KR19990087684A

KR19990087684A - 옥수수에서 절지효소를 코딩하는 핵산분자

Info

Publication number: KR19990087684A
Application number: KR1019980707149A
Authority: KR
Inventors: 미카엘 엠머만; 로타 빌미처; 젠스 코스만
Original assignee: 플랜트테크 바이오테크날러지 게엠베하
Priority date: 1996-03-07
Filing date: 1997-03-06
Publication date: 1999-12-27
Also published as: US6255561B1; WO1997032985A1; EP0885303A1; DE19608918A1; US6762346B2; US20020162138A1; CA2248535A1; AU2096097A; JP2001501450A; AU718730B2

Abstract

본 발명은 절지효소의 효소적 활성을 갖는 옥수수에서 단백질을 코딩하는 핵산분자에 관한 것으로서,

핵산분자는 옥수수 뿐만 아니라 유전자도입 식물에서 절지효소를 코딩하며,

변형된 특성을 갖는 아밀로펙틴이 옥수수로부터의 절지효소 발현 또는 내인성 절지효소 활성 억제로 인해 합성되는 식물내에서도 코딩하는 것을 특징으로 한다.

Description

옥수수에서 절지효소를 코딩하는 핵산분자

본 발명은 절지효소(R 효소)의 효소적 활성을 갖는 옥수수에서 단백질을 코딩하는 핵산분자에 관한 것이다. 또한 본 발명은 유전자도입 식물 및 식물세포에 관한 것으로서, 변형된 정도의 분지를 갖는 아밀로펙틴은 옥수수에서 부가적인 절지효소 활성의 발현 또는 내인성 절지효소 활성의 저해에 의해 합성된다. 본 발명은 또한 상기 유전자도입 식물세포 및 식물에서 얻을 수 있는 전분에 관한 것이다.

전분은 많은 식물에서 저장물질 및 재생가능하고, 산업적으로 이용가능한 원료로서 중요한 역할을 하며, 중요성이 증가되고 있다. 전분의 산업상의 용도면에서, 그의 구조, 형태 및/또는 물리화학적 변수의 측면에서 처리산업의 요구를 만족시키는 것이 필요하다. 가능한 넓은 영역에서 사용되기위하여, 부가적으로 매우 다양한 물질을 얻는 것이 필요하다.

다당류 전분은 화학적으로 균질한 기본성분으로, 즉 글루코오스분자로 이루어져 있다. 그러나, 그들의 중합화 정도 및 분지 정도의 차이에 의해다양한 형태의 분자들의 복합 혼합물을 이룬다. α-1,4-글리코시드적으로 분지된 글루코오스 분자로 이루어진 기본적으로 미분지된 중합체인 아밀로오스-전분과 분지된 중합체인 아밀로펙틴-전분사이에는 α-1,6-글리코시드 내부결합으로 분지가 일어나는 차이점이 있다.

옥수수 또는 감자와 같이 전분생성에 전형적으로 사용되는 식물에서, 합성된 전분은 대략 25% 아밀로오스-전분 및 약 75% 아밀로펙틴-전분으로 이루어진다. 예를들면 옥수수의 경우에, 아밀로펙틴과 달리 더 분지된 다당류가 고도의 분지 및 다른 용해도를 나타냄으로써 아밀로펙틴과 구별되는 소위 피토글리코겐(phytoglycogen)이 나타난다.(Lee 등의 Arch. Biochem. Biophys. 143 (1971), 365-374; Pan 및 Nelson, Plant Physiol. 74 (1984), 324-328 참조). 본 출원의 범위안에서, 아밀로펙틴이라는 용어는 피토글리코겐으로 구성되는 식으로 사용된다.

산업분야에서 사용되는 기본성분 전분의 균질성 측면에서, 예를들면 성분 아밀로펙틴만 또는 성분 아밀로오스만을 함유하는 전분생성 식물이 요구된다. 많은 다른 용도에 있어서, 분지정도가 다른 아밀로펙틴 형을 합성할 수 있는 식물이 요구된다.

예를들면 상기의 식물은 품종개량 또는 돌연변이생성 기술에 의해 얻어질 수 있다. 가령 옥수수와 같이, 돌연변이화에 의해 오직 아밀로펙틴만이 형성되는 변이체가 생성될 수 있는 다양한 식물종이 알려져 있다. 또한 감자의 경우에, 유전자형이 화학적 돌연변이화에 의해 반수체 계통에서 생성되었다. 상기 유전자형은 아밀로오스를 형성하지 않는다(Hovenkamp-Hermelink, Theor. Appl. Genet. 75 (1987), 217-221).

비저(Visser) 등의 (Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 289) 및 WO 92/11376에서, 또한 감자에서 입자-결합 전분 합성효소의 유전자의 안티센스-저해에 의해, 주로 순수한 아밀로펙틴을 합성하는 변이체가 생성될 수 있다는 것이 공지되어 있다. 더욱이, 분지 효소(Q 효소)를 코딩하는 DNA 서열은 WO 92/14827에 공지되어 있으며, 아밀로펙틴 전분으로 α-1,6가지를 도입시킨다. 상기 DNA 서열에 의해 전분의 아밀로오스/아밀로펙틴 비율이 변화되는 유전자도입 식물을 생성할 수 있다.

재조합 DNA기술에 의해 식물에서 합성되는 전분의 분지 정도의 부가적인 표적 변형을 위하여, 전분대사, 특히 전분분자의 분지에 참여하는 효소를 코딩하는 DNA 서열이 동정할 필요가 있다.

전분분자로 분지를 도입하는 Q 효소와 달리, 식물에는 분지를 용해할 수 있는 효소가 있다. 상기 효소는 절지효소(debranching enzyme)로 불리우고, 그들의 물질적인 특이성에 따라 세 개의 그룹으로 분류된다:

(a) 풀룰란(pullulan)을 제외하고, 클레브시엘라속(Klebsiella)과 같은 미생물 및 식물에서 나타나며, 기질로서 아밀로펙틴을 사용하는 풀룰라나제(pullulanase). 식물에서 상기 효소들은 또한 R 효소라고 불리운다.

b) 미생물 및 식물에서 나타나며, 기질로서 풀룰란이 아닌 글리코겐 및 아밀로펙틴을 사용하는 이소아밀라제. 이소아밀라제는 예를들어 옥수수(Manners & Rowe, Carbohydr. Res. 9 (1969), 107) 및 감자(Ishizaki 등의 Agric. Biol. Chem. 47 (1983), 771-779)의 경우에 기술되어 있다.

(c) 덱스트린을 기질로서 사용하는 포유류 및 효모의 경우에 기술되어 있는 아밀로-1,6-글루코시다제.

사탕무의 경우에, 리(Li) 등은 (Plant Physiol. 98(1992), 1277-1284) 5개의 엔도아밀라아제 및 2개의 엑소아밀라제를 제외하고 풀룰라나제 형태의 하나의 절지효소의 발현을 입증하였다. 크기가 대략 100kD이고, 적정 pH값이 5.5인 상기 효소는 엽록체내에 위치한다. 기질로서 풀룰란을 사용하는 절지효소는 시금치에 있다고도 기술되어 있다. 사탕무에서 뿐만아니라 시금치에서 절지효소는 기질로서 풀룰란과 반응하는 것과 비교하여 기질로서 아밀로펙틴과 반응에서 5배 낮은 활성을 나타낸다(Ludwig 등의 Plant Physiol. 74 (1984), 856-861; Li 등의 Plant Physiol. 98 (1992), 1277-1284).

농업적으로 중요한 전분-저장 원예 식물인 감자의 경우에, 절지효소의 활성이 홉손(Hobson) 등의 의해 검토되었다(J. Chem. Soc., (1951), 1451). Q-효소에 반대되는 중요한 효소는 다당류 사슬의 신장을 유도하는 특정의 활성을 나타내지 않고, 단지 주로 α-1,6-글리코시드 결합을 가수분해한다. 그러나 상기 효소는 더 상세히 특징화될 수 없었다.

감자의 경우에, 정제된 단백질의 부분 펩티드 서열화 뿐만아니라 절지효소의 정제방법이 이미 제시되어 있다(WO 95/04826).

절지효소의 정제 및 상응하는 cDNA의 분리는 지금까지 시금치에 대해서 기술되어 있었다(Renz 등의 Plant Physiol. 108 (1995), 1342).

가장 중요한 전분운반 식물, 즉 옥수수에 있어서, 종래문헌에는 하나의 절지효소의 존재만 기술되어 있었다. 상기의 기질특이성에 의해 절지효소는 이소아밀라제로 분류된다(Hannah 등의 Scientia Horticulturae 55 (1993), 177-197 또는 Garwood (1984) in Starch Chemistry and Technology, Whistler, R.L., BeMiller, J.N., Puschall, E.F. (eds.), Academic Press San Diego, New York, Boston, 25-86). 상응하는 돌연변이체는 su(당류)로 명명되었다. 당류 유전자좌의 유전자가 최근에 클론되었다(James 등의 Plant Cell 7 (1995), 417-429). 당류 유전자좌를 제외하고 다른 유전자좌가 옥수수에 대해 공지되어 있으며, 이는 절지효소 활성을 갖는 단백질을 코딩한다. 그러므로, 옥수수에서 절지효소의 다른 형태의 존재에 대해서는 기술되어 있지 않다. 유전자도입 옥수수 식물이 특정의 절지효소의 활성을 더 이상 발현하지 않도록 생성된다면, 예를들면 아밀로펙틴 전분의 분지정도를 변형시키기위하여, 옥수수에서 나타나는 모든 절지효소를 동정하고, 상응하는 유전자 또는 cDNA서열을 분리할 필요가 있다.

그러므로, 본 발명에 관련된 기술적인 문제는 옥수수에서 나타나는 부가적인 절지효소를 동정하고, 상기 효소를 코딩하는 상응하는 핵산분자를 분리하는 것이다.

상기의 문제는 청구의 범위에 한정된 것과 같은 구체적인 실시예의 제시에 의해 해결된다.

그러므로 본 발명은 옥수수에서의 절지효소의 생물학적 활성 또는 그의 생물학적 활성을 갖는 단편을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산분자에 관한 것으로서, 상기 핵산분자는 서열번호 2에 기술되어 있는 아미노산 서열을 나타내는 옥수수에서 절지효소를 코딩하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 실시형태에서, 상기 핵산분자는 서열번호 1에 기술되어 있는 뉴클레오티드 서열, 특히 코딩영역 또는 상응하는 리보뉴클레오티드 서열로 이루어진다.

또한 본 발명은 옥수수에서 절지효소의 생물학적 활성 또는 그의 생물학적 활성을 갖는 단편을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산분자 및 상기에 기술된 핵산분자 중 하나를 잡종화하는 것에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 유전자 코드의 퇴화에 의해 상기 핵산분자의 서열과 다른 서열을 갖고, 옥수수에서 절지효소의 생물학적 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 핵산분자에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 핵산분자의 완전한 또는 부분적인 서열에 상보적인 서열을 갖는 핵산분자에 관한 것이다.

본 발명의 범위안에서, “잡종화”라는 용어는 종래의 잡종화 조건하에서, 바람직하게는 엄격한 조건하에서의 잡종화를 나타낸다(예를들면 Sambrook 등의 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 참조). 본 발명의 핵산분자에 대해 잡종화하는 핵산분자는 소망형태의 옥수수에서 기본적으로 유도될 수 있다.

본 발명의 분자에 대해 잡종화하는 핵산분자는 예를 들어 게놈 또는 cDNA 라이브러리에서 분리될 수 있다.

옥수수에서 상기 핵산분자의 동정 및 분리는 본 발명의 분자 또는 상기 분자의 일부를 사용하여 일어나며, 이와같은 경우에, 표준방법에 따른 잡종화에 의해 상기 분자의 역 보체가 일어날 수 있다(Sambrook 등의 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY를 볼 것).

잡종화의 프로브로서, 예를들면 서열번호 1에서 나타낸 뉴클레오티드서열 및 그의 일부를 정확하게 또는 기본적으로 함유하는 핵산분자가 사용된다. 잡종화 프로브로서 사용된 단편은 종래의 합성방법 및 본 발명의 핵산분자의 서열과 기본적으로 동일한 서열에 의해 생성된 합성단편일 수 있다. 본 발명의 핵산 서열에 대해 잡종화하는 유전자를 동종하고 분리한 후에, 상기 서열이 결정되고, 상기 서열에 의해 코딩되는 단백질의 성질이 분석된다.

본 발명의 핵산분자에 대해 잡종화하는 분자는 또한 옥수수에서 절지효소를 코딩하는 상기 DNA-분자의 대립 변이체, 즉 예를들면 효소적으로 활성인 그의 단편, 유도체 및 단편으로 이루어진다. 상기에서, 단편은 옥수수에서 절지효소의 효소적 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하기위해 충분한 길이를 갖는 핵산분자의 일부로 정의된다. 상기에서, 유도체라는 용어는 상기 분자의 서열이 하나 또는 그 이상의 위치에서 상기 핵산분자의 서열과 다르고, 상기 서열에 대해 높은 상동성을 나타내는 것을 의미한다. 상기에서 상동은 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 60%, 특히 80% 이상 및 더 바람직하게 90%이상의 서열동일성을 갖는 것을 의미한다. 상기 핵산분자와 비교할 때 나타나는 일탈은 결실, 추가, 치환, 삽입 또는 재조합에 의해 일어난다.

게다가, 상동은 그들이 코딩하는 각각의 핵산분자 또는 단백질이 기능적 및/또는 구조적으로 같은 것을 의미한다. 상기에 기술된 분자에 상동이고, 상기 분자의 유도체를 나타내는 핵산분자는 일반적으로 상기 분자의 변이체이며, 같은 생물학적 기능을 나타내는 변이체를 구성한다. 상기 변이체는 자연적으로 일어나는 변이가 될 수 있으며, 예를들면 다른 생물체 또는 돌연변이체에서 유도된 서열이고, 상기 돌연변이는 자연적으로 일어날 수 있고, 또는 특정의 돌연변이생성에 의해 도입될 수 있다. 더욱이 상기 변이체는 합성적으로 생성된 서열일 수 있다. 상기 대립 변이체는 자연적으로 일어날 뿐만아니라 합성적으로 생성된 변이체 또는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 변이체일 수 있다.

본 발명에 따른 핵산분자의 다양한 변이체에 의해 코딩되는 단백질은 일반적인 특징을 나타낸다. 효소활성, 분자량, 면역반응, 입체배좌 등은 상기 특징에 속할 뿐만 아니라 겔전기영동내 이동도, 크로마토그래피특성, 침전계수, 용해도, 분광 특성, 안정도; 최적-pH, 최적-온도 등과 같은 물리적인 특징에 속한다.

상기 절지효소의 효소활성은 예를들면 WO 95/04826에 기술된 것과 같이 염색시험에 의해 나타낼 수 있다. 상기 시험은 변성되지 않은 아밀로펙틴-함유 폴리아크릴아미드 겔(PAAG)상에서 옥수수 낟알로부터 단백질 추출물을 분리하고, 계속해서 적당한 완충액으로 배양시킨후, 요오드염색을 실시함으로써 전분-변형 활성을 갖는 단백질이 나타난다는 사실에 근거하는 것이다. 요오드로 처리된 미분지 아밀로오스는 청색으로 염색되는 반면에 아밀로펙틴은 적자색으로 염색된다. 요오드로 처리하여 적자색으로 염색된 아밀로펙틴-함유 폴리아크릴아미드겔에서, 겔의 색은 절지활성이 집적되는 곳에서 청색으로 변하는 경향이 있고, 자색으로 염색된 아밀로펙틴의 가지는 절지효소에 의해 용해된다.

선택적으로 절지효소 활성은 DNSS 시험에 의해 나타날 수 있다(Ludwig 등의 Plant Physiol. 74 (1984), 856-861).

본 발명의 핵산분자는 특정의 소망의 핵산분자, 특히 DNA 또는 RNA분자로, 가령 cDNA, 게놈성 DNA, mRNA 등 일 수 있다. 상기는 자연적으로 발생하는 분자일 수 있고, 또는 재조합 DNA 또는 화학적 기술에 의해 생성될 수 있다.

본 발명에 따른 핵산분자는 옥수수에서 절지효소의 효소활성을 갖는 알려져 있지 않은 단백질을 코딩한다. 절지효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한개의 유전자좌만 옥수수에 대해 기술되어 있다(James 등의 loc. cit.). 종래에는 절지효소를 코딩하는 다른 유전자가 옥수수에 존재하는 것이 인식되지 않았다. 제임스 등의(loc., cit.)에 기술되어 있는 것과 같이 본 발명의 핵산분자와의 상동성 비교는 상기 서열들이 많은 상동성을 나타내지 않으며, 서로 잡종화되지 않는다는 것을 보여주었다. 그러므로 본 발명의 분자는 옥수수에서 새로운 형태의 절지효소를 코딩한다. 상기 분자에 의해, 옥수수 및 다른 전분-저장식물의 전분대사를 특이적으로 방해할 수 있으며, 그래서 화학적 또는 물리적 성질에서 변형된 전분을 합성할 수 있다. 상기는 바람직하게 전분-저장 식물에서 본 발명의 핵산분자를 과잉발현 시킴에 의해 일어날 수 있으며, 바람직하게는 안티센스, 리보자임 또는 공억제효과에 의해 본 발명의 핵산서열을 사용하여 옥수수에서 절지효소 활성을 감소시킴에 의해 일어날 수 있다.

더욱이, 본 발명은 본 발명의 핵산분자에 특이적으로 잡종화할 수 있는 적어도 15염기쌍의 길이를 갖는 핵산분자에 관한 것이다. 상기에서, 특이적인 잡종화는 상기 분자가 옥수수에서 새로운 절지효소를 코딩하는 핵산분자에 잡종화하고, 다른 단백질을 코딩하는 핵산분자에는 잡종화하지 않는 것을 의미한다. 상기에서, 잡종화는 바람직하게는 엄격한 조건하에서 잡종화하는 것을 의미한다(상기를 참조). 특히 본 발명은 본 발명의 핵산분자의 전사물에 잡종화하여, 해독을 방해하는 핵산분자에 관한 것이다. 이들은 바람직하게 전사물에 상보적인 RNA 분자이다.

더욱이, 본 발명은 본 발명의 상기 핵산분자를 함유하고, 벡터, 특히 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지 및 유전공학에서의 일반적인 벡터에 관한 것이다.

특히 바람직한 실시예에서, 벡터내 포함된 핵산분자는 원핵세포 및 진핵세포에서 전사 및 해독할 수 있게 하는 조절요소에 결합된다.

다른 실시예에서, 본 발명은 상기에 기술된 본 발명의 핵산분자 또는 본 발명의 벡터에 의해 형질전환되는 원핵세포 또는 진핵세포와 같은 숙주세포 뿐만 아니라 형질전환된 세포에서 유도된 세포 및 본 발명의 핵산분자 또는 벡터를 함유하는 세포에 관한 것이다. 상기 숙주세포는 식물 또는 동물세포 뿐만아니라 세균 또는 진균세포일 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 핵산분자에 의해 코딩되는 옥수수에서 절지효소의 생물학적 활성을 갖는 단백질, 또는 그의 생물학적 활성을 갖는 단편에 관한 것이다.

그리고 본 발명은 옥수수에서 절지효소의 생물학적 활성을 갖는 식물 단백질을 제조하는 방법 또는 그의 생물학적 활성을 갖는 단편에 관한 것으로서, 본 발명의 숙주세포는 적당한 조건하에서 배양되고, 상기 단백질은 배양된 세포 및/또는 배양배지와 같은 배양체에서 분리된다.

본 발명에 따른 핵산분자를 공급함으로써, 상응하는 형질전환되지 않은 세포와 같은 야생형 세포와 비교할 때, 옥수수에서 새로운 또는 증가된 절지효소의 활성을 나타내는 방법으로 재조합 DNA기술에 의해 식물세포를 변형시킬 수 있다. 옥수수 세포 또는 옥수수식물은 야생형 세포 또는 식물과 비교할 때 감소된 절지효소 활성을 나타내는 방법으로 특히 변형될 수 있다.

그러므로 바람직한 실시예에서, 본 발명의 숙주세포는 형질전환되지 않은 세포와 비교할 때 새로운 또는 증가된 절지효소 활성을 나타내는 본 발명의 도입된 핵산분자의 발현 및 존재로 인한 유전자도입 식물세포에 관한 것이다. 상기 유전자도입 식물세포는 도입된 핵산분자가 다른 게놈성 배경을 갖는 세포에서 유도되는 것과 같은 형질전환된 세포와 이종이거나, 또는 형질전환된 식물종과 상동이라면 도입된 핵산분자가 형질전환되지 않은 세포에서는 자연적으로 나타나지 않는 게놈내 자리에 위치한다는 점에서 형질전환되지 않은 세포와 다르다. 상기 도입된 핵산분자는 천연 프로모터에 의해 조절되거나 또는 외래 유전자의 조절요소와 결합될 수 있다.

상기에 기술된 유전자도입 식물 세포를 함유하는 유전자도입 식물은 또한 본 발명의 주제이다.

본 발명의 핵산분자로 형질전환되고, 상기 분자의 도입에 의해 옥수수에서 절지효소가 합성되는 식물은 소망하는 종류의 식물일 수 있다. 바람직하게는 외떡잎 식물 또는 쌍떡잎 식물성 유용한 식물이 있으며, 특히 곡류, 콩과, 감자류 또는 메스크메론과 같은 전분저장 식물이 바람직하다.

특히 상기 곡류는 벼목에 속하는 외떡잎식물이고, 특히 벼과이다. 그의 예로는 아베나종(Avena)(오트), 트리티쿰(Triticum)(밀), 세케일(Secale)(호밀), 호듐(Hordeum)(보리), 오리자(Oryza)(쌀), 파니쿰(Panicum), 펜니세툼(Penisetum), 세타리아(Setaria), 소굼(Sorghum)(기장), 제아(Zea)(옥수수)등이 있으며, 제아 메이스(Zea mays)종에서의 식물(옥수수)이 특히 바람직하다. 전분-저장 콩과는 피섬(Pisum)종(예를들면 피섬 사티붐(Pisum sativum)), 비시아(Vicia)(예를들면 비시아 파바(Vicia faba)), 시서(Cicer)(예를들면 시서 아리티눔(Cicer arietinum)), 렌스(Lens)(예를들면 렌스 쿨리나리스(Lens culinaris)), 파세올루스(Phaseolus)(예를들면 파세올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris) 및 파세울루스 코시누스(Phaseolus coccineus)) 등의 여러 유형이 있다.

본 발명의 식물 및 유전자도입 식물세포에서 옥수수에서 새로운 또는 부가적인 절지효소 활성의 발현은 세포 및 식물에서 합성된 아밀로펙틴의 분지 정도에 영향을 준다. 그러므로, 상기 식물에서 합성된 전분은 야생형 식물에서의 전분과 비교할 때 변형된 물리적 및/또는 화학적 성질을 나타낸다. 이와 같이, 본 발명은 또한 유전자도입 식물 세포 및 식물에서 얻어지는 전분에 관한 것이다.

더욱이, 본 발명은 종자, 과실, 자른 가지, 괴경, 근경 등과 같은 유전자도입 식물의 생식물질에 관한 것으로, 상기 생식물질은 상기에 기술된 유전자도입 식물세포를 포함한다. 옥수수 식물의 경우에, 생식물질은 옥수수 낟알이 바람직하다.

더욱이, 본 발명은 본 발명의 절지효소를 코딩하는 내인성 핵산 분자의 전사 또는 해독의 억제로 인해 본 발명의 절지효소의 활성이 감소하는 옥수수에서 유전자도입 식물세포에 관한 것이다. 이것은 대응하는 식물세포내에서 본 발명의 핵산 분자 또는 그의 일부를 안티센스 방향으로 발현함으로써, 및 안티센스 효과로 인하여 상기 절지효소의 활성이 감소되는 사실에 의해 얻어지는 것이 바람직하다. 식물세포안에서 절지효소 활성을 감소시키기 위한 다른 방법은 본 발명의 DNA분자의 전사물을 특이적으로 분열시키는 적당한 리보자임을 발현시키는 것이다. 본 발명의 DNA분자에 의해 상기 리보자임을 제조하는 것은 본 기술분야의 종사자에게 잘 알려져 있다. 또한 리보자임 효과와 협력하여 안티센스 효과를 발휘하는 분자를 발현시킬 수 있다. 선택적으로, 식물세포에서 절지효소의 활성은 공억제 효과에 의해 감소될 수 있다. 이 방법은 본 기술분야에 종사하는 사람에게 잘 알려져 있으며, 예를들면 Jorgensen(Trens Biotechnol. 8(1990), 340-344), Niebel 등의(Curr, Top. Microbiol. Immunol. 197(1995), 91-103), Flavell 등의 (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197(1995), 43-46), Palaqui and Vaucheret(Plant. Mol. Biol. 29(1995), 149-159), Vaucheret 등의 (Mol. Gen. Genet. 248(1995), 311-317), de Borne 등의 (Mol. Gen, Genet 243(1994),613-621)등에 기술되어 있다.

본 발명은 또한 감소된 절지효소 활성을 갖는 상기 유전자도입 식물세포를 포함하는 유전자도입 옥수수 식물에 관한 것이다.

형질전환되지 않은 식물과 비교하였을 때, 유전자도입 세포 및 식물의 아밀로펙틴 전분은 감소된 절지효소 활성으로 인해 변형된 분지정도를 나타낸다. 그래서, 유전자도입 세포나 식물로부터 얻을 수 있는 변성된 전분은 본 발명의 주요 물질이 된다.

본 발명은 또한 종자와 같이 상기 기술된 유전자도입 식물의 생식물질에 관한 것으로, 상기 물질은 상기 유전자도입 식물 세포를 함유한다.

절지효소 활성으로 인해, 야생형 식물에서 합성되는 아밀로펙틴 전분과 비교해 볼 때 변형된 정도의 분지를 갖는 아밀로펙틴 전분을 형성하는 유전자도입 식물세포는 예를들면 다음 단계로 구성되는 방법에 의해 제조된다:

(a) 다음 DNA 서열로 구성된 발현 카세트를 제조한다.

(ⅰ) 식물 세포내에서 전사를 확실하게 하는 촉진제;

(ⅱ) 절지 효소 또는 생물학적으로 활성인 그의 단편의 효소적 활성을 가지는 단백질을 코딩하고 센스-방향으로 촉진제의 3′- 끝에 결합되어지는 본 발명의 적어도 하나의 핵산 서열.

(ⅲ) 선택적으로, 코딩지역의 3′-말단에 결합되는 폴리-A-꼬리를 확장하는 전사물에 첨가하고 전사를 종결시키기 위한 종결신호.

(b) 단계(a)에서 제조된 발현 카세트로 식물세포를 형질전환시킨다.

절지효소 활성의 감소로 인해, 야생형 식물에서 합성되는 아밀로펙틴 전분과 비교해 볼 때 감소된 정도의 분지를 갖는 아밀로펙틴 전분을 형성하는 유전자도입 옥수수 식물세포는 예를들면 다음 단계로 구성되는 방법에 의해 제조된다:

(a) 다음 DNA 서열로 구성된 발현 카세트를 제조한다.

(ⅰ) 식물 세포내에서 전사를 확실하게 하는 촉진제;

(ⅱ) 절지 효소 또는 생물학적으로 활성인 부분의 효소적 활성을 가지는 단백질을 코딩하고 안티센스-방향으로 촉진제의 3′- 끝에 결합되어지는 본 발명의 적어도 하나의 핵산 서열.

형질전환을 위해 선택된 식물내에서 기능하는 모든 촉진제는 기본적으로 (ⅰ)상에서 언급된 촉진제로서 사용될 수 있다. 촉진제는 사용된 식물종에 대하여 상동 또는 이종일 수 있다. 예를들면, 모든 식물조직에서 구조발현을 확실하게 하는 꽃양배추 모자이크 바이러스(Odell 등의 Nature 313(1985),810-812)의 35S촉진제 및 또한 WO/9401571에 기술되어진 촉진제 구성물을 사용할 수 있다. 다른 예로는 옥수수로에서 폴리유비퀴틴(polyubiquitin) 유전자의 촉진제(Christensen 등의 Plant Mol. Biol. 18(1992) 675-689)가 있다. 그러나, 외인성 인자에 의해 결정될 때 단지 활성화만되는 촉진제도 사용될 수 있다(WO/9307279 참조). 이점에 있어서, 간단한 유도를 위해 사용하는 열-쇼크 단백질의 촉진제가 매우 흥미를 일으킨다. 게다가, 특히 식물조직에서 아랫방향 서열의 발현을 일으키는 촉진제를 사용할 수 있다(Stockhaus 등의 EMBO J. 8(1989), 2245-2251 참조). 형질전환된 식물의 전분-저장 부분에서 활성인 촉진제를 사용하는 것이 바람직하다. 옥수수의 경우에, 전분-저장부분은 옥수수 낟알이고, 감자의 경우에는 괴경이다. 감자에서 본 발명의 핵산 분자를 과잉발현시키기 위해서, 괴경-특이 B33-촉진제(Rocha-Sosa 등의 EMBO J. 8(1989), 23-29)를 사용할 수 있다.

V.faba 및 다른 식물에서 종자-특이 발현을 확실하게 하는 비시아 파바(Vicia faba)에서의 USP 촉진제와 같은 종자-특이 촉진제가 다양한 식물종에 있다고 이미 기술되어 있다(Fiedler 등의 Plant Mol. Biol. 22(1993), 669-679; Baumlein 등의 Mol. Gen. Genet. 225(1991), 459-467). 옥수수의 경우에는, 예를들면, 제인(zein) 유전자의 촉진제가 옥수수 낟알의 배젖(endosperm)안에서 특이적 발현을 하게 한다(Pedersen 등의 Cell 29(1982), 1015-1026; Quattrocchio 등의 Plant Mol. Biol. 15(1990),81-93).

옥수수에서 절지효소의 효소적 활성을 가지는 단백질을 코딩하고, 처리 단계(a)(ⅱ)에서 언급된 핵산서열이 센스-방향으로 촉진제에 연결되는 경우에, 이 핵산서열은 형질전환된 식물종과 관련하여 외래 또는 이종 기원 뿐만아니라 본래 또는 상동기원일 수 있고, 예를 들어 다른 식물(바람직하기로는 상기 언급된 전분-저장 식물)뿐만 아니라 옥수수 식물이 상기 발현 카세트로 형질전환될 수 있다.

합성되는 단백질은 원래 식물세포내의 특정 바람직한 구획안에 위치되어있다. 식물 절지효소는 일반적으로 색소체안에 위치되어 있으므로 이 세포기관으로 전좌하기 위한 시그널 서열을 가지고 있다. 다른 구획안에서 정위(localization)를 얻기 위해서는, 상기 시그널 서열을 코딩하는 DNA서열이 결실되어야 하며, 코딩 영역은 각각의 구획안에서 정위를 하게 하는 DNA서열에 결합되어야 한다. 이러한 서열은 알려져있다(Braun 등의 EMBO J. 11(1992), 3219-3227; Wolter t al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(1988), 846-850; Sonnewald 등의 Plant J. 1(1991), 95-106 참조).

옥수수에서 절지효소의 효소적 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 처리 단계(a)(ⅱ)에서 언급된 핵산서열이 안티센스 방향으로 촉진제에 연결되는 경우에는, 형질전환되는 식물종에 관련하여 상동의 핵산 서열이 바람직하다. 그러나 내인성적으로 존재하는 절지효소 유전자에 고도의 상동성, 특히 80%이상, 바람직하기로는 90% 내지 100% 및 가장 바람직하게 95%이상의 상동성을 나타내는 핵산서열이 사용될 수 있다.

15bp의 최소길이를 가지는 서열이 사용될 수 있다. 보다 짧은 서열을 사용하더라도, 억제효과는 배제될 수 없다. 100 내지 500 범위의 염기쌍 범위의 보다 긴 서열이 바람직하게 사용되며; 효과적인 안티센스 억제를 위해서 500 염기쌍 이상의 길이를 가지는 서열이 사용된다. 보통 5000 염기쌍보다 짧은 서열, 바람직하기로는 2500 염기쌍보다 짧은 서열을 사용하는 것이 바람직하다.

식물세포에서 전사를 위한 종결신호는 기술되고 원하는 대로 교환될 수 있다. 예를 들면, 아그로박테륨 튬파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로부터의 옥토핀신타아제(octopinsynthase)의 종결신호가 사용될 수 있다.

처리 단계(a)에 따라 구성된 발현 카세트의 이동은 플라스미드, 특히 식물 게놈안으로 발현 카세트를 안정하게 통합완성(integratio)시키는 플라스미드를 사용하여 실시하는 것이 바람직하다.

옥수수에서 새로운 절지효소를 과잉발현하기 위한 상기 언급된 방법은 원래 모든 식물종에서 사용될 수 있다. 상기에서, 단자엽식물 및 쌍자엽식물, 특히 상기 전분-저장 식물에 많은 관심이 있다. 절지효소 활성을 감소시키기 위한 상기 언급된 방법은 단자엽 식물, 특히 옥수수에 사용되기에 바람직하다.

상기 언급된 방법에 따라 구성된 발현 카세트의 도입으로 인해, RNA는 형질전환된 식물세포안에서 형성되어진다. 옥수수에서 절지효소를 코딩하는 핵산 서열이 발현 카세트안에 센스방향으로 촉진제에 결합된다면, 식물세포내 옥수수에서 부가의 또는 새로운 절지효소를 합성하기 위한 매트릭스로 제공하는 mRNA가 합성된다. 그의 결과로서, 상기 세포들은 활성을 나타내고, 또는 경우에 따라 옥수수에서 절지효소 활성을 증기시키며, 세포안에서 형성된 아밀로펙틴의 분지정도를 변형시킬 수 있다. 이것에 의해, 자연적으로 발생하는 전분과 비교해볼 때 전분은 증가된 상동성 뿐만 아니라 더욱 명료하게 정렬된 구조에 특징이 있다. 이것은, 다른 것중에서, 필름형성 특성에 영향을 줄 수 있다.

그러나, 옥수수에서 절지효소를 코딩하는 핵산 서열이 안티센스 방향으로 촉진제에 연결된다면, 안티센스-RNA는 내인성 절지효소 유전자의 발현을 억제하는 유전자도입 식물세포안에서 합성된다. 결과적으로 이러한 세포들은 옥수수에서 새로운 절지효소의 감소된 활성을 나타내고, 변성된 전분을 합성시킨다. 이러한 안티센스 기술에 의하여 옥수수에서 내인성 절지효소 유전자의 발현이 0% 내지 100%의 범위내에서 다른 정도로 억제되는 식물을 제조할 수 있다. 특히, 이는 분지의 정도를 가장 다양하게 변화시켜 아밀로펙틴 전분을 합성하는 옥수수 식물을 생산할 수 있게 되었다. 이것은 상기 변화를 제공하기 위해서 많은 비용과 시간이 걸리는 종래의 품종개량 및 돌연변이생성 기술에 비하여 장점을 가진다. 고도로 분지된 아밀로펙틴은 특별히 큰 표면을 가지고 있으므로 공중합체로서 특히 적당하다. 분지정도가 높은 것은 물내 아밀로펙틴의 용해도를 향상시킨다. 이러한 특성은 어떤 기술적 용도에 있어 매우 유용하다.

옥수수는 특히 절지효소를 코딩하는 본 발명의 핵산 분자를 이용하여 변형된 아밀로펙틴을 제조하는데 적당하다. 그러나, 본 발명의 적용은 이 식물종에 국한되지 않는다. 원하는 다른 식물종도 과잉발현에 사용될 수 있다.

유전자도입 식물에서 합성된 변형된 전분은 종래방법에 의하여 식물 또는 식물세포로부터 분리될 수 있고 정제후에 식료품 및 산업용 제품을 제조하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 전분은 공지의 방법에 의하여 당 분야의 기술을 가진 자에 의해 쉽게 변형될 수 있고 음식 및 비음식 산업에서 다른 용도변형 또는 비변형 방식으로 사용될 수 있다.

기본적으로, 전분의 용도는 두개의 주요분야로 세분화될 수 있다. 한 분야는 전분의 가수분해 제품과, 소위 천연 전분을 포함한다. 가수분해 제품은 본래 효소적 또는 화학적 처리에 의해 얻어지는 글루코오스 및 글루칸 성분으로 구성된다. 이것은 발효 및 화학적 변형과 같은 부가 처리과정에 이용될 수 있다. 상기에 있어서, 가수분해 과정이 간단하고 저비용으로 실시될 수 있다는 점에서 중요하다. 현재에는, 이것은 아밀로글루코시다아제를 효소적으로 사용하여 실시된다. 이것은 사용된 효소에 대하여 영향받기 쉬움을 제한하는 입체구조 또는 적은 분지로 인해 소화성이 향상되고, 입자표면이 증가하는 것과 같은 전분구조의 변화로 인한 가수분해를 위한 소량의 효소를 사용하여 비용을 줄일 수 있다.

그의 중합체 구조 때문에 사용되어지는 소위 천연 전분의 용도는 두 개의 다른 영역으로 세분화될 수 있다.

1. 식료품으로서의 용도

전분은 본래 수성 첨가제를 결합할 목적으로 제공하고/또는 증가된 점성이나 증가된 겔 형성을 야기하는 다양한 식료품에 사용되는 전형적인 첨가제이다. 중요한 특징적 성질은 유동 및 흡착습성, 팽창 및 파스티피케이션(Pastification) 온도, 점성도 및 농화 수행도, 전분의 용해도, 투명도 및 페이스트 구조, 열, 전단응력 및 산 내성, 퇴화 경향, 필름형성 능력, 냉동 및 해동에 대한 내성, 소화도 뿐만아니라 무기 또는 유기 이온과의 복합체 형성 능력이다.

2. 비식품용으로서의 용도

용도의 다른 주요분야는 다양한 제조과정에서의 보조제 또는 기술적 제품내 첨가제로서의 전분의 용도이다. 보조제로서 전분을 사용하는 용도의 주요분야는, 우선, 종이 및 판지 산업이다. 이 분야에서, 전분은 주로 유지(고체회수), 충진제 및 미세과립 정립(sizing), 응고물로서 및 탈수에 사용된다. 게다가 강성, 경도, 소리, 그립, 광택, 부드러움, 찢는 강도 뿐만아니라 표면에 관한 전분의 유리한 성질이 이용된다.

2.1 종이 및 판지 산업

종이제조 과정에서는 표면, 코팅, 질량 및 분무로 용도가 네 분야로 분화될 수 있다. 표면처리에 관한 전분에 필요한 것은 본질적으로 고도의 밝기, 대응되는 점성도, 높은 점성도 안정성, 양호한 필름형성 뿐만아니라 먼지가 적게 형성되는 것이다. 고체 함유물을 코팅하는데 사용될때, 대응되는 점성, 높은 결합능력 뿐만 아니라 높은 색소 친화력이 중요한 역할을 한다. 대부분에 대한 첨가제로서, 신속함, 균일함, 무손실 분산, 높은 기계적 안정성 및 종이 펄프내에서의 완전한 유지가 중요하다. 분무에 전분을 사용할때, 고체의 대응하는 함유량, 높은 점성도 뿐만 아니라 높은 결합능력이 또한 중요하다.

2.2 접착제 산업

적용되는 주요분야는, 이를테면, 접착성산업인데, 적용분야는 4개의 영역으로 세분화된다: 순수한 전분아교로서의 용도, 특별한 화학물로 제조된 전분아교에 있어서의 용도, 합성수지 및 중합체 분산물에 대한 첨가제로서의 용도 뿐만아니라 합성 접착체의 확장제로서의 전분의 용도. 모든 전분계 접착제의 90%는 골판지, 종이 마대 및 백, 종이 및 알루미늄용 합성물질, 박스 및 봉투용 습윤아교, 스탬프 등을 제조하는데 사용된다.

2.3 직물 및 직물보호 제품

보조제 및 첨가제로서의 다른 가능한 용도는 직물 및 직물보호 제품의 제조에 있다. 직물산업에서는, 다음과 같은 네 개의 분야에서 분화될 수 있다: 직조시 활성인 장력에 대해 보호하기 위해 절삭행동을 약화 및 강화하는 것 뿐만 아니라 직조동안 내마모성을 증가시키기 위한 보조제와 같은 정립제, 표백, 염색등과 같은 질을 악화시키는 전처리후의 주로 직물 향상제, 염료 확산을 방해하기 위한 염료 페이스트의 제조시 농후제 및 실을 재봉하기 위한 워핑용 첨가제로서의 용도.

2.4 건축산업

그리고 전분은 건축재료에서 첨가제로서 사용되어질 수 있다. 한가지 예로서 석고반죽 보드의 제조인데, 여기서 얇은 반주갠에서 혼합된 전분은 물로 패스티화되고, 석고보드의 표면에서 확산되어 판지를 보드와 결합시킨다. 적용되는 또다른 분야는 전분을 회반죽과 광물섬유에 혼합하는 것이다. 미리 혼합한 콘크리트에서, 전분은 정립처리를 감속하는데 사용되어질 수 있다.

2.5 지표 안정화

그리고, 전분은 인공적인 대지이동시 물에 대해 지표입자들을 일시적으로 보호하는데 사용되는 지표안정화 수단으로서 제작하는데 유리하다. 당 분야의 지식에 따라, 전분과 중합체 에멀션으로 구성된 조합제품은 지금까지 사용된 제품과 같이 부식-감소 및 외피화-감소 효과를 가지는 것으로 인지될 수 있으나, 이것은 상대적으로 덜 비싸다.

2.6 식물보호제 및 비료로서의 용도

적용되는 다른 분야로는 상기 제조물의 특별한 성질을 변형시키기 위한 식물보호제로서의 용도이다. 이를테면, 전분은 식물보호제 및 비료의 습윤도를 향상시키고, 활성 성분의 투여량을 방출하고, 액체, 휘발성 및/또는 냄새나는 활성 성분을 미정질의 안정하고 변형된 물질로 전환시키고, 양립불가능한 조성을 혼합시키고, 및 감소된 분해로 인한 효과의 지속을 연장시키는데 이용된다.

2.7 약품, 의약품 및 화장품 산업

전분은 또한 약품, 의약품 및 화장품 산업의 분야에서 사용되어질 수 있다. 제약산업에서, 전분은 정제용 결합제와 캡슐에서 결합제의 희석을 위해 사용되어질 수 있다. 또한, 전분은 삼킬때 유액을 흡수하여 짧은시간후에 부풀어 활성성분이 되도록 많이 방출되기 때문에 정제용 정제 분해물질로서 적당하다. 이러한 성질상의 이유로, 의약적 유동성(flowance)과 가루 분말이 다른 분야에서 적용되어진다. 화장품분야에서, 전분은 향기나 살리실산과 같은 분말 첨가제의 운반체로서 사용될 수 있다. 전분을 적용할수 있는 상대적으로 비싼 분야는 치약이다.

2.8 석탄 및 연탄에서 첨가제로서의 전분

석탄 및 연탄에서 첨가제로서의 전분의 용도도 또한 생각할 수 있다. 전분을 첨가함으로써, 석탄은 정량적으로 덩어리화 및/또는 고급 질의 연탄화될 수 있어 연탄의 조숙한 붕괴를 막을 수 있다. 바비큐 석탄은 4 내지 6%의 첨가된 전분, 칼로레이티드(calorated) 석탄은 0.1 내지 0.5%를 함유한다. 또한, 석탄과 연탄에서 전분을 첨가하면 유독성 물질의 방출이 감소하기 때문에 전분은 결합제로서 적당하다.

2.9 광석 및 석탄슬러리의 처리

전분은 광석 및 석탄슬러리의 처리시 응집제(flocculant)로서 사용될 수 있다.

2.10 물질포장용 첨가제

또 다른 적용분야는 주조시, 물질을 처리하는 첨가제로서의 용도이다. 다양한 주조처리를 위해, 결합제와 혼합된 모래에서 제조된 코어가 필요하다. 오늘날, 가장 통상 사용되는 결합제는 대부분이 팽윤 전분인, 변형된 전분과 혼합된 벤토나이트이다. 전분을 첨가하는 목적은 유동저항성을 증가시킬뿐만 아니라 결합강도를 향상시키는 것이다. 그리고 팽윤 전분은, 냉수에서의 분산능력, 재수화능력, 모래 내에서의 양호한 혼합능력 및 물과의 높은 결합능력과 같은, 제조공정을 위한 필요조건을 보다 잘 만족시킬 수 있다.

2.11 고무 산업

고무 산업에서 전분은 기술적 및 시각적 질을 향상시키기 위하여 사용되어진다. 이것을 사용하는 이유는 표면광택, 그립 및 외관을 향상시키기 때문이다. 이러한 목적을 위해서, 전분은 냉 가황전에 고무체의 끈적이는 고무화 표면상에 분산되어진다. 이것은 또한 고무의 프린트능력을 향상시키기 위하여 사용되어진다.

2.12 가죽 대용품의 제조

변형된 전분을 적용할 수 있는 또 다른 분야는 가죽 대용품의 제조이다.

2.13 합성 중합체에서의 전분

플라스틱 시장에서 다음의 적용분야가 나타나고 있다: 전분에서 유도된 제품의 처리공정으로의 통합(전분은 단지 충진제일뿐이고, 합성중합체와 전분사이에는 직접적 결합이 없음), 또는 선택적으로 전분에서 유도된 제품의 중합체제조로의 통합(전분 및 중합체는 안정적 결합을 형성함).

순수한 충진제로서의 전분의 용도는 활석과 같은 다른 물질과는 필적할 수 없다. 이러한 상황은 특이 전분 성질이 효과적으로 되어 최종제품의 성질프로필이 명확하게 변화될때에는 다르다. 한가지 예로서 폴리에틸렌과 같이 열가소성 물질의 처리시 전분제품의 용도이다. 이것에 의해, 전분 및 합성중합체는 '마스타 배치(master batch)'를 형성하기 위해 공억제에 의해 1:1의 비율로 결합되고, 이로부터 다양한 제품이 입자화 폴리에틸렌을 사용한 통상의 기술에 의하여 제조된다. 폴리에틸렌 필름에서 전분의 완성은 중공체내 물질투과도를 향상시키고, 수증기의 투과도를 향상시키고, 정전기방지 행동을 향상시키고, 항블록 행동을 향상시킬 뿐만아니라 수성 염료와의 프린트능력을 향상시킨다.

또한 폴리우레탄 폼(foam)에서 전분을 이용할 수 있다. 전분 유도체의 적용 뿐만아니라 처리기술의 최적화로 인해, 합성 중합체와 전분의 히드록시기사이의 반응을 특이적으로 조절할 수 있다. 전분을 사용함으로써 다음의 성질 프로필을 가지는 폴리우레탄 필름이 수득된다: 감소된 열팽창계수, 감소된 수축작용, 향상된 압력/인장 행동, 물 흡수의 변화없이 증가된 수증기 침투도, 감소된 가연성 및 균열밀도, 감소되지 않은 가연성 부분, 없는 할로겐화물 및 감소된 노화. 현재까지 남아있는 단점이라면 압력 및 충격강도가 감소된다는 것이다.

필름의 제품개발은 선택적이 아니다. 또한 화분, 판 및 사발과 같은 고체 플라스틱 제품은 50% 이상의 전분함량으로 제조될 수 있다. 그리고 전분/중합체 혼합물은 매우 쉽게 생분해가능한 잇점을 제공한다.

그리고 그들의 물과의 우수한 결합력으로 인해 가장 중요한 전분결합 중합체가 얻어진다. 이들은 라디칼 사슬 기작의 원칙에 따라 결합된 합성 단량체의 측 격자 및 전분의 백본을 갖는 제품이다. 오늘날 사용가능한 전분결합 중합체는 높은 점성도에서 전분 1g당 물 1000g이상의 향상된 결합 및 보유능력이 특징이다. 상기 초흡수제는 종자 펠릿과 같은 농업 분야에서 뿐만 아니라 기저귀 및 종이와 같은 제품과 같은 위생분야에 주로 사용된다.

재조합 DNA 기술에 의해 변형된 전분의 용도에 결정적인 것은 구조, 물함량, 단백질 함량, 지방 함량, 섬유 함량, 재/인산 함량, 아밀로오스/아밀로펙틴 비율, 상대몰질량 분포, 분지정도, 입자크기 및 형태 뿐만 아니라 결정화이며, 한편, 하기의 특징을 얻는다: 흐름 및 흡착습성, 패스티피케이션 온도, 점성도, 농후화 행동, 용해도, 페이스트 구조, 투명도, 열, 전단력 및 내산성, 재분해하는 경향, 겔형성 능력, 냉동/해동에 대한 내성, 복합체 형성능력, 요오드 결합, 필름 형성, 접착강도, 효소 안정성, 소화력 및 반응성.

재조합 DNA 기술에 의해 변형된 전분의 용도에 결정적인 것은 구조, 물함량, 단백질 함량, 지방 함량, 섬유 함량, 재/인산 함량, 아밀로오스/아밀로펙틴 비율, 상대몰질량 분포, 분지정도, 입자크기 및 형태 뿐만 아니라 결정화이며, 한편, 하기의 특징을 얻는다: 흐름 및 흡수 행동, 패스티피케이션 온도, 점성도, 농후화 행동, 용해도, 페이스트 구조, 투명도, 열, 전단력 및 내산성, 재분해하는 경향, 겔형성 능력, 냉동/해동에 대한 내성, 복합체 형성능력, 요오드 결합, 필름 형성, 접착강도, 효소 안정성, 소화력 및 반응성.

유전자도입 식물을 유전자 조작에 의해 변형된 전분을 제조함으로써 불필요한 화학적 또는 물리적 방법에 의해 또 다른 변형을 하는 방법으로 식물에서 얻어지는 전분의 특성을 변형시킬수 있다. 한편, 재조합 DNA 기술에 의해 변형된 전분은 또 다른 화학적 변형을 받을 수 있으며, 이는 상기 분야의 응용에 질적인 개선을 가져올 것이다. 상기 화학적 변형은 원래 당업자에 공지되어 있다. 특히 열처리, 산처리, 산화 및 에스테르화에 의한 변형은 인산염, 질산염, 황산염, 크산틴산염, 초산염 및 구연산염 전분의 형성을 유도한다. 다른 유기산은 또한 에스테르화에 사용되어질 수 있다:

―전분 에테르의 형성

전분 알킬 에테르, O-알릴 에테르, 히드록실알킬 에테르, O-카르복시기메틸 에테르, N-함유 전분 에테르, P-함유 전분 에테르 및 S-함유 전분 에테르.

―분지된 전분의 형성

―전분결합 중합체의 형성.

원칙적으로, 본 발명의 절지 효소의 활성이 증가되거나 감소되고, 동시에 전분 생합성에 관련한 다른 효소의 활성이 변형되는 식물을 생산하기 위해 본 발명의 핵산 분자가 사용되어질 수 있다. 이 점에 있어서, 모든 종류의 치환과 조합이 생각되어질 수 있다. 예를들면, 본 발명의 단백질을 코딩하는 핵산 분자 또는 그에 상응하는 안티센스-구조물은 분지 효소의 합성이 억제되거나, 안티센스-효과나 돌연변이로 인해 su-유전자의 또는 내인성 GBSS Ⅰ-, SSS Ⅰ-, Ⅱ- 또는 GBSS Ⅱ-단백질의 합성이 이미 억제되는 식물 세포로 도입될 수 있다(예를 들어 WO92/14827에 기술된 것 또는 ae 변이체와 관련(Shannon and Garwood, 1984, in Whistler, BeMiller and Paschall, starch: Chemistry and Technology, Academic Press, London, 2^ndedition(1984) 25-86참조)).

변형된 식물내 여러 절지 효소의 합성이 억제된다면, DNA 분자가 형질전환을 위해 사용되어질 수 있고, 동시에 각각의 절지 효소를 코딩하는 안테센스-방향의 다수 영역을 포함하고, 적당한 촉진제에 의해 제어되거나, 대응 리보자임이나 대응 공억제 RNA를 코딩한다. 상기 구조물에서 각 서열은 자신의 프로모터에 의해 선택적으로 제어될 수도 있고, 또는 다른 서열은 공통 프로모터로부터 융합될 때 전사되어질 수 있다. 마지막 대안은 상기 경우에서처럼 각 단백질 합성이 같은 정도로 방지되는 것이 바람직하다.

더구나, 절지 효소를 코딩하는 DNA 서열은 제외하고 DNA 서열이 가능한데, 전분 합성이나 변형과 관계된 다른 단백질을 코딩하는 다른 서열도 있다. 이는 안티센스 RNA, 대응 리보자임 또는 공억제 RNA를 코드할 수 있다. 다시말해, 서열은 차례로 연결되어지고 공통 프로모터로부터 전사되거나 각각은 자신의 프로모터에 의해 전사되어질 수 있다. 상기 DNA 분자에서 한 프로모터로부터 전사되어지는 안티센스 단편의 갯수에는 상한(上限)이 없다. 그러나 얻은 전사물은 보통 20kb보다 길지 않고, 바람직하게 5kb보다 길지 않아야 한다.

다른 코딩 영역과 조합하는 상기 DNA 분자에서 적당한 프로모터의 아랫 방향흐름에 위치되어지는 코딩 영역은 다음의 단백질을 코딩하는 DNA 서열로부터 유도되어진다: 입자-결합 전분 합성효소(GBSS Ⅰ과 Ⅱ), 다른 용해성 전분 합성효소(SSS Ⅰ과 Ⅱ), 분지효소, 절지 효소, 불균형화 효소 및 전분 가인산분해효소. 상기 목록은 단지 예에 불과하다. 상기 조합의 구성 내에서 다른 DNA를 사용하는 것도 생각할 수 있다.

상기 구조물에 의해서 동시에 상기 구조물로 형질전환된 식물 세포 내에서 여러 효소의 합성을 억제할 수 있다.

더구나, 상기 구조물은 하나 또는 그 이상의 전분 생합성 유전자에 결함이 있는 종래의 변이체에 도입될 수 있다(Shannon and Garwood, loc. cit.). 상기 결함은 다음 단백질과 관련될 수 있다: 입자-결합(GBSS Ⅰ과 Ⅱ) 및 용해성 전분 합성효소(예를들면 SSS Ⅰ과 Ⅱ), 분지 효소(BE Ⅰ과 Ⅱ), 절지 효소(su-유전자좌), 불균형화 효소 및 전분 가인산분해효소. 다시말해, 상기 목록은 단지 예에 불과하다.

고등식물로 외래 유전자의 도입을 준비하기 위해, 형질전환된 박테리아 세포의 선별을 위한 마커 유전자와 E. coli를 위한 복제신호를 포함하는 많은 클로닝 벡터들이 임의대로 처분가능하다. 상기 벡터의 예로는 pBR322, pUC 시리즈, M13mp 시리즈, pACYC184 등이 있다. 바람직한 서열은 적당한 제한 자리에서 벡터로 통합될 수 있다. 얻어진 플라스미드는 E. coli 세포의 형질전환을 위해 사용되어진다. 형질전환된 E. coli 세포는 적당한 배지내에서 배양된 후, 회수되고 분해된다. 플라스미드가 회복된다. 얻어진 플라스미드 DNA의 특징화를 분석하는 방법으로서 제한 분석, 겔 전기영동 및 다른 화학-분자생물학적 방법이 사용된다. 각 조작후에 플라스미드 DNA는 쪼개어지고, 얻어진 DNA 단편은 다른 DNA 서열에 결합될 수 있다. 각 플라스미드 DNA는 동일한 플라스미드나 다른 플라스미드로 클론되어질 수 있다.

식물 숙주 세포로 DNA를 도입하기 위해, 광범위한 기술이 사용된다. 상기 기술들은 형질전환 매개물로써 아그로박테륨 튬파시엔스이나 아그로박테륨 리조유전자(rhizogene)를 사용하여 T-DNA와의 식물 세포 형질전환, 원형질체 융합, DNA의 일렉트로포레이션(electroporation)과 주입법, 바이오리스틱(biolistic)법에 의한 DNA 도입 및 그외 가능한 다른 방법들을 포함한다. DNA의 식물 세포로의 DNA의 일렉트로포레이션 및 주입의 경우에, 플라스미드를 사용하는데 특별한 요구 사항이 없다. pUC 유도체와 같은 간단한 플라스미드가 사용되어질 수 있다. 그러나, 전체 식물이 상기 방법으로 형질전환된 세포로부터 재생되어지는 경우에 선별가능한 마커 유전자가 있어야 한다. 식물 세포로 바람직한 유전자를 도입하는 방법에 따라, 다른 DNA 서열이 필요하다. 예를 들어 식물 세포의 형질전환을 위해 Ti- 또는 Ri-플라스미드가 사용된다면, Ti- 또는 Ri-플라스미드 T-DNA의 적어도 오른쪽 경계, 바람직하게 오른쪽과 왼쪽 경계는 플랭킹(flanking) 영역으로써 도입되어지는 외래 유전자에 연결되어야 한다.

형질전환을 위해 아그로박테리아가 사용된다면, 통합되어지는 DNA는 특별한 플라스미드, 즉 매개 벡터나 이진(binary) 벡터로 클론되어야 한다. T-DNA내의 서열에 대한 서열상동성으로 인해, 매개 벡터는 상동 재조합에 기인한 아그로박테리아의 Ti- 또는 Ri-플라스미드로 통합되어질 수 있다. 상기는 또한 T-DNA의 이동에 필요한 vir-영역을 포함한다. 매개 벡터는 아그로박테리아내에서 복제될수 없다. 헬퍼 플라스미드에 의해 매개 벡터는 아그로박테륨 튬파시엔스으로 이동될 수 있다(결합). 이진 벡터는 아그로박테리아 뿐만 아니라 E. coli에서 복제될수 있다. 이들은 오른쪽과 왼쪽 T-DNA 경계 영역에 의해 만들어지는 링커 또는 폴리링커뿐만 아니라 선별가능한 마커 유전자를 포함한다. 이들은 아그로박테리아로 직접 형질전환될 수 있다(Holsters 등의 Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). 숙주세포로서 작용하는 아그로박테리아는 vir-영역을 운반하는 플라스미드를 포함해야한다. vir-영역은 T-DNA의 식물 세포로의 이동을 위해 필요하다. 부가적인 T-DNA가 존재할 수 있다. 상기 방법으로 형질전환된 아그로박테륨은 식물 세포의 형질전환에 사용되어진다.

식물 세포의 형질전환을 위한 T-DNA의 용도는 유럽 특허 공보 제 EP 120 516호; Hoekeman, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam(1985), Chapter Ⅴ; Fraley 등의 Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 및 An 등의 EMBO J. 4(1985), 277-287에 충분히 연구되어 설명되어 있다.

식물 세포로 DNA를 이동시키기 위해, 식물 외식(外植)은 아그로박테리아 튬파시엔스이나 아그로박테륨 리조유전자와 함께 적당히 공배양되어질 수 있다. 감염된 식물체(예를들면, 잎 조각, 줄기 조각, 뿌리 뿐만아니라 원형질체나 현탁 배양된 식물 세포)으로부터 전체 식물은 형질전환된 세포의 선별을 위해 항생물질이나 바이오지드를 함유하는 적당한 배지내에서 재생된다. 상기 방법으로 얻어진 식물은 도입된 DNA의 존재유무에 따라 검사되어진다. 원형질체를 형질전환하거나 바이오리스틱 방법을 사용함으로써 외래 DNA를 도입하기 위한 다른 가능성은 당업자에게 공지되어 있다(참고. 예를들면 Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise(H. J. Rehm, G. Reed, A. Puhler, P. Stadler, editors), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge).

아그로박테륨 튬파시엔스에 의한 Ti-플라스미드 벡터 시스템을 통한 쌍자엽 식물의 형질전환이 확실히 이루어지는 반면에, 최근의 연구에서는 단자엽 식물은 아그로박테륨에 근거한 벡터에 의한 변형에 적당하다는 것을 알 수 있다(Chan 등의 Plant Mol. Biol. 22(1993), 491-506; Hiei 등의 Plant J. 6(1994), 271-282, Deng 등의 Science in China 33(1990), 28-34; Wilmink 등의 Plant Cell Reports 11(1992), 76-80; May 등의 Bio/Technology 13(1995), 486-492; Conner and Domisse; Int. J. Plant Sci. 153(1992), 550-555; Ritchie 등의 Transgenic Res. 2(1993), 252-265).

단자엽 식물의 형질전환을 위한 대안 시스템은 바이오리스틱 접근에 의한 형질전환(Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104(1994), 37-84; Vasil 등의 Bio/Technology 11(1993), 1553-1558; Ritala 등의 Plant Mol. Biol. 24(1994), 317-325; Spencer 등의 Theor. Appl. Gent. 79(1990), 625-631), 원형질체 형질전환, 부분적으로 투과가능화된 세포의 일렉트로포레이션, 유리섬유에 의한 DNA 도입이다.

특히 옥수수의 형질전환을 다룬 관계 문헌은 다양하다(참고로 예를들면 WO95/06128, 유럽 특허 EP 0 513 849호; 유럽 특허 EP 0 465 875호; Fromm 등의 Biotechnology 8(1990), 833-844; Gordon-Kamm 등의 Plant Cell 2(1990), 603-618; Koziel 등의 Biotechnology 11(1993), 194-200). 유럽 특허 EP 292 435에 생식 식물이 무점액, 무른 과립질 옥수수 유합 조직으로부터 얻어질 수 있는 방법이 개시되어 있다. 상기 문헌에서 실리토(Shillito)등에 의해 (Bio/Technology 7(1989), 581) 생식 식물을 재생하기 위해서, 식물로 재생이 가능하고, 원형질체를 나누는 배양액이 만들어질 수 있는 유합조직-현탁 배양액으로부터 시작할 필요가 있음을 알았다. 7개월 내지 8개월의 실험관내 배양 주기 후에 실리토 등은 생존가능한 후손을 가지는 식물을 얻었지만, 형태학과 생식력에 있어서 기형을 나타냈다.

프리올리(Prioli)와 쇤달(Soeendahl)의 (Bio/Technology 7 (1989), 589)에는 카테토(Cateto) 옥수수 근교계 Cat 100-1의 옥수수 원형질체로부터 시작하여 생식 식물을 재생시키고, 얻는 방법이 기술되어 있다. 상기 저자는 원형질체가 생식 식물로 재생하는 것은 배양조건과 주개-세포의 생리학적 상태, 유전자형과 같은 다수의 다양한 요인에 의존한다고 가정한다. 보리(Wan and Lemaux, loc.cit.; Ritala 등 loc.cit.) 및 밀(Nehra 등, Plant J 5 (1994), 285-297)과 같은 다른 곡류의 성공적인 형질전환도 기술되어 있다.

도입된 DNA가 식물세포의 게놈내에 통합되면, 보통 안정하게 계속하며, 원래 형질전환된 세포의 자손내에 남는다. 상기는 바이오지드(biozid)에 대한 내성 또는 카나마이신, G 418, 블레오마이신, 히그로마이신 또는 포스피노트리신 등과 같은 항생성에 대한 내성을 형질전환된 식물세포에 전달하는 선별가능한 마커를 보통 함유한다. 그러므로 개별적으로 선별된 마커는 도입된 DNA가 없는 세포에 대해 형질전환된 세포를 선별시켜준다.

형질전환된 세포는 식물내에서 보통의 방법으로 성장한다(또한 McCormick 등, Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84 참조). 수득한 식물은 보통의 방법으로 배양될 수 있으며, 동일한 형질전환된 유전적 형질 또는 다른 유전적 형질을 갖는 식물과 이종교배될 수 있다. 수득된 잡종은 각각 상응하는 표현형적 특징을 가진다. 종자는 식물세포들로부터 얻어질 수 있다.

표현형적 특징이 안정하게 유지되는지, 이동되는지를 확인하기 위해서는 둘 또는 그 이상의 세대가 성장해야 한다. 게다가 상응하는 표현형 또는 다른 성질이 남을 것을 확인하기 위해서는 종자가 수확되어야 한다.

그리고 본 발명은 야생형 식물에 비해 변형된 정도의 분지를 갖는 아밀로펙틴 전분을 합성하는 식물을 제조하기 위한 본 발명의 핵산분자의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 다른 주된 문제는 상기 단백질의 단편 또는 절지효소의 효소적 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 분자와 상동인 식물 및 다른 유기체로부터 동정하고, 분리하기 위한, 본 발명의 핵산분자 또는 그의 일부 또는 그의 역보완물의 용도이다. "상동성"이라는 용어는 상기 정의를 언급한다.

본 실시예는 본 발명을 설명한다.

사용되는 배지 및 용액:

원형질체 분리배지(100㎖)

셀룰라아제 오노주카(onozuka) R S(메이지 세이카, 일본) 800㎎

펙토리아제 Y 23 40㎎

KNO₃200㎎

KH₂PO₄136㎎

K₂HPO₄47㎎

CaCl₂2H₂O 147㎎

MgSO₄7H₂O 250㎎

소혈청 알부민(BSA) 20㎎

글루코오스 4000㎎

프룩토오스 4000㎎

수크로오스 1000㎎

pH 5.8

삼투압 660mosm.

원형질체 세척액 1: 원형질체 분리용액과 유사하나, 셀룰라아제, 펙토리아제 및 BSA가 없다.

형질전환 완충액:

a) 글루코오스 0.5M

MES 0.1%

MgCl₂6H₂O 25mM

pH 5.8

600mosm.으로 조정

b) PEG 6000-용액

글루코오스 0.5M

MgCl₂6H₂O 100mM

헤페스(Hepes) 20mM

pH 6.5

PEG 6000은 용액(40% w/v PEG)을 사용하기 바로 전에 b)에 기재된 완충액에 첨가된다. 이 용액은 0.45㎛ 멸균 여과기를 통해 여과된다.

W5 용액

CaCl₂125mM

NaCl 150mM

KCl 5mM

글루코오스 50mM

원형질체 배양배지(㎎/ℓ)

KNO₃3000

(NH₄)₂SO₄500

MgSO₄7H₂O 350

KH₂PO₄400

CaCl₂2H₂O 300

무라시게-스쿠그(Murashige-Skoog) 배지로서의 Fe-EDTA 및 미량원소(Physiol. Plant, 15 (1962), 473).

m-이노사이트 100

티아민 HCl 1.0

니코틴산 아미드 0.5

피리독신 HCl 0.5

글리신 2.0

글루쿠론산 750

갈락투론산 750

갈락토오스 500

말토오스 500

글루코오스 36,000

프룩토오스 36,000

수크로오스 30,000

아스파라긴 500

글루타민 100

프롤린 300

카세인가수분해물 500

2,4 디클로로페녹시 아세트산(2,4-D) 0.5

pH 5.8

삼투압 600mosm.

하기 실시예에서는 하기의 방법들이 사용되었다.

1. 클로닝 방법

E.Coli를 클로닝하기 위해 벡터 pBluescript Ⅱ SK(스트라타 유전자(stratagene))을 사용하였다.

2. 박테리아 균주

Bluescript 벡터 및 pUSP 구조물용으로 E.coli 균주 DH5α를 사용하였다(미국, 게이스버그의 베데스다 연구실험실). E.coli 균주 XL1-Blue는 생체조건내 절단에 사용하였다.

3. 옥수수의 형질전환

(a) 세포계통 DSM 6009의 원형질체 제조

원형질체 분리

원형질체 현탁배양시 배지를 마지막으로 교체하고 2-4일후, 바람직하게 3일후 액체배지를 빼내고, 남은 세포를 50㎖ 원형질체 세척액 1로 세척하고, 한번더 흡인건조시켰다. 채취된 세포덩어리 2g에 10㎖ 원형질체 분리배지를 첨가하였다. 재현탁된 세포와 세포집합물을 약하게 쉐이킹(30 내지 40rpm)하면서 27±2℃의 암실에서4 내지 6시간동안 배양하였다.

원형질체 정제

1㎖당 적어도 만개(현미경적 조사)의 원형질체가 나오자마자 메쉬크기가 200 또는 45㎛인 스테인레스 스틸 또는 나일론 체를 통해 현탁액을 체친다. 세포 집합물을 적당하게 분리하기 위해 100㎛ 및 60㎛ 체를 함께 이용한다. 원형질체-함유 여과물을 현미경적으로 조사한다. 보통 98-99% 원형질체를 함유한다. 나머지는 소화되지 않은 단일세포들이다. 상기 정도의 순도를 갖는 원형질체 제조물은 추가의 구배 원심분리없이 형질전환 실험에 사용한다. 원형질체는 원심분리로 침강된다(회전 로터(100×g, 3분)내에서 100UpM). 상층액은 포기하고, 원형질체는 세척액 1내에서 재현탁된다. 원심분리를 반복하고, 계속해서 원형질체를 형질전환 완충액내에서 재현탁한다.

(b) 원형질체 형질전환

형질전환 원형질체내에서 재현탁된 원형질체를 0.5-1×10⁶원형질체/㎖의 적정기에서 50㎖ 폴리알로머 튜브내로 10㎖비율로 채운다. 형질전환에 사용된 DNA를 트리스-EDTA(TE) 완충액용액에 용해시킨다. 플라스미드 DNA 10㎍을 각 ㎖ 원형질체 현탁액에 첨가한다. 포스피노트리신에 내성을 제공하는 플라스미드는 벡터로서 이용한다(예를 들어 EP 0 513 849를 참조). DNA 첨가후, 용액내에 DNA가 균일하게 분포되도록 원형질체 현탁액을 조심스럽게 흔든다. 바로후에 5㎖ PEG 용액을 적상첨가한다.

조심스럽게 상기 튜브를 흔들어서 PEG 용액을 균일하게 분포시킨다. 그런후에 5㎖ PEG 용액을 첨가하고, 균일한 혼합을 반복한다. 원형질체를 PEG 용액내 ±2℃에서 20분동안 잔류시킨다. 후에 원형질체를 3분동안 원심분리하여 침강시킨다(100g; 1000Upm). 상층액은 포기한다. 원형질체는 조심스럽게 흔들면서 20㎖ W5 용액내에서 세척하고, 다시 원심분리시킨다. 그리고나서 20㎖ 원형질체 배양배지내에서 재현탁하고, 다시한번 원심분리하고, 배양배지내에서 다시 재현탁시킨다. 적정기는 6-8×10⁵원형질체로 조정하고, 원형질체는 페트리 접시(Ø60㎜, 높이 15㎜)내에서 3㎖ 비율로 배양한다. 페트리 접시를 파라필름으로 밀봉하고, 25±2℃의 암실에서 저장한다.

(c)원형질체 배양

원형질체 분리 및 형질전환하고 처음 2-3주동안 신선한 배지를 첨가하지 않고 원형질체를 배양한다. 원형질체로부터 발생된 세포가 20 내지 50개의 세포 이상을 갖는 세포 집합물로 발전하자마자 삼투성 수크로오스(90g/ℓ)를 함유하는 1㎖ 신선한 원형질체 배양배지를 첨가한다.

(d)형질전환된 옥수수 세포의 선별 및 식물 재생

신선한 배지를 첨가하고 3-10일후, 원형질체로부터 발전한 세포 집합물을 100㎎/ℓ L-포스피노트리신을 갖는 한천배지상에 펼친다. 원형질체 배양배지, 수크로오스 90g/ℓ 및 2,4D 1.0㎎/ℓ를 갖는 N6-배지는 MS 배지의 다량- 및 미량-영양 염을 갖는 배지와 같이 유사한 배지로서 적당하다(무라시게 및 스쿠그(1962), 상기 참조).

안정하게 형질전환된 원형질체로부터 발달한 칼리는 선택적인 배지상에서 더 성장한다. 3 내지 5주후, 바람직하게 4주후, 유전자도입 칼리를 더 이상 옥신을 함유하지 않고, L-포스피노트리신 100㎎/ℓ을 함유하는 신선한 선별배지에 옮긴다. L-포스피노트리신-아세틸-트랜스퍼라아제 유전자가 그들의 게놈내에 통합된 유전자도입 옥수수 칼리의 약 50%는 3 내지 5주내에 L-포스피노트리신의 존재하 상기 배지상에서 식물로 분화하기 시작한다.

(e)유전자도입 생식 식물의 성장

배발생 형질전환된 옥수수조직은 5×10^-4M L-포스피노트리신의 존재하 호르몬이 없는 N6-배지(Chu C.C. 등, Sci. Sin. 16(1975), 659)상에서 배양한다. 상기 배지상에서, 충분히 강한 방법으로 포스피노트리신-아세틸-트랜스퍼라아제 유전자(PAT 유전자)를 발현하는 옥수수 배는 식물로 발달한다. 형질전환되지 않은 배 또는 아주 약한 PAT 활성을 갖는 것은 죽는다. 실험관내 식물의 잎의 길이가 4 내지 6㎜가 되자마자 이들을 흙으로 옮긴다. 뿌리에 남아있는 한천을 세척한 후, 진흙, 모래, 질석 및 화분흙이 3:1:1:1의 비율로 있는 혼합물에 상기 식물을 심고, 심은후 첫 3일동안 90-100%의 상대 대기습도에서 흙배양에 적응시킨다. 성장은 23±1/17±1℃의 낮/밤 온도에서 식물높이에서 약 25000lux의 14시간 광주기를 갖는 기후챔버내에서 실시한다. 적응된 식물은 65±5% 대기습도에서 배양한다.

4.DNA 단편의 방사성 표시

DNA 단편의 방사성 표시는 제조자의 소개에 따라 보에링거(독일)제 DNA-무작위 프라이머 라벨링으로 실시하였다.

실시예 1

제아 메이즈에서 절지효소를 코딩하는 cDNA의 클로닝

옥수수에서 전분 절지효소를 코딩하는 cDNA 분자를 분리하기 위해, 옥수수 잎에서 폴리A⁺RNA로부터 시작하는 벡터 람다 ZAPⅡ(스트라타유전자)내에서 cDNA 라이브러리를 구성하고, 파지 헤드안에 채웠다. XL1 Blue 균주의 E.coli 세포는 cDNA 단편(1×10⁶pfu)을 함유하는 파지로 계속 감염시키고, 75㎠당 약 30,000의 밀도로 페트리 접시내 배지상에 펼쳤다. 8시간 배양후, 니트로셀룰로오스 막을 분해되는 박테리아상에 놓고, 1분후에 제거하였다. 그 필터를 0.2M NaOH내에서 먼저 배양하고; 1.5M NaCl에서 2분동안, 0.4M Tris/HCl pH 7.5에서 2분동안 및 마지막으로 2×SSC에서 2분동안 배양하였다. UV 가교로 DNA를 건조 및 고정시킨후, 방사적으로 표시된 프로브를 첨가하기 전에 필터를 3시간동안 42℃의 잡종화 완충액내에서 배양하였다.

프로브로는 감자에서 절지효소를 코딩하는 감자의 cDNA(서열 3 참조)를 사용하였다. 상기 cDNA는 감자에서 절지효소의 부분적 아미노산 서열로부터 유도된 퇴화 올리고뉴클레오티드로 미리 분리하였다.

잡종화는 2×SSC, 10×덴하르드트(Dehnhardt's) 용액; 50mM Na₂HPO₄, pH 7.2; 0.2% SDS; 5mM EDTA 및 250㎍/㎖ 변성된 청어 정자 DNA로 48℃에서 실시하였다.

잡종화 파지클론은 분리되고, 표준법으로 더 정제하였다. 생체내 절단으로, 양성파지 클론으로부터 E.coli 클론을 얻었다. E.coli는 각 cDNA 삽입물을 갖는 이중나선 pBluescript 플라스미드를 함유하였다. 삽입물의 크기 및 제한형태를 조사한후, 플라스미드 DNA를 적당한 클론으로부터 분리하였다. 상기 방법으로 분리한 플라스미드인 pREM-53은 1195bp의 삽입물을 함유하였다.

실시예 2

pREM-53 플라스미드의 cDNA 삽입물의 서열분석

실시예 1에 기술된 바와 같이 분리한 플라스미드 pREM-53의 경우, cDNA 삽입물의 뉴클레오티드 서열은 디데스옥시뉴클레오티드-법(Sanger 등, Proc.Natl.Sci. USA 74(1977), 5463-5467)에 의해 표준경로로 측정하였다. 삽입물의 길이는 1995bp이었다. 뉴클레오티드 서열과 상응하는 아미노산 서열은 하기 서열 1에 나타나 있다. 상동성 비교는 코딩된 단백질이 옥수수로부터의 절지효소라는 것을 보여준다.

서열 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열은 옥수수에서 알려지지 않은 절지효소를 코딩하는 부분적인 cDNA를 나타낸다. 상기 서열로, 표준기술에 의해 적당한 cDNA 또는 게놈성 라이브러리로부터 게놈성 서열 또는 완전한 cDNA 서열을 분리할 수 있다.

서열 목록

(1)일반적 정보 :

(ⅰ)출원인 :

(A)성명 : 플랜트테크 바이오테크날러지 게엠베하 포르스헝 앤드 엔트뷔클룽

(B)주소 : 헤르만스베르더 14

(C)도시 : 포츠담

(E)국가 : 독일

(F)우편번호 : 14473

(ⅱ)발명의 명칭 : 옥수수에서 절지효소를 코딩하는 핵산분자

(ⅲ)서열수 : 4

(ⅳ)컴퓨터 해독 형태 :

(A)매개형태 : 플로피 디스크

(B)컴퓨터 : IBM PC 호환형

(C)운용체계 : PC-DOS/MS-DOS

(D)소프트웨어 : Patent In Release #1.0, Version #1.30(EPA)

(2)서열번호 1의 정보

(ⅰ)서열특성 :

(A)길이: 1993 염기쌍

(B)형: 뉴클레오티드

(C)쇄의 수 : 2 본쇄

(D)형태 : 직쇄상

(ⅱ)서열의 종류 : cDNA 내지 mRNA

(ⅲ)추정서열 : 없음

(ⅳ)안티센스 : 없음

(ⅵ)기원 :

(A)생물명 : Zea mays

(F)조직의 종류 : Blattgewebe

(ⅸ)서열의 특징 :

(A)이름/키이 : CDS

(B)위치 : 1..1675

(ⅹⅰ)서열 : 서열번호 1:

(2)서열번호 2의 정보

(ⅰ)서열 특성 :

(A)길이 : 558 아미노산

(B)형 : 아미노산

(D)형태 : 직쇄상

(ⅱ)서열의 종류 : 단백질

(ⅹⅰ)서열 : 서열번호 2:

(2)서열번호 3의 정보 :

(ⅰ)서열 특성 :

(A)길이 : 492 염기쌍

(B)형 : 뉴클레오티드

(C)쇄의 수 : 1 본쇄

(D)형태 : 직쇄상

(ⅱ)서열의 종류 : cDNA 내지 mRNA

(ⅲ)추정서열 : 없음

(ⅳ)안티센스 : 없음

(ⅵ)기원 :

(A)생물명 : Solanum tuberosum

(B)주명 : Berolina

(F)조직의 종류 : 괴경

(ⅸ)서열의 특징 :

(A)이름/키이 : CDS

(B)위치 : 1..492

(D)다른 정보:/생성물="절지효소(R-효소)"

(ⅹⅰ)서열 : 서열번호 3:

(2)서열번호 4의 정보

(ⅰ)서열 특성 :

(A)길이 : 164 아미노산

(B)형 : 아미노산

(D)형태 : 직쇄상

(ⅱ)서열의 종류 : 단백질

(ⅹⅰ)서열 : 서열번호 4:

Claims

절지효소의 생물학적 활성을 갖는 제아 메이스에서 단백질을 코딩하는 핵산분자에 있어서,

(가)서열 1에 나타낸 아미노산 서열로 구성된 단백질을 코딩하는 핵산분자;

(나)서열 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 함유하는 핵산분자;

(다)(가) 또는 (나)의 핵산분자를 잡종화하는 핵산분자; 및

(라)유전암호의 변성으로 인해 (가),(나) 또는 (다)의 핵산분자의 뉴클레오티드 서열로부터 벗어나는 뉴클레오티드 서열 핵산분자로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
제 1 항에 있어서,

상기 핵산분자는 cDNA 분자인 것을 특징으로 하는 핵산분자.
길이가 적어도 15bp이고, 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 핵산분자의 한 가닥과 특이적으로 잡종화하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
제 3 항에 있어서,

제 1 항 또는 제 2 항에 따른 핵산분자의 전사물과 특이적으로 잡종화하므로써 그의 해독을 방해하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
제 1 항 또는 제 2 항의 핵산분자를 함유하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 5 항에 있어서,

상기 핵산분자는 조절요소에 센스방향으로 결합되고, 이는 원핵세포 또는 진핵세포내에서 전사 및 해독을 가능하게 하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 1 항 또는 제 2 항의 핵산분자 또는 제 5 항 또는 제 6 항의 벡터로 형질전환되고, 또는 상기 세포로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
절지효소의 생물학적 활성을 갖는 제아 메이즈로부터 단백질을 제조하는 방법에 있어서,

제 7 항의 숙주세포는 적당한 조건하에서 배양되고, 합성 단백질은 배양액으로부터 회수되는 것을 특징으로 하는 제아 메이즈로부터의 단백질 제조방법.
제아 메이즈로부터의 단백질에 있어서,

상기 단백질은 절지효소의 생물학적 활성을 갖고, 제 1 항 또는 제 2 항의 핵산분자에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 단백질.
제 1 항 또는 제 2 항의 핵산분자 또는 제 5 항 또는 제 6 항의 벡터로 형질전환된 유전자도입 식물세포에 있어서,

옥수수에서 절지효소의 생물학적 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산분자는 식물세포내에서 해독가능한 mRNA를 전사시키는 조절요소의 조절하에 두는 것을 특징으로 하는 유전자도입 식물세포.
제 10 항의 유전자도입 식물세포를 함유하는 것을 특징으로하는 유전자도입 식물.
제 11 항에 있어서,

상기 유전자도입 식물은 전분-저장 식물인 것을 특징으로 하는 유전자도입 식물.
제 12 항에 있어서,

상기 유전자도입 식물은 곡류 식물인 것을 특징으로 하는 유전자도입 식물.
제 13 항에 있어서,

상기 유전자도입 식물은 옥수수 식물인 것을 특징으로 하는 유전자도입 식물.
제 10 항의 식물세포 또는 제 11 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 식물로부터 수득가능한 것을 특징으로 하는 전분.
제 1 항 또는 제 2 항의 핵산분자에 의해 코딩되는 절지효소의 활성이 절지효소를 코딩하는 내인성 핵산분자의 전사 또는 해독의 저해로 인해 형질전환되지 않은 세포에 비해 감소되는 유전자도입 식물세포에 있어서,

전사억제는

(가)핵산분자 또는 그의 일부가 식물내에서 전사시키는 조절요소에 안티센스-방향으로 결합되는 상기 핵산분자의 일부 또는 제 1 항 또는 제 2 항의 핵산분자의 발현;

(나)제 1 항 또는 제 2 항의 핵산분자의 전사물을 특이적으로 분열시키는 리보자임의 발현;

(다)본 발명의 단백질을 코딩하는 내인성 유전자의 발현을 억제하는 공억제 RNA의 발현에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 유전자도입 식물세포.
제 16 항에 따른 식물세포를 함유하는 것을 특징으로 하는 유전자도입 식물.
제 17 항에 있어서,

상기 식물은 옥수수 식물인 것을 특징으로 하는 유전자도입 식물.
제 16 항의 식물세포 또는 제 17 항 또는 제 18 항의 식물로부터 수득가능한 것을 특징으로 하는 전분.
제 10 항 또는 제 16 항의 식물세포를 함유하는 것을 특징으로 하는 제 11 항 내지 제 14 항 또는 제 17 항 또는 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 식물의 생식물질.
식품 또는 산업용 제품을 제조하기 위한 것을 특징으로 하는 제 15 항 또는 제 19 항에 따른 전분의 용도.