferas. De interesse são plantas cultivadas para a produção de energia, assim chamadas de culturas energéticas, tais como as culturas de energia baseada em celulose como Panicum virgatum (switchgrass) Sorghum bicolor (sorgo, Capim Sudão), Miscanthus giganteus (miscanto), Saccharum sp. (cana energética), Populus balsamifera (choupo), Andropogon gerardii (bluestem grande), Pennisetum purpureum (capim-elefante), Phalaris arundinacea (capim

56/83 amarelo), Cynodon dactylon (grama-bermudas), Festuca arundinacea (festuca alta), Spartina pectinata (espartina da pradaria), Medicago sativa (alfafa), Arundo donax (cana gigante), Secale cereale (centeio), Salix spp. (salgueiro), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale spp. (triticum - trigo X centeio) e Bamboo; e culturas energéticas à base de amido como Zea mays (milho) e Manihot esculenta (mandioca); e culturas energéticas à base de açúcar como Saccharum sp. (cana de açúcar), Beta vulgaris (beterraba sacarina), e Sorghum bicolor (L.) Moench (sorgo sacarino); e culturas energéticas de produção de biocombustível como Glycine max (soja), Brassica napus (canola), Helianthus annuus (girassol), Carthamus tinctorius (açafrão), Jatropha curcas (Jatropha), Ricinus communis (rícino), Elaeis guineensis (palmeira de óleo Africana), Elaeis oleifera(palmeira de óleo americana), Cocos nucifera (coco), Camelina sativa (linho selvagem), Pongamia pinnata (Pongam), Olea europaea (oliveira), Linum usitatissimum (linho), Crambe abyssinica (Abyssinian-kale), e Brassica juncea.

[00117] A discussão sobre os métodos gerais dados aqui destina-se apenas a fins ilustrativos. Outros métodos alternativos e modalidades serão aparentes para aqueles versados na técnica após revisão desta descrição, e devem ser incluídos dentro do espírito e do alcance deste pedido.

[00118] Também deve ser entendido que os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, mas não limitar, a invenção.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: Isolamento do micro-organismo de amostras ambientais [00119] Identificação de rizobactérias formadoras de esporos usando um método de diluições em série e raízes sonicadas. Os seguintes micro-organismos foram isolados usando um método de raízes sonicadas, diluições em série, conforme descrito abaixo: os

57/83 isolados SGI-026-G06 e SGI-026-G07, que foram isolados a partir de uma amostra de grama tipo agulha; o isolado SGI-041-B03, que foi isolado a partir de uma amostra de centeio selvagem; e o isolado SGI020-A01, que foi isolado de tecidos de raiz de trigo cultivados em uma amostra de solo de compósito.

[00120] Um procedimento de enriquecimento foi desenvolvido para identificar especificamente rizobactérias formadoras de esporos. Brevemente, extratos de raiz sonicada foram tratados com calor para matar as células vegetativas e, então, banhados em um meio rico. Micro-organismos que sobreviveram ao tratamento térmico e formaram colônias foram considerados formadores de esporos. Esse método foi considerado ser particularmente eficaz para a seleção de bactérias Gram-positivas. Raízes recém-amostradas foram usadas como material de partida para estes avanços. Cortes finos encontrados na ponta das raízes são os mais jovens, podem ter uma alta densidade de pêlo radicular, e geralmente têm altas densidades de rizobactérias. Uma lâmina estéril foi usada para cortar estas áreas das raízes em segmentos de 5 a 10 cm, que foram, em seguida, lavados debaixo de água milliQ estéril para remover as partículas de solo grandes. Quando necessário, uma lavagem mais rigorosa foi realizada colocando as raízes em um tubo Falcon de 50 mL com 25 mL 1 e de solução salina tamponada com fosfato estéril (isto é, tampão PBS) e colocando em vórtex durante 1 minuto. Cada amostra de raiz foi posteriormente suspensa em 20 mL de tampão PBS estéril e sonicada em gelo por dois intervalos de 1 minuto a 8 watts usando um Fisher Scientific Sonic Dismembrator. Para tratamento térmico, normalmente 1 mL de suspensão de células de raiz sonicada foi transferido para um tubo Eppendorf estéril incubado em um banho de água a 80°C durante 20 minutos. As suspensões celulares tratadas com calor foram permitidas arrefecer à temperatura ambiente antes de serem

58/83 serialmente diluída a concentrações de 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, e 10^-7. 100 μL de cada diluição de 10 vezes foram espalhados em placas de cultura contendo um meio microbiológico solidificado com ágar e 100 mg/L de ciclo-heximida para inibir o crescimento de fungos. Em alguns casos, foi necessário realizar uma diluição de 1/10 ou 1/100 antes do chapeamento a fim de obter a densidade de CFU adequada para a colheita de colônia. Colônias isoladas foram escolhidas usando pontas de pipetas estéreis, dispostas em placas de microtitulação de 96 poços cada uma contendo 150 μL 2 e de meio líquido de YT por poço. As placas de microtitulação foram incubadas durante 1 a 2 dias a 30°C a fim de obter uma célula de alta densidade para caracterização adicional e arquivamento.

[00121] Isolamento de bactérias formadoras de biopelícula. Os seguintes isolados microbianos foram isolados usando um método formador de biopelícula conforme descrito abaixo: o isolado SGI-003H11, que foi isolado a partir de uma amostra de raiz de planta Yucca; o isolado SGI-034-C09 isolado, que foi isolado a partir de uma amostra de raiz de grama; e o isolado SGI-034-E10, que foi a partir de uma amostra de planta de Laço da Rainha Anne.

[00122] Método formador de biopelícula: Neste procedimento, as bactérias formadoras de biopelícula foram isoladas de segmentos de raiz sonicada, conforme descrito por Fall et al. (Syst. Appl. Microbiol. 27.372-379, 2004). Conforme descrito acima, as bactérias que formam biopelículas na superfície de uma raiz são normalmente bactérias de colonização de raiz muito boas. Em geral, quando tais bactérias estão presentes em altas densidades, elas podem ter uma influência significativa sobre a saúde da planta e podem competitivamente excluir patógenos invasores. Brevemente, a sonicação foi usada para remover as células bacterianas e fúngicas ligeiramente associadas à raiz, deixando para trás apenas os micróbios que foram fortemente

59/83 aderidos à superfície da raiz. Ambas as bactérias formadoras de biopelícula Gram-positivas e Gram-negativas foram selecionadas usando esse método.

[00123] Raízes recém-amostradas foram usadas como material de partida para estes avanços. Cortes finos encontrados na ponta das raízes eram os tecidos mais jovens, tinham uma alta densidade de pelo radicular, e geralmente tinham altas densidades de rizobactérias. Uma lâmina estéril foi usada para cortar estas áreas das raízes em segmentos de 5 a 10 cm, que em seguida foram lavados, colocandoos em um tubo Falcon de 50 mL com 25 mL 1 e de PBS e colocando em vórtex por 1 minuto. Os detritos da lavagem foram permitidos repousar, e então uma pinça estéril foi usada para transferir os segmentos de raiz lavados em tubos Falcon de 50 mL preenchidos com 25 mL 1e de PBS, e sonicados em gelo usando um Fisher Scientific Sonic Dismembrator por dois intervalos de 30 segundos com uma pausa de 30 segundos entre os impulsos. As amostras de raiz sonicada foram transferidas para placas de Petri de plástico estéreis e permitidas secar completamente sem tampas dentro de uma cabine de biossegurança. Cada segmento de raiz foi então colocado em uma placa de CMA separada contendo 1% de ágar (10 g/L de digerido de caseína, 10 g/L de manitol, 10 g/L de ágar). De vez em quando, uma pinça estéril foi usada para empurrar o segmento de raiz para os meios de ágar. As placas foram posteriormente incubadas a 37°C e monitoradas para o crescimento microbiano. Normalmente após 1 a 2 dias, múltiplos crescimentos microbianos emergiram a partir da raiz e para os meios de CMA. Uma ponta da pipeta estéril foi usada para escolher crescimentos com morfologias exclusivas ao longo do segmento e cada um destes crescimentos foi transferido para o centro de uma placa de CMA contendo 0,3% de agarose. As placas de CMA foram posteriormente incubadas durante 1 a 2 dias a 37°C e

60/83 monitoradas para o crescimento. Normalmente, isolados formadores de biopelícula exibiram crescimento dendrítico neste meio.

[00124] Um loop estéril foi usado para transferir a biomassa e purificar por faixa cada isolado das placas de CMA em placas de CMKA (2% de ágar, 1,2 g/L de K2HPO4). O meio de CMKA restringe o crescimento de biopelícula e permite a escolha de colônias individuais para o arquivamento.

EXEMPLO 2: Crescimento e armazenamento de isolados microbianos [00125] As bactérias isoladas foram armazenadas como uma cultura pura. Uma colônia bacteriana foi transferida para um frasco contendo meio líquido de caldo R2A (Tecknova) e permitida crescer a 30°C, com agitação a 250 rpm por dois dias. A cultu ra foi então transferida para frascos contendo 15% de glicerol e armazenada a 80°C.

EXEMPLO 3: Extração de DNA, Sequenciamento e Taxonomia [00126] Uma alíquota de 20 pl de suspensão de células bacterianas foi transferida para uma placa de PCR de 96 poços contendo 20 pl de um tampão de 2x lise (100 mM de Tris HCL, pH 8,0, 2 mM de EDTA, pH 8,0, 1% de SDS, 400 pg/mL de Proteinase K). As condições de Lise eram como segue: Incubação a 55°C durante 30 m inutos, seguida de incubação a 94°C por 4 minutos. Uma alíquota do produto de lise foi usada como a fonte do modelo de DNA para amplificação por PCR.

[00127] Para a amplificação da região de 16S rRNA, cada mistura de PCR foi preparada em uma reação de volume final de 20 pl contendo 4 pl da reação da lise bacteriana, 2 μΜ de cada iniciador de PCR, 6% de Tween-20, e 10 μl de 2 x ImmoMix (Bioline USA Inc, Taunton, MA). Os iniciadores usados para amplificação por PCR foram M13-27F

5-TGTAAAACGACGGCCAGTTAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

61/83

SEQ ID NO: 8) e 1492R de cauda de M13 (5'CAGGAAACAGCTATGACCGGTTACCTTGTTACGACTT-3'; SEQ ID NO: 9). A PCR foi realizada em um termociclador pessoal PTC-200 (MJ-Research, MA, EUA) como segue: 94°C por 10 minutos; 94°C por 30 segundos, 52°C por 30 segundos, 72°C por 75 segu ndos para 30 ciclos; 72°C por 10 minutos. Uma alíquota de 2 pl de cada produto de PCR foi executada em um gel de agarose de 1,0% para confirmar uma única banda do tamanho esperado. Bandas positivas foram isoladas, purificadas, e submetidas a sequenciamento de PCR. O sequenciamento foi realizado em direções de iniciação avançada e reversa por J. Craig Venter Institute em San Diego, na Califórnia, usando 454 tecnologias.

[00128] A busca por homologia para a sequência de nucleotídeos determinada foi conduzida usando o banco de dados de DDBJ/GenBank/EMBL. Posteriormente, a relação filogenética da sequência de nucleotídeos dos genes 16 rRNA foi analisada entre as cepas bacterianas isoladas descritas aqui, bactérias dos gêneros e espécies que apresentam altas homologias de sequência para as cepas bacterianas isoladas, e outras grandes variedades de gêneros e espécies bacterianos, usando o programa de construção de árvore filogenética ClustalW. Identidade e similaridade de sequência foram também determinadas usando o software GenomeQuest™ (Gene-IT, Worcester Mass. EUA). O resultado da análise de sequência revelou que os isolados de bactéria SGI-003_H11, SGI-020_A01, SGI026_G06, SGI-026_G07, SGI-034_C09, SGI-034_E10, SGI-041_B03 podem ser considerados estar relacionados à espécie de Pantoea agglomerans, Bacillus thuringiensis, Burkholderia metallica, Burkholderia vietnamiensis, Bacillus pumilus, Herbaspirillum sp., Pedobacter sp., respectivamente, com base em homologias de sequência de >98% de cada uma das sequências de 16 rRNA para os

62/83 respectivos micro-organismos.

EXEMPLO 4: Características bioquímicas dos Isolados Bacterianos [00129] As bactérias isoladas foram adicionalmente estudadas para propriedades importantes em sua interação com as plantas. As propriedades estudadas incluem a fixação de nitrogênio, secreção de sideróforo, solubilização de fósforo inorgânico, produção de ácido 1aminociclopropano-1-carboxílico (ACC) deaminase, produção de 2,3butanodiol, e a produção de auxina de hormônio de crescimento de planta. Os resultados de ensaios bioquímicos in vitro são mostrados na Tabela 2.

Fixação de nitrogênio:

[00130] Suspensões celulares bacterianas foram estiradas em um meio sólido, com a seguinte composição que não incluiu uma fonte de nitrogênio: KOH 4,0 g/L; K₂HPO₄ 0,5 g/L; MgSO<7H₂O 0,2 g/L; NaCl 0,1 g/L; CaCl₂ 0,02 g/L; FeSO<7H₂O 0,005 g/L; NaMoO4^2H₂O 0,002 g/L; MnSO4YH₂O 0,01 g/L; Ácido málico 5,0 g/L; Goma de Gellan 0,1 a 1,0 g/L; e opcionalmente, 0,5% v/v de azul de Bromotimol, pH 7,0. Concentrações de goma de Gellan ou ágar podem variar conforme necessário para atingir a espessura média desejada; normalmente usou-se 0,5 g/L. As camadas foram incubadas a 30^oC por 2 a 5 dias. Estas placas foram monitoradas diariamente e colônias foram selecionadas conforme elas apareceram. Em alguns casos, períodos de crescimento longos (até duas semanas ou mais) permitiram a captura dos isolados de crescimento mais lento. Estas placas de camada foram normalmente escolhidas por colônia usando 20 ou 200 pl de pontas de pipetas de barreira de aerossol em placas de cultura de células de 96 poços preenchidas com 150 μ l/poço de meio 2YT. Alternativamente, os isolados foram escolhidos por colônia de placas diretamente em meio livre de N para confirmar suas habilidades de crescimento livre de N. Os resultados, como resumidos na Tabela 2,

63/83 indicam que somente o isolado SGI-026-G07 mostrou atividade de fixação de nitrogênio a um nível detectável.

Secreção de sideróforo:

[00131] Este ensaio foi usado para identificar isolados bacterianos que estavam produzindo sideróforos, que são compostos quelantes de Fe³⁺ de alta afinidade, in vitro. Normalmente, os isolados microbianos foram cultivados em um meio mínimo, que era essencialmente livre de Fe. Todos os produtos de vidro usados ao longo deste ensaio foram lavados com ácido e enxaguados três vezes com água milliQ para remover Fe residual que pode alterar os resultados do ensaio. A composição do meio de MM9 foi a seguinte: K₂HPO₄ 0,5 g/L; NH₄Cl 1,0 g/L; MgSO<H₂O 0,2 g/L; NaCl 0,5 g/L; Tampão de TUBOS 7,55 g/L; Glicose 10,0 g/L; Ácido Glucônico 2,5 g/L; Ácido Málico 2,5 g/L; Ácidos de Casamino 0,5 g/L. O meio foi ajustado para pH 7,0 com 5N de KOH, e esterilizado usando um filtro de 0,2 μΜ (Corning).

[00132] Este ensaio foi normalmente executado em um formato de alta produtividade usando uma estação de manipulação de líquido Beckman FX e placas de cultura de células de 96 poços com 150 μL de meio de crescimento de MM9 por poço. Culturas e meios foram distribuídos e transferidos assepticamente usando uma ferramenta de precisão autoclavável sob uma capa de fluxo laminar. Após a transferência, as culturas foram incubadas a 30^oC por 5 dias. Após a incubação, os sobrenadantes de cultura foram colhidos através de centrifugação usando uma placa de filtro de 0,22 μΜ de 96 poços. Dez microlitros de sobrenadante filtrado foram transferidos de cada poço para uma placa de ensaio Falcon. Uma curva padrão foi preparada usando desferrioxamina (DFO) diluída no meio de MM9. Duzentos microlitros da solução de ensaio de CAS [10 mM de HDTMA, Fe(III)Solução: 1 mM de FeCl₃.6H2O, 10 mM de HCl, 2 mM de CAS] foram adicionados a cada um dos sobrenadantes e poços padrão, seguidos

64/83 de incubação à temperatura ambiente por 20 a 30 minutos. A absorvância da solução de ensaio de CAS azul em 630 nm (SpectroMax M2) é inversamente proporcional à concentração de sideróforo em cada poço (isto é, a solução de ensaio deve mudar para um laranja intenso, com maiores quantidades de sideróforos). Solubilização de fósforo inorgânico:

[00133] A capacidade dos isolados microbianos de solubilizar fosfato mineral in vitro foi avaliada como segue. Bactérias a serem testadas foram estiradas no meio de crescimento de fosfato de ágar [Hidroxilapatita - Ca₁₀(PO₄)₅(OH)₂ 5,0 g/L; NH₄Cl 1,0 g/L; MgSO₄-H₂O 0,2 g/L; NaCl 0,5 g/L; FeSO₄-7H₂O 0,01 g/L; Na₂MoO₄-7H₂O 0,01 g/L; MnSO₄-7H₂O 0,01 g/L; Glicose 5,0 g/L; Ácido Glucônico 2,5 g/L; Ácido Málico 2,5 g/L; Ácidos Casamino 0,5 g/L; Goma de Gellan 20,0 g/L; pH 7,2)], e seu crescimento foi monitorado diariamente. O meio de cultura tinha uma aparência opaca, devido à presença de fosfato de cálcio. O crescimento bacteriano e a perda da cor do meio seriam observados se as bactérias tivessem capacidade de dissolução de fosfato de cálcio. Isolados tendo a capacidade de solubilizar o fosfato de fase mineral produziriam um halo claro no meio opaco ao redor da colônia. Como resumido na Tabela 2, a capacidade de solubilizar fosfato mineral não foi detectável em qualquer um dos micro-organismos testados, conforme determinado pelo ensaio in vitro descrito aqui. Produção de ACC deaminase:

[00134] Um dos principais mecanismos utilizados por rizobactérias promotoras do crescimento de planta (PGPM) para facilitar o crescimento e o desenvolvimento da planta é a redução dos níveis de etileno pela desaminação de ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC), o precursor imediato de etileno em plantas. ACC deaminase catalisa a hidrólise de ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC) em α-cetobutirato e amônia. A presença do produto de α-cetobutirato

65/83 pode, então, ser determinada indiretamente através de uma reação com 2, 4-dinitrofenilhidrazina em HCl para formar um derivado de fenilhidrazona. Após a adição de NaOH, a quantidade de fenihidrazona na solução pode ser determinada espectrofotometricamente medindo a absorbância a 540 nm (Penrose and Glick, Physiol Plant. May; 118:10-1, 2003). Este ensaio foi executado normalmente em um formato de alta produtividade usando placas de cultura de células de 96 poços. Cada poço continha 150 pL de meio de crescimento de sais de DF suplementado com 2,0 g/L de (NH₄)₂SO₄. Culturas e meios foram distribuídos e transferidos assepticamente usando uma ferramenta de precisão autoclavável sob uma capa de fluxo laminar. Após a transferência, as culturas foram incubadas a 30^oC por 2 dias. Após atingir a turbidez, as culturas foram transferidas uma segunda vez usando uma ferramenta de precisão estéril sob uma capa de fluxo laminar em placas de 96 poços, contendo 150 pl por poço de meio de crescimento de sais de DF suplementado com 5 mM de ACC como única fonte de nitrogênio, seguida por uma incubação de 4 dias a 30^oC. A absorvância de cada cultura em 600 nm foi medida usando um espectrofotômetro. Os isolados que exibiram o crescimento robusto sob estas condições (OD > 0,2) foram levados adiante para ensaio adicional para atividade de ACC deaminase conforme descrito em Penrose and Glick, 2003, supra.

[00135] Os resultados dos testes, conforme resumido na Tabela 2, indicaram que os seguintes isolados produziram quantidades significativas de ACC deaminase: SGI-003-H11, SGI-026-G06, SGI026-G07, e SGI-041-B03.

Produção de 2,3-butanodiol:

[00136] A capacidade dos isolados bacterianos de sintetizar 2,3butanodiol in vitro foi avaliada da seguinte forma usando espectroscopia de massa de cromatografia gasosa capilar, conforme

66/83 descrito por Ryu et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:4927-4932, 2003). Este ensaio foi normalmente executado em um formato de alta produtividade usando placas de cultura de células de 96 poços com 150 pL de meio de crescimento de sais de DF por poço. Um titer-tek também pode ser usado ao preparar um grande número de placas para telas primárias de grandes coleções de isolados. Culturas e meios foram distribuídos e transferidos assepticamente usando uma ferramenta de precisão autoclavável sob uma capa de fluxo laminar. Após a transferência, as culturas foram incubadas a 30^oC por 5 dias. Após a incubação, os sobrenadantes de cultura foram colhidos através de centrifugação usando uma placa de filtro de 0,22 μΜ de 96 poços. 50 microlitros de sobrenadante filtrado de cada poço foram transferidos para os poços correspondentes de uma placa de 96 poços profundos contendo 450 μL 50% de metanol por poço, usando uma pipeta de multicanal L200 e vedada com uma vedação de placa adesiva, seguido de ensaio de quantificação de 2,3-butanodiol usando o protocolo descrito por Ryu et al. (2003, supra). Os resultados dos testes, conforme resumido na Tabela 2, indicaram que os seguintes isolados produziram quantidades significativas de 2,3-butanodiol: SGI003-H11, SGI-034-C09, e SGI-041-B03.

Produção de auxina:

[00137] As auxinas são hormônios que podem afetar diretamente o crescimento das plantas. Este ensaio foi executado para determinar se os isolados bacterianos produziram auxinas, uma vez que muitos isolados bacterianos endofíticos e de rizosfera são conhecidos por possuir vias bioquímicas que sintetizam auxina ácido indol-3-acético (IAA) e seus derivados. O triptofano é muitas vezes um precursor nesta síntese; e, portanto, este ensaio quantificou a produção de IAA (auxina) de isolados bacterianos cultivados em um meio suplementado com uma baixa concentração do aminoácido triptofano.

67/83 [00138] Este ensaio foi normalmente executado em um formato de alta produtividade usando placas de cultura de células de 96 poços com 150 pL de meio de crescimento de YT por poço. Ao preparar um grande número de placas para telas primárias de grandes coleções de isolados, um titer-tek foi usado. Culturas e meios foram distribuídos e transferidos assepticamente usando uma ferramenta de precisão autoclavável sob uma capa de fluxo laminar. Após a transferência, as culturas foram incubadas a 30^oC por 5 dias. Após a incubação, os sobrenadantes de cultura foram colhidos através de centrifugação usando uma placa de filtro de 0,22 μΜ de 96 poços. Dez microlitros de sobrenadante filtrado de cada poço foram transferidos para uma placa de ensaio Falcon. Duzentos microlitros da solução do ensaio de Salkowsky (Gordon and Weber, Plant Physiol. 26:192-195, 1951) foram adicionados a cada um dos sobrenadantes e poços padrão, seguidos de incubação à temperatura ambiente por 15 a 20 minutos. A reação foi monitorada por absorbância da placa sobre o SpectroMax Μ2 a 535 nm como a mudança de cor de amarelo para roxo/rosa da solução de ensaio de Salkowsky foi proporcional à concentração de auxina (IAA) em cada poço. Os resultados dos testes, conforme resumido na Tabela 2, indicaram que os seguintes isolados produziram quantidades significativas de fitohormônio auxina: SGI003-H11, SGI-020-A01, SGI-034-C09, SGI-034-C09, e SGI-041-B03.

Tabela 2: Características bioquímicas dos isolados bacterianos (ND: não detectável).

Isolados bacterianos	Atividade bioquímica
Isolado ID	Taxonomia Provisória	Produçã o de auxina	ACCdeaminas e	2,3butanodio l	Nfixaçã o	Solubilizaçã o de fósforo
003_H11	Pantoea agglomerans	Sim	Sim	Sim	ND	ND

68/83

020_A01	Bacillus thuringiensis	Sim	ND	ND	ND	ND
026_G06	Burkholderia metallica	ND	Sim	ND	ND	ND
026_G07	Burkholderia vietnamiensis	ND	Sim	ND	Sim	ND
034_C09	Bacillus pumilus	Sim	ND	Sim	ND	ND
034_E10	Herbaspirillum sp.	ND	ND	ND	ND	ND
041_B03	Pedobacter sp.	Sim	Sim	Sim	ND	ND

[00139] EXEMPLO 5: Atividade de biocontrole dos isolados bacterianos contra fitopatógenos fúngicos [00140] Um ensaio de antagonismo in vitro foi usado para avaliar a capacidade das cepas bacterianas isoladas para suprimir o desenvolvimento de vários patógenos fúngicos, incluindo Fusarium graminearum NRRL-5883, Monographella nivalis ATCC MYA-3968, Gibberella zeae ATCC-16106, Stagnospora nodurum ATCC-26369, Colletotrichum gramnicola ATCC-34167, e um patógeno Penicillium sp. O ensaio foi executado em batata dextrose ágar (PDA). Cepas isoladas de bactérias foram cultivadas em ágar de caldo de soja Trípico com força de um quinto (TSBA/5) por 24 h antes do uso.

[00141] Para cada patógeno fúngico, um inóculo conidial foi produzido por hifas derrubando uma colônia ativamente em crescimento do fungo e transferindo as cepas de hifas para meio de ágar PDA. Após incubar as placas durante 7 dias a 25^oC usando um fotoperíodo de 12 h/dia, conídios fúngicos foram lavados a partir de placas de PDA usando um tampão de fosfato fraco (0,004% de tampão de fosfato, pH 7,2, com 0,019% de MgCl₂). Uma suspensão de

69/83 conídios fúngicos no tampão de fosfato fraco (aproximadamente 1 χ 10⁵ de conídios/mL) foi então imediatamente pulverizada sobre a superfície do ágar, e as placas pulverizadas em seguida foram incubadas a 25^oC por 48 a 72 h antes do uso em testes de antagonismo.

[00142] Para iniciar os testes de antagonismo, células de cepas microbianas isoladas foram inoculadas por ponto em distâncias iguais dentro do perímetro da placa. Após cinco dias, as cepas bacterianas foram marcadas como antibiose positiva quando havia uma área visivelmente clara (isto é, zona de inibição de crescimento) sem crescimento micelial em torno do perímetro das colônias microbianas. Os resultados dos ensaios de antagonismo, conforme resumido na Tabela 3, demonstraram que cada um dos micro-organismos divulgados neste documento inibiu o desenvolvimento de vários fitopatógenos fúngicos, incluindo Fusarium graminearum, Monographella nivalis, Gibberella zeae, Stagnospora nodurum, Colletotrichum gramnicola, Penicillium sp.

Tabela 3: Atividade de biocontrole dos isolados bacterianos contra fitopatógenos fúngicos

Isolados bacterianos	Supressão de crescimento de patógenos fúngicos (zona de inibição marcada após 5 dias de incubação)
Isolad o ID	Taxonomia Provisória	Fusariu m gramine arum	Monogr aphella nivalis	Gibber ella zeae	Stagnos pora nodurum	Colletotric hum gramnicol a	Penicilli um sp.
003_H 11	Pantoea agglomerans	Não	Sim	Não	Não	Não	Não
020_A 01	Bacillus thuringiensis	Sim	Não	Sim	Sim	Sim	Não

70/83

026_ G06	Burkholderia metallica	Não	Sim	Sim	Sim	Sim	Sim
026_ G07	Burkholderia vietnamiensis	Não	Sim	Não	Não	Não	Não
034_C 09	Bacillus pumilus	Não	Não	Não	Sim	Não	Não
034_E 10	Herbaspirillu m sp.	Não	Não	Não	Sim	Não	Não
041_B 03	Pedobacter sp.	Não	Sim	Não	Sim	Sim	Sim

EXEMPLO 6: Intensificação do potencial de rendimento de trigo [00143] Efeitos da inoculação bacteriana no crescimento das plantas e o rendimento foram estudados em uma estufa com o isolado SGI-020-A01. Suspensões de células microbianas foram preparadas como segue. Culturas de caldo, meios de 2YT, ou meios de crescimento similares, foram inoculadas a partir de estoques de glicerol do isolado ou placas da faixa. Normalmente, antes do uso na câmara de crescimento, estufa, ou campo, culturas bacterianas foram iniciadas 48 a 72 horas para permitir que as culturas atinjam a fase exponencial final. Isolados que têm tempos de duplicação mais longos já foram iniciados adiantados. As culturas foram incubadas a 30 °C em um agitador rotativo a 200 rpm. Após o crescimento, as células foram peletizadas a 10.000 χ g, durante 15 min a 4^oC e ressuspensas no tampão de MgSO₄ a 10 mM (pH7.0). As densidades das células foram normalizadas para cada isolado em uma base de CFU/mL. Normalmente, as suspensões de ~10⁹ de CFU/mL foram preparadas para cada isolado e transportadas em gelo para o local de inoculação. Inoculações foram executadas diluindo essas suspensões de células 1/20 na água de irrigação para uma densidade final de 5 e 10⁷ CFU/mL. Para ensaios em vaso de 1 litro, 20 mL da suspensão de

71/83 células diluída foram distribuídos uniformemente sobre a superfície de cada vaso de replicação.

[00144] O ensaio em estufa foi conduzido com um solo de campo deficiente em nutrientes. Após a remoção de detritos e grandes rochas, o solo de campo foi misturado cuidadosamente para assegurar a homogeneidade. Após o preenchimento, o solo em cada um dos vasos foi pressionado para baixo ~2 cm para uma camada de sementeira sólida. Sementes de um cultivo de trigo comercial (trigo vermelho duro de primavera; Howe Seeds, Inc.) foram semeadas em vasos de 1 litro contendo meio de solo de campo (vasos de plástico de diâmetro cônico de 10,5 cm x 12,5 cm). Dois gramas de sementes de trigo de primavera (aproximadamente 70 sementes) foram distribuídos uniformemente em cada vaso e 50 mL de solo de campo foram aplicados e espalhados uniformemente sobre a camada de sementes. Seguindo o surgimento uniforme de coleóptilo de trigo e posterior surgimento da primeira folha, a população de planta foi inoculada com 20 mL de 10⁹ CFU/mL de SGI-020-A01. Plantas de controles negativos receberam 20 mL de tampão de inóculo apenas. Cada condição foi executada em 8 de planos de replicação, cada um contendo quatro vasos de 1 litro (n = 4 por plano). Os planos foram distribuídos aleatoriamente em quatro blocos experimentais. As sementes e plantas foram então mantidas em uma estufa durante 60 dias à temperatura ambiente (variando de cerca de 8^oC a cerca de 22^oC) com ciclos de luz diurnos de aproximadamente 11,5 horas de luz solar/12 horas escuro durante todo o ensaio. As plantas foram uniformemente regadas no fundo a um nível de hidratação apropriado, dependendo da temperatura e do estágio de crescimento. Em aproximadamente 30 dias após a semeadura, aproximadamente 70 indivíduos por vaso foram empilhados e amarrados de forma frouxa para evitar a contaminação cruzada e minimizar efeitos posicionais, devido à

72/83 variação nas plantas caindo para outros vasos. Em aproximadamente 60 dias após a semeadura, as plantas foram permitidas secar na preparação para a colheita. Cabeças de trigo foram colhidas em cerca de 80 dias após a sementeira. Cada cabeça de trigo foi removida pelo corte logo abaixo da cabeça. Cabeças de trigo dentro de cada replicação do vaso foram agrupadas, pesadas, e posteriormente usadas como uma estimativa do potencial de rendimento. Todas as plantas da população foram colhidas no mesmo dia e tratamentos foram colhidos em uma ordem aleatória para eliminar grandes diferenças no tempo entre a colheita entre os tratamentos. Como resultado, as plantas de trigo tratadas com o isolado SGI-020-A01 mostraram um aumento de 40% no rendimento potencial em comparação com as plantas de controle não tratadas (2,95 g/vaso vs. 2,10 g/vaso). As médias e desvios padrão foram documentados através de todas as 8 replicações e realizou-se uma ANOVA (Análise de Variância). A eficácia do isolado microbiano SGI-020-A01 na intensificação do potencial de rendimento de trigo foi quantificada através da análise do rendimento de cabeça de trigo em peso para replicação do vaso. Valores P de <0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

EXEMPLO 7: Intensificação de produção de biomassa em milho [00145] Efeitos da inoculação bacteriana no crescimento das plantas e o rendimento foram estudados em experimentos em estufa com cada um dos seguintes isolados bacterianos. SGI-034-C09, SGI034-E10, SGI-003-H11, SGI-041-B03, SGI-026-G06, e SGI-026-G07. Os ensaios em estufa foram conduzidos com um solo de campo deficiente em nutrientes. Após a remoção de detritos e grandes rochas, o solo de campo foi misturado cuidadosamente com solo dos vasos (70:30) para assegurar a homogeneidade. Após o preenchimento, o solo em cada um dos vasos foi pressionado para

73/83 baixo ~2 cm para uma camada de sementeira sólida. Sementes de um cultivo de milho comercial (Dow AgroSciences) foram semeadas em vasos de 1 litro (vasos cônicos de 10,5 cm x 12,5 cm) cada um contendo meio de solo. Dois grãos de milho foram distribuídos uniformemente em cada vaso na orientação do embrião, seguido pela aplicação de 50 mL de solo de campo, que foi espalhado uniformemente sobre a camada de sementes. Após a germinação, o abate de uma muda por vaso é executado se necessário para que cada vaso contenha apenas uma planta.

[00146] Após o surgimento uniforme de coleóptilo de milho e posterior surgimento da primeira folha, a população de planta foi inoculada com ~20 mL de 10⁹ CFU/ml de um isolado microbiano selecionado a partir do grupo SGI-034-C09, SGI-034-E10, SGI-003H11, SGI-041-B03, SGI-026-G06, e SGI-026-G07. As suspensões de células microbianas foram preparadas conforme descrito no Exemplo 6 acima. Plantas de controles negativos receberam 20 mL de tampão de inóculo apenas.

[00147] Cada condição foi executada em 8 de planos de replicação, cada um contendo dois vasos de 1 litro (n=2 por plano). Os planos foram distribuídos aleatoriamente em quatro blocos experimentais. As sementes e plantas foram então mantidas em uma estufa durante 60 dias à temperatura ambiente (variando de cerca de 8^oC a cerca de 22^oC) com ciclos de luz diurnos de aproximadamente 11,5 horas de luz solar/12 horas escuro durante todo o ensaio. As plantas foram uniformemente regadas no fundo a um nível de hidratação apropriado, dependendo da temperatura e do estágio de crescimento. A biomassa triturada acima de milho foi colhida em cerca de 60 dias após a semeadura.

[00148] Todas as plantas da população foram colhidas no mesmo dia e tratamentos foram colhidos em uma ordem aleatória para

74/83 eliminar grandes diferenças no tempo entre a colheita entre os tratamentos. As plantas de milho foram analisadas pela diferença na biomassa total. Conforme documentado na Tabela 4, as plantas de milho tratadas com cada um dos isolados microbianos mostraram um aumento significativo na biomassa total em comparação com as plantas de controle não tratadas. As médias e desvios padrão foram documentados através de todas as 8 replicações e realizou-se uma ANOVA (Análise de Variância).

Tabela 4: Eficácia dos isolados microbianos na intensificação da biomassa total da planta.

Tratamento	Biomassa da planta (g)	Valor p	Aumento biomassa (%)	da
Não tratada	58,6	N/A	N/A
SGI-034-C09	106,3	<0,0001	181%
SGI-034-E10	103,6	<0,0001	177%
SGI-003-H11	100,7	<0,0001	172%
SGI-041-B03	99,5	0,0001	170%
SGI-026-G06	98,3	0,0002	168%
SGI-026-G07	97,3	0,0003	166%

EXEMPLO 8: Tratamento de revestimento de sementes de trigo sementes e sementes de milho [00149] Experimentos de tratamento de sementes em pequena escala foram conduzidos após um procedimento descrito em Sudisha et al. (Phytoparasitica, 37:161-169, 2009) com pequenas modificações. Normalmente, uma solução de estoque de biopolímero foi feita adicionando 1 grama de goma arábica em pó (MP Biomedical) para 9 mL de água e misturando para homogeneidade. Culturas turvas de preparações de esporos microbianos ou células microbianas ativamente em crescimento foram lavadas com PBS e ajustadas para OD600 de ~5,0. Três mL de suspensão de células ajustada foram

75/83 peletizados através de centrifugação em um tubo Falcon de 50 mL. O sobrenadante resultante foi decantado, substituído por 3 mL de solução de estoque de biopolímero e a suspensão resultante foi misturada completamente. Normalmente, cerca de 25 g de sementes foram adicionados ao tubo Falcon e vigorosamente agitados ou colocados em vórtex para garantir uma distribuição uniforme da suspensão de goma/célula. Sementes revestidas foram espalhadas em barcos para pesagem de plástico para secar em uma capa de fluxo laminar, até que não ficassem mais pegajosas, geralmente 3 horas com a mistura periódica. As sementes revestidas foram, então, armazenadas a 4^oC e periodicamente testadas para a estabilidade. Uma variedade de sementes de trigo e milho foram revestidas e testadas da forma descrita acima, incluindo as variedades de trigo vermelho duro de primavera comum Briggs Faller, Glenn, Hank, RB07, Samson; variedades de trigo vermelho duro de inverno Jerry, McGill, Overland; e variedade de sementes de milho DKC62-61, bem como um cultivo de milho comercial (Dow AgroSciences).

[00150] O teste de viabilidade dos micróbios usados na formulação de revestimento de sementes foi executado usando um método de contagem de placa padrão. Normalmente, uma quantidade predeterminada de sementes revestidas foi testada pela presença de micróbios viáveis lavando as sementes em uma alíquota do tampão apropriado e chapeamento de quantidades equivalentes de tampão em meios de ágar nutriente. Unidades formadoras de colônia viáveis foram determinadas após a incubação de 1 a 4 dias a 30^oC. O teste de viabilidade mostrou que, entre 1 χ 10⁴ e 4 χ 10⁷ unidades formadoras de colônia viáveis por semente estavam presentes após aproximadamente cinco semanas de armazenamento a 4^oC. Quando as sementes foram revestidas com esporos microbianos, a viabilidade da maioria dos micróbios testados permaneceu estável durante pelo

76/83 menos quatro meses, incluindo várias remessas interestaduais dos Estados Unidos, dentro e fora de recipientes refrigerados. Quando armazenados sob refrigeração (4^oC) os micróbios sobreviveram no revestimento de sementes com pouca perda de viabilidade durante os períodos de teste. Os resultados indicaram que sementes revestidas com as composições divulgadas neste documento poderiam ser armazenadas por longos períodos sob refrigeração e apontaram que os micróbios sobreviveriam durante os períodos de temperaturas mais altas para distribuição. Além disso, a taxa de germinação das sementes revestidas foi testada e determinada ser essencialmente idêntica à das sementes de controle, que eram também sementes revestidas com goma arábica somente ou sementes não revestidas.

EXEMPLO 9: Formulação de Estado Sólido das Composições Microbianas [00151] Esta seção descreve uma formulação exemplar de um fertilizante microbiano, onde as bactérias em conformidade com a presente invenção são encapsuladas e o fertilizante está na forma sólida. Grânulos de alginato são preparados como segue:

[00152] Um mililitro de 30% de glicerol é adicionado a 1, 1,5 ou 2% de solução de alginato de sódio, dependendo das propriedades do alginato (razão de M/G) para obter um volume final de 25 mL. As células bacterianas de uma cultura de 250 mL obtidas a partir de um dos isolados bacterianos da invenção ou de uma combinação de dois ou mais isolados são peletizadas via centrifugadas, em seguida, lavadas com uma solução salina (0,85% de NaCl, p/v), suspensas em 25 mL de mistura de alginato, e misturadas completamente. Esta suspensão de células é adicionada gota a gota em 1,5 ou 2% (p/v) de uma solução aquosa de CaCl2 estéril prearrefecida sob agitação suave para obter os grânulos bacterianos-alginato. Estes grânulos são permitidos endurecer por 2 a 4 h à temperatura ambiente. Os grânulos

77/83 são coletados por peneiração e são lavados várias vezes com água estéril e armazenados a 4^oC. A fim de preservar a formulação, os grânulos molhados frescos podem ser congelados a cerca de -80^oC antes da liofilização a cerca de-45^oC por 15 h. Os grânulos secos liofilizados podem ser armazenados em recipientes apropriados, tais como garrafas de vidro estéreis.

[00153] Para estimar as contagens viáveis, as bactérias encapsuladas podem ser liberadas a partir de grânulos por ressuspensão de 100 mg de grânulos em solução salina tamponada com fosfato (pH 7,0) por 30 min, seguido de homogeneização. O número total de bactérias liberadas é determinado pelo método de contagem de placa padrão após a incubação a 30^oC por 48 h. Em intervalos de um mês, as densidades das células nos grânulos são enumeradas usando método similar.

EXEMPLO 10: Compatibilidade das composições microbianas com fungicidas comerciais [00154] Conforme as preocupações ambientais estão aumentando em relação ao uso de pesticidas na agricultura, alternativas biológicas são cada vez mais percebidas como inevitáveis. No entanto, novas formulações biológicas devem também permitir que organismos sobrevivam e expressem seu impacto benéfico específico. Fungicidas químicos são geralmente tóxicos não apenas para micro-organismos deletérios, mas também para os benéficos. No entanto, a chance de sobrevivência destes agentes microbianos pode ter sido intensificada quando aplicados a taxas reduzidas.

[00155] No presente estudo, o material transportador à base de turfa é usado para inoculação de ambos o fungicida tratado bem como sementes de culturas próprias. A tolerabilidade bacteriana do fungicida é geralmente avaliada da seguinte forma: a) sementes próprias inoculadas por bactérias cultivadas em um meio de crescimento

78/83 bacteriano apropriado tais como placas de tripticase soja ágar (TSA; Triptona 15g/L; Soytone 5 g/L, cloreto de sódio 5 g/L e ágar 15 g/L), b) sementes inoculadas por bactérias tratadas com fungicida cultivadas em placas de TSA comuns e, c) sementes inoculadas por bactérias tratadas com fungicida cultivadas em bolsas de crescimento estéreis. Normalmente, três concentrações de fungicida são usadas em cada um dos experimentos: a dose recomendada do fabricante e duas doses mais baixas (em 75% e 50% da dose recomendada). Sementes inoculadas por bactérias tratadas com fungicida são armazenadas após a inoculação e usadas em intervalos de tempo diferentes (2 h, 4 h e 6 h) para examinar o impacto da germinação de sementes. Tanto a germinação de sementes quanto a presença bacteriana são monitoradas em placas petri. Para o estudo em bolsa de crescimento, sementes tratadas com fungicida (dose recomendada) são usadas, e os comprimentos da raiz e do hipocotil foram medidos em 7 dias de crescimento da muda.

[00156] Alguns isolados rizobacterianos da invenção são compatíveis com vários fungicidas comumente usados conforme determinado pelo crescimento bacteriano em placas de TSA enriquecidas com fungicida. Em geral, ambas as sementes tratadas com fungicida e puras, revestidas com turfa inoculada não mostram nenhuma variação significativa na germinação em relação ao controle não inoculado. Além disso, efeitos de promoção de crescimento em comprimentos da muda total e da raiz são observados em todos os tratamentos rizobacterianos em relação ao controle não inoculado.

EXEMPLO 11: Desenvolvimento de cultivos de ocorrência não natural e programa de reprodução [00157] Bactérias endofíticas da presente invenção são introduzidas em plantas de cultivo, incluindo os cereais, de diferentes genótipos e origem geográfica, sem tais fungos endofíticos, para criar

79/83 combinações de planta-endófito com características agronômicas aprimoradas, usando procedimentos análogos àqueles conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos no Pedido de Patente U.S. N° 20030195117A1, Pedido de Patente U.S. N° 20010032343A1; e Patente U.S. N° 7.084.331, entre outros. Desse modo, combinações de planta sintética-endófito podem ser criadas e selecionadas em um programa de desenvolvimento de reprodução/cultivo com base na sua capacidade de formar e manter uma combinação mutualística que resulta em um benefício agronômico. A avaliação das características agronômicas da combinação também pode ser utilizada em tal programa de reprodução. Estas características podem incluir, sem limitação, tolerância à seca, acúmulo de biomassa, resistência à infestação de insetos, palatabilidade para animais de criação (por exemplo, herbívoros), facilidade de reprodução e rendimento de sementes, entre outros. Essas combinações podem diferir em níveis de acumulação de metabólitos microbianos que são tóxicos para as pragas e ervas daninhas, incluindo níveis de alcaloides do ergot, níveis de lolina, níveis de peramina, ou níveis de lolitrem, exibindo características agronômicas desejadas de plantas de cultivo, incluindo resistência à alimentação ou infestação de insetos, resistência ao estresse abiótico, palatabilidade para animais de criação, acúmulo de biomassa, facilidade de reprodução, e rendimento das sementes, entre outros traços.

EXEMPLO 12: Estudo de Rendimento [00158] Sementes de milho (Zea mays) foram revestidas com diferentes tratamentos microbianos e semeadas em um campo preparado. Cada tratamento foi replicado 5 vezes no design de bloco completo aleatório. Uma única replicação consistia em quatro leitos longos de 30 pés (linhas), 60 sementes foram semeadas (6 polegadas de distância) em cada leito. Para fins de observação, dados foram

80/83 retirados das duas linhas intermediárias apenas.

[00159] O surgimento da planta foi registrado duas vezes, como mostrado na Tabela 5 abaixo como a porcentagem de plantas na replicação que tinha brotado. Dez plantas nas duas linhas intermediárias de cada plotagem foram marcadas com uma fita plástica para registro de estatísticas vitais, tais como a altura da planta, medição da clorofila, peso da planta etc. das plantas.

[00160] As alturas da planta (medindo a ponta da folha mais alta/mais longa) registradas 31 e 56 dias após a plantação indicaram que a altura da planta entre os tratamentos não foi significativamente diferente. A maioria das plantas foi seca e as folhas encolheram no dia 110 após a plantação, portanto, em alguns casos, plantas consideradas (medidas) menores do que na medição anterior, mas no geral, a altura da planta não diferiu entre os tratamentos. Na 5^a semana de plantação, o teor de clorofila foi medido (em unidades SPAD) das folhas inferiores (ca. 60 cm acima do solo) e folhas superiores (segunda folha totalmente expandida a partir da parte superior) de dez plantas marcadas de cada plotagem. O teor de clorofila entre os tratamentos não diferiu significativamente. No dia 110 e 111 de plantação, a colheita foi colhida. Dez plantas marcadas de cada plotagem foram cortadas no nível do solo e acima do solo, partes das plantas foram pesadas (peso de toda a planta ou WPtWt), orelhas de milho foram removidas e o comprimento da espiga foi medido (comprimento da orelha com grãos) (região preenchida com grãos negociáveis apenas), em seguida, os grãos foram retirados da espiga e seu peso foi medido para o peso do grão por orelha (KnlWt/orelha).

[00161] Logo após a colheita manual de 10 plantas por plotagem tinha acabado, uma colheitadeira mecânica, Gleaner® K2 (AllisChalmers Mfrg, Milwaukee, WI) foi trazida. Esta máquina removeu mecanicamente as plantas restantes a partir de duas linhas

81/83 intermediárias de cada plotagem, removeu os grãos das espigas, e levou à medição de umidade do grão e peso (10 orelhas + colheita em máquina). O rendimento total projetado no teor de umidade de 15,5% (libras de grão de milho por acre) com base no peso (lb.) dos grãos (incluem grãos de espigas colhidas por máquina+espigas colhidas manualmente) foi de 10368,14 libras por acre ou 185,15 bushels por acre para SGI-003-H11 (Pantoea agglomerans). Este foi o maior rendimento entre todos os tratamentos do organismo e significativamente diferente dos tratamentos para Bacillus amyloliquefaciens SGI-015_F03. O outro alto produtor foi o tratamento com Bacillus thuringiensis SGI-020_A01.

[00162] Em conclusão, todas as plantas nos diferentes tratamentos surgiram e cresceram da mesma forma nas condições de campo fornecidas com a mesma quantidade de fertilizantes, herbicidas préemergentes (com extração de ervas daninhas manual posteriormente na estação) e irrigação semanal durante a estação quente e crescente, e controle de pragas especialmente da lagarta do milho. Com todas as condições iguais, o tratamento com SGI-003-H11 (Pantoea agglomerans) produziu o maior rendimento sobre o não micróbio, tratamento de controle. Desse modo, 003_H11 produziu um rendimento aproximadamente 17% maior do que do grupo de controle. Desse modo, em várias modalidades da invenção a aplicação de uma quantidade eficaz do organismo de acordo com qualquer um dos métodos descritos neste documento produz pelo menos 10% ou pelo menos 12,5%, ou pelo menos 15% ou cerca de 17% de mais rendimento do que um grupo de controle, que em algumas modalidades pode ser determinado por acre de produto vegetal (por exemplo, orelhas de milho) por acre ou bushels de produto vegetal por acre. Os organismos listados na Tabela 5 são SGI-003-H11 (Pantoea agglomerans); SGI-015-F03 (Bacillus amyloliquefaciens); e SGI-02082/83

A01 (Bacillus thuringiensis).

Tabela 5

Organismo	Surgimento	Surgimento	Altura	Altura	Altura
Data	20/6	24/6	11/7	5/8	28/9
Controle	97,00	94,50	103,64	277,22	267,82
SGI-003-H11	89,50	93,34	103,32	273,58	272,04
SGI-015-F03	95,67	96,67	105,02	282,02	276,08
SGI-020-A01	94,83	95,33	102,04	268,94	264,80

Organismo	Folha superior	Folha inferior	WPtWt	Comprimento da orelha w/knls
Data	18/7	18/7	28/9	28/9
Controle	43,24	60,85	493,24	14,98
SGI-003-H11	44,17	59,43	494,92	14,29
SGI-015-F03	44,90	63,96	473,40	14,45
SGI-020-A01	46,45	63,84	488,30	14,20

Organismo	Knl p/orelha(g)	Knl p/orelha(lb)	10 orelhas+máquina	10 orelhas+máquina
Data	28/9	28/9	29/9	29/9
Controle	168,62	0,37	157,81	8837,63
SGI-003-H11	171,96	0,38	185,15	10368,14
SGI-015-F03	156,24	0,34	161,17	9025,62
SGI-020-A01	158,68	0,35	163,09	9133,16
[00163]	Um número	de modalidades da invenção foi descrito. No

entanto, será entendido que elementos das modalidades aqui descritos podem ser combinados para fazer modalidades adicionais e diversas modificações podem ser feitas sem abandonar o espírito e o escopo da invenção. Nesse sentido, outras modalidades, alternativas e equivalentes estão no escopo da invenção como descrito e

83/83 reivindicado aqui.

[00164] Posições dentro da aplicação são apenas para conveniência do leitor e não limitam de forma alguma o escopo da invenção ou suas modalidades.

[00165] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são incorporados neste documento por referência na mesma medida como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse indicado especificamente e individualmente para ser incorporado por referência.

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma cepa de Pantoea agglomerans SGI-003-H11, depositada como NRRL B-50483; em que a composição compreende ainda um transportador; e uma quantidade agronomicamente eficaz de um composto ou composição selecionado do grupo consistindo em um fertilizante, um acaricida, um bactericida, um fungicida, um inseticida, um microbicida, e um nematicida.
2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido transportador é uma semente de planta.
3. 3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida composição é uma formulação de revestimento de sementes.
4. 4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida composição é preparada como uma formulação selecionada do grupo que consiste em uma emulsão, um coloide, um pó, um grânulo, uma pelota, um pó, um spray, uma emulsão e uma solução.
5. 5. Método para o tratamento de uma semente de planta, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de exposição ou contato da referida semente de planta com uma cepa ou cultura microbiana como definida na reivindicação 1.
6. 6. Método para melhorar o crescimento e/ou rendimento de uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende a aplicação de uma quantidade eficaz de uma cepa ou cultura microbiana como definida na reivindicação 1, à planta, ou ao redor da planta.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida cepa ou cultura microbiana é cultivada em um meio de crescimento ou solo de uma planta hospedeira prévia ou

   Petição 870190025394, de 18/03/2019, pág. 4/9

   2/2 simultaneamente ao crescimento de plantas hospedeiras no referido meio de crescimento ou solo.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma planta de milho ou uma planta de trigo.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida cepa ou cultura microbiana é estabelecida como um endófito em tal planta.