CN112470925A - 樟子松组织培养基及生根方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种樟子松组织培养基及生根方法，生根方法包括以下步骤：选择樟子松幼嫩针叶部分作为外植体，并进行杀菌消毒处理；诱导前将外植体浸泡到NaCl溶液中进行预处理；愈伤组织的诱导；愈伤组织的增殖；生根培养。采用本发明方法进行樟子松愈伤组织诱导和培养解决了目前樟子松组织培养技术难度大、效率低的问题。本发明解决了樟子松植株组培外植体的选择,并提出了诱导分化、增殖和生根的组织培养方法。这不仅对樟子松，而且对其他针叶植物的育种具有重要意义，具有巨大的生态和经济意义。

Description

樟子松组织培养基及生根方法
技术领域
本发明涉及一种樟子松组织培养基及生根方法，属于植物培植技术领域。
背景技术
针叶树以高大通直的形态以及优良木材质地，在实木用材、造纸、造林等领域都具有重要的地位。其中樟子松是具有重要经济价值和生态功能的针叶树种之一。但是樟子松的繁殖一直存在效率低、生根困难的问题，其中组织培养中不定根诱导效率是制约樟子松育种大规模推广应用的一个重要难题。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种樟子松组织培养基及生根方法，以解决樟子松组织培养过程中植物愈伤组织的诱导和分化生根的难题。
为解决上述技术问题，本发明提供一种樟子松组织培养基，包括：
愈伤组织诱导培养基：1/2 LM培养基+2，4-D +6-BA+ NAA+黄基水杨酸+β-巯基乙醇+Vorinostat+5-azacytidine；
增殖培养基：MS基础培养基+ 6-BA+ NAA+γ-氨基丁酸+维生素C+维生素B+乳酸；
生根培养基：1/4强度的DCR基本培养基+蔗糖+NAA+IBA( 5mg/L)+IAA +GA3+β-巯基乙醇。
优选地，所述2，4-D 的浓度为0.4-5.0 mg/L，6-BA的浓度为1.0-4.0 mg/L，NAA的浓度为0.3-10.0mg/L，黄基水杨酸的浓度为0.2-5.0μg/L，β-巯基乙醇的终浓度为1：2000-5500，所述Vorinostat为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，终浓度0.2-1.0μmol/L，所述5-azacytidine 为一种DNA甲基化酶抑制剂，浓度为0.5-5.5μmol/L。
优选地，所述6-BA的浓度为1.0-3.0 mg/L，NAA的浓度为0.1-10.0 mg/L，γ-氨基丁酸的浓度为5.0-50μmol/L，维生素C的浓度为0.01-0.8 μg/L，维生素B的浓度为0.01-1.5μg/L，乳酸的浓度为0.5-5.0 %。
优选地，所述蔗糖的浓度为0.5%，NAA的浓度为0.05-1.5mg /L，IBA的浓度为0.5-15mg/L，IAA的浓度为0.1-10.0 mg/L，GA3的浓度为0.05-5.5 mg/L，β-巯基乙醇的终浓度1：3000-10000。
本发明还提供一种樟子松组织培养生根方法，包括以下步骤：
选择樟子松幼嫩针叶部分作为外植体，并进行杀菌消毒处理；
诱导前将外植体浸泡到NaCl溶液中进行预处理；
采用上述的愈伤组织诱导培养基进行愈伤组织诱导；
采用上述的增殖培养基进行愈伤组织的增殖；
采用上述的生根培养基进行生根培养。
优选地，选择樟子松于初春季节取幼嫩针叶片作为外植体。
优选地，所述杀菌消毒处理方法为：将幼嫩针叶在超净台中用75%酒精浸泡1分钟，无菌水流水洗3次,再用0.1% HgCl2浸泡10分钟后，用5% 百菌清浸泡1小时。
优选地，所述的诱导前对外植体的预处理为：浸泡到10g/L NaCl溶液5分钟。
本发明所达到的有益效果：
（1）培养基的配方中使用了调节DNA甲基化酶活性的DNA甲基化酶抑制剂5-azacytidine和调节乙酰化酶活性的组蛋白去乙酰化酶抑制剂Vorinostat，目的是用于诱导基因组表观遗传学的改变，从而促进促进细胞分裂素、生长素结合蛋白等植物细胞增殖分化过程中重要的相关基因的表达上调，调控组织培养的高效进行。
（2）为降低组织培养过程中氧自由基对细胞的损伤，本发明使用β-巯基乙醇这种还原剂，从而减轻氧自由基对新生细胞的伤害，提高组培效率。γ-氨基丁酸是重要的植物生长促进剂，本发明研究发现其能加快植物愈伤组织形成的速度，经检测发现添加γ-氨基丁酸后组培过程中植物组织中超氧物歧化酶(SOD)水平上升，从而促进了组培的效率。因此从利用β-巯基乙醇抗氧化，和利用γ-氨基丁酸提高SOD水平来抑制氧自由基对组培的抑制作用。
（3）采用本发明方法进行樟子松愈伤组织诱导和培养解决了目前樟子松组织培养技术难度大、效率低的问题。本发明解决了樟子松植株组培外植体的选择,并提出了诱导分化、增殖和生根的组织培养方法。这不仅对樟子松，而且对其他针叶植物的育种具有重要意义，具有巨大的生态和经济意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
本发明提供一种樟子松组织培养生根方法，包括以下步骤：
实施例1
步骤一、选择樟子松针叶为外植体，并杀菌消毒处理：
以嫩针叶片为外植体：3月的初春季节取幼嫩针叶片。
杀菌消毒处理方法为：将幼嫩针叶在超净台中用75%酒精浸泡1分钟，无菌水流水洗3次,再用0.1% HgCl2浸泡10分钟后，用5% 百菌清浸泡1小时。
步骤二、诱导前对外植体的预处理 ：
消毒处理后将幼嫩针叶浸泡到10 g/L NaCl溶液5分钟。通过NaCl的刺激，有助于愈伤组织形成。
步骤三、愈伤组织诱导培养的配制 ：
愈伤组织诱导培养基的具体配方如下：1/2 LM培养基+2，4-D (0.4mg/L)+6-BA(1.0 mg/L)+ NAA（0.3mg/L）+黄基水杨酸（0.2μg/L）+β-巯基乙醇（终浓度1：2000）+Vorinostat(SAHA，一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，终浓度0.5μmol/L)+5-azacytidine (5-AZA，一种DNA甲基化酶抑制剂1.2μmol/L)。
将步骤一、二中处理好的外植体接种到培养基。针叶在接种7天后,针叶变粗，2周后可见切口处出现绿色颗粒愈伤组织。
步骤四、增殖培养基配制与愈伤组织的增殖：
增殖培养基成分包括：MS基础培养基+ 6-BA(2.0 mg/L)+ NAA（0.5 mg/L）+γ-氨基丁酸（GABA,50μmol/L）+维生素C（0.2 μg/L）+维生素B（0.1 μg/L）+乳酸（2%）。
外植体接种1个月左右后，将愈伤组织转接到增殖培养基,转接7天后, 愈伤组织快速生长快，逐渐呈深绿色。
步骤五、生根培养基配制与生根诱导：
分化培养基配制成分如下：1/4强度的DCR基本培养基+蔗糖（0.5%）+NAA( 0.2mg /L)+IBA( 5mg/L)+IAA (0.5 mg/L)+GA3( 0.2mg/L)+β-巯基乙醇（终浓度1：3000）。
在转接到培养基后，生根效率为25.32%。
实施例2
步骤一、选择樟子松针叶为外植体，并杀菌消毒处理： 步骤同实施例1。
步骤二、诱导前对外植体的预处理 ：步骤同实施例1。
步骤三、愈伤组织诱导培养的配制 ：
愈伤组织诱导培养基的具体配方如下：1/2 LM培养基+2，4-D (0.4mg/L)+6-BA(1.5 mg/L)+ NAA（0.5mg/L）+黄基水杨酸（0.5μg/L）+β-巯基乙醇（终浓度1：4000）+Vorinostat(SAHA，一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，终浓度0.9μmol/L)+5-azacytidine (5-AZA，一种DNA甲基化酶抑制剂1.5μmol/L)。
将步骤一、二中处理好的外植体接种到培养基。针叶在接种5天后,针叶变粗，3周后可见切口处出现绿色颗粒愈伤组织。
步骤四、增殖培养基配制与愈伤组织的增殖：
增殖培养基成分包括：MS基础培养基+ 6-BA(2.0 mg/L)+ NAA（0.5 mg/L）+γ-氨基丁酸（GABA,30μmol/L）+维生素C（0.7 μg/L）+维生素B（0.3 μg/L）+乳酸（2%）。
外植体接种1个月左右后，将愈伤组织转接到增殖培养基,转接5天后, 愈伤组织快速生长快，逐渐呈深绿色。
步骤五、生根培养基配制与生根诱导：
分化培养基配制成分如下：1/4强度的DCR基本培养基+蔗糖（0.5%）+NAA( 0.2mg /L)+IBA( 5mg/L)+IAA (0.9 mg/L)+GA3( 0.6mg/L)+β-巯基乙醇（终浓度1：5000）。
在转接到培养基后，生根效率为18.55%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.樟子松组织培养基，其特征在于，包括：
愈伤组织诱导培养基：1/2 LM培养基+2，4-D +6-BA+ NAA+黄基水杨酸+β-巯基乙醇+Vorinostat+5-azacytidine；
增殖培养基：MS基础培养基+ 6-BA+ NAA+γ-氨基丁酸+维生素C+维生素B+乳酸；
生根培养基：1/4强度的DCR基本培养基+蔗糖+NAA+IBA( 5mg/L)+IAA +GA3+β-巯基乙醇。
2.根据权利要求1所述的樟子松组织培养基，其特征在于，所述2，4-D 的浓度为0.4-5.0 mg/L，6-BA的浓度为1.0-4.0 mg/L，NAA的浓度为0.3-10.0mg/L，黄基水杨酸的浓度为0.2-5.0μg/L，β-巯基乙醇的终浓度为1：2000-5500，所述Vorinostat为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，终浓度0.2-1.0μmol/L，所述5-azacytidine 为一种DNA甲基化酶抑制剂，浓度为0.5-5.5μmol/L。
3.根据权利要求1所述的樟子松组织培养基，其特征在于，所述6-BA的浓度为1.0-3.0mg/L，NAA的浓度为0.1-10.0 mg/L，γ-氨基丁酸的浓度为5.0-50μmol/L，维生素C的浓度为0.01-0.8 μg/L，维生素B的浓度为0.01-1.5 μg/L，乳酸的浓度为0.5-5.0 %。
4.根据权利要求1所述的樟子松组织培养基，其特征在于，所述蔗糖的浓度为0.5%，NAA的浓度为0.05-1.5mg /L，IBA的浓度为0.5-15mg/L，IAA的浓度为0.1-10.0 mg/L，GA3的浓度为0.05-5.5 mg/L，β-巯基乙醇的终浓度1：3000-10000。
5.樟子松组织培养生根方法，其特征在于，包括以下步骤：
选择樟子松幼嫩针叶部分作为外植体，并进行杀菌消毒处理；
诱导前将外植体浸泡到NaCl溶液中进行预处理；
采用权利要求1或2所述的愈伤组织诱导培养基进行愈伤组织诱导；
采用权利要求1或3所述的增殖培养基进行愈伤组织的增殖；
采用权利要求1或4所述的生根培养基进行生根培养。
6.根据权利要求5所述的樟子松组织培养生根方法，其特征在于，选择樟子松于初春季节取幼嫩针叶片作为外植体。
7.根据权利要求5所述的樟子松组织培养生根方法，其特征在于，所述杀菌消毒处理方法为：将幼嫩针叶在超净台中用75%酒精浸泡1分钟，无菌水流水洗3次,再用0.1% HgCl2浸泡10分钟后，用5% 百菌清浸泡1小时。
8.根据权利要求5所述的樟子松组织培养生根方法，其特征在于，所述的诱导前对外植体的预处理为：浸泡到10g/L NaCl溶液5分钟。
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