BR112020012062A2 - regeneração de plantas na presença de inibidores de histona desacetilases - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se ao campo de melhoramento de plantas e, em particular, à regeneração de plantas a partir de células e outros tecidos. Mais particularmente, a invenção fornece métodos e meios para melhorar a formação de calos e à regeneração de plantas a partir de tecido caloso usando um inibidor de histona desacetilase.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "REGENE-

RAÇÃO DE PLANTAS NA PRESENÇA DE INIBIDORES DE HISTONA DESACETILASES".

[0001] A presente invenção refere-se ao campo de melhoramento de plantas e, em particular, à regeneração de plantas a partir de células e outros tecidos. Mais particularmente, a invenção fornece métodos e meios para melhorar a formação de calos e a regeneração de plantas a partir de tecido de calos que usam um inibidor de histona desacetilase.

[0002] A regeneração de plantas envolve a cultura in vitro de célu- las, tecidos e órgãos sob condições físicas e químicas definidas. Sabe- se que a regeneração ocorre em plantas. Nas plantas, células diferen- ciadas são capazes de se regenerar em toda a variedade de tecidos sob condições de cultura apropriadas. A regeneração pode envolver orga- nogênese direta ou indireta. Na regeneração direta, os órgãos in vitro são induzidos diretamente a partir de tecidos do explante; na regenera- ção indireta, um órgão de novo é tipicamente formado a partir de um tecido intermediário, o calo. Os calos das plantas são estruturas indife- renciadas que podem dar origem a novos tecidos. Folhas, brotos, raízes e embriões de plantas podem ser extraídos de um calo em crescimento ao trata-lo com diferentes proporções de hormônios.

[0003] Em geral, três fases podem ser reconhecidas durante a re- generação de uma planta. Primeiro, as células somáticas de tecidos dos explantes podem responder aos sinais hormonais para adquirir caracte- rísticas similares às células meristemáticas, um processo conhecido como "desdiferenciação". Em segundo, as células de calo com compe- tência organogênica serão reprogramadas e determinadas para a for- mação de órgãos específicos sob a influência de equilíbrio hormonal. À terceira fase de regeneração, a morfogênese, é independente de hor- mônios fornecidos exogenamente. Assim, o tratamento hormonal exó-

geno é o fator crítico que desencadeia os primeiros eventos de desen- volvimento na regeneração in vitro.

[0004] No entanto, a obtenção de células desdiferenciadas (calos) que podem se regenerar em plantas inteiras nem sempre é viável para muitas espécies de plantas. Sabe-se que a beterraba sacarínica é re- calcitrante à desdiferenciação e regeneração de plantas. Estas dificul- dades foram os principais obstáculos para a obtenção de beterrabas transgênicas, por exemplo, através de um processo de transformação mediado por Agrobacterium. Desde décadas, criadores e pesquisado- res estão trabalhando no desenvolvimento de protocolos mais eficientes para transformação e regeneração de plantas recalcitrantes à formação de calos. Normalmente, estas plantas mostram variações genotípicas, causando diferenças drásticas nas taxas de formação de calos e brotos entre diferentes linhagens (Ivic-Haymes & Smigocki (2005), "Identifica- tion of highly regenerative plants within sugar beet (Beta vulgaris L.) breeding lines for molecular breeding", In Vitro Cellular and Develop- mental Biology-Plant, 41(4), 483-488; Mishutkina & Gaponenko (2006), "Sugar beet (Beta vulgaris L.) morphogenesis in vitro: effects of phyto- hormone type and concentration in the culture medium, type of explants and plant genotype on shoot regeneration frequency", Russian Journal of Genetics, 42(2), 150-157; Tomita et a/. (2013), "Evaluation of the po- tential for somatic embryogenesis in sugar beet (Beta vulgaris L.) breed- ing lines and improvement of regeneration efficiency", Plant Biotechnol- ogy, 30(5), 479-487), A regeneração frequente para determinados genótipos não é possível em geral. Kishchenko et al. 2005 ("Production of transgenetic sugarbeet (Beta vulgaris L.) plants resistant to phos- phinothricin", Cell biology international, 29(1), 15-19) e Kagami et al. 2015, "Sugar beet (Beta vulgaris L.) Agrobacterium Protocols", Volume 1, 335-347) descrevem protocolos bem conhecidos para transformação de beterraba sacarínica; no entanto, estes protocolos mostram forte de- pendência do genótipo.

[0005] No contexto da indução da embriogênese de haploides, a fim de produzir plantas haploides duplas a partir de micrósporos, descobriu- se que, ao adicionar HDACi (inibidores de histona desacetilases), tal como tricostatina A (TSA), ao meio de cultura, há um grande aumento na proporção de células derivadas de gametófitos masculinos de diver- sas espécies de plantas que sofrem crescimento embriogênico (docu- mento WO 2015/044199 A1). No entanto, o uso de TSA na formação e regeneração de calos tem sido bastante preocupante. Em Furuta et al. ((2011), "The CKH2/PKL chromatin remodeling factor negatively regula- tes cytokinin responses in Arabidopsis calli", Plant and Cell Physiology, 52(4), 618-628), a caracterização do mutante 2 hipersensível à citoqui- nina 2 (ckh2) em Arabidopsis mostrou que a desacetilação de histonas está intimamente relacionada ao crescimento de calos induzido por ci- tocinas. A aplicação de TSA tem sido usada como substituto parcial das citoquininas na promoção do crescimento de calos a partir de explantes de hipocótilo. A citoquinina (cinetina) e a TSA não induziram ao cresci- mento de calos, nem individualmente nem em combinação. Recente- mente, Lee et al. ((2016), Histone deacetylation-mediated cellular dedi- fferentiation in Arabidopsis", Journal of Plant Physiology, 191, 95-100) descreveram que a desacetilação de histona é necessária para a forma- ção de calos a partir de explantes foliares em Arabidopsis. No entanto, o tratamento com TSA levou à formação de calos com defeito. Em su- porte a isto, um subconjunto de genes HDAC foi positivamente regulado em calos e alguns mutantes de hdac mostraram capacidade reduzida de formação de calos.

[0006] Resumindo estes achados, parece que, em Arabidopsis, a TSA tem um efeito oposto na indução de calos a partir de folhas e, em combinação com a citoquinina, a TSA não induz a calos em explantes de hipocótilos.

[0007] Surpreendentemente, os inventores descobriram que os ini- bidores de histona desacetilase (HDACIi), tal como TSA, têm um efeito positivo sobre o início de calos em plantas da espécie Beta vulgaris, tal como beterraba sacarínica. Este efeito da TSA e de outros HDACIis não foi comprovado para protocolos de regeneração indiretos ou para supe- rar a recalcitrância, por exemplo, em genótipos de beterraba sacarínica antes. É importante ressaltar que nem a TSA nem qualquer outro HDACi foi usado em nenhum protocolo de transformação de culturas que tem como alvo melhorar a eficiência.

[0008] Assim, um primeiro aspecto da presente invenção é o uso de um HDACi em um método para induzir à formação de calos ou produzir calos com uma capacidade aprimorada de regeneração de rebentos a partir de células de planta, em particular a partir de células de planta somáticas ou embrionárias e, de preferência, a partir de um explante ou uma parte isolada de uma planta. As células de planta embrionárias são, de preferência, células não haploides. Maior capacidade de regenera- ção de rebentos é avaliada comparado com o mesmo método para a produção de calo e o mesmo genótipo, mas sem o uso do HDACi.

[0009] A presente invenção fornece um método para induzir à for- mação de calos ou produzir calos com uma capacidade aprimorada de regeneração de rebentos a partir de pelo menos uma célula de planta que compreende a etapa de cultivar a pelo menos uma célula de planta na presença de um HDACIi. Em princípio, basta usar apenas uma célula de planta para executar o método de acordo com a presente invenção. Assim, se o plural "células de planta" for usado daqui em diante, o texto não deve ser entendido no sentido de que seria necessário um número mínimo de células de planta.

[0010] Células de planta adequadas para uso no método da pre- sente invenção incluem células de planta embrionárias e células de planta somáticas. A maneira como estas células de planta são forneci- das não é importante para o método de acordo com a presente inven- ção. Por exemplo, células de planta embrionárias ou somáticas podem ser fornecidas a partir de um explante isolado de uma planta. Qual parte de uma planta é elegível para obter um explante depende das espécies de plantas em particular. Em geral, células de planta adequadas podem ser obtidas para instâncias de hipocótilo, pecíolo, meristemas de broto e axiais, lâmina foliar, flor, parênquima ou células parenquimáticas, nó intermediário, sementes, embriões e raízes de uma planta.

[0011] Nos termos da invenção, "inibidor de histona desacetilases" ou "HDACIi" se refere a qualquer composto químico que inibe a histona desacetilase. Deve ser entendido que o HADCIi pode ser um único com- posto ou uma combinação de vários compostos. Uma classe preferida de compostos adequados para conferir a atividade inibidora de histona desacetilase desejada são ácidos hidroxâmicos e hidroxamatos, tais como tricostatina A (TSA), vorinostate (SAHA), belinostate (PXD101), LAQ824 e panobinostate (LBH589). De acordo com a invenção, é pre- ferido usar TSA como inibidor de histona desacetilase. Outros exemplos de HDACis para uso de acordo com a invenção incluem tetrapeptídeos cíclicos (tal como trapoxina B) e depsipeptídeos, benzamidas, tais como entinostate (MS-275), CI994 e mocetinostate (MGCDO103), cetonas eletrofílicas e compostos de ácido alifático, tais como fenilbutirato e ácido valproico.

[0012] Cultivar células de planta pode compreender o crescimento das células de planta em um meio que compreende um HDACIi. Alter- nativa ou adicionalmente, o HDACIi pode ser introduzido nas células da planta, por exemplo, via bombardeamento, eletroporação ou microinje- ção ou qualquer outro método conhecido por aqueles versados na téc- nica. De acordo com a invenção, é preferível cultivar as células de planta em um meio que contém HDACi. A etapa de cultivo pode ser realizada usando qualquer meio indutor de calos (Callus-Inducing Medium - CIM) bem conhecido na técnica. A princípio, vários tipos de misturas de sais basais pode ser usado para cultura de células, porém, mais preferivel- mente, o meio compreende meio de Murashige e Skoog modificado, meio de White ou meio para planta lenhosa.

[0013] De acordo com um aspecto preferido da invenção, o CIM é complementado com o HDACi. A concentração de HDACIi no meio pode variar a partir de cerca de 0,01 uM a cerca de 5,0 uM. Descobriu-se que diferentes plantas toleram o HDACi de maneira diferente. Pelo menos em algumas plantas, concentrações de HDACi, em particular de TSA, acima de 5,0 UM, podem ser citotóxicas. A fim de alcançar o aumento desejado da formação de calo, a concentração de HDACIi no meio está, de preferência, na faixa de 0,01 uM a 1,0 uM.

[0014] Além do HDACi, um ou mais aditivos adicionais podem ser usados no meio de cultura. Por exemplo, o meio de cultura pode ser suplementado com reguladores de crescimento de plantas, tais como auxinas, citoquininas e giberelinas, para iniciar a formação de calos. Po- dem ser fornecidas vitaminas para melhorar o crescimento, tais como vitaminas B5 de Gamborg. O enriquecimento com nitrogênio, fósforo e potássio também se mostrou útil.

[0015] Surpreendentemente, descobriu-se que o método da inven- ção é adequado para induzir à formação de calos ou produzir calos com uma capacidade aumentada de regeneração de rebentos, mesmo em espécies de plantas ou genótipos de plantas recalcitrantes. Assim, usando o método da invenção, é possível melhorar a regeneração indi- reta em espécies de plantas ou genótipos de plantas recalcitrantes.

[0016] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a indu- ção da formação de calo pode ser seguida pela regeneração de reben- tos a partir do tecido caloso. Uma vez que o uso de HDACi, em particular TSA, de acordo com a presente invenção promove a formação de calos,

o resultado é um método aprimorado para regenerar plantas. Os inven- tores descobriram que, frequentemente, mais calos se formaram com o uso de HDACi, em particular T SA, porém, mesmo que não tenha sido formado mais ou menos tecido calosos, a qualidade do calo foi clara- mente aprimorada, ou seja, o calo formado mostra uma capacidade apri- morada de regeneração de rebentos. Assim, a presente invenção for- nece um método para regenerar rebentos a partir de um tecido caloso que compreende a etapa de: (a) induzir à formação de calos a partir de pelo menos uma célula de planta, conforme descrito acima, e (b) cultivar o tecido caloso obtido na etapa (a) sob condições que promovam o crescimento de rebentos a partir do tecido caloso.

[0017] Condições de cultura adequadas são bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Dependendo da planta em questão, estas condições podem variar.

[0018] De acordo com outro aspecto da invenção, o efeito benéfico do HDACi na formação de calos pode ser explorado em métodos de transformação de células de planta, bem como em métodos nos quais o genoma de uma célula de planta é modificado. Descobriu-se que, em espécies de plantas ou genótipos de plantas recalcitrantes, a eficiência da transformação pode ser aprimorada usando HDACi. Assim, a inven- ção também se refere ao uso de um HDACi em um método de transfor- mação de uma célula de planta e ao uso de um HDACi em um método de modificação do genoma de uma célula de planta.

[0019] Consequentemente, a invenção fornece um método para transformar uma célula de planta que compreende as seguintes etapas: (a) induzir à formação de calos a partir de pelo menos uma célula de planta, conforme descrito acima, e (b) introduzir em uma célula de planta a ser usada na etapa (a) e/ou em uma célula do calo obtido na etapa (a) pelo menos uma sequência de nucleotídeos de interesse.

[0020] A etapa (a) de indução da formação de calo é realizada usando o método descrito aqui acima. De preferência, a formação de calo é induzida na presença de um TSA que pode ser adicionado ao meio ou diretamente introduzido nas células da planta.

[0021] Na etapa (b), uma célula é transformada pela introdução de uma molécula de ácidos nucleicos na célula de uma forma estável para causar expressão estável ou transitória da sequência de ácidos nuclei- cos. A transformação de células de planta monocotiledôneas e dicotile- dôneas agora é rotineira, e a seleção da técnica de transformação mais apropriada será determinada por aqueles versados na técnica. A esco- lha do método varia de acordo com o tipo de planta a ser transformada; aqueles versados na técnica na técnica reconhecerão a adequabilidade de métodos particulares para determinados tipos de plantas. Métodos adequados podem incluir, porém sem limitações: eletroporação de pro- toplastos vegetais; transformação mediada por lipossomas; transforma- ção mediada por polietileno glicol (PEG); transformação usando vírus; microinjeção de células de planta; bombardeamento de microprojéteis de células de planta; infiltração a vácuo; e transformação mediada por Agrobacterium.

[0022] De acordo com uma modalidade da presente invenção, a pelo menos uma sequência de nucleotídeos de interesse é introduzida na célula de planta para ser usada na etapa (a) para induzir à formação de calos. Deve ser entendido que, neste caso, a etapa (b) é realizada antes da etapa (a). De acordo com outra modalidade da invenção, pelo menos uma sequência de nucleotídeos de interesse é introduzida em uma célula do calo obtido na etapa (a). Deve ser entendido que, neste caso, a etapa (b) é realizada após a etapa (a). De acordo com uma outra modalidade da invenção, pelo menos uma sequência de nucleotídeos de interesse é introduzida em uma célula de planta durante a indu- ção/formação de calos, isto é, as etapas (a) e (b) são realizadas em paralelo ou simultaneamente. Além disso, é possível introduzir sequên- cias de nucleotídeos de interesse tanto na célula a ser usada para a formação de calos quanto na célula do calo resultante da etapa (a). De acordo com esta modalidade, o método inclui as seguintes etapas: (i) introduzir em uma célula de planta pelo menos uma se- quência de nucleotídeos de interesse, (ii) induzir à formação de calos a partir da célula obtida na etapa (i) e (iii) introduzir pelo menos uma sequência de nucleotídeos de interesse em uma célula do calo obtida na etapa (ii).

[0023] A etapa de introdução da pelo menos uma sequência de nu- cleotídeos de interesse pode ser realizada usando qualquer método adequado comumente conhecido na técnica. Estão disponíveis vários métodos para transferir ácidos nucleicos de interesse para células de planta. Um método mediado por vetor exemplificativo é a transformação mediada por Agrobacterium conforme descrito, por exemplo, por Lin- dsay & Gallois, 1990, Journal of Experimental Botany, e Kischenko et al., 2005, Cell Biology International for Sugar Beet, por Ishida et al., 2007, ("Agrobacterium-mediated transformation of maize", Nature Pro- tocols, 2 (7), 1614-1621) para milho ou pela empresa PureWheat Technology da Japan Tobacco para trigo. Outras técnicas adequadas incluem bombardeamento de partículas, infiltração a vácuo, imersão flo- ral e eletroporação.

[0024] A sequência de nucleotídeos de interesse de acordo com a invenção pode ser uma sequência de DNA ou RNA, por exemplo, MRNA, siRNA, miRNA etc. Mais particularmente, a sequência de nucle- otídeos de interesse codifica pelo menos uma característica fenotípica. De preferência, a característica fenotípica conferida pelo DNA ou RNA pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em resistência/to- lerância ao estresse biótico, incluindo resistência/tolerância a patóge- nos, em que o patógeno pode ser um patógeno viral, bacteriano, fúngico ou animal, resistência/tolerância ao estresse abiótico, incluindo resistên- cia/tolerância ao frio, resistência/tolerância ao estresse pela seca, resis- tência/tolerância osmótica, resistência/tolerância ao estresse pelo calor, resistência/tolerância ao estresse pelo frio ou geada, resistência/tole- rância ao estresse oxidativo, resistência/tolerância ao estresse por me- tais pesados, estresse por sal ou resistência/tolerância à extração de água, resistência/tolerância ao acamamento, resistência/tolerância ao tombamento ou resistência/tolerância a um ou mais herbicidas, tais como glifosato, glufosinato, 2,4-D, Dicamba, inibidores de ALS, etc. À pelo menos uma característica fenotípica de interesse também pode ser selecionada a partir do grupo que consiste na modificação de outro traço agronômico de interesse, incluindo aumento de rendimento, modifica- ção do tempo de floração, modificação da cor das sementes, modifica- ção da composição do endosperma, modificação do teor nutricional ou engenharia metabólica de uma via de interesse.

[0025] Um ácido nucleico (molécula) ou nucleotídeo (sequência) ou polinucleotídeo, conforme usado aqui, se refere a DNA e RNA. O DNA também inclui cDNA e DNA genômico. Uma molécula de ácidos nuclei- cos pode ser fita simples ou dupla e pode ser sintetizada quimicamente ou produzida por meio de expressão biológica in vitro ou mesmo in vivo.

[0026] Será evidente que sempre que as sequências de nucleotí- deos das moléculas de RNA são definidas por referência à sequência de nucleotídeos das moléculas de DNA correspondentes, a timina (T) na sequência de nucleotídeos deve ser substituída pela uracila (U). Se referência é feita a moléculas de RNA ou DNA, isto ficará claro a partir do contexto do pedido.

[0027] Além disso, a invenção também fornece um método para modificar o genoma de uma célula de planta que compreende as se- guintes etapas: (a) induzir à formação de calos a partir de pelo menos uma célula de planta, conforme descrito acima, e (b) modificar o genoma de uma célula de planta a ser usada na etapa (a) e/ou de uma célula do tecido caloso obtido na etapa (a) ao introduzir na dita célula uma enzima efetora específica para localização que reconhece preferivelmente uma localização predeterminada no ge- noma da dita célula e, opcionalmente, uma molécula de ácidos nuclei- cos de reparo,

[0028] em que a modificação do dito genoma é selecionada a partir de: i. uma substituição de pelo menos um nucleotídeo; ii. uma eliminação de pelo menos um nucleotídeo; lil. uma inserção de pelo menos um nucleotídeo; ou iv. qualquer combinação de i-iii.

[0029] A etapa (a) de indução da formação de calo é realizada por meio do método descrito acima. De preferência, a formação de calos é induzida na presença de TSA como HDACi, o qual pode ser adicionado ao meio ou introduzido diretamente nas células da planta.

[0030] Na etapa (b), a modificação do genoma da célula é conse- guida por meio de uma enzima indutora de ruptura de DNA fita dupla (Double-Stranded DNA, DSB) ou enzima indutora de ruptura de DNA fita simples (Single Stranded DNA, SSB) (nickase), a qual reconhece preferivelmente uma localização predeterminada no genoma da dita cé- lula.

[0031] A etapa de modificação do genoma pode ser realizada antes e/ou após a indução da formação de calos. Assim, de acordo com um primeiro aspecto da invenção, o genoma de uma célula de planta é mo- dificado conforme descrito na etapa (b) e a célula de planta modificada resultante é, então, usada em uma etapa subsequente (a) de induzir à formação de calos. De acordo com outro aspecto da invenção, a etapa (a) de indução da formação de calo é realizada primeiro e subsequen- temente pelo menos uma célula do tecido caloso resultante é modificada na etapa (b) por meio de uma enzima efetora específica para localiza- ção. De acordo com uma outra modalidade da invenção, o genoma de uma célula de planta é modificado conforme descrito na etapa (b) du- rante a indução/formação de calos, isto é, as etapas (a) e (b) são reali- zadas em paralelo ou simultaneamente. Além disso, é possível modifi- car o genoma da célula de planta a ser usada na etapa de formação de calos e de uma célula do tecido caloso resultante da etapa de indução da formação de calos. De acordo com este aspecto da invenção, o mé- todo inclui as etapas de: (i) modificar o genoma de uma célula de planta, (ii) induzir à formação de calos da célula resultante da etapa (i)e (ili) modificar o genoma de uma célula do tecido caloso ob- tido na etapa (ii).

[0032] Exemplos de enzimas efetoras específicas são, em particu- lar, enzimas tais como nucleases, nickases, recombinases, transposa- ses, editores de bases ou complexos moleculares, incluindo estas fer- ramentas. Estes efetores têm a capacidade de introduzir uma clivagem de fita dupla (enzima indutora de ruptura de DNA de fita dupla (DSBI)) ou uma clivagem de fita simples (enzima indutora de ruptura de DNA fita simples (SSBI)) em uma localização genômico alvo ou tem a capaci- dade de introduzir uma modificação direcionada, incluindo uma mutação pontual, uma inserção ou uma eliminação em uma localização genômica alo de interesse. Uma enzima efetora específica para localização pode atuar por si só ou em combinação com outras moléculas como parte de um complexo molecular. A enzima efetora específica para localização pode estar presente como uma molécula de fusão ou como moléculas individuais associadas ou que são associadas através de pelo menos uma de uma interação covalente ou não covalente, de modo que os componentes do complexo efetor específico para localização sejam mantidos em proximidade física estreita. O complexo pode incluir um modelo de reparo para fazer uma conversão ou substituição de sequên- cia direcionada na localização alvo. Um modelo de reparo (RT) repre- senta uma sequência de ácidos nucleicos fita simples ou dupla que pode ser fornecida durante qualquer edição genômica, causando uma ruptura de DNA fita dupla ou simples para auxiliar o reparo direcionado da dita ruptura de DNA ao fornecer um RT como modelo de sequência conhe- cido que auxilia o reparo direcionado à homologia.

[0033] Conforme usado aqui, uma "enzima indutora de ruptura de DNA fita dupla" ou "enzima DSBI" é uma enzima capaz de induzir a uma ruptura de DNA fita dupla em uma sequência de nucleotídeos especí- fica, denominada de "sítio de reconhecimento". A enzima indutora de ruptura de DNA fita dupla (DSB) pode, por exemplo, ser selecionada a partir do grupo que consiste em meganuclease, nuclease efetora TAL, nuclease de dedo de zinco, sistemas CRISPR, tais como CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpf1, CRISPR/Csm1, CRISPR/MAD7, CRISPR/CasX ou CRISPR/CasY. Endonucleases de clivagem rara são enzimas DSBI que têm um sítio de reconhecimento, de preferência a partir de cerca de 14 a 70 nucleotídeos consecutivos e, portanto, têm uma frequência muito baixa de clivagem, mesmo em genomas maiores, como a maioria dos genomas de plantas. As endonucleases "homing", também denomina- das de meganucleases, constituem uma família de tais endonucleases de clivagem rara. Elas podem ser codificadas por íntrons, genes inde- pendentes ou sequências intervenientes, e apresentam propriedades estruturais e funcionais impressionantes que as diferenciam das enzi- mas de restrição mais clássicas, geralmente dos sistemas bacterianos de tipo Il de modificação por restrição bacteriana. Seus sítios de reco- nhecimento têm uma assimetria geral que contrasta com a simetria de díade característica da maioria dos sítios de reconhecimento de enzi- mas de restrição. Foi demonstrado que várias endonucleases "homing" codificadas por íntrons ou inteiras promovem o alojamento de seus res- pectivos elementos genéticos em locais alélicos, sem íntrons ou sem sequências intervenientes. Ao fazer uma ruptura de fita dupla específica para localização em alelos sem íntrons ou sem sequências intervenien- tes, estas nucleases criam extremidades recombinogênicas, as quais se envolvem em um processo de conversão gênica que duplica a sequên- cia codificadora e leva à inserção de um íntron ou uma sequência inter- veniente ao nível do DNA. Uma lista de outras meganucleases de cliva- gem raras e seus respectivos sítios de reconhecimento é fornecida na Tabela | do documento WO 03/004659 (páginas 17 a 20) (incorporado aqui por referência).

[0034] Além disso, estão disponíveis métodos para conceber endo- nucleases de clivagem raras personalizadas que reconhecem basica- mente qualquer sequência de nucleotídeos alvo de escolha. Resumida- mente, as enzimas de restrição quiméricas podem ser preparadas usando híbridos entre um domínio de dedo de zinco concebido para re- conhecer uma sequência de nucleotídeos específica e o domínio de cli- vagem de DNA não específico de uma enzima de restrição natural, tal como Fokl. Tais métodos foram descritos, por exemplo, nos documen- tos WO 03/080809, WO 94/18313 ou WO 95/09233 e em Isalan et al, 2001, Nature Biotechnology 19, 656-660; Liu et al. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530).

[0035] Outro exemplo de endonucleases personalizadas inclui as assim denominadas nucleases TALE (TALENs), as quais são baseadas em efetores de tipo ativador de transcrição (Transcription Activator-Like

Effectors, TALES) do gênero bacteriano Xanthomonas fundido ao domí- nio catalítico de uma nuclease (por exemplo, Fokl ou uma variante do mesmo)). A especificidade de ligação a DNA destas TALEs é definida por di-resíduos de repetição variável (Repeat-Variable Diresidues, RVDs) de unidades de repetição de 34/35 aminoácidos dispostas em tandem, de modo que um RVD reconheça especificamente um nucleo- tídeo no DNA alvo. As unidades de repetição podem ser montadas para reconhecer basicamente qualquer sequência alvo e fundidas a um do- mínio catalítico de uma nuclease para criar endonucleases específicas para sequência (consulte, por exemplo, Boch et a/., 2009, Science 326: páginas 1509-1512; Moscou e Bogdanove, 2009, Science 326: p1501; e documentos WO 2010/079430, WO 2011/072246, WO 2011/154393, WO 2011/146121, WO 2012/001527, WO 2012/093833, WO 2012/104729, WO 2012/138927, WO 2012/138939). O documento WO2012/138927 descreve ainda TALENs e TALENs monoméricas (compactas) com vá- rios domínios catalíticos e combinações dos mesmos.

[0036] Recentemente, um novo tipo de sistema de endonuclease personalizável foi descrito; o assim denominado sistema CRISPR/Cas. Um sistema CRISPR, em seu ambiente natural, descreve um complexo molecular que compreende pelo menos um pequeno RNA não codifica- dor e individual em combinação com uma nuclease Cas ou outra nu- clease CRISPR, tal como uma nuclease Cpf1 (Zetsche et al., "Cpfl Is a Single RNA-Guides Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System", Cell, 163, páginas 1-13, outubro de 2015), o qual pode produzir uma ruptura específica de fita dupla do DNA. Atualmente, os sistemas CRISPR são classificados em 2 classes, as quais compreendem cinco tipos de sistemas CRISPR, o sistema tipo Il, por exemplo, que usa Cas9 como efetor, e o sistema de tipo V que usa Cpf1 como molécula efetora (Makarova et al., Nature Rev. Microbiol., 2015). Em sistemas CRISPR artificiais, um RNA sintético não codificador e uma nuclease CRISPR e/ou opcionalmente uma nuclease CRISPR modificada para atuar como nickase ou sem qualquer função de nuclease, podem ser usados em combinação com pelo menos um RNA guia sintético ou artificial ou gRNA que combina a função de um crRNA e/ou um tracr»RNA (Makarova et al., 2015, supra). A resposta imune mediada por CRISPR/Cas em sistemas naturais requer CRISPR-RNA (crRNA), em que a maturação deste RNA guia, o qual controla a ativação específica da nuclease CRISPR, varia significativamente entre os vários sistemas CRISPR que foram caracterizados até o momento.

Primeiramente, o DNA invasor, também conhecido como um espaçador, é integrado entre duas regiões de repetição adjacentes na extremidade proximal do /ocus CRISPR.

Os sistemas CRISPR de tipo Il, por exemplo, podem codificar uma nuclease Cas9 como enzima essencial para a etapa de interferência, sistema que contém um crRNA e também um RNA transativador (tracr»RNA) como motivo guia.

Estes hibridizam e formam regiões de RNA fita dupla (ds) que são reconhecidas pela RNAse Ill e podem ser clivadas para formar crRNAs maduros.

Estes, por sua vez, se associam à molécula de Cas, a fim de direcionar a nuclease especificamente para a região de ácidos nucleicos alvo.

As moléculas de gRNA recombinante podem compreen- der a região variável de reconhecimento de DNA e também a região de interação de Cas e, portanto, podem ser concebidas especificamente, independentemente do ácido nucleico alvo específico e da nuclease Cas desejada.

Como mecanismo de segurança adicional, PAMs (moti- vos protoespaçadores adjacentes) devem estar presentes na região de ácidos nucleicos alvo; estas são sequências de DNA que seguem dire- tamente o DNA reconhecido pelo complexo Cas9/RNA.

A sequência PAM para Cas9 de Streptococcus pyogenes foi descrita como "NGG" ou "NAG" (código padrão de nucleotídeos IUPAC) (Jinek et a/., Science 2012, supra) para uma Cas9 derivada de Streptococcus pyogenes.

À sequência PAM para Cas9 de Staphylococcus aureus é "NNGRRT" ou

"NNGRR(N)". São conhecidos outros sistemas CRISPR/Cas9 variantes. Assim, uma Cas9 de Neisseria meningitidis cliva na sequência PAM NNNNGATT. Uma Cas9 de Streptococcus thermophilus cliva na se- quência PAM NNAGAAW. Recentemente, um outro motivo PAM NNNN- RY AC foi descrito para um sistema CRISPR de Campylobacter (docu- mento WO 2016/021973 A1). Para nucleases Cpf1, foi descrito que o complexo Cpf1-crRNA, sem um tracrRNA, reconhece e cliva eficiente- mente o DNA alvo procedido por um PAM rico em T curto, em contraste com os PAMs ricos em G geralmente reconhecidos pelos sistemas Cas9 (Zetsche et al. supra). Além disso, que usam polipeptídeos CRISPR mo- dificados, podem ser obtidas quebras de cadeia simples. O uso combi- nado de Cas nickases com vários gRNAs recombinantes também pode induzir quebras de fita dupla de DNA altamente específicas por meio de dupla penetração de DNA. Além disso, ao usar dois gRNAs, a especifi- cidade da ligação do DNA e, portanto, a clivagem do DNA, podem ser otimizadas. Entretanto, outros efetores CRISPR, tais como CasX e CasY descritos originalmente para bactérias, estão disponíveis e repre- sentam outros efetores que podem ser usados para fins de engenharia genômica (Burstein et al/., "New CRISPR-Cas Systems from Uncultiva- ted Microbes", Nature, 2017, 542, 237-241.

[0037] Além disso, variantes de Cas ou Cpf1 modificadas ou quais- quer outras variantes efetoras CRISPR modificadas, por exemplo, vari- antes de Cas9, podem ser usadas de acordo com os métodos da pre- sente invenção como parte de um complexo de edição de bases, por exemplo, BE3, VOR-BE3, EQR-BE3, VRER-BE3, SaBE3, SaKKH-BE3 (consulte Kim et a/., Nat. Biotech., 2017, doi: 10.1038/nbt.3803). Por- tanto, de acordo com a presente invenção, são previstas nucleases CRISPR artificialmente modificadas que podem realmente não ser "nu- cleases" no sentido de enzimas de clivagem de fita dupla, mas que são nickases ou variantes mortas de nuclease, as quais ainda possuem re- conhecimento de DNA inerente e, portanto, capacidade de ligação.

[0038] Um "editor de base", conforme usado aqui, refere-se a uma proteína ou um fragmento da mesma que tem a mesma atividade cata- lítica da proteína da qual ela é derivada, proteína ou fragmento da mesma, individualmente ou quando fornecida como um complexo mo- lecular, denominado como complexo de edição de bases aqui, tem a capacidade de mediar uma modificação de base direcionada, ou seja, a conversão de uma base de interesse, resultando em uma mutação pon- tual de interesse. De preferência, o pelo menos um editor de bases, no contexto da presente invenção, está temporária ou permanentemente ligado a pelo menos um efetor específico para localização ou, opcional- mente, a um componente de pelo menos um complexo efetor específico para localização. A ligação pode ser covalente e/ou não covalente.

[0039] O sítio de clivagem de uma enzima DSBI ou uma enzima SSB] se refere à localização exata no DNA onde a ruptura de DNA fita dupla é induzida. O sítio de clivagem pode ou não estar compreendido (sobreposto) ao sítio de reconhecimento da enzima DSBI ou SSBI e, portanto, é dito que o sítio de clivagem de uma enzima DSBI ou SSBI está localizado no sítio de reconhecimento ou próximo do mesmo. O sítio de reconhecimento de uma enzima DSBI ou SSB], também deno- minado de sítio de ligação, é a sequência de nucleotídeos que é (espe- cificamente) reconhecida pela enzima DSBI ou SSBI e determina sua especificidade de ligação. Por exemplo, um monômero TALEN ou ZNF tem um sítio de reconhecimento que é determinado por suas repetições RVD ou ZF, respectivamente, enquanto que o sítio de clivagem é deter- minado pelo domínio de nuclease (por exemplo, Fokl) e geralmente está localizado fora do sítio de reconhecimento. No caso de TALENs ou ZFNs diméricos, o sítio de clivagem está localizado entre os dois sítios de reconhecimento/ligação dos respectivos monômeros, aquela região de DNA interveniente na qual ocorre a clivagem sendo denominada como região espaçadora.

[0040] Aqueles versados na técnica serão capazes de escolher uma enzima DSBI ou SSBI que reconhece um determinado sítio de reconhe- cimento e induz a uma DSB ou SSB em um sítio de clivagem em ou nas proximidades da localização pré-selecionada ou conceber uma enzima DSBI ou SSBJI. Alternativamente, um sítio de reconhecimento de enzima DSBI ou SSBI pode ser introduzido no genoma alvo usando qualquer método de transformação convencional ou cruzando com um organismo com um sítio de reconhecimento de enzima DSBI ou SSBI em seu ge- noma, e qualquer DNA desejado pode ser posteriormente introduzido em ou na proximidade do sítio de clivagem desta enzima DSBI ou SSBI.

[0041] Em um aspecto particularmente preferido desta modalidade, uma molécula de ácidos nucleicos de reparo é adicionalmente introdu- zida na célula de planta.

[0042] Conforme usado aqui, uma "molécula de ácidos nucleicos de reparo" é uma molécula de DNA fita simples ou dupla ou molécula de RNA que é usada como modelo para modificação do DNA genômico na localização pré-selecionada nas proximidades ou no sítio de clivagem. Conforme usado aqui, "usar como modelo para modificação do DNA genômico" significa que a molécula de ácidos nucleicos de reparo é co- piada ou integrada na localização pré-selecionada por meio de recom- binação homóloga entre a(s) região(ões) de flanqueamento e a(s) re- gião(ões) de homologia correspondente(s) no genoma alvo que flan- queia a localização pré-selecionada, opcionalmente em combinação com a junção N-terminal não homóloga (Non-Homologous End-Joining, NHEJ) em uma das duas extremidades da molécula de ácidos nucleicos de reparo (por exemplo, no caso de haver apenas uma região de flan- queamento). A integração através de recombinação homóloga permitirá a junção precisa da molécula de ácidos nucleicos de reparo ao genoma alvo até o nível de nucleotídeos, enquanto que a NHEJ pode resultar em pequenas inserções/eliminações na junção entre a molécula de áci- dos nucleicos de reparo e o DNA genômico.

[0043] Conforme usado aqui, "uma modificação genômica" significa que o genoma mudou quanto a pelo menos um nucleotídeo. Isto pode ocorrer pela substituição de pelo menos um nucleotídeo e/ou uma elimi- nação de pelo menos um nucleotídeo e/ou uma inserção de pelo menos um nucleotídeo, contanto que resulte em uma alteração total de pelo menos um nucleotídeo comparado com a sequência de nucleotídeos da localização genômica alvo pré-selecionada antes da modificação, deste modo, permitindo a identificação da modificação, por exemplo, por meio de técnicas tais como sequenciamento ou análise de PCR e assim por diante, das quais aqueles versados na técnica estarão bem cientes.

[0044] Conforme usado aqui, "uma localização pré-selecionada" ou "localização predefinida" indica uma sequência de nucleotídeos especí- fica no genoma (por exemplo, o genoma nuclear) no local em que se deseja inserir, substituir e/ou eliminar um ou mais nucleotídeos. Este pode, por exemplo, ser um /ocus endógeno ou uma sequência de nu- cleotídeos específica ou ligada a um DNA ou transgene estranho previ- amente introduzido. A localização pré-selecionada pode ser uma posi- ção de nucleotídeos específica (após) na qual se pretende fazer uma inserção de um ou mais nucleotídeos. A localização pré-selecionada também pode compreender uma sequência de um ou mais nucleotídeos que devem ser trocados (substituídos) ou eliminados.

[0045] Conforme usado no contexto do presente pedido, o termo "cerca de" significa +/- 10 % do valor citado, de preferência +/- 5 % do valor citado. Por exemplo, cerca de 100 nucleotídeos (nt) deve ser en- tendido como um valor entre 90 e 110 nt, de preferência entre 95 e 105.

[0046] Conforme usado aqui, uma "região de flanqueamento" é uma região da molécula de ácidos nucleicos de reparo que tem uma sequên- cia de nucleotídeos homóloga à sequência de nucleotídeos da região de flanqueamento da região do DNA (ou seja, a montante ou a jusante) da localização pré-selecionada. Será evidente que o comprimento e a porcentagem de identidade de sequência das regiões de flanqueamento devem ser escolhidos de modo a permitir a recombinação homóloga en- tre as ditas regiões de flanqueamento e sua região de DNA correspon- dente a montante ou a jusante da localização pré-selecionada. A região ou regiões de DNA que flanqueiam a localização pré-selecionada que tem homologia com a região ou regiões de flanqueamento de DNA ou regiões da molécula de ácidos nucleicos de reparo também são deno- minadas como regiões de homologia ou regiões no DNA genômico.

[0047] Para ter homologia suficiente para recombinação, as regiões de DNA de flanqueamento da molécula de ácidos nucleicos de reparo podem variar quanto ao comprimento e devem ter pelo menos cerca de nt, cerca de 15 nt ou cerca de 20 nt de comprimento. No entanto, a região de flanqueamento pode ser tão longa quanto possível (por exem- plo, até cerca de 100-150 kb, tais como cromossomas artificiais bacteri- anos (Bacterial Artificial Chromosomes, BACs) completos. De preferên- cia, a região de flanqueamento terá a partir de 50 a 2000 nt, por exem- plo, cerca de 100 200, 500, 1000 ou 1000 nt. Além disso, as regiões que flanqueiam o DNA de interesse não precisam ser idênticas às regiões de homologia (as regiões de DNA que flanqueiam a localização pré-se- lecionada) e podem ter entre cerca de 80 % a cerca de 100 % de iden- tidade de sequência, de preferência cerca de 95 % a cerca de 100 % de identidade de sequência com as regiões de DNA que flanqueiam a lo- calização pré-selecionada. Quanto maior a região de flanqueamento, menos rigoroso será o requisito de homologia. Além disso, para conse- guir a troca da sequência de DNA alvo na localização pré-selecionada sem alterar a sequência de DNA das sequências de DNA adjacentes,

as sequências de DNA de flanqueamento devem ser, de preferência, idênticas às regiões de DNA a montante e a jusante que flanqueiam a localização pré-selecionada.

[0048] Conforme usado aqui, "a montante" indica uma localização em uma molécula de ácidos nucleicos que está mais próxima da extre- midade 5' da dita molécula de ácidos nucleicos. Da mesma forma, o termo "a jusante" se refere a uma localização em uma molécula de áci- dos nucleicos que está mais próximo da extremidade 3' da dita molécula de ácidos nucleicos. Para evitar dúvidas, as moléculas de ácidos nuclei- cos e suas sequências são, tipicamente, representadas na direção 5' para 3' (da esquerda para a direita).

[0049] Para atingir a modificação da sequência na localização pré- selecionada, as regiões de flanqueamento devem ser escolhidas de modo que a extremidade 3' da região de flanqueamento a montante e/ou a extremidade 5' da região de flanqueamento a jusante se alinhem com as extremidades da localização predefinida. Como tal, a extremidade 3' da região de flanqueamento a montante determina a extremidade 5' da localização predefinida, enquanto que a extremidade 5' da região de flanqueamento a jusante determina a extremidade 3' da região predefi- nida.

[0050] Conforme usado aqui, a dita localização pré-selecionada que está localizada fora ou distante do sítio de clivagem (e/ou reconheci- mento) significa que a localização na qual se pretende fazer a modifica- ção genômica (a localização pré-selecionada) não compreende o sítio de clivagem e/ou sítio de reconhecimento da enzima DSBI ou SSB, ou seja, a localização pré-selecionada não se sobrepõe ao sítio de cliva- gem (e/ou reconhecimento). Fora/distante neste aspecto significa, as- sim, a montante ou a jusante do sítio de clivagem (e/ou reconheci- mento).

[0051] A célula de planta modificada que sofreu transformação ou edição gênica de acordo com os métodos da presente invenção e pos- sivelmente tem um genoma modificado pode ser regenerada em uma planta inteira (fértil). Assim, em um aspecto preferido da invenção, a transformação de uma célula de planta ou a modificação de um genoma de uma célula de planta, respectivamente, é seguida por uma etapa de regeneração de uma planta.

[0052] Consequentemente, a presente invenção fornece um mé- todo para a produção de uma planta transgênica que compreende as seguintes etapas: (a) transformar uma célula de planta de acordo com o mé- todo descrito acima, e (b) regenerar uma planta transgênica a partir da célula trans- gênica resultante da etapa (a) ou de uma célula transgênica derivada da mesma.

[0053] As plantas transgênicas ou células transgênicas da etapa (b) compreendem pelo menos uma sequência de nucleotídeos de interesse introduzida na etapa (a) como um transgene de maneira estável ou tran- sitória.

[0054] Além disso, a presente invenção também fornece um método para produzir uma planta geneticamente modificada que compreende as seguintes etapas: (a) modificar o genoma de uma célula de planta de acordo com o método descrito acima, e (b) regenerar uma planta a partir da célula resultante da etapa (a) ou de uma célula (que compreende a modificação do genoma gerado na etapa (a)) derivada do mesmo.

[0055] As técnicas de regeneração dependem da manipulação de determinados fito-hormônios em um meio de crescimento de cultura te- cidual, dependendo ocasionalmente de um marcador biocida e/ou her- bicida que pode ser introduzido juntamente com a(s) sequência(s) de nucleotídeos desejada(s) de interesse. A regeneração de plantas a par- tir de protoplastos cultivados é descrita em Evans et a/., Protoplasts Iso- lation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, páginas 124-176, MachMillilan Publishing Company, New York, 1983; e Binding, Regene- ration of Plants, Plant Protoplasts, páginas 21-73, CRC Press, Boca Ra- ton, 1985. A regeneração também pode ser obtida a partir de calos ve- getais, explantes, protoplastos, embriões imaturos ou maduros, tecido embrionário, tecidos meristemáticos, órgãos ou partes dos mesmos. Tais técnicas de regeneração são descritas de modo geral em Klee (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467486. Para obter plantas inteiras a partir de tecidos transgênicos, tais como embriões imaturos, elas po- dem ser cultivadas sob condições ambientais controladas em uma série de meios contendo nutrientes e hormônios, um processo conhecido como cultura tecidual. Uma vez que plantas inteiras são geradas e pro- duzem sementes, a avaliação da progênie é iniciada.

[0056] A presente invenção é aplicável a qualquer espécie de planta, seja monocotiledônea ou dicotiledônea. De preferência, plantas que podem estar submetidas aos métodos e usos da presente invenção são plantas que não pertencem ao gênero Arabidopsis ou que não são plantas da espécie Arabidopsis thaliana. Mais preferivelmente, as plan- tas que podem ser submetidas aos métodos e usos da presente inven- ção são selecionadas a partir do grupo que consiste em Hordeum vul- gare, Hordeum bulbusom, Sorghum bicolor, Saccharum officinarium, Zea spp., including Zea mays, Setaria italica, Oryza minuta, Oryza sa- tiva, Oryza australiensis, Oryza alta, Triticum aestivum, Triticum durum, Secale cereale, Triticale, Malus domestica, Brachypodium distachyon, Hordeum marinum, Aegilops tauschii, Daucus glochidiatus, Beta spp., including Beta vulgaris, Daucus pusillus, Daucus muricatus, Daucus ca- rota, Eucalyptus grandis, Nicotiana sylvestris, Nicotiana tomentosifor-

mis, Nicotiana tabacum, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersi- cum, Solanum tuberosum, Coffea canephora, Vitis vinifera, Erythrante guttata, Genlisea aurea, Cucumis sativus, Marus notabilis, Crucihima- laya himalaica, Crucihimalaya wallichii, Cardamine nexuosa, Lepidium virginicum, Capsella bursa pastoris, Olmarabidopsis pumila, Arabis hir- sute, Brassica napus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Raphanus sati- vus, Brassica juncacea, Brassica nigra, Eruca vesicaria subsp. sativa, Citrus sinensis, Jatropha curcas, Populus trichocarpa, Medicago trunca- tula, Cicer yamashitae, Cicer bijugum, Cicer arietinum, Cicer reticula- tum, Cicer judaicum, Cajanus cajanifolius, Cajanus scarabaeoides, Phaseolus vulgaris, Glycine max, Gossypium sp., Astragalus sinicus, Lotus japonicas, Torenia fournieri, Allium cepa, Allium fistulosum, Allium sativum, Helianthus annuus, Helianthus tuberosus and/or Allium tubero- sum. Particularly preferred are Beta vulgaris, Zea mays, Triticum aesti- vum, Hordeum vulgare, Secale cereale, Helianthus annuus, Solanum tuberosum, Sorghum bicolor, Brassica rapa, Brassica napus, Brassica juncacea, Brassica oleracea, Glycine max e/ou Gossypium sp.

[0057] Uma planta da espécie Beta vulgaris é, em particular, uma planta da subespécie Beta vulgaris subsp. maritima (Seemangold) ou Beta vulgaris subsp. vulgar. Esta inclui, por exemplo, Beta vulgaris subsp. vulgaris var. altissima (beterraba sacarínica no sentido mais res- trito), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. vulgar (Mangold), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. condditiva (beterraba), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. crassa/alba (beterraba forrageira).

[0058] O objetivo da presente invenção são também as plantas que são obtidas ou obteníveis por meio dos métodos descritos acima ou par- tes ou sementes das plantas. Consequentemente, uma modalidade da invenção é uma planta transgênica obtida ou obtenível por meio do mé- todo acima de transformar uma célula de planta e regenerar uma planta a partir da dita célula, bem como progênie, sementes ou partes da mesma, em que a progênie, a semente ou a parte da mesma compre- ende a pelo menos uma sequência de nucleotídeos de interesse como um transgene, de maneira estável ou transitória. Outra modalidade da invenção é uma planta geneticamente modificada obtida ou obtenível por meio do método acima para modificar o genoma de uma célula de planta e regenerar uma planta a partir da dita célula, bem como a pro- gênie, sementes ou partes da mesma, em que a progênie, a semente ou a parte da mesma compreende a modificação genômica introduzida por meio do método da invenção.

[0059] Partes de uma planta incluem órgãos de plantas tais como folhas, calos, caules, raízes, brotos vegetativos, meristemas, embriões, anteras, óvulos ou frutas, tecidos vegetais, tais como tecido caloso, te- cido de armazenamento, tecido meristemático, tecido embriogênico, te- cido foliar, tecido de broto, tecido radicular, tecido tumoral vegetal ou tecido reprodutivo, incluindo células de planta, tais como células de planta isoladas com uma parede celular ou agregados ou protoplastos, por exemplo, e pode significar uma fusão de vários órgãos, por exemplo, uma flor ou semente ou parte de um órgão, por exemplo, um segmento transversal do caule.

[0060] Outro objetivo da presente invenção é uma célula de planta ou sementes derivadas da planta transgênica ou planta geneticamente modificada acima. Uma célula de planta derivada da planta transgênica acima compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos de in- teresse como um transgene, enquanto que uma célula de planta deri- vada da planta geneticamente modificada acima compreende a modifi- cação em seu genoma.

[0061] A invenção será ainda descrita com referência às seguintes figuras e exemplos descritos aqui. No entanto, deve ser entendido que a invenção não está limitada a tais exemplos.

[0062] Salvo indicação em contrário nos Exemplos, todas as técni- cas de DNA recombinante são realizadas de acordo com protocolos pa- drão conforme descrito em Sambrook et a/. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY e nos Volumes 1 e 2 de Ausubel et a/. (1994) Current Proto- cols in Molecular Biology, Current Protocols, EUA. Os materiais e méto- dos padrão para o trabalho molecular de plantas são descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) por RDD Cray, publicado em conjunto pela BIOS Scientific Publications Ltda. (Reino Unido) e Blackwell Scien- tific Publications, Reino Unido. Outras referências para técnicas padrão de biologia molecular incluem Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição, Cold Spring Harbor La- boratory Press, NY, Volumes | e Il de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Segunda Edição, Academic Press (Reino Unido). Materiais e métodos padrão para reações em cadeia da polimerase podem ser en- contrados em Dieffenbach e Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, e em McPherson et al. (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, Primeira Edição, Springer Verlag, Alemanha.

[0063] Todas as patentes, pedidos de patente e publicações ou des- crições públicas (incluindo publicações na Internet) mencionadas ou ci- tadas aqui são incorporadas por referência na íntegra. Figuras

[0064] A Figura 1 mostra os resultados de uma análise qualitativa da indução de calos em meios suplementados com TSA a 0,5, 1,0 ou 5,0 UM. A indução de controle em meio sem TSA também é mostrada. Dez explantes por condição foram fotografados aleatoriamente.

[0065] A Figura 2 mostra os resultados de uma análise qualitativa da indução de calos em meios suplementados com TSA a 0,01 ou 0,1 UM. A indução de controle em meio sem TSA também é mostrada. Dez explantes por condição foram fotografados aleatoriamente.

[0066] A Figura 3 mostra diagramas de barras que demonstram a indução de calos e a regeneração de plantas usando diferentes quanti- dades de TSA.

A: frequência de indução de calos a partir de explantes folia- res incubados em meio suplementado com TSA a 0,5, 1,0 e 5,0 UM.

B: quantidade de calos produzidos sob cada condição. À quantidade foi estimada com base no número de pratos com calos co- lhidos, obtidos em cada variante.

C: capacidade de regeneração de rebentos com base no nú- mero de rebentos desenvolvidos por explante foliar usado para cada condição experimental.

[0067] A Figura 4 mostra diagramas de barras que demonstram a indução de calos e a regeneração de plantas usando diferentes quanti- dades de TSA.

A: frequência de indução de calos a partir de explantes folia- res incubados em meio suplementado com TSA a 0,01 e 0,1 uM.

B: quantidade de calos produzidos em cada condição. À quantidade foi estimada com base no número de pratos com calos co- lhidos, obtidos em cada variante.

C: capacidade de regeneração de rebentos com base no nú- mero de rebentos desenvolvidos por explante foliar usado para cada condição experimental.

[0068] A Figura 5 é um diagrama que mostra a quantificação de explantes foliares com desenvolvimento de calos friáveis em 3 pontos no tempo durante a indução de calos. O meio foi suplementado com diferentes concentrações de TSA.

[0069] A Figura 6. A regeneração de rebentos a partir de calos in- duzida em meio suplementado com TSA é aprimorada em genótipos recalcitrantes. A: Frequência média de indução de calo do genótipo con- trole (1) e dois genótipos com nível médio (2) ou alto (3) de recalcitrância na regeneração da parte aérea. A indução de calo foi realizada em meio sem TSA (barra branca) ou suplementado com TSA a 0,01 uM (barra cinza). B: frequência de regeneração da parte aérea dos calos produzi- dos tanto no meio de controle (barra branca) quanto no meio suplemen- tado com TSA a 0,01 uM (barra cinza). Foram realizados dois experi- mentos com três repetições por genótipo. Observe que o genótipo 3 muito recalcitrante é capaz de regenerar rebentos somente quando os calos foram produzidos em meio que contém TSA. Exemplos

1. Descrição técnica do protocolo de indução de calos de beterraba sa- carínica

[0070] Este método é com base na publicação de Kischenko et al., 2005 Cell Biology Internacional.

[0071] 1. Rebentos micropropagados do genótipo S706 foram usa- dos como matéria-prima. Os rebentos foram multiplicados em sais MS suplementados com 30 g/| de sacarose e 0,25 mg/l de benziladenina (BAP).

[0072] 2. Para induzir a calos friáveis, os explantes foliares foram isolados de rebentos micropropagados e incubados em meio que con- tém sais MS, incluindo 15 g/| de sacarose e 2 mg/| de BAP como controle e no mesmo meio suplementado com TSA a 0,01 uM (B1), TSA a 0,1 UM (B2), TSA a 0,5 uM (B3), TSA a 1,0 UuM (B4) e TSA a 5,0 UM (B5), a 28 ºC no escuro durante 7 semanas.

[0073] 3. O desenvolvimento de calos a partir de explantes foliares foi monitorado durante a incubação no meio de indução de calos em 4, 5,6 e 7 semanas.

[0074] 4. Os explantes foliares que produzem calos friáveis foram pontuados para calcular a frequência de indução de calos (porcentagem de explantes foliares que produziram calos friáveis).

[0075] Uma frequência de indução de calo aumentada foi obser- vada quando TSA é suplementada ao meio de indução de calo em uma faixa de concentração a partir de 0,01 uM a 1,0 uM (Figura 1, Figura 2, Figura 3A e Figura 4A). O efeito depende da concentração de TSA, uma vez que concentrações mais altas de TSA (por exemplo, 5,0 UM) pare- cem ser citotóxicas. Além disso, a TSA aumenta a quantidade de calos por explante foliar (Figuras 3B e 4B).

2. Descrição técnica do protocolo de regeneração de rebentos

[0076] 1. Os calos friáveis da etapa 4 foram colhidos em meio que contém sais MS, 30 g/l de sacarose, 1 mg/l de GA3 e 1 mg/l de TDZ e transferidos para pratos separados.

[0077] 2. Os pratos foram incubados sob a luz (16 h) a 24 ºC durante dias.

[0078] 3. Os rebentos em desenvolvimento foram contados sob um estereomicroscópio para estimar a capacidade de regeneração (número de rebentos por explante foliar inicial).

3. Resultados

[0079] Foi observado um número aumentado de rebentos regene- rados por explante (Figuras 3C e 4C). Além disso, a TSA acelera a for- mação de calos e, portanto, reduz o tempo para produzir eventos trans- gênicos (Figura 5). Após 28 dias, ocorreu um grande número de explan- tes foliares com calos em desenvolvimento. Sem a aplicação de TSA, este número não foi atingido, mesmo após 49 dias. Além disso, os pri- meiros testes iniciais mostraram que, ao adicionar TSA, a recalcitrância dependente de genótipo à formação de calos poderia ser reduzida.

[0080] Experimentos adicionais mostram que a regeneração de re- bentos induzidos em meio (CIM) suplementado com TSA é aprimorada em genótipos recalcitrantes de Beta vulgaris. Os genótipos 1 e 2 repre-

sentam genótipos recalcitrantes de Beta vulgaris a partir dos quais ape- nas uma pequena quantidade de plantas pode ser regenerada a partir de tecido caloso por meio de protocolos padrão.

O genótipo 3 é recalci- trante absoluto, cuja regeneração através de protocolos conhecidos não é possível.

A indução de calo foi realizada em meio sem TSA (barra branca) ou suplementado com TSA a 0,01 uM (barra cinza) (Figura 6A). Frequência de regeneração de rebentos a partir do calo produzido no meio de controle (barra branca) ou no meio suplementado com TSA a 0,01 UM (barra cinza) (Figura 6B). Foram realizados dois experimentos com três repetições por genótipo.

No genótipo 1, a adição de TSA re- sulta em uma formação aumentada de calos e uma capacidade aprimo- rada de regeneração de rebentos a partir deste calo: a frequência média de indução de calos aumenta de 66,3 % para 82 %, o número médio de rebentos por explante de 4,7 para 7,7. Para o genótipo 2, não foi obser- vado aumento significativo da frequência de indução de calos, no en- tanto, o calo produzido era obviamente de melhor qualidade, de modo que a capacidade de regeneração de rebentos foi claramente aprimo- rada: o número médio de rebentos por explante aumentou de 2,4 para 4,6. Para o genótipo 3 com alto nível de recalcitrância, a frequência de indução de calos foi muito baixa sem e com TSA, talvez um pouco maior com TSA.

No entanto, a regeneração da parte aérea dos calos produzi- dos só foi possível se o calo foi induzido na presença de TSA.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para induzir à formação de calos a partir de pelo menos uma célula vegetal, caracterizado por compreender a etapa de cultivar pelo menos uma célula vegetal na presença de um inibidor de histona desacetilase (HDACI).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma célula vegetal é uma célula somática ou embrionária e, de preferência, um explante ou uma parte do mesmo isolado de uma planta.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que o HDACi é tricostatina A (TSA).

4, Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a etapa de cultivar a pelo menos uma célula compreende: (i) crescer a pelo menos uma célula em um meio que com- preende o HDACi , de preferência em uma concentração de 0,01 a 5,0 UM, e/ou (ii) introduzir o HDACi em pelo menos uma célula, por exem- plo, via bombardeamento, eletroporação ou microinjeção.

5. Método para regenerar brotos a partir de um tecido caloso caracterizado por compreender as seguintes etapas: (a) induzir à formação de calos a partir de pelo menos uma célula vegetal por meio do método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a4, e (b) cultivar o tecido caloso obtido na etapa (a) sob condições que promovam o crescimento de brotos a partir do tecido caloso.

6. Método para transformar uma célula vegetal caracterizado por compreender as seguintes etapas: (a) induzir à formação de calos a partir de pelo menos uma célula vegetal por meio do método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a4,e (b) introduzir, em uma célula vegetal a ser usada na etapa (a) e/ou em uma célula calosa obtida na etapa (a), pelo menos uma sequência de nucleotídeos de interesse.

7. Método para produzir uma planta transgênica caracteri- zado por compreender as seguintes etapas: (a) transformar uma célula vegetal por meio do método como definido na reivindicação 6, e (b) regenerar uma planta transgênica a partir da célula trans- gênica resultante da etapa (a) ou de uma célula transgênica derivada da mesma.

8. Método para modificar o genoma de uma célula vegetal caracterizado por compreender as seguintes etapas (a) induzir à formação de calos a partir de pelo menos uma célula vegetal por meio do método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a4,e (c) modificar o genoma de uma célula vegetal a ser usada na etapa (a) e/ou uma célula de tecido caloso obtida na etapa (a) ao intro- duzir, na dita célula, uma enzima efetora específica para o local que re- conhece preferencialmente um local predeterminado no genoma da dita célula e, opcionalmente, uma molécula de ácidos nucleicos de reparo, em que a modificação do dito genoma é selecionada a partir de: i. uma substituição de pelo menos um nucleotídeo; ii. uma eliminação de pelo menos um nucleotídeo; iii. uma inserção de pelo menos um nucleotídeo; ou iv. qualquer combinação de |. - iii.

9. Método para produzir uma planta geneticamente modifi- cada, caracterizado por compreender as seguintes etapas: (a) modificar o genoma de uma célula vegetal por meio do método como definido na reivindicação 8, e (b) regenerar uma planta a partir da célula resultante da etapa (a) ou a partir de uma célula derivada da mesma.

10. Planta transgênica caracterizada por ser obtida ou obte- nível por meio do método como definido na reivindicação 7 ou uma planta descendente da mesma.

11. Planta geneticamente modificada caracterizada por ser obtida ou obtenível por meio do método como definido na reivindicação 9 ou uma planta descendente da mesma.

12. Célula vegetal ou semente da planta, como definida na reivindicação 10, caracterizadas pelo fato de que a célula vegetal ou a semente compreende a pelo menos uma sequência de nucleotídeos de interesse como transgene.

13. Célula vegetal ou semente da planta, como definida na reivindicação 11, caracterizadas pelo fato de que a célula vegetal ou a semente compreende a modificação no genoma.

14. Uso de um HDACi caracterizado por ser em um método para induzir à formação de calos a partir de pelo menos uma célula ve- getal, em particular a partir de um explante isolado de uma planta.

15. Uso de um HDACIi caracterizado por ser em um método para regeneração indireta de uma planta, em um método de transforma- ção de uma célula vegetal ou em um método de modificação do genoma de uma célula vegetal.