CN113575418A - 用于樟子松离体胚干化处理的装置和培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于樟子松离体胚干化处理的装置，包括：顶部开口的储水容器、顶部开口的离体胚容器和浸水层，所述离体胚容器的底面设置有打孔区，所述打孔区设置有若干紧密排布的细孔；所述离体胚容器放置于所述储水容器内，所述离体胚容器底面与储水容器的底面的内表面之间设置所述浸水层，所述浸水层与离体胚容器底面接触的区域包含所述打孔区；使用时所述储水容器的顶部由封口膜密封。本发明还提供了基于该干化装置对樟子松离体胚处理的方法及促进其萌发生根的方法。本发明首次提供了对樟子松离体胚进行干化处理并进一步促进其萌发生根的技术方案，有利于促进樟子松的组培研究进展。
Description
技术领域
本发明涉及木本植物组织培养技术领域，具体涉及一种用于樟子松离体胚干化生根的装置和方法。
背景技术
在当今针叶树良种扩繁过程中，往往在扦插和嫁接难以成功的时候，选择以胚为外植体的组织培养，尤其采用体细胞胚胎发生技术。这些技术在胚上产生大量幼芽或在愈伤组织上产生大量幼胚，而这些离体幼胚生根困难往往成为育苗技术瓶颈。这主要是由于没有胚乳提供营养，影响了离体胚的正常发育起始和正向进展及代谢水平，其次是离体胚中存在较多内含生根抑制物质。研究表明为这些离体胚提供适宜的温湿度和光照条件，有利于诱导这些离体胚正向的代谢物质积累及各类抑制物质的转化，从而产生有利于生长发育的内含物质。比如王军辉等通过弱光“滤纸容器法”使云杉高频率生根，具体做法是将离体胚放置在垫有2层滤纸的塑料培养皿(40mm×12mm)中，随后将培养皿放置在更大的玻璃培养皿(120mm×15mm)内，玻璃皿中放置10mL无菌水，使得胚处于底面相对干燥而四周相对湿润的环境中，培养皿用封口膜封口。这种过程也叫做“干化”。对于云杉干化处理14天胚的颜色也发生了变化，标志着胚内含物质产生了良性的代谢变化。研究表明弱光干化，即在光强低于2000Lx的条件下，更有利于云杉胚的生长发育。利用以上方法，将变了色的云杉离体胚接种到未加激素的培养基上，云杉离体胚可以生长和生根。以上云杉离体胚干化生根的方法，表明了离体胚的萌发生根需要特殊的环境，而这种环境是种特异性的，也就是不同树种的胚会需要不同的适宜萌发生根的环境，尤其是空气湿度和光照两个方面。但是，将同样用弱光“滤纸容器法”处理樟子松离体胚时却未见胚颜色发生变化，也未见生长。将这样的胚接种到培养基上，不管是否加了激素，也未见胚颜色变化，有的处理胚伸长但未见子叶分化，更没有根的分化，因此，促进樟子松的离体胚的萌发和生根条件和方法需要进一步摸索和研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种使樟子松离体胚能够干化变色并促进其生根的方法。
一种用于樟子松离休胚干化处理的装置，包括：
顶部开口的储水容器、顶部开口的离体胚容器和浸水层，所述离体胚容器的底面设置有打孔区，所述打孔区设置有若干紧密排布的细孔；所述离体胚容器放置于所述储水容器内，所述离体胚容器底面与储水容器的底面的内表面之间设置所述浸水层，所述浸水层与离体胚容器底面接触的区域包含所述打孔区；使用时所述储水容器的顶部由封口膜密封；所述浸水层由玻璃微纤维、涤纶树脂或聚丙烯制成。
在根据本发明的一个实施方案中，所述细孔的孔径为0.5-1.5mm。
在根据本发明的一个实施方案中，所述浸水层和离体胚容器底面之间还设置有微孔滤膜；优选地，所述微孔滤膜孔径为0.4-2.0μm。
在根据本发明的一个实施方案中，所述储水容器直径120-150mm，高15-25mm；所述离体胚容器直径90-120mm，高12-20mm。
在根据本发明的一个实施方案中，所述储水容器为玻璃材质；所述离体胚容器为玻璃或聚苯乙烯材质。
本发明还提供了一种樟子松离体胚干化处理的方法，包括：
1)于无菌环境下，向灭菌处理的储水容器中注入少量无菌水，依次将浸水层和离体胚容器置入储水容器中，然后将樟子松离体胚放置于离体胚容器的打孔区；
2)以封口膜将储水容器的顶部密封；
3)将密封后的储水容器置于光强为11000-13000Lux的全光谱LED灯侧向光照下进行干化处理8-14天。
在根据本发明的一个实施方案中，还包括：
在浸水层与离体胚容器之间放置有微孔滤膜。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)所述樟子松离体胚的前处理是通过包括下述步骤的方法实现的：
以75％酒精对离体胚进行灭菌处理5-10s，然后以蒸馏水冲洗10-20s，再以吸水纸将离体胚上的水分去除。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)中所述樟子松离体胚的之间间距不小于5mm。
本发明进一步提供了一种促进樟子松离体胚萌发的方法，包括：
1)将经权利要求6-9中任一项所述的方法干化处理后的樟子松离体胚置于1/4MS培养基上培养45天，至获得生长出针叶的培养材料；
2)将所述生长出针叶的培养材料转移至萌发培养基中培养至其生根，所述萌发培养基由1/4MS培养基加入IBA1.0 mg/L和0.1％AC配制而成；优选地在萌发培养基中培养60天。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
本发明提供的干化装置可以基于实验室常用的培养皿和滤纸制备，简单便捷，并且相对于现有技术中的“滤纸桥法”本发明的干化装置有利于在干化过程中观察种子变化，并且显著减少了霉菌污染的情况。同时，由于在研究中发现樟子松离体胚的干化处理条件显著有别于云杉等现有技术中公开的品种，因而，本发明首次提供了对樟子松离体胚进行干化处理并进一步促进其萌发生根的技术方案，有利于促进樟子松的组培研究进展。
附图说明
图1为本发明的用于樟子松离体胚干化处理的装置结构示意图；
图2为改良前滤纸桥法的设置方法与效果；
图3为空培养皿法的效果；
图4为滤纸容器法的效果；
图5为利用滤纸桥法(a)和本发明提供的改良后滤纸桥法(b)进行樟子松离体胚干化处理的霉菌污染的对比图，改良滤纸桥法的效果图(未打孔c，打孔d)；
图6为普通日光灯和全光谱LED植物生长补光灯的光谱对照图；其中，a为普通日光灯，b为全光谱LED植物生长补光灯；
图7为根据本发明的培养的樟子松离体胚的生根过程；其中，a为离体胚樟子无激素培养基下胚轴伸长、子叶生长；b为离体胚在无激素培养基培养45d后转接到有激素培养基；c为离体胚在有激素培养基培养60d后生根图片。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
实施例1樟子松离体胚干化处理装置
本发明首先提供了一种用于樟子松离休胚干化处理的装置，如图1所示，该用于樟子松离休胚干化处理的装置包括顶部开口的储水容器1、顶部开口的离体胚容器2和浸水层3，离体胚容器2的底面设置有打孔区4，打孔区设置有若干紧密排布的细孔，所述细孔的孔径优选为0.5-1.5mm。在实验室中可以将玻璃培养皿用作储水容器1，而利用直径小于玻璃培养皿的塑料培养皿制作离体胚容器，例如，玻璃培养皿规格为120mm×15mm，塑料培养皿的规格为40mm×12mm。当然，由于塑料培养皿不能高压灭菌，在制作时应当注意在无菌环境下利用无菌的器械扎孔制作。离体胚容器2放置于所述储水容器1内，离体胚容器2底面与储水容器1的底面的内表面之间设置所述浸水层3，所述浸水层3与离体胚容器2底面接触的区域包含所述打孔区4。优选地，浸水层和离体胚容器底面之间还设置有微孔滤膜，以进一步提升防止霉菌污染的效果；更优选地，所述微孔滤膜孔径为0.4-2.0微米。使用时需要将储水容器1的顶部由封口膜密封。浸水层3由玻璃微纤维、涤纶树脂或聚丙烯制成，在实验室中可由灭菌处理后的滤纸替代。所述储水容器为玻璃材质；所述离体胚容器为玻璃或聚苯乙烯材质。
实施例2干化方法设计
在本实施例中设置了四种干化处理方法：“滤纸桥法”、“空培养皿法”、“滤纸容器法”和改良“滤纸桥法”，同时以四种方法分别对樟子松离体胚进行干化处理10天。
1.“滤纸桥法”：
将体细胞胚放置在塑料培养皿(40mm×12mm)中，随后将塑料皿放置在更大的玻璃培养皿(120mm×15mm)内，玻璃皿中放置10mL无菌水，用2层湿润滤纸覆盖在塑料皿上做成滤纸桥，最后玻璃皿用封口膜封口(图2)。
2.“空培养皿法”
将体细胞胚放置在塑料培养皿(40mm×12mm)中，随后将塑料皿放置在更大的玻璃培养皿(120mm×15mm)内，玻璃皿中放置10mL无菌水，最后玻璃皿用封口膜封口(图3)。实验布设10天后调查樟子松离体胚变色率为20.0％，污染率为44.4％。
3.“滤纸容器法”
将离体胚放置在垫有2层滤纸的塑料培养皿(40mm×12mm)中，随后将培养皿放置在更大的玻璃培养皿(120mm×15mm)内，玻璃皿中放置10mL无菌水，使得胚处于底面相对干燥而四周相对湿润的环境中，培养皿用封口膜封口(图4)。实验布设10天后调查樟子松离体胚变色率为16.7％，污染率为85.6％。
4.改良“滤纸桥法”，
在滤纸桥法的基础上，不将滤纸放在塑料小培养皿上面，而是垫在下面，塑料培养皿底部中间区域做出孔径1mm的细孔。对于珍贵植物种的离体胚，还可在打孔区与滤纸之间铺一层微孔滤膜(孔径0.45微米)(图1,图5)。取胚后放入培养皿，加入蒸馏水，用封口膜密封。
每种干化方式设置5次重复，且每个重复中置入30-60个离体胚。按照以上4种方法干化处理的樟子松离体胚放置在散射光下培养10d，这一过程中若发现污染的胚计数并及时用镊子拣出，观察培养皿内胚的形态和颜色变化。
观察发现采用改良“滤纸桥法”效果最好，离体胚干化1d后底部均开始变为红色，中上部微绿色，10d时，红色和绿色均明显(图5中的a)。而传统滤纸桥法污染率较高(图5中的b)。
改良“滤纸桥法”将滤纸垫在塑料小培养皿下面，塑料培养皿底部中间区域做出孔径1mm的细孔，这样做可使放置于底部的含水滤纸的水汽从孔向上穿过，有效发挥了滤纸的水汽桥梁作用，在中间打孔也有利于水汽的扩散均匀。由于传统“滤纸桥法”的滤纸在胚的上面，不便于实验观察，改良后的“滤纸桥法”克服了这一缺点。同时传统方法将滤纸放在上面容易使离体胚滋生细菌，容易吸附霉菌的菌丝，将滤纸放在底部则减小了滤纸向离体胚传播病菌的几率。对于珍贵植物种的离体胚，在打孔区与滤纸之间铺一层微孔滤膜(孔径0.45μm)，可进一步起到了防菌的效果(图5)。
除了对干化方法的筛选外，对离体胚进行前处理也对干化效果有很大影响。为清除离体胚上可能寄生的霉菌，用75％酒精对离体胚进行灭菌处理5-10s，然后用蒸馏水冲洗10-20s，用酒精消毒过的镊子夹取离体胚。用吸水纸将离体胚附近的水分小心吸干净，这有利于离体胚的初始干化，尽早启动正向的代谢进程。离体胚的摆放要彼此之间有5mm的间距，以防交叉感染。
实施例3最佳光照条件筛选
研究发现利用普通日光灯(型号T8，14W，广东佛山)效果不好，变色率低。利用光谱彩色照度计(SPIC-300AW)测定表明，普通日光灯和全光谱LED植物生长补光灯(型号AL13-1,35W，广东佛山)在光质存在差别，表现在短波的紫光和较长波的红光缺乏，蓝光和绿光中间的波段相对能量也较低(图6)。在光强度差异表现更加显著，全光谱LED灯光照强度是普通日光灯的6倍，在保持25℃室温前提下，全光谱LED灯光照下经温水催芽处理的离体胚变色率达到90％(表1)。可见无论是樟子松还是赤松，离体胚变色均需要较强的光照，应属于高辐照度反应类型(HIR)。另外，浸泡催芽时间导致离体胚含水率不足，也降低变色率(表1)
表1影响干化变色的各因素
注：光强测定时距光源15-20cm。
实施例4培养基和激素筛选
将已变色且伸长的胚，取优良者在1/4MS培养基上培养45d，发现离体胚能长出针叶，但不生根(如图7中a所示)。将长出3-5mm针叶的繁殖材料，移至萌发培养基(1/4MS+IBA1.0mg·L-1+AC0.1％)(如图7中b所示)，60d后成功生根(如图7中c所示，表2)。以上现象说明，胚萌发针叶不需生长素参与，只需一些基本的营养，如蔗糖、氨基酸、各种元素，这些MS培养基能满足需要。但若需生根，则无机盐含量需降低。实验也表明生根仅提供营养是不够的，还需生长素的参与，这些生长素不能在胚中合成，在完整种子中是由胚乳提供的，胚和胚乳的关系及相关基因的调控在水稻中已有了较深入的研究。在对离体胚进行组培，需要添加生长素的培养基才能生根。而逐渐生根的苗木则可以产生细胞分裂素，因此基质中不需添加6-BA。研究表明，体细胞胚不同于合子胚，其萌发生根一般不需要在培养基中添加生长素等植物生长调节剂，可能因为在前期诱导和增殖阶段生长素等已在体胚中积累的缘故。但也有在这个阶段添加IBA和NAA处理提高了生根率的报道。
表2影响生根的培养基与激素浓度
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于樟子松离体胚干化处理的装置，其特征在于，包括：
顶部开口的储水容器、顶部开口的离体胚容器和浸水层，所述离体胚容器的底面设置有打孔区，所述打孔区设置有若干紧密排布的细孔；所述离体胚容器放置于所述储水容器内，所述离体胚容器底面与储水容器的底面的内表面之间设置所述浸水层，所述浸水层与离体胚容器底面接触的区域包含所述打孔区；使用时所述储水容器的顶部由封口膜密封；所述浸水层由玻璃微纤维、涤纶树脂或聚丙烯制成。
2.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述细孔的孔径为0.5-1.5mm。
3.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述浸水层和离体胚容器底面之间还设置有微孔滤膜；优选地，所述微孔滤膜孔径为0.4-2.0μm。
4.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述储水容器直径120-150mm，高15-25mm；所述离体胚容器直径90-120mm，高12-20mm。
5.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述储水容器为玻璃材质；所述离体胚容器为玻璃或聚苯乙烯材质。
6.一种樟子松离体胚干化处理的方法，其特征在于，包括：
1)于无菌环境下，向灭菌处理的储水容器中注入少量无菌水，依次将浸水层和离体胚容器置入储水容器中，然后将樟子松离体胚放置于离体胚容器的打孔区；
2)以封口膜将储水容器的顶部密封；
3)将密封后的储水容器置于光强为11000-13000Lux的全光谱LED灯侧向光照下进行干化处理8-14天。
7.如权利要求6所述的樟子松离体胚干化处理的方法，其特征在于，还包括：
在浸水层与离体胚容器之间放置有微孔滤膜。
8.如权利要求6所述的樟子松离体胚干化处理的方法，其特征在于，
步骤1)所述樟子松离体胚的前处理是通过包括下述步骤的方法实现的：
以75％酒精对离体胚进行灭菌处理5-10s，然后以蒸馏水冲洗10-20s，再以吸水纸将离体胚上的水分去除。
9.如权利要求6所述的樟子松离体胚干化处理的方法，其特征在于，步骤1)中所述樟子松离体胚的之间间距不小于5mm。
10.一种促进樟子松离体胚萌发的方法，其特征在于，包括：
1)将经权利要求6-9中任一项所述的方法干化处理后的樟子松离体胚置于1/4MS培养基上培养45天，至获得生长出针叶的培养材料；
2)将所述生长出针叶的培养材料转移至萌发培养基中培养至其生根，所述萌发培养基由1/4MS培养基加入IBA1.0mg/L和0.1％AC配制而成；优选地在萌发培养基中培养60天。
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