BRPI0617769B1 - Isolated nucleic acid molecule, vector, methods for obtaining vegetable cell and plant, methods for expressing a nucleotide sequence in a vegetable cell, selective expression method - Google Patents

Abstract

<b>molécula de ácido nucleico isolada, construçao de dna, vetor, célula vegetal, planta, semente, métodos para expressar uma sequência de nucleotídeo em uma planta, em uma célula vegetal, método de expressao seletiva <d>a presente invenção fornece composições e métodos para regular a expressão de sequências de nucleotídeo heterólogas em uma planta. as composições incluem uma nova sequência de nucleotídeo para um promotor tecido-preferencial de milho. é fornecido um método para expressar uma sequência de nucleotideo heteróloga em uma planta usando a sequência promotora aqui apresentada. o método compreende incorporar estavelmente no genoma de uma célula vegetal uma sequência de nucleotídeo operacionalmente ligada ao promotor raiz- preferencial da presente invenção e regenerar plantas estavelmente transformadas que expressam a sequência de nucleotideo.

Description

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA, VETOR, MÉTODOS PARA OBTER CÉLULA VEGETAL E PLANTA, MÉTODOS PARA EXPRESSAR UMA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO EM UMA PLANTA E EM UMA CÉLULA VEGETAL, MÉTODO DE EXPRESSÃO SELETIVA

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção se refere ao campo da biologia molecular de plantas, mais especificamente à regulação da expressão gênica em plantas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Avanços recentes na engenharia genética de plantas permitiram a criação de plantas apresentando características ou traços melhorados, tais como resistência a doença, resistência a insetos, resistência a herbicidas, maior estabilidade ou vida útil do produto final disponibilizado para o consumidor obtido a partir de plantas e melhoria da qualidade nutricional das partes comestíveis da planta. Portanto, um ou mais genes desejados provenientes de uma fonte diferente da planta, mas construídos para conferir características ou qualidades diferentes ou melhoradas, podem ser incorporados ao genoma da planta. Um ou mais novos genes podem, então, ser expressos na célula da planta para apresentar o fenótipo desejado, tal como um novo traço ou nova característica.

Os sinais regulatórios adequados devem estar presentes e devem estar no local adequado no tocante ao gene, a fim de se obter a expressão do gene recém-inserido na célula da planta. Estes sinais regulatórios podem incluir uma região promotora, uma seqüência líder 5' não traduzida e uma seqüência 3' de terminação / poliadenilação de transcrição.

Um promotor é uma seqüência de DNA que dirige a maquinaria celular de uma planta para produzir RNA a partir de seqüência de codificação contígua a jusante (3') do promotor. A região promotora influencia a taxa, o estágio de desenvolvimento e o tipo de célula em que o transcrito de RNA do gene é produzido. A transcrição do RNA é processada para produzir RNA mensageiro (mRNA) que serve como um molde para a tradução da seqüência de RNA na seqüência de aminoácidos do polipeptídeo codificado. A seqüência líder 5'não traduzida é uma região do mRNA a montante da região de codificação de proteína que pode representar um papel na iniciação e tradução do mRNA. 0 sinal 3' de terminação/ poliadenilação de transcrição é uma região não traduzida a jusante da região de codificação da proteína, que funciona nas células vegetais para produzir a terminação da transcrição de RNA e a adição dos nucleotídeos poliadenilato à extremidade 3' do RNA. A expressão das seqüências heterólogas de DNA em um hospedeiro vegetal depende da presença de um promotor operacionalmente ligado que seja funcional dentro do hospedeiro vegetal. 0 tipo de seqüência de promotor escolhido se baseia em quando e como, dentro do organismo, se deseja a expressão do DNA heterólogo. Quando se deseja expressão em tecidos ou órgãos específicos, promotores preferenciais para tecidos podem ser usados. Quando se deseja expressão de gene em resposta a um estímulo, promotores induzíveis são o elemento regulador de escolha.

Em contraste, quando se deseja expressão continua em todas as células de uma planta, promotores constitutivos são utilizados.

Um promotor induzivel é um promotor que é capaz de ativar direta ou indiretamente a transcrição de uma ou mais seqüências de DNA ou de genes em resposta a um indutor. Na ausência de um indutor as seqüências de DNA ou genes não serão transcritos. 0 indutor pode ser um agente químico, tal como um metabólito, regulador de crescimento, herbicida ou composto fenólico, ou um estresse fisiológico imposto diretamente à planta, tal como frio, calor, sal, toxinas. No caso de combater pragas de plantas, é também desejável ter um promotor que seja induzido por patógenos de plantas, incluindo pragas de inseto em plantas, nematóides ou agentes de doença, tais como uma bactéria, vírus ou fungos. O contato com o patógeno induzirá a ativação da transcrição, de modo tal que será produzida uma proteína de combate ao patógeno em um momento em que ela será eficaz na defesa da planta. Um promotor induzido por patógeno pode também ser usado para detectar o contato com um patógeno, por exemplo, por expressão de um marcador detectável de modo que pode ser avaliada a necessidade de aplicar pesticidas. Uma célula vegetal que contém um promotor induzivel pode ser exposta a um indutor por aplicação externa do indutor à célula ou à planta tal como por pulverização, aspersão, aquecimento ou por exposição ao patógeno operativo.

Um promotor constitutivo é um promotor que dirige a expressão de um gene nas diversas partes de uma planta e continuamente durante todo o desenvolvimento da planta.

Exemplos de alguns promotores constitutivos que são amplamente usados para induzir a expressão de genes heterólogos em plantas transgênicas incluem o promotor de gene nopalina sintase (NOS), proveniente de Agrobacterium tumefadens, {patente US 6.034.322), promotores de virus mosaico de couve flor (CaMv) 35S e 19S (patente US 5.352.605), aqueles derivados de qualquer um dos diversos genes de actina, que são conhecidos como sendo expressos na maioria dos tipos de células (patente US 6.002.068) e o promotor de ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen et al. (1992) 18:675-689) que é um produto gênico conhecido por acumular em muitos tipos de células.

Seqüências reguladoras adicionais a montante e/ou a jusante da seqüência do núcleo do promotor podem ser incluidas em construções de expressão de vetores de transformação para produzir níveis variáveis de expressão de seqüências de nucleotídeos heterólogos em uma planta transgênica. Λ alteração genética de plantas com o uso de técnicas de engenharia genética para produzir plantas com traços úteis exige, portanto, a disponibilidade de uma variedade de promotores. A fim de elevar ao máximo a aplicação comercial da tecnologia de plantas transgênicas, é importante direcionar a expressão do DNA introduzido de um modo específico para um local. É desejável produzir compostos defensivos tóxicos, por exemplo, em tecidos sujeitos ao ataque por patógenos, mas não em tecidos que devem ser colhidos e comidos por consumidores. Direcionando ao sítio a síntese ou a armazenagem de proteínas ou compostos desejáveis, as plantas podem ser manipuladas como fábricas, ou sistemas de produção, para uma variedade tremenda de compostos com utilidade comercial. Os promotores específicos de células proporcionam a capacidade de dirigir a síntese de compostos, no tempo e no espaço, para tecidos ou órgãos altamente especializados, tais como raízes, folhas, tecidos vasculares, embriões, sementes ou flores.

Alternativamente, poderia ser desejável inibir a expressão de uma seqüência de DNA nativa dentro de tecidos de uma planta para obter um fenótipo desejado. Neste caso, tal inibição poderia ser obtida com a transformação da planta para compreender um promotor com preferência por tecido ligado operacionalmente a uma seqüência de nucleotídeos antisense, de modo tal que a expressão da seqüência antisense produza uma transcrição de RNA que interfira com a tradução do mRNA da seqüência de DNA nativa.

Como os padrões de expressão de um gene (ou genes) quimérico(s) introduzido(s) em uma planta são controlados usando promotores, há um interesse constante no isolamento e na identificação de promotores inéditos que sejam capazes de controlar a expressão de um gene (ou genes) quimérico (quiméricos).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO São propostos composições e métodos para a regulação da expressão gênica em uma planta. As composições compreendem seqüências de nucleotídeos novas para um promotor que inicia a transcrição de um modo tecido-específico. Mais especificamente uma região de iniciação de transcrição isolada de um gene de planta rico em prolina é proposta. Outras concretizações da invenção compreendem a seqüência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 1, a seqüência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, fragmentos das seqüências de nucleotídeos apresentadas nas SEQ ID Nos: 1-5 e a seqüência de promotor de planta depositada como Depósito de Patente No.. NRRL B-30879 na Coleção de Cultura do Serviço de pesquisa Agrária, do inglês - Agricultural Research Service (ARS) Culture Collection, sediada na Unidade de Pesquisa em Genômica Microbiana e Bioprocessos do Centro Nacional de Pesquisa para a Utilização da Agricultura, do inglês Microbial Genomics and Bioprocessing Research Unit do National Center for Agricultural Utilization Research (NCAUR) nos termos e condições do Tratado de Budapest. As composições das concretizações compreendem ainda seqüências de nucleotídeos que têm pelo menos 7 0% de identidade de seqüências com as seqüências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-5, e que dirigem a expressão tecido-específica de uma seqüência de nucleotídeos operacionalmente ligada. Também são incluídas seqüências de nucleotídeos que se hibridizam em condições estríngentes ou com a seqüência apresentada em SEQ ID NOs: 1, 3, 4, e 5 ou com a seqüência de promotor de planta depositada em hospedeiros bacterianos como Depósito de Patente NO. NRRL B-30879, ou seus complementos.

As composições também incluem construções de DNA que compreendem um promotor das concretizações ligado operacionalmente a uma seqüência de nucleotídeo heteróloga de interesse, em que o promotor é capaz de dirigir a expressão da seqüência de nucleotídeo em uma célula de planta e o promotor compreende as seqüências de nucleotídeo das concretizações. As concretizações propõem ainda vetores de expressão e plantas ou células de planta tendo estavelmente incorporado aos seus genomas uma construção de DNA mencionado acima. Além disso, as composições incluem sementes transgênicas de tais plantas. Métodos das concretizações compreendem um meio para expressar seletivamente uma seqüência de nucleotídeo em uma planta, compreendendo a transformação de uma célula de planta com uma construção de DNA e a regeneração de uma planta transformada a partir da referida célula de planta, a construção de DNA compreendendo um promotor e uma seqüência de nucleotídeo heteróloga ligada operacionalmente ao promotor, em que o promotor inicia a transcrição tecido-específica da seqüência de nucleotídeo em uma célula de planta. Deste modo, as seqüências de promotor são úteis para o controle da expressão de seqüências de codificação ligadas operacionalmente de um modo específico para tecido. A jusante e sob a regulação de iniciação transcricional do promotor haverá uma seqüência de interesse que produzirá a modificação do fenótipo da planta. Tal modificação inclui a modulação da produção de produto endógeno, quanto a quantidade, distribuição relativa, ou semelhantes, ou a produção de um produto de expressão exógena para proporcionar uma função inédita ou produto inédito na planta. Por exemplo, uma seqüência de nucleotídeo heteróloga que codifica um produto de gene que confere resistência a patógeno, herbicida, sal, frio, seca ou inseto incide no âmbito da invenção.

Em outro aspecto, os métodos descritos se referem a um método para a modulação da expressão em tecidos selecionados de uma planta transformada estavelmente compreendendo as etapas de (a) transformação de uma célula vegetal com uma construção de DNA compreendendo o promotor das concretizações ligado operacionalmente a pelo menos uma seqüência de nucleotídeo; (b) cultivo da célula de planta em condições de crescimento da planta e (c) regeneração de uma planta estavelmente transformada a partir da célula de planta, em que a expressão da seqüência de nucleotideo altera o fenótipo da planta.

DESCRIÇÃO SUCINTA DOS DESENHOS A Figura 1 é um gráfico mostrando os níveis de expressão de duas construções compreendendo o promotor Silk419, uma com o íntron ADHI de milho e uma sem ele, juntamente com um vetor de controle UBI:GUS, em plantas transformadas estáveis TO no estágio V10. Os dados de expressão foram obtidos usando protocolos de ensaio MUG. A Figura 2 é um gráfico mostrando os níveis de expressão de duas construções que compreendem o promotor Silk419, uma com o íntron ADHI de milho e oura sem ele, em plantas transformadas estáveis TO no estágio Rl. Os dados de expressão foram obtidos usando protocolos de ensaio MUG.

Figura 3 é um gráfico mostrando os niveis de expressão de uma construção que compreende o promotor Silk419 com o intron ADHI do milho em plantas transformadas estáveis TI no estágio V10. Os dados de expressão foram obtidos usando protocolos de ensaios MUG. A Figura 4 é um gráfico mostrando os níveis médios de expressão de uma construção compreendendo o promotor Silk419 com o intron ADHI do milho em plantas transformadas estáveis TI no estágio RI. Os dados de expressão foram obtidos usando protocolos de ensaios MUG.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

As composições das concretizações compreendem seqüências de nucleotideos inéditas para promotores de planta, especialmente um promotor tecido-preferencial de um gene do milho, mais especificamente, o promotor "419" do milho. Em particular, as concretizações propõem moléculas de ácido nucléico isoladas compreendendo a seqíiência de nucleotideos apresentada nas SEQ ID NOs: 1-5 e a seqüência de promotor de planta depositada em hospedeiros bacterianos como Depósito de Patente No. NRRL B-30879 em 22 de setembro de 2005 e seus fragmentos, variantes e complementos.

Um depósito do promotor "419" do milho foi feito em 22 de setembro de 2005 no Agricultural Research Service (ARS) Culture Collection, localizado na Microbial Genomics and Bioprocessing Research Unit do National Center for Agricultural Utilization Research (NCAUR), nos termos do Tratado de Budapeste. 0 depósito recebeu o seguinte número de acesso: NRRL B-30879. 0 endereço de NCAUR é 1815 N. University Street, Peoria, IL, 61604. Este depósito será mantido nos termos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para os fins de Procedimentos de Patentes. Este depósito foi feito simplesmente como uma conveniência para os versados na técnica e não é uma admissão de que um depósito é exigido nos termos de 35 U.S.C.S 112. 0 depósito estará disponível irrevogavelmente e sem restrição ou condição para o público após a concessão de uma patente. No entanto, deve ficar subentendido que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para a prática da invenção em questão em derrogação de direitos de patentes concedidos por ação governamental.

As seqüências de promotor das concretizações são úteis para a expressão de seqüências de nucleotídeos ligadas operacionalmente de um modo tecido-preferencial. Mais especificamente, o promotor das concretizações, quando usado em conjunto com o íntron ADHI do milho e incluindo a 5' UTR nativo, dirige a expressão a níveis altos em diferentes tecidos da planta, mas não constitutivamente. O padrão de expressão é de interesse, pois ele incluí tecidos que são afetados pela podridão do caule e espiga do milho. 0 promotor dirige a expressão no comprimento do caule, nas raízes, na epiderme interna das bainhas da folha, nas glumas de inflorescência, nas inflorescências femininas, e nos tecidos vasculares do sabugo imediatamente abaixo dos pontos de ligação aos floretes. 0 promotor é também ativo no pericarpo, mas somente naquela porção do pericarpo localizada na base do grão na semente madura. 0 promotor não é ativo no pólen e é somente fracamente ativo nas lâminas da folha. As seqüências das concretizações também encontram uso na construção de vetores de expressão para transformação subseqüente em plantas de interesse, como marcadores moleculares, e semelhantes. As seqüências de promotor 419 das concretizações dirigem a expressão de seqüências de nucleotídeos ligadas operacionalmente de um modo tecido-preferencial. Portanto, as seqüências de promotor 419 encontram uso na expressão tecido-preferencial de uma seqüência de nucleotídeos ligada operacionalmente de interesse. 0 método específico usado para obter o promotor 419 das concretizações da presente invenção é descrito no Exemplo 5 que aparece na seção dos Exemplos deste pedido.

As concretizações abrangem composições de ácido nucléico isolado ou substancialmente purificado. Uma molécula de ácido nucléico "isolada" ou "purificada", ou porção biologicamente ativa sua, é substancialmente isenta de outro material celular, ou de meio de cultura quando produzida por técnicas recombinantes, ou substancialmente isenta de precursores químicos ou de outras substâncias químicas quando sintetizada quimicamente. Um ácido nucléico "isolado" é essencialmente isento de seqüências (de preferência seqüências codificadoras de proteína) que naturalmente flanqueiam o ácido nucléico (isto é, seqüências localizadas nas extremidades 3' e 5' do ácido nucléico) no DNA genômico do organismo do qual é derivado o ácido nucléico. Em diversas concretizações, por exemplo, a molécula isolada de ácido nucléico pode conter menos -de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1 kb de seqüências de nucleotideos que naturalmente flanqueiam a molécula de ácido nucléico no DNA genômico da célula da qual é derivado o ácido nucléico. O promotor 419 dirige a expressão endógena de um gene de milho que codifica uma proteína rica em prolina (SEQ ID NO: 6) que tem alguma semelhança a uma proteina putativa lipase/hidrolase de motivo GDSL proveniente de arroz (AK100754). Os genes ricos em prolina são conhecidos na técnica como tendo uma ampla variedade de funções em plantas. As lipases da classe GDSL são conhecidas como existindo em plantas (veja Helliwell et al. (2001) Plant Cell 13(9):2115-2126,- Cummins & Edwards (2004) Plant Journal 39: 894-904), mas são mais bem conhecidas e caracterizadas em bactérias, nas quais elas geralmente existem com enzimas secretadas ou ligadas a membrana e usam moléculas específicas diferentes como substratos. Veja, por exemplo, Flieger et al. (2002) Infect. Immun. 70(11): 6094-6106; Farn et al. (2001) J. Bacteriol. 183 (22):6717-6720; e Carinato et al. (1998) J. Bacteriol. 180(14): 3517-3521.

As composições das concretizações incluem moléculas de ácido nucléico isoladas compreendendo as seqüências de nucleotídeo promotor apresentadas em SEQ ID NOs: 1, 3, 4 e 5. 0 termo "promotor" se destina a significar uma região reguladora de DNA geralmente compreendendo um TATA-box capaz de dirigir a RNA polimerase II para iniciar a síntese de RNA no sitio de iniciação de transcrição apropriado para uma seqüência de codificação especifica. Um promotor pode, além disso, compreender outras seqüências de reconhecimento geralmente posicionadas a montante ou 5' do TATA-box, denominadas elementos promotores a montante, que influenciam a velocidade de iniciação de transcrição. É fato reconhecido que, tendo-se identificado as seqüências de nucleotideos para as regiões promotoras descritas no presente documento, a capacidade de isolar e identificar outros elementos regulatórios na região 5' não traduzida a montante das regiões promotoras especificas identificadas no presente documento incide no estado da técnica. Portanto, as regiões promotoras descritas no presente documento podem, por exemplo, ainda compreender elementos regulatórios a montante tais como aqueles responsáveis pela expressão tecidual e temporal da seqüência de codificação, acentuadores e semelhantes. Veja especialmente patente australiana NO. AU-A-77751/94 e patentes US 5.466.785 e 5.635.618. Do mesmo modo os elementos do promotor que permitem a expressão nos tecidos desejados podem ser identificados, isolados e usados com outros promotores de núcleo para conferir expressão com preferência por tecido. Neste aspecto das concretizações, um "núcleo do promotor" se destina a significar um promotor sem elementos promotores.

Dentro do contexto desta descrição, o termo "elemento regulador" também se refere a uma seqüência de DNA, geralmente, mas nem sempre, a montante (5') da seqüência de codificação de um gene estrutural que inclui seqüências que controlam a expressão da região de codificação proporcionando o reconhecimento de RNA polimerase e/ou outros fatores necessários para que a transcrição seja iniciada em um sitio especifico. Um exemplo de um elemento regulador que provê o reconhecimento de RNA polimerase ou outros fatores de transcrição para assegurar a iniciação em um sitio especifico é um elemento promotor. Um elemento promotor compreende um elemento núcleo do promotor, responsável pela iniciação da transcrição, assim como outros elementos regulatórios (conforme será discutido em outro local neste pedido) que modificam a expressão genética. Deve também ficar subentendido que seqüências de nucleotideos localizadas dentro de introns, ou a 3' da seqüência de região de codificação, podem também contribuir para a regulação da expressão de uma região de codificação de interesse. Exemplos de introns adequados incluem, sem limitação, o intron IVS6 do milho ou o intron da actina do milho. Um elemento regulador pode também incluir aqueles elementos que estão localizados a jusante (3') do sítio de iniciação de transcrição, ou no interior de regiões transcritas, ou ambos. Dentro do contexto desta descrição, um elemento regulador pós-transcricional pode incluir elementos que são ativos depois da iniciação da transcrição, por exemplo, acentuadores de tradução e de transcrição, repressores de tradução e de transcrição e determinantes de estabilidade de mRNA.

Os elementos regulatórios, ou seus fragmentos, das concretizações podem ser associados operacionalmente com elementos regulatórios heterólogos ou promotores a fim de modular a atividade do elemento regulador heterólogo. Tal modulação inclui a intensificação ou a repressão da atividade de transcrição do elemento regulador heterólogo, a modulação dos eventos pós-transcricionais ou tanto a intensificação ou a repressão da atividade de transcrição do elemento regulador heterólogo como a modulação de eventos pós-transcricionais. Um ou mais elementos regulatórios, por exemplo, ou seus fragmentos, das concretizações podem ser associados operacionalmente com promotores constitutivos, induziveis ou tecido-preferenciais ou seus fragmentos, para modular a atividade de tais promotores no interior dos tecidos desejados dentro de células de planta.

As seqüências promotoras tecido-preferenciais de milho das concretizações, quando montadas no interior de uma construção de DNA de tal modo que o promotor esteja ligado operacionalmente a uma seqüência de nucleotídeos de interesse, permitem a expressão da seqüência de nucleotídeos nas células de uma planta transformada estavelmente com este construto de DNA. 0 termo "operacionalmente ligado" se destina a significar que a transcrição ou tradução da seqüência de nucleotídeo heteróloga se encontra sob a influência da seqüência de promotor. "Operacionalmente ligado" também se destina a significar a ligação de duas seqüências de nucleotídeos de modo tal que a seqüência de codificação de cada fragmento de DNA permaneça dentro da matriz de leitura adequada. Deste modo, as seqüências de nucleotídeos para os promotores das concretizações são providas em construções de DNA juntamente com a seqüência de nucleotídeo de interesse, tipicamente uma seqüência de nucleotídeo heteróloga para a expressão na planta de interesse. 0 termo "seqüência de nucleotídeo heteróloga" se destina a significar uma seqüência que não está naturalmente ligada operacionalmente com a seqüência de promotor. Embora esta seqüência de nucleotideo seja heteróloga em relação à seqüência de promotor, ela pode ser homóloga ou nativa; ou heteróloga, ou estranha ao hospedeiro na planta. É fato reconhecido que os promotores das concretizações podem ser usados com suas seqüências de codificação nativas para aumentar ou reduzir a expressão, resultando assim em uma alteração no fenótipo da planta transformada.

As modificações das seqüências promotoras isoladas das concretizações podem proporcionar uma faixa de expressão da seqüência de nucleotídeos heteróloga. Assim, elas podem ser modificadas para se tornarem promotores fracos ou promotores fortes. Geralmente um "promotor fraco" se destina a significar um promotor que dirige a expressão de uma seqüência de codificação a um nivel baixo. Um "nivel baixo" de expressão se destina a significar a expressão a niveis de aproximadamente 1/10.000 transcritos a aproximadamente 1/10.000 transcritos a aproximadamente 1/500.000 transcritos. Por outro lado, um promotor forte dirige a expressão de uma seqüência de codificação a um nivel alto, ou a aproximadamente 1/10 transcritos a aproximadamente 1/100 transcritos a aproximadamente 1/1.000 transcritos.

Os fragmentos e variantes das seqüências de promotor descritas também incidem no âmbito da invenção. Um "fragmento" significa uma porção da seqüência de promotor. Os fragmentos de uma seqüência de promotor podem conservar atividade biológica e, portanto abranger fragmentos capazes de dirigir a expressão preferida pelo tecido de uma seqüência de nucleotídeos operacionalmente ligada. Portanto, menos do que a seqüência de promotor inteira, por exemplo, descrita no presente documento pode ser utilizada para dirigir a expressão de uma seqüência de nucleotídeos operacionalmente ligada de interesse, tal como uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína heteróloga. A determinação de que tais fragmentos reduzem ou não os' níveis de expressão ou alteram ou não a natureza da expressão, isto é, a expressão constitutiva ou induzível, incide no estado da técnica. Alternativamente, os fragmentos de uma seqüência de nucleotídeos promotora que são úteis como sondas de hibridização, tais como as descritas abaixo, geralmente não conservam esta atividade reguladora. Portanto, os fragmentos de uma seqüência de nucleotídeos podem variar de pelo menos aproximadamente 20 nucleotídeos aproximadamente 50 nucleotídeos, aproximadamente 100 nucleotídeos e até as seqüências de nucleotídeos de comprimento total descritas no presente documento.

Assim, um fragmento da seqüência de nucleotídeos promotora 419 do milho pode codificar uma porção biologicamente ativa do promotor 419 do milho ou pode consistir em um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridização ou como um "primer" (oligonucleotídeo iniciador) de PCR usando métodos descritos abaixo. Uma porção biologicamente ativa do promotor 419 do milho pode ser preparada isolando uma porção de uma das seqüências de nucleotídeos promotora 419 do milho e avaliando a atividade dessa porção do promotor 419 do milho. As moléculas de ácido nucléico que são fragmentos de uma seqüência de nucleotídeos promotora compreendem pelo menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000 ou até o número de nucleotídeos presentes na seqüência de nucleotídeos promotora de comprimento total descrita no presente documento, tal como 1101 nucleotídeos para SEQ ID NO:l. Três fragmentos específicos do promotor 419, por exemplo, que conservam a atividade promotora são descritos no pedido como SEQ ID NOs: 4, 5 e 6. Os fragmentos truncados do promotor têm 602 pb (SEQ ID NO: 4), 350 pb (SEQ ID NO: 5) e 129 pb (SEQ ID NO: 6) de comprimento.

Os nucleotídeos de tais fragmentos geralmente compreenderão a seqüência de reconhecimento ΤΔΤΑ da seqüência de promotor específica. Tais fragmentos podem ser obtidos pelo uso de enzimas de restrição para clivar a seqüência de nucleotídeos promotora que ocorre naturalmente descrita no presente documento; sintetizando uma seqüência de nucleotídeos a partir da seqüência que ocorre naturalmente da seqüência de DNA promotor; ou podem ser obtidos com o uso de tecnologia PCR. Veja, mais especificamente, Mullis et al. (1987) Methods Enzymol. 155:335-350, e Erlich, ed. (1989) PCR Technology (Stockton Press, Nova York). Variantes destes fragmentos de promotor, tais como as que resultam de mutagênese sítio-direcionada e de um procedimento tal como o "rearranjo" de DNA, são também abrangidas pelas composições.

Um "análogo" dos elementos regulatórios das concretizações inclui qualquer substituição, deleção ou adição à seqüência de um elemento regulador desde que o análogo conserve pelo menos uma propriedade reguladora associada com a atividade do elemento regulador das concretizações. Tais propriedades incluem o direcionamento de preferência por órgão ou tecido, ou uma combinação delas, ou atividade temporal, ou atividade de desenvolvimento, ou uma combinação delas. 0 termo "variantes" se destina a significar seqüências que têm uma similaridade substancial com uma seqüência de promotor descrita no presente documento. As seqüências de nucleotideos, variantes que ocorrem naturalmente tais como estas podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular conhecidas, tais como, por exemplo, com reação em cadeia de polimerase (PCR) e técnicas de hibridização conforme delineado abaixo. As seqüências de nucleotideos variantes também incluem seqüências de nucleotideos derivadas sinteticamente tais como as geradas usando-se, por exemplo, mutagênese sitio-direcionada.

Geralmente, as variantes de uma seqüência de nucleotideos específica terão pelo menos 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, geralmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, to 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com aquela seqüência de nucleotideos específica conforme determinado por programas de alinhamento de seqüências descritos em outro ponto do presente documento usando-se parâmetros default. As variantes biologicamente ativas também incidem no âmbito da presente invenção. As variantes biologicamente ativas incluem, por exemplo, a seqüência de promotor nativa tendo uma ou mais substituições, deleções ou inserções de nucleotideos. A atividade de promotor pode ser medida usando-se técnicas tais como análise Northern blot, medições de atividade repórter tomadas de fusões transcricionais e semelhantes. Veja, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York), doravante "Sambrook", incorporado ao presente documento a título de referência. Alternativamente, os níveis de um gene repórter tal como a proteina fluorescente verde (GFP) ou semelhante produzido sob o controle de um fragmento ou variante de promotor podem ser medidos. Veja, por exemplo, patente US 6.072.050, incorporada ao presente documento a título de referência.

Os métodos para a mutagênese e alterações de seqüências de nucleotídeos são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492; Kunkel et al, (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; patente U.S. No. 4.873.192; Walker e Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nova York) e as referências citadas nelas.

As variantes de seqüências de nucleotídeo promotor também abrangem seqüências derivadas de um procedimento mutagênico e recombinogênico tal como rearranjo de DNA. Com tal procedimento, uma ou mais seqüências de promotor diferentes podem ser manipuladas para criar um novo promotor que possui as propriedades desejadas. Deste modo são geradas bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes de uma população de polinucleotídeos de seqüências relacionadas compreendendo regiões de seqüência que têm uma identidade de seqüências substancial e podem ser recombinadas de modo homólogo in vitro ou in vivo. As estratégias para tal rearranjo de DNA são conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94 :4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; e patentes US 5.605.793 e 5.837.458.

As seqüências de nucleotideos das concretizações podem ser usadas para isolar as seqüências correspondentes provenientes de outros organismos, especialmente de outras plantas, de outras monocotiledôneas, por exemplo. Deste modo, podem ser usados métodos tais com PCR, hibridização e semelhantes para se identificar tais seqüências baseadas em sua homologia de seqüências à seqüência apresentada no presente documento. Incidem também no âmbito da presente invenção as seqüências isoladas com base na sua identidade de seqüência à seqüência integral de promotor 419 do milho apresentada no presente documento ou a seus fragmentos. As regiões de promotor das concretizações podem ser isoladas de qualquer planta, incluindo, sem limitação, milho (Zea mays), Brassica (Brassica napus, Brassica rapa ssp.), alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , girassol (Helianthus annuus), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata inglesa (Solanum tuberosum), amendoim (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium hirsutum), batata doce {Ipomoea batatus), aipim (Manihot esculenta), café (Cofea spp.), coco (Cocos nucifera) , abacaxi (Ananas comosus), árvores cítricas (Cítrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana [Musa spp.), abacate [Persea americana), figo [Ficus casica), goiaba [Psidium guajava), manga [Mangifera indica), azeitona (Olea europaea), aveia, cevada, vegetais, plantas ornamentais, e coníferas. As plantas incluem milho, soja, girassol, cártamo, Brassíca ou canola, trigo, cevada, centeio, alfafa, e sorgo.

Em uma abordagem de PCR, podem ser projetados primers de oligonucleotídeos para uso em reações de PCR para amplificar as seqüências correspondentes de DNA a partir de cDNA ou de DNA genômico extraído de qualquer planta de interesse. Métodos para projeto de primers de PCR e para a clonagem por PCR são geralmente conhecidos na técnica e são descritos em Sambrook, acima. Veja também Innis et al., eds. {1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nova York); Innis e Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nova York); e Innis e Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nova York). Métodos conhecidos de PCR incluem, sem limitação, métodos usando-se primers pareados, primers aninhados, primers específicos individuais, primers degenerados, primers específicos de gene, primers específicos de vetor, primers parcialmente malpareados e semelhantes.

Em técnicas de híbridízação, toda a seqüência de nucleotídeos conhecida ou parte dela é usada como uma sonda que hibridiza seletivamente a outras seqüências de nucleotídeos correspondentes presentes em uma população de fragmentos de DNA genômico clonados ou fragmentos de cDNA (isto é, bibliotecas genômicas ou de cDNA) de um organismo escolhido. As sondas de hibridização podem consistir em fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotideos, e podem ser marcadas com um grupo detectável tal como 32P ou qualquer outro marcador detectável. Portanto, sondas para hibridização podem, por exemplo, ser produzidas por marcação de oligonucleotideos sintéticos baseados nas seqüências de promotor 419 do milho das concretizações. Os métodos para a preparação de sondas para a hibridização e para a construção de cDNA e de bibliotecas genômicas são geralmente conhecidos na técnica e são descritos em Sambrook, acima. A hibridização de tais seqüências pode ser conduzida em condições estringentes. "Condições estringentes" ou "condições de hibridização estringentes" consistem em condições pretendidas nas quais uma sonda se hibridizará à sua seqüência alvo até um ponto detectavelmente maior do que a outras seqüências (pelo menos duas vezes em relação ao fundo, por exemplo). As condições estringentes são dependentes de seqüência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Controlando-se a estringência das condições de hibridização e/ou de lavagem, podem ser identificadas seqüências alvo que tem 100% de complementaridade à sonda (sondagem homóloga). Alternativamente, as condições de estringência podem ser ajustadas para permitir um mau alinhamento nas seqüências de modo que sejam detectados graus inferiores de similaridade (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda tem menos de aproximadamente 1000 nucleotídeos de comprimento, freqüentemente menos de 500 nucleotídeos de comprimento.

Tipicamente, as condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é inferior a aproximadamente 1,5 de íon Na, tipicamente de aproximadamente 0,01 a 1,0M de íon Na de concentração (ou de outros sais) a um pH de 7,0 a 8,3 e a temperatura é de pelo menos aproximadamente 30°C para sondas curtas (10 a 50 nucleotídeos, por exemplo) e de pelo menos aproximadamente 60°C para sondas longas (acima de 50 nucleotídeos, por exemplo). As condições estringentes podem também ser obtidas com a adição de agentes desestabilizantes tais como formamida. As condições de baixa estringência exemplares incluem a hibridização com uma solução tampão de formamida a 30 a 35%, NaCl a 1M, SDS (dodecil sulfato de sódio) a 1% a 37°C, e uma lavagem em 1 X a 2 X SSC (20 X SSC = NaCl a 3,0M/citrato trissódico a 0,3M) a uma temperatura de 50 a 55°C. Condições de estringência moderada exemplar incluem hibridização em formamida a 40 a 45%, NaCl a 1,0M, SDS a 1% a 37°C, e uma lavagem em 0,5 X a 1 X de SSC a uma temperatura de 55 a 60°C. As condições de alta estringência exemplares incluem a hibridização em formamida a 50%, NaCl a 1M, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em 0,1 x SSC a uma temperatura de 60 a 65°C durante pelo menos 30 minutos. A duração de hibridização é geralmente inferior a aproximadamente 24 horas, geralmente de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas. A especificidade é tipicamente a função de lavagens pós-hibridização, sendo os fatores críticos a intensidade iônica e a temperatura da solução final de lavagem. Para híbridos de DNA-DNA, o ponto de fusão térmico (Tm) pode ser aproximado da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (% de GC) - 0,61 (% de form) - 500/L; em que M é a molaridade dos cátions monovalentes, % de GC é porcentagem de nucleotídeos de guanosina e citosina no DNA,% de form é a porcentagem de formamida na solução de hibridização e L é o comprimento do híbrido nos pares de bases. A Tm é a temperatura {em condições de resistência iônica e pH definidos) à qual 50% de uma sequência alvo complementar se hibridiza a uma sonda perfeitamente pareada. Tm é reduzida de aproximadamente 1°C para cada 1% de malpareamentos; portanto a Tm, as condições de hibridização e/ou condições de lavagem podem ser ajustadas para se hibridizar a seqüências da identidade desejada. Se as seqüências com 5: 90% de identidade são procuradas, por exemplo, a Tm pode ser reduzida de 10°C. Geralmente as condições estringentes são selecionadas para se encontrarem aproximadamente 5°C abaixo da Tm para a seqüência específica e o seu comprimento a uma intensidade iônica e pH definidos. NO entanto, condições gravemente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3, e 4°C abaixo da Tm; condições de estringência moderada podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8 9 ou 10°C abaixo da Tm; condições de baixa estringência podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14 15 ou 20°C abaixo da Tm. Usando-se a equação, composições de hibridização e de lavagem e Tm desejada, os versados na técnica compreenderão que as variações na estringência das soluções de hibridização e/ou lavagem são inerentemente descritas. Se o grau desejado de malpareamento resultar em uma Tm de menos de 45°C (solução aquosa) ou 32°C (solução em formamida) , é preferível se aumentar a concentração de SSC de modo que possa ser usada uma temperatura mais elevada. Um guia extenso para a hibridização de ácidos nucléicos se encontra em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nova York); e Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nova York), doravante "Ausubel". Veja, também, Sambrook acima.

Assim, incidem no âmbito da presente invenção as seqüências isoladas que têm atividade de promotor tecido-preferencial e que se hibridizam em condições estringentes às seqüências promotoras 419 do milho descritas no presente documento, ou com seus fragmentos.

Em geral, as seqüências que têm atividade promotora e que se hibridizam às seqüências de promotor descritas no presente serão pelo menos 40% a 50% homólogas, aproximadamente 60% a 70% homólogas e até mesmo aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95% a 98% homólogas ou mais às seqüências descritas. Isto é, a similaridade de seqüências das seqüências pode variar, compartilhando pelo menos aproximadamente 40% a 50%, aproximadamente 60% a 70%, e até mesmo 80%, 85%, 90%, 95% a 98% de similaridade de seqüências.

Os termos abaixo são usados para descrever as relações entre seqüências entre dois ou mais ácidos nucléicos ou polinucleotideos: (a) "seqüência de referência", (b) "janela de comparação", (c) "identidade de seqüências", (d) "porcentagem de identidade de seqüências" e (e) "identidade substancial". (a) Conforme empregado no presente, "seqüência de referência" é uma seqüência definida usada como uma base para a comparação de seqüências. Uma seqüência de referência pode ser um subconjunto de uma seqüência especificada ou a seqüência integral; como um segmento de um cDNA ou seqüência de gene de comprimento total, por exemplo, ou o cDNA ou seqüência de gene completas. (b) Conforme empregado no presente, "janela de comparação" faz referência a um segmento contíguo e especificado de uma seqüência de polinucleotídeo em que a seqüência de polinucleotídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, falhas) em comparação com a seqüência de referência (que não compreende nem adições nem deleções) para um alinhamento ótimo das duas seqüências. Geralmente a janela de comparação tem pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de comprimento e opcionalmente pode ter 30, 40, 50, 100 ou mais. Os versados na técnica observarão que para se evitar um alto grau de similaridade a uma seqüência de referência devido à inclusão de falhas na seqüência de polinucleotídeo uma penalidade para a falha é tipicamente introduzida e é subtraída do número de pareamentos.

Os métodos de alinhamento de seqüências para comparação são bem conhecidos na técnica. Portanto, a determinação de porcentagem de identidade de seqüências entre quaisquer duas seqüências pode ser obtida usando-se um algoritmo matemático. Exemplos não limitantes de tais algoritmos matemáticos são o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS 4:11-17; o algoritmo de homologia local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; o algoritmo de alinhamento por homologia de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; o método de busca por similaridade de Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85:2444-2448; o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264-2268, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877.

As implementações por computador destes algoritmos matemáticos podem ser utilizadas para a comparação de seqüências para se determinar a identidade de seqüências. Tais implementações incluem, sem limitação: CLUSTAL no programa PC/Gene (disponível de Intelligenetics, Mountain View, Califórnia); o programa ALIGN (Versão 2.0); o programa ALIGN PLUS (Versão 3.0, Copyright 1997): e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package de Genetics Computer Group, Versão 10 (disponível de Accelrys, 9685 Scranton Road, San Diego, CA, 92121, USA). A matriz de contagem usada na Versão 10 do Wisconsin Genetics Software Package é BLOSUM62 (veja Henikoff e Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915).

Os alinhamentos que usam estes programas podem ser conduzidos usando-se os parâmetros default. O programa CLUSTAL é descrito por Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65; e Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. Os programas ALIGN e ALIGN PLUS são baseados no algoritmo de Myers e Miller (1988) acima. Uma tabela de resíduos de peso PAM120, uma penalidade para prolongamento de falha de 12 e uma penalidade para a falha de 4 pode ser usada com o programa ALIGN quando se comparam seqüências de aminoácidos. Os programas BLAST de Altschul et al.. (1990) J. MOl. Biol. 215:403 são baseados no algoritmo de Karlin e Altschul (1990) acima. As buscas de nucleotideos por BLAST podem ser conduzidas com o programa BALSTN, contagem = 100, comprimento de palavra = 12, para obter seqüências de nucleotideos homólogas a uma seqüência de nucleotideos que codifica uma proteína das concretizações. As buscas de proteínas por BLAST podem ser conduzidas com o programa BALSTX, contagem = 50, comprimento de palavra = 3, para se obter seqüências de aminoácidos homólogas à proteína ou polipeptídeo das concretizações. Para se obter os alinhamentos com falhas para fins de comparação pode ser utilizado Gapped BLAST (em BLAST 2.0) conforme descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, PSI-BLAST (em BLAST 2.0) pode ser usado para conduzir a busca repetida que detecta relações distantes entre moléculas. Veja Altschul et al. (1997) acima. Quando se utiliza BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST os parâmetros default dos programas respectivos (BLASTN, por exemplo, para seqüências de nucleotideos, BALSTX para proteínas) pode ser usado. Veja o sítio na Internet para o National Center for Biotechnology Information. A não ser que seja declarado em contrário, os valores de identidade/similaridade de seqüências fornecidos no presente documento se referem ao valor obtido usando-se o programa GAP com parâmetros default, ou qualquer programa equivalente. "Programa equivalente" se destina a descrever qualquer programa de comparação de seqüências que, para quaisquer duas seqüências em questão, gera um alinhamento que tem pareamentos de nucleotideos ou de resíduos de aminoácidos idênticos e uma identidade de seqüências de porcentagem idêntica quando comparado com o alinhamento correspondente gerado por GAP. 0 programa GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch (1980) acima, para encontrar o alinhamento de duas seqüências completas que maximiza o número de pareamentos e minimiza o número de falhas. GAP considera todos os alinhamentos e posições de falhas possíveis e cria o alinhamento com o número máximo de bases pareadas e com um número mínimo de falhas. Ele permite que se crie uma penalidade para a criação de falha e uma penalidade para o prolongamento da falha em unidades de bases pareadas. GAP deve fazer um ganho do número de pareamentos por penalidade para a criação de falha para cada falha que ele insere. Se for selecionada uma penalidade para o prolongamento de falha acima de zero, GAP deve, além disso, fazer um ganho para cada falha inserida do comprimento da falha vezes a penalidade para o prolongamento de falha. Os valores de penalidade para a criação de falha default e os valores de penalidade para o prolongamento de falha na Versão 10 do Wisconsin Genetics Software Package para seqüências de proteína são 8 e 2 respectivamente. Para seqüências de nucleotídeos a penalidade para a criação de falha default é 50 ao passo que a penalidade para o prolongamento de falha default é 3. As penalidades para a criação de falha e para o prolongamento de falha podem ser expressas como um número inteiro selecionado do grupo de números inteiros consistindo em 0 a 200. Assim, as penalidades para a criação de falha e para o prolongamento de falha podem ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou mais. (c) Conforme empregado no presente, "identidade de seqüências" ou "identidade" dentro do contexto de duas seqüências de ácidos nucléicos ou de polipeptídeos faz referência aos resíduos nas duas seqüências que são iguais quando alinhadas para uma correspondência máxima sobre uma janela de comparação especificada. Quando a porcentagem de identidade de seqüências é usada com referência a proteínas, é reconhecido o fato de que as posições de resíduos que não são idênticas freqüentemente diferem por substituições conservadas de aminoácidos, em que os resíduos de aminoácidos são usados em vez de outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas semelhantes {carga ou hidrofobicidade, por exemplo) e não alteram, portanto, as propriedades funcionais da molécula. Quando as seqüências diferem em substituições conservadas, a porcentagem de identidade de seqüências pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservadora da substituição. Diz-se que as seqüências que diferem por tais substituições conservadas têm "similaridade de seqüências" ou "similaridade". Os meios para a produção deste ajuste são conhecidos dos versados na técnica. Tipicamente isto envolve se dar uma contagem de uma substituição conservada como um malpareamento parcial e não um malpareamento total, aumentando assim a porcentagem de identidade de seqüências. Assim, no caso em que um aminoácido idêntico recebe uma contagem de 1, por exemplo, e uma substituição não conservada recebe uma classificação de zero, uma substituição conservada recebe uma contagem entre zero e 1. A contagem de substituições conservadas é calculada conforme implementado no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Califórnia), por exemplo. (d) Conforme empregado no presente, "porcentagem de identidade de seqüências" significa o valor determinado comparando-se duas seqüências com alinhamento ótimo sobre uma janela de comparação, em que a porção da seqüência de polinucleotideo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, falhas) em comparação com a seqüência de referência (que não compreende nem adições nem deleções) para alinhamento ótimo das duas seqüências. A porcentagem é calculada determinando-se o número de posições em que ocorre uma base de ácido nucléico ou residuo de aminoácido idêntico nas duas seqüências para produzir o número de posições pareadas, dividindo-se o número de posições pareadas pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando-se o resultado por 100, para se obter a porcentagem de identidade de seqüências. (e) (i) O termo "identidade substancial" de seqüências de polinucleotldeos significa que um polinucleotideo compreende uma seqüência que tem pelo menos 7 0% de identidade de seqüências, pelo menos 80%, 90%, ou 95%, em comparação a uma seqüência de referência usando-se um dos programas de alinhamento descritos usando-se parâmetros padrão. Os versados na técnica reconhecerão que estes valores podem ser adequadamente ajustados para se determinar a identidade correspondente de proteínas codificadas por duas seqüências de nucleotídeos levando-se em conta a degeneração do códon, a similaridade de aminoácidos, o posicionamento da matriz de leitura e semelhantes. A identidade substancial de seqüências de aminoácidos para tais fins normalmente significa uma identidade de seqüências de pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou 95%.

Uma outra indicação de que as seqüências de nucleotídeos são substancialmente idênticas é o fato de que duas moléculas se hibridizam entre si em condições estringentes. Geralmente as condições estringentes são selecionadas para se encontrarem aproximadamente 5°C abaixo da Tm para a seqüência específica a uma intensidade iônica definida e a um pH definido. No entanto as condições estringentes abrangem temperaturas na faixa de aproximadamente 1°C a aproximadamente 20°C abaixo da Tm, dependendo do grau desejado de estringência, conforme qualificado de outro modo no presente documento. Os ácidos nucléicos que não se hibridizam entre si em condições estringentes ainda serão substancialmente idênticos se os polipeptídeos que eles codificam são substancialmente idênticos. Isto pode ocorrer, quando uma cópia de um ácido nucléico, por exemplo, é criada usando-se o máximo de degeneração de códon permitida pelo código genético. Uma indicação de que duas seqüências de ácidos nucléicos são substancialmente idênticas é quando o polipeptideo codificado pelo primeiro ácido nucléico é imunologicamente trans-reativo com o polipeptideo codificado pelo segundo ácido nucléico. A seqüência de promotor 419 do milho, descrita no presente documento, assim como suas variantes e fragmentos, são úteis para a engenharia genética de plantas, por exemplo, para a produção de uma planta transformada ou transgênica, para expressar um fenótipo de interesse. Conforme empregado no presente, os termos "planta transformada" e "planta transgênica" se referem a uma planta que compreende no interior do seu genoma um polinucleotideo heterólogo. Geralmente o polinucleotideo heterólogo é estavelmente integrado no interior do genoma de uma planta transgênica ou transformada de modo tal que o polinucleotideo é passado para gerações sucessivas. 0 polinucleotideo heterólogo pode ser integrado ao genoma sozinho ou como parte de uma construção recombinante de DNA. Deve ficar subentendido que conforme empregado no presente, o termo "transgênico" inclui qualquer célula, linhagem de células, calo, tecido, parte de planta ou planta cujo genótipo tenha sido alterado pela presença do ácido nucléico heterólogo incluindo aqueles transgênicos deste modo alterados assim como aqueles criados por cruzamento sexual ou propagação assexuada a partir do transgênico inicial. 0 termo "transgênico", conforme empregado no presente, não abrange a alteração do genoma (cromossômico ou extra-cromossômico) por métodos de cruzamento vegetal convencional ou por eventos que ocorrem naturalmente tais como fertilização cruzada aleatória, infecção viral não recombinante, transformação bacteriana não recombinante, transposição não recombinante, ou mutação espontânea.

Um "evento" transgênico é produzido pela transformação de células vegetais com uma construção de DNA heterólogo, incluindo uma construção de ácido nucléico de DNA que compreende um transgene de interesse, a regeneração de uma população de plantas resultante da inserção do transgene no genoma da planta e a seleção de uma planta especifica caracterizada pela inserção em um local especifico do genoma. Um evento é fenotipicamente caracterizado pela expressão do transgene. A nível genético, um evento é parte da constituição genética de uma planta. 0 termo "evento" também e refere à progênie produzida por um extra-cruzamento sexual entre o transformante e uma outra variedade que inclui o DNA heterólogo.

Conforme empregado no presente, o termo "planta" inclui referência a plantas integrais, órgãos de plantas (folhas, caule, raízes, por exemplo, etc.), sementes, células de planta e sua prole. Deve ficar subentendido que partes de plantas transgênicas, dentro do âmbito das concretizações compreendem, por exemplo, células de planta, protoplastos, tecidos,, calo, embriões, assim como flores, caules, frutos, óvulos, folhas ou raízes se originando em plantas transgênicas ou sua progênie anteriormente transformada com uma molécula de DNA da invenção, e consistindo, portanto, pelo menos em parte em células transgênicas.

Conforme empregado no presente, o termo "célula de planta" inclui, sem limitação, culturas de suspensão de sementes, embriões, regiões meristemáticas, tecido do calo, folhas, raizes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos. A classe de plantas que pode ser usada nos métodos das concretizações é geralmente é tão ampla como a classe de plantas superiores passíveis de serem submetidas a técnicas de transformação, incluindo tanto plantas monocotiledôneas como dicotiledôneas.

As seqüências de promotor e os métodos descritos no presente documento são úteis na regulação da expressão de qualquer seqüência de nucleotídeos heteróloga em uma planta hospedeira. Portanto, a seqüência de nucleotídeos heteróloga ligada operacionalmente aos promotores descritos no presente documento pode consistir em um gene estrutural codificando uma proteína de interesse. Os genes de interesse refletem os mercados comerciais e os interesses dos envolvidos no desenvolvimento da cultura. As culturas e os mercados de interesse se modificam, e à medida que as nações em desenvolvimento abrem mercados globais, também emergirão novas culturas e tecnologias. Além disso, à medida que aumenta a nossa compreensão das características e facetas agronômicas tais como rendimento e heterose, a escolha de genes para a transformação se alterará proporcionalmente. As categorias gerais de genes de interesse para as concretizações incluem, por exemplo, aqueles genes envolvidos em informação, tais como "zinc fingers", os envolvidos em comunicação, tais como as quinases e os envolvidos em administração, tais como proteína de choque térmico. As categorias mais especificas de transgenes incluem, por exemplo, genes que codificam proteínas que conferem resistência a estresse abiótico, tal como estiagem, temperatura, salinidade e toxinas tais como pesticidas e herbicidas ou a estresse biótico, tal como ataques por fungos, vírus, bactérias, insetos e nematóides, e desenvolvimento de doenças associadas com estes organismos. Diversas alterações no fenótipo são de interesse incluindo a modificação da expressão de um gene em um tecido vegetal específico, a alteração de um mecanismo de defesa da planta contra patógeno ou inseto, o aumento da tolerância da planta a herbicidas, a alteração do desenvolvimento tecidual para responder ao estresse do ambiente e semelhantes. Os resultados podem ser obtidos provendo-se a expressão de produtos heterólogos ou um aumento da expressão de produtos endógenos nas plantas. Alternativamente, os resultados podem ser obtidos provendo-se a redução da expressão de um ou mais produtos endógenos, especialmente de enzimas, transportadores, ou cofatores, ou afetando a absorção de nutrientes na planta. Estas alterações resultam em uma alteração no fenótipo da planta transformada. É fato reconhecido que qualquer gene de interesse pode ser ligado operacionalmente às seqüências promotoras descritas no presente documento e expressas em tecidos de planta.

Uma construção de DNA que compreende um destes genes de interesse pode ser usado com técnicas de transformação, tais como as descritas abaixo para criar resistência a doença ou a insetos em fenótipos de plantas suscetíveis ou para aumentar a resistência a doença ou a insetos em fenótipos de plantas resistentes. Conseqüentemente esta divulgação abrange métodos que são voltados para a proteção de plantas contra patógenos fúngicos, bactérias, vírus, nematóide, insetos e semelhantes. "Resistência a doença" ou "resistência a insetos" significa que as plantas evitam sintomas prejudiciais que são o resultado de interações planta-patógeno.

Os genes de resistência a doença e de resistência a insetos tais com lisozimas, cecropinas, maganinas ou tioninas para proteção antibacteriana ou as proteínas relacionadas com a patogênese (PR) tais como as glucanases e quitinases para proteção antifúngica, ou endotoxinas Bacillus thuringiensis, inibidores de protease, colagenases, lectinas, e glicosidases para o controle de nematóides ou de insetos são todos exemplos de produtos genéticos úteis.

Os patógenos das concretizações incluem, sem limitação, vírus ou viróides, bactérias, insetos, nematóides, fungos e semelhantes. Os vírus incluem vírus mosaico do tabaco ou pepino, vírus de mancha anular, vírus da necrose, vírus mosaico anão do milho etc. Os nematóides incluem nematóides parasíticos tais como nó da raiz, cisto e nematóides de lesão etc.

Os genes que codificam traços de resistência a doença incluem genes de detoxificação, tais como contra fumonisina (patente US 5.792.931) genes de avirulência (avr) e de resistência a doença (R) (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); e semelhantes. Os genes de resistência a insetos podem codificar a resistência a pragas que tem um grande impacto sobre o rendimento tais como verme da raiz, verme cortador, broca européia do milho, e semelhantes. Tais genes incluem, por exemplo, genes de proteína tóxica a Bacillus thuringiensis (patentes US 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser et al. (1986) Gene 48: 109); lectinas (Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:825); e semelhantes.

Os traços de resistência a herbicida podem ser introduzidos em plantas por genes que codificam a resistência a herbicidas que atuam para inibir a ação de acetolactato sintase (ALS), especialmente os herbicidas do tipo sulfoniluréia (o gene de acetolactato sintase (ALS), por exemplo, contendo mutações que levam a tal resistência, especialmente as mutações S4 e/ou Hra), genes que codificam a resistência a herbicidas que atuam para inibir a ação de glutamina sintase, tais como fosfinotricina ou Basta® (glufosinato) (o gene bar, por exemplo) ou outros tais genes conhecidos na técnica. 0 gene bar codifica resistência ao herbicida Basta®, o gene nptll codifica a resistência aos antibióticos canamicina e geneticina e o gene de ALS codifica a resistência ao herbicida clorsulfuron. A resistência a glifosato é conferida por genes de 5-enolpiruvl-3-fosfiquimato sintase (EPSP) mutante e aroA. Veja, por exemplo, a patente US 4.940.835 concedida a Shah et al., que divulga a seqüência de nucleotídeos de uma forma de EPSPS que pode conferir resistência a glifosato. A patente US No. 5.627.061 concedida a Barry et al. também descreve genes que codificam enzimas EPSPS. Veja também patentes US 6.248.876; 6.040.497; 5.804.425; 5.633.435; 5.145.783; 4.971.908; 5.312.910; 5.188.642; 4.940.835; 5.866.775; 6.225.114; 6.130.366; 5.310.667; 4.535.060; 4.769.061; 5.633.448; 5.510.471; RE 36.449; RE 37.287; e 5.491.288; e as publicações internacionais WO 97/04103; WO 97/04114; WO 00/66746; WO 01/66704; WO 00/66747 e WO 00/66748, que são incorporadas ao presente documento a título de referência para tal fim. A resistência a glifosato é também conferida a plantas que expressam um gene que codifica uma enzima glifosato óxido-reductase, conforme descrito com mais detalhes nas patentes U.S. Nos. 5.776.760 e 5.463.175, que são incorporadas ao presente documento a titulo de referência para tal fim. Além da resistência a glifosato, pode ser conferida a plantas pela super-expressão de genes que codificam glifosato N-acetil-transferase. Veja, por exemplo, pedidos de patentes US Nos. de Série 10/004.357; e 10/427.692.

Os genes da esterilidade podem também ser codificados em uma construção de DNA e proporcionar uma alternativa à retirada física do cacho. Exemplos de genes usados de tal modo incluem genes com preferência a tecido masculino e genes com fenótipos de esterilidade masculina tais como QM, descrito na patente US 5.583.210. Outros genes incluem quinases e os que codificam compostos tóxicos ou ao desenvolvimento gametofítico masculino ou feminino.

Os traços comerciais podem também ser codificados em um gene ou genes que poderiam aumentar, por exemplo, amido para a produção de etanol ou proporcionar a expressão de proteínas. Um outro uso comercial importante de plantas transformadas é a produção de polímeros e bioplásticos tais como os descritos na patente U.S. No. 5.602.321. Genes tais como β-cetotiolase, PHBase (poliidróxi-butirato sintase} e acetoacetil-CoA reductase (veja Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170: 583705847) facilitam a expressão de polihidróxi-alcanoatos (PHAs).

Os traços agronomicamente importante que afetam a qualidade do grão, tais como níveis e tipos de óleos, saturados e insaturados, qualidade e quantidade de aminoácidos essenciais, níveis de celulose, amido e teor de proteína podem ser geneticamente alterados usando-se os métodos das concretizações. As modificações incluem o aumento do teor de ácido oléico, óleos saturados e insaturados, o aumento de níveis de lisina e enxofre, a provisão de aminoácidos essenciais e a modificação do amido. As modificações da proteína hordotionina em milho são descritas nas patentes US 5.990.389; 5.885.801; 5.885.802 e 5.703.049; incorporadas ao presente documento a título de referência. Um outro exemplo consiste em proteína de semente rica em lisina e/ou enxofre codificada pelo de albumina 2S de soja descrita na patente US 5.850.016, depositado em 20 de março de 1996, e o inibidor de quimotripsina da cevada, Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106, cujo conteúdo é incorporado ao presente documento a título de referência.

Os produtos exógenos incluem enzimas e produtos vegetais assim como os provenientes de outras fontes incluindo procariontes e outros eucariontes. Tais produtos incluem enzimas, cofatores, hormônios e semelhantes.

Exemplos de outros genes aplicáveis e seu fenótipo associado incluem o gene que codifica a proteina do capsideo viral e/ou RN, ou outros genes virais ou de plantas que conferem resistência viral; genes que conferem resistência a fungos; genes que conferem resistência a insetos; genes que promovem o aumento do rendimento; e genes que proporcionam resistência a estresse, tal como a desidratação resultante de calor e salinidade, metais tóxico ou elementos de traços, ou semelhantes. "RNAi" se refere a uma série de técnicas correlatas para a redução da expressão de genes (veja, por exemplo, patente US 6.506.559), Técnicas mais antigas denominadas por outros nomes são consideradas hoje em dia como se apoiando no mesmo mecanismo, mas receberam nomes diferentes na literatura. Estes incluem "inibição antisense", a produção de transcritos de RNA antisense capazes de suprimir a expressão da proteina alvo, e "co-supressâo" ou "supressão sense" que se referem à produção de transcritos de RNA no sentido, capazes de suprimir a expressão de genes estranhos ou endógenos idênticos ou substancialmente semelhantes (patente US 5.231.020, incorporada ao presente documento a titulo de referência) . Tais técnicas se apoiam no uso de construções que resultam no acúmulo de RNA de dois filamentos com uma complementaridade de filamento ao gene alvo a ser silenciado. A sequência de promotor 419 do milho e os seus fragmentos ou variantes correlatas biologicamente ativas descritas no presente documento, podem ser usada para dirigir a expressão de construções que resultará na interferência no RNA incluindo microRNAs e siRNAs. A sequência de nucleotídeos heteróloga ligada de modo operativo ao promotor 419 do milho e a seqüências promotoras correlatas descritas no presente documento podem consistir em uma seqüência antisense para um gene alvo. A terminologia "seqüência de nucleotídeos de DNA antisense" se destina a significar uma seqüência que tem uma orientação inversa à orientação normal 5- a 3' daquela seqüência de nucleotídeos. Quando fornecida em uma célula de planta, a expressão da seqüência de DNA antisense impede a expressão normal da seqüência de nucleotídeos de DNA para o gene alto. A seqüência de nucleotídeos antisense codifica uma transcrição de RNA que é completar e capaz de se hibridizar com o RNA mensageiro (mRNA) endógeno produzido pela transcrição da seqüência de nucleotídeos de DNA para o gene alvo. Neste caso, a produção da proteína nativa codificada pelo gene alvo é inibida para se obter uma resposta fenotípica desejada. As modificações das seqüências antisense podem ser feitas desde que as seqüências se hibridizem e interfiram na expressão do mRNA correspondente. Deste modo, podem ser usadas construções antisense que têm pelo menos 70%, 80% ou 85% ou mais de identidade de seqüências às seqüências antisense correspondentes. Além disso, porções dos nucleotídeos antisense podem ser usadas para destruir a expressão do gene alvo. Geralmente, podem ser usadas seqüências de pelo menos 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos ou mais. Portanto, as seqüências promotoras descritas no presente documento podem ser ligadas operacionalmente a seqüências de DNA antisense para reduzir ou inibir a expressão de uma proteína nativa nos tecidos de planta selecionados.

Em uma concretização, as construções de DNA compreenderão uma região de iniciação de transcrição compreendendo uma das seqüências de nucleotídeos de promotor descritas no presente documento, ou variantes ou fragmentos seus, ligados operacionalmente a uma seqüência de nucleotídeos heteróloga cuja expressão deve ser controlada pelo promotor com preferência a tecido das concretizações. Tal construção de DNA é dotada com uma multiplicidade de sítio de restrição para a inserção da seqüência de nucleotídeos a se encontrar sob a regulação transcricional das regiões reguladoras. A construção de DNA pode, além disso, conter genes marcadores de seleção. A construção de DNA incluirá na direção 5'-3' da transcrição, uma região de iniciação de transcrição (isto é um promotor com preferência a tecido das concretizações), região de iniciação da tradução, uma seqüência de nucleotídeos heteróloga de interesse, uma região de terminação da tradução e, opcionalmente, uma região de terminação de transcrição funcional no organismo do hospedeiro. As regiões reguladoras (isto é, promotores, regiões reguladoras transcricionais e regiões de terminação da tradução) e/ou o polinucleotídeo das concretizações pode ser nativo/análogo à célula hospedeira ou um ao outro. Alternativamente, as regiões reguladoras e/ou o polinucleotídeo das concretizações podem ser heterólogos à célula hospedeira ou um em relação ao outro. Conforme empregado no presente, "heterólogo" com referência a uma seqüência é uma seqüência que se origina de uma espécie estranha, ou, se for proveniente da mesma espécie, é substancialmente modificada a partir da sua forma nativa na composição e/ou lócus genõmico por intervenção humana deliberada. Um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo heterólogo, por exemplo, é proveniente de uma espécie diferente da espécie da qual o polinucleotídeo foi derivado, ou, se for da mesma espécie/espécie análoga, um ou os dois são substancialmente modificados a partir da sua forma original e/ou o lócus genõmico, ou o promotor não é o promotor nativo para o polinucleotídeo operacionalmente ligado. A região de terminação opcionalmente incluída pode ser nativa com a região de iniciação de transcrição, pode ser nativa com o polinucleotídeo operacionalmente ligado de interesse, pode ser nativa com a planta hospedeira ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, ser estranha ou heteróloga) ao promotor, ao polinucleotídeo de interesse, à hospedeira ou à qualquer combinação deles. As regiões de terminação convenientes são disponíveis de plasmídeo-Ti de A. tumefaciens, tais como regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Veja também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91 :151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639. Em concretizações específicas é utilizado o terminador do gene do inibidor II (Pinll) de protease de batata particular. Veja, por exemplo, Keil et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:5641-5650; e An et al. (1989) Plant Cell 1:115-122, incorporados ao presente documento a título de referência integralmente. A construção de DNA que compreende uma seqüência de promotor das concretizações ligada operacionalmente a uma seqüência de nucleotídeos heteróloga pode também conter pelo menos uma seqüência de nucleotídeos adicional para um gene a ser co-transformado no organismo. Alternativamente, pode(m) ser provida(s) seqüência(s) adicional(ais) em uma outra construção de DNA.

Caso seja adequado, a seqüência de nucleotídeos heteróloga cuja expressão se encontra sob o controle da seqüência de promotor tecido-preferencial das concretizações e qualquer(quaisquer) seqüência(s) de nucleotídeos adicional(ais) pode(m) ser otimizada(s) para um aumento da expressão na planta transformada. Isto é, estas seqüências de nucleotídeos podem ser sintetizadas usando-se códons com preferência para a planta para um aumento da expressão. Existem métodos disponíveis na técnica para a síntese de seqüências de nucleotídeos com preferência para a planta. Veja, por exemplo, patentes US 5.380.831 e 5.436.391, e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporados ao presente documento a título de referência.

Modificações de seqüências adicionais são conhecidas por aumentar a expressão gênica em um hospedeiro celular. Estas modificações incluem a eliminação de seqüências que codificam sinais de poliadenilação espúrios, sinais de sítio da recomposição éxon-íntron, repetições semelhantes à transposons, e outras seqüências tais bem caracterizadas que podem ser prejudiciais à expressão genética. O teor de G-C da seqüência de nucleotídeos heteróloga pode ser ajustado à média de níveis para um hospedeiro celular dado, conforme calculado por referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Quando possível, a seqüência é modificada para evitar estruturas de mRNA secundárias em "hairpin" previstas.

As construções de DNA podem, além disso, conter seqüências líderes 5'. Tais seqüências líderes podem atuar para melhorar a tradução. Os líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem: líderes picornavírus, líder EMCV (região 5' não codificadora de encefalomiocardite) (Elroy-Stein et al, (1989) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 86:6126-6130), por exemplo; líderes potivírus, líder TEV (Vírus de Entalhe do Tabaco), por exemplo, (Allison et al. (1986) Virology 154:9-20); líder MDMV (Vírus do Mosaico Anão do Milho); proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); líder não traduzido do mRNA da proteína do capsídeo do vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); líder vírus do mosaico do tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, páginas 237-256); e líder de vírus de manchas cloróticas do milho (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Veja, também, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology 84:965-968. Outros métodos para se aumentar a tradução e/ou a estabilidade de mRNA podem também ser utilizados, íntrons, por exemplo, tais como o íntron de ubiquitina do milho (Christensen e Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218; Christensen et al. (1992) Plant Molecular Biology 18:675-689) ou o íntron Adhl do milho (Kyozuka et al. (1991 ) Mol. Gen. Genet. 228:40-48; Kyozuka et al. (1990) Maydica 35:353-357), e semelhantes.

As construções de DNA das concretizações podem também incluir outros acentuadores ("enhancers"), ou acentuadores de tradução ou de transcrição, conforme possam ser necessários. Estas regiões de acentuador são bem conhecidas dos versados na técnica e podem incluir o códon de iniciação AT e seqüências adjacentes. O códon de iniciação deve estar em fase com a matriz de leitura da seqüência de codificação para assegurar a tradução da seqüência integral. Os sinais de controle de tradução e os códons de iniciação podem ser provenientes de uma variedade de origens, tanto natural com sintética. As regiões de iniciação da tradução podem ser providas da fonte da região de iniciação de transcrição ou do gene estrutural. A seqüência pode também ser derivada do elemento regulador selecionado para expressar o gene e pode ser especificamente modificada de modo a aumentar a tradução do mRNA. É fato reconhecido que para se aumentar os niveis de transcrição, podem ser utilizados acentuadores em combinação com as regiões de promotor da descrição. Os acentuadores são conhecidos na técnica e incluem a região acentuadora SV40, o elemento acentuador 35S e semelhantes.

Ao se preparar a construção de DNA, podem ser manipulados os diversos fragmentos de DNA, de modo a proporcionar as seqüências de DNA na orientação adequada e, conforme apropriado na matriz de leitura adequada. Para tal fim, podem ser empregados adaptadores ou "linkers" para ligar os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem estar envolvidas para proporcionar sítios de restrição convenientes. Podem ser acrescentados ou removidos sítios de restrição, pode ser removido o DNA supérfluo ou podem ser introduzidas outras modificações semelhantes nas seqüências das concretizações. Para tal fim, pode estar envolvida mutagênese in vitro, reparo de primer, restrição, desnaturação, re-substituições, tais como transições e transversões, por exemplo.

Os genes repórteres ou genes marcadores de seleção podem ser incluídos nas construções de DNA. Exemplos de genes repórteres adequados conhecidos na técnica podem ser encontrados, por exemplo, em Jefferson et al. (1991) em Plant Molecular Biology Manual, ed. Gelvin et al. (Kluwer Academic Publishers), pp. 1-33; DeWet et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7:725-737; Goff et al. (1990) EMBO J. 9:2517- 2522; Kain et al. (1995) BioTechniques 79:650-655; e Chiu et al. (1996) Current Biology 6:325-330.

Os genes marcadores de seleção para a seleção de células ou tecidos transformados podem incluir genes que conferem resistência a antibiótico ou resistência a herbicidas. Exemplos de genes marcadores de seleção adequados incluem, sem limitação, os genes que codificam resistência a cloranfenicol (Herrera Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987-992); metotrexato (Herrera Estrella et al. (1983) Nature 303:209- 213; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 76:807-820); higromicina (Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:103-108; Zhijian et al. (1995) Plant Science 708:219- 227); estreptomicina (Jon.es et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 270:86-91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res. 5:131-137); bleomicina (Hille et al. (1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176); sulfonamida (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 75:127-136); bromoxinila (Stalker et al. (1988) Science 242:419-423); glifosato (Shaw et al. (1986) Science 233:478-481); fosfinotricina (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518).

Outros genes que poderiam servir na recuperação de eventos transgênicos, mas que poderiam não ser necessários no produto final incluiríam, sem limitação, exemplos tais como GUS (b-glicuronidase; Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387), GFP (proteína de fluorescência verde; Chalfie et al. (1994) Science 263:802), luciferase (Riggs et al. (1987) Nucleic Acids Res. 75(19):8115 e Luehrsen et al. (1992) Methods Enzymol. 276:397-414), e os genes do milho que codificam a produção de antocianina (Ludwig et al. (1990) Science 247:449).

As moléculas de ácido nucléico das concretizações são úteis nos métodos direcionados à expressão de uma seqüência de nucleotídeos em uma plana. Isto pode ser obtido por transformação de uma célula de planta de interesse com uma construção de DNA compreendendo um promotor identificado no presente documento, ligado operacionalmente a uma seqüência de nucleotídeos heteróloga e por regeneração de uma planta estavelmente transformada a partir da célula de planta. Os métodos das concretizações são também direcionados a expressão seletiva de uma seqüência de nucleotídeos em um tecido vegetal. Esses métodos compreendem a transformação de uma célula de planta com uma construção de DNA que compreende um promotor identificado no presente documento que inicia a transcrição tecido-preferencial em uma célula de planta ligado operacionalmente a uma seqüência de nucleotideos heteróloga e a regeneração de uma planta transformada a partir da célula de planta. A construção de DNA que compreende a seqüência de promotor específico das concretizações operacionalmente ligada a uma seqüência de nucleotideos de interesse pode ser usada para a transformação de qualquer planta. Deste modo, podem ser obtidas plantas, células de planta, tecidos vegetais, sementes, raízes e semelhantes geneticamente modificados, isto é, transgênicos ou transformados.

As espécies de plantas adequadas para as concretizações incluem, sem limitação, milho (Zea mays), Brassica sp. (B. napus, B. rapa, B. juncea, por exemplo) , especialmente aquelas espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de sementes, alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), painço {por exemplo, pearl millet (Pennisetum glaucum), proso millet (Panicum miliaceum), foxtail millet (Setaria itálica), finger millet {Eleusine coracana), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max) , tabaco (Nicotiana tabacum), batata inglesa (Solanum tuberosum), amendoim (Arachis hypogaea), algodão {Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus), aipim (Manihot esculenta), café {Cofea spp.), coco (Cocos nucifera) , abacaxi (Ananas comosus), árvores cítricas (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis) , banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casíca) , goiaba {Psidium guajava), manga (Mangifera indica), azeitona (Olea europaea), mamão (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadâmia {Macadamia integrifolia) , amêndoa (Prunus amygdalus) , beterraba açucareira (Beta vulgaris) , cana de açúcar (Saccharum spp.), aveia, cevada, vegetais, plantas ornamentais e coníferas.

Os legumes incluem tomates (Lycopersicon esculentum), alface (Lactuca sativa, por exemplo), vagem (Phaseolus vulgaris), feijão lima (Phaseolus limensis), ervilhas (Lathyrus spp.), e membros do gênero Cucumis, tais como pepino (C. sativus), cantalupo (C. cantalupensis) , e melão (C. melo). As plantas ornamentais incluem azálea (Rhododendron spp.), hortênsia (Macrophylla hydrangea), hibiscos (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipas (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petúnias (Petunia hybrida), cravo (Dianthus caryophyllus), bico de papagaio (Euphorbia pulcherrima), e crisântemo.

As coníferas que podem ser empregadas na colocação em prática das concretizações incluem, por exemplo, pinheiros tais como Pinus taeda, Pinus elliotii, pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro lodgepole (Pinus contorta), e pinheiro de Monterey (Pinus radiata) ; pinheiro Douglas-fir (Pseudotsuga menziesii); cicuta do oeste {Tsuga canadensis); abeto de Sitka (Picea glauca); sequóia {Sequoia sempervirens); pinheiros verdadeiros como pinheiro prateado (Abies amabilis) e pinheiro do bálsamo (Abies balsamea); e cedros tais como o cedro vermelho do Oeste (Thuja plicata) e cedro amarelo do Alaska (Chamaecyparis nootkatensis). Plantas das concretizações podem ser plantas de culturas (por exemplo, milho, alfafa, girassol, Brassica, soja, algodão, cártamo, amendoim, sorgo, trigo, painço, tabaco etc.) A presente invenção é especialmente adequada para qualquer membro da família de plantas monocotiledôneas que inclui, sem limitação, milho, arroz, cevada, aveia, trigo, sorgo, centeio, cana de açúcar, abacaxi, inhame, cebola, banana, coco e tâmaras.

Conforme empregado no presente, "vetor" se refere a uma molécula de DNA tal como plasmídeo, cosmideo, ou fago bacteriano para a introdução de uma construção de nucleotídeo, por exemplo, uma construção de DNA em uma célula hospedeira. Os vetores de clonagem contêm tipicamente um sítio de restrição ou um número pequeno de sítios de restrição de reconhecimento de endonuclease em que podem ser inseridas seqüências de DNA estranho de um modo determinável sem perda de uma função biológica essencial do vetor, assim como um gene marcador que é adequado para uso na identificação e seleção de células transformadas com o vetor de clonagem. Os genes marcadores tipicamente incluem genes que proporcionam resistência a tetraciclina, resistência a higromicina ou resistência a ampicilina.

Os métodos das concretizações envolvem a introdução de uma construção de nucleotídeo em uma planta. 0 termo "introdução" é usado no presente documento para significar a apresentação a planta da construção de nucleotídeo de tal modo que a construção ganhe acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos das concretizações não dependem de um método específico para a introdução de uma construção de nucleotídeo a uma planta, sendo necessário somente que a construção de nucleotídeo ganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Os métodos para a introdução de construções de nucleotídeo nas plantas são conhecidos na técnica, incluindo, sem limitação, métodos de transformação estável, métodos de transformação transitória e métodos mediados por vírus. "Transformação estável" se destina a significar que a construção de nucleotídeo é introduzida em uma planta se integra ao genoma da planta e é capaz de ser herdada por sua progênie. "Transformação transitória" se destina a significar que a construção de nucleotídeo introduzida em uma planta não se integra ao genoma da planta.

As construções de nucleotídeos das concretizações podem ser introduzidas em plantas colocando-se as plantas em contato com um vírus ou com ácidos nucléicos virais. Geralmente tais métodos envolvem a incorporação de uma construção de nucleotídeo das concretizações ao interior de uma molécula de DNA ou RNA viral. Os métodos para a introdução de construções de nucleotídeos nas plantas e a expressão e uma proteína neles codificada, envolvendo moléculas de DNA ou RNA viral são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, patentes US 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367 e 5.316.931; incorporadas ao presente documento a título de referência.

Os protocolos de transformação assim como os protocolos para a introdução de seqüências de nucleotídeos em plantas podem variar dependendo do tipo de planta ou célula de planta, isto é, monocotiledôneas ou dicotiledôneas, visadas para a transformação. Os métodos adequados para a introdução de seqüências de nucleotideos em células de planta e a inserção subseqüente no genoma da planta incluem microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), eletroporação {Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:5602-5606, transformação mediada por Agrobacterium (patentes U.S. Nos. 5.981.840 e 5.563.055), transferência genética direta (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722), e aceleração de partícula balística (veja, por exemplo, patentes US 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244; 5.932.782; Tomes et al. (1995) in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg e Phillips (Springer-Verlag, Berlin); e McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926). Veja também Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebola); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer e McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:4305-4309 (milho); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (milho); patentes U.S. Nos. 5.240.855; 5.322.783 e 5.324.646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 97:440-444 (milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (Londres) 311:763-764; patente U.S. No.. 5.736.369 (cereais); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, Nova York), pp. 197-209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 and Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformação mediada por vibrissas); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (eletroporação); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 72:250-255 e Christou e Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (milho por meio de Agrobacterium tumefaciens); todas incorporadas ao presente documento a titulo de referência.

As células que tiverem sido transformadas podem ser cultivadas em plantas de acordo com meios convencionais. Veja, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas podem então ser cultivadas e ou polinizadas com a mesma cepa transformada ou diferentes cepas, e o híbrido resultante tendo a expressão com preferência a tecido da característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para se assegurar de que a expressão tecido-preferencial da característica fenotípica desejada é mantida de modo estável e é herdada, sendo então as sementes colhidas para se assegurar e que a expressão com preferência a tecido da característica fenotípica desejada foi atingida. Portanto, conforme empregado no presente, "sementes" transformadas se referem a sementes que contêm a construção de nucleotídeo estavelmente integrado ao genoma da planta. Há uma variedade de métodos para a regeneração de plantas a partir de tecido vegetal. 0 método específico de regeneração dependerá do tecido vegetal de partida e da espécie da planta especifica a ser regenerada. A regeneração, o desenvolvimento, e o cultivo de plantas a partir de transformantes de protoplastos de uma única planta ou de diversos explantes transformados são conhecidos na técnica (Weissbach e Weissbach, (1988) Em: Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.), Academic Press, Inc., San Diego, CA) . Este processo de regeneração e cultivo tipicamente inclui as etapas de seleção de células transformadas, cultura destas células individualizadas através dos estágios habituais do desenvolvimento embrionário através do estágio de plântulas enraizadas. Os embriões e sementes transgênicas são regeneradas de modo análogo. Os brotos enraizados transgênicos resultantes são em seguida plantados em um meio de cultura adequada para plantas tal como solo. As plantas regeneradas são geralmente auto-polinizadas para produzir plantas transgênicas homozigóticas. Caso contrário, o pólen obtido das plantas regeneradas é cruzado com plantas criadas de sementes de linhagens agronomicamente importantes. Por outro lado, o pólen proveniente de plantas destas linhagens importantes é usado para polinizar as plantas regeneradas. Uma planta transgênica das concretizações que contêm um polipeptídeo desejado é cultivada usando~se métodos conhecidos dos versados na técnica.

As concretizações proporcionam composições para testar compostos que modulam a expressão no interior de tecidos selecionados de embriões e plantas. Os vetores, células e plantas podem ser usados para se testar moléculas candidatas para agonistas e antagonistas do promotor 419 do milho. Um gene repórter pode ser ligado operacionalmente a um promotor 419 do milho e ser expresso como um transgene em uma planta. Os compostos a serem testados são acrescentados e a expressão do gene repórter é medida para se determinar o efeito sobre a atividade do promotor.

Os exemplos abaixo são dados a titulo de ilustração e não como limitação.

EXPERIMENTOS

As concretizações são ainda definidas nos exemplos abaixo, em que as partes e porcentagens são em peso e os graus são Celsius, a não ser que seja declarado em contrário. As técnicas em biologia molecular foram tipicamente conduzidas conforme descrito em Ausubel ou Sambrook, acima. Deve ficar subentendido que estes Exemplos, embora indicando determinadas concretizações, são dados a titulo de ilustração somente. Da discussão abaixo e destes Exemplos, os versados na técnica poderão determinar as características das concretizações, e sem se afastar do espírito e âmbito delas, pode introduzir diversas alterações e modificações nas concretizações para adaptá-las a diversos usos e condições. Assim, diversas modificações das concretizações além das apresentadas e descritas no presente documento se tornarão aparentes aos versados na técnica com a leitura da descrição acima. Tais modificações são também destinadas a incidir no âmbito das reivindicações apensas. 0 conteúdo de cada referência apresentada no presente documento é integralmente incorporado a titulo de referência.

Exemplo 1: Identificação de gene em biblioteca enriquecida com inflorescencia feminina. 0 gene 419 foi identificado como tendo um promotor que poderia dirigir a expressão preferencialmente em uma biblioteca de espiga imatura durante um teste de cDNA subtrativo. Foi construída uma biblioteca de cDNA a partir de espigas imaturas de milho em lambda ZAP™ (Stratagene, LaJolla, CA) usando os protocolos recomendados pelo fabricante. Os sobrenadantes de colônia foram testados com sonda marcada com 32P sintetizada a partir de mRNA isolado de espigas imaturas de milho (Sambrook). Os clones que se hibridizaram bem acima do fundo foram purificados e seqüenciados.

Exemplo 2: Caracterização da expressão usando Northern Blots As hibridizações Northern foram usadas para confirmar o enriquecimento em espiga imatura do gene 419. Foi conduzido um exame de tecidos de milho numa variedade de estágios de desenvolvimento. 0 total de RNA foi extraído usando-se TriReagent™ (Molecular Research Center, Inc., Cincinati, OH) de acordo com as instruções do fabricante, com base nos métodos desenvolvidos por Chomczynski e Sacchi ((1987)) Anal. Biochem. 162, 156-159). RNA foi fracionado em géis de agarose a 1,3% contendo aldeido fórmico a 2,2M (Sambrook), e transferido para membrana de GT ZetaProbe™ (Bio-Rad, Hercules, CA) por ação capilar usando-se 20 X SSC. As manchas foram submetidas a 120.000 pj/cm2 de luz UV para produzir a reticulaçao do RNA. A pré-hibridização e a hibridização ocorreram a 65°C em fosfato de sódio a 0,25M, pH 7,2, SDS a 7%. A sonda consistia em 419 cDNA rotulado com 32P. As manchas foram lavadas duas vezes, durante 30 minutos cada, em fosfato de sódio a 20M, pH 7,2, SDS a 7%, em seguida mais duas vezes durante 30 minutos cada, em fosfato de sódio a 20 mM, pH 7,2, SDS a 1%, todas a 65°C. Depois da lavagem, as manchas foram secadas ao ar, cobertas com filme plástico e expostas a uma película de raios X. Nenhuma expressão foi detectada nas raízes, lâminas foliares em RI (o estágio no qual a planta do milho está em flor), no pólen ou no cerne do caule em Rl. Foi detectada uma expressão moderada em folhas cotiledonares, nas cascas, nas bainhas de folhas Rl, grãos e espigas imaturas 8 dap (dias após a polinização). Foram detectados níveis muito altos de expressão em inflorescências femininas receptivas não polinizados, no cacho pré-meiótico e nas língulas.

Exemplo 3: Organização genômica (Southern blots) Hibridizações Southern usando a seqüência cDNA 419 como uma sonda indicam que o gene é uma cópia única. O DNA genômico foi extraído de folhas cotiledonares do milho de acordo com Chen e Dellaporta (Urea-based Plant DNA Miniprep In Freeling, M; Walbot, V, eds, (1994) The Maize Handbook. Springer-Verlag, Nova York, pp 526-527). Os southern-blots foram construídos usando DNA digerido com SstI, HindIII ou EcoRV de acordo com Dellaporta e Moreno (Southern Blot Hybridization In The Maize Handbook, supra, pp 569-572). 0 blotting, hibridização, lavagem e detecção foram conduzidos como para os northern-blots, veja o Exemplo 2, exceto que a transferência de DNA para a membrana de náilon ocorreu em 10 X SSC. Em cada caso, foi detectada somente uma faixa com hibridização intensa.

Exemplo 4: Experimentos in si tu A sonda usada para os protocolos in situ tinha a metade do comprimento de clone de cDNA (-0,7 kb) no fagemídeo pBK-CMV (Stratagene). O plasmídeo foi linearizado com Sad para a sonda antisense (T7) e com Smal para a sonda no sentido (T3) usando as RNA polimerases correspondentes (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha). As sondas de RNA foram marcadas com digoxigenina e hibridizadas a seções de tecido de acordo com Jackson (Jackson, DP (1991) In situ hybridization in plants. Em DJ Bowles, SJ Gurr, M. McPherson, eds, Molecular Plant Pathology: A Practical Approach. Oxford University Press, Oxford, pp 163-174), com modificações de acordo com Bradley et al. (Bradley D, et al. (1993) Cell 72:85-95.). A detecção mediada por anticorpo levou ao desenvolvimento do sinal depois de uma incubação de um dia para o outro indicando um nivel alto de expressão.

Em inflorescências femininas maduras antes da fertilização (ponta, meio e base), foi observada uma expressão intensa em todas as células em todos as inflorescências femininas, incluindo epiderme, mas a expressão era fraca ou ausente na parte de floema dos feixes vasculares. Os elementos do xilema mostraram um sinal intenso.

Em espigas imaturas, foi observada uma expressão intensa na célula mãe de megasporos de óvulos nas espigas primárias de plantas de 7 semanas. Neste estágio, as inflorescências femininas começaram a crescer, mas o seu comprimento não excede o da inflorescência como um todo. 419 foi expresso nos fios vasculares da inflorescência feminina, mas não nas demais células da inflorescência feminina. O sinal foi também detectado nos estames, no florete rudimentar (inferior) e nos feixes vasculares da espiga. Foi observado em toda a espiga um nivel muito baixo de sinal, possivelmente não acima do fundo.

Nos grãos e glumas em desenvolvimento, antes da fertilização foi observada uma expressão total de baixo nivel do gene, mas o sinal era mais intenso nas glumas externas.

Em espigas primárias imaturas de plantas de 5 semanas, 419 estava expresso a um nivel muito baixo, quando era, em todo o meristema da espiga e nas folhas jovens das cascas. A expressão era sucessivamente mais intensa em folhas de cascas mais velhas (externas). Neste estágio, os primórdios das espiculas já estavam formados, mas os primórdios do órgão floral ainda não tinham se diferenciado.

Nos meristemas de brotos vegetativos de plantas de 17 dias, 419 estava expresso a um nível muito baixo, quando estava. A expressão era sucessivamente mais intensa em folhas mais velhas (externas) e no tecido dos nós.

Foi observada uma expressão intensa em todas as células da aurícula, incluindo na epiderme. 0 sinal parecia um tanto mais fraco nas células com paredes celulares especialmente fortes, tais como os elementos metaxilêmicos dos feixes vasculares e nas células esclerenquimatosas localizadas acima e abaixo dos feixes vasculares principais.

Foi observada uma expressão intensa era todas as células da língula, incluindo na epiderme. Não havia nenhum sinal nas células com reforços de parede celular forte que estavam localizados na periferia.

Havia uma expressão intensa na lâmina foliar em praticamente todas as células. Foi observado um sinal especialmente intenso nos feixes vasculares (xilema e floema) e nas células do esclerênquima.

Nas pontas das raízes adventícias de plantas de 3 semanas, praticaraente nenhuma expressão detectável na coifa da raiz e no meristema radicular. 0 sinal foi sucessivamente mais intenso em células mais diferenciadas ao longo do eixo da raiz.

Controle Negativo: Uma sonda sense não produziu nenhum sinal em qualquer um dos tecidos descritos acima. Uma exceção consistiu na lâmina foliar, onde houve um sinal fraco no esclerênquima e em alguns dos elementos menores do xilema. No entanto, a diferença em intensidade de sinal em comparação com a sonda antisense era muito evidente.

Concluindo, o gene 419 mostrou uma expressão intensa nas inflorescências femininas, mas não exclusivamente neste tecido. A lingula, a auricula e a lâmina foliar também apresentaram uma expressão intensa e ocorreu uma expressão fraca nos grãos, glumas, espigas imaturas, ápice vegetativo, folhas jovens e pontas das raizes. Uma observação interessante consistiu na expressão intensa especifica à célula mãe de megasporo, implicando uma função neste tecido.

Exemplo 5: Isolamento e clonagem do promotor 0 procedimento para o isolamento do gene é descrito no Manual do usuário para o kit Genome Walker vendido por BD BioSciences {anteriormente Clontech Laboratories, Inc.) Paio Alto, Calif. DNA genômico proveniente de uma linhagem de milho foi isolado usando-se reagentes Puregene® adquiridos de Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN, usado de acordo com as instruções do fabricante. 0 DNA foi então usado exatamente conforme descrito no Manual de Uso do GenomeWalker™ (Clontech PT3042-1) . Resumindo, o DNA foi digerido separadamente com as enzimas de restrição Dral, EcoRV, PvuII e StuI, todos cortadores de ponta cega. O DNA foi extraído com fenol, em seguida com clorofórmio, precipitando-se então com etanol. Os adaptadores de GenomeWalker™ foram ligados nas extremidades do DNA restrito. Refere-se ao DNA resultante como DL 1-4, respectivamente.

Para o isolamento do promotor 419 foram projetados primers aninhados tendo aproximadamente 250 pb e 150 pb, respectivamente, 3' de ATG de 419. Estes foram usadas com cada amostra de DNA (DL 1-4) e os primers GenomeWalker™ adequados em duas séries de PCRs. As combinações de primers e o modo como estas PCR foi conduzida são descritos abaixo: Na primeira série de PCR, foi usado o primer Clontech AP1 (SEQ ID NO: 7) e o primer 1 especifico a gene (gspl) (SEQ ID NO: 8) . A PCR foi conduzida em um ciclador térmico modelo PTC-100 com Hot Bonnet® de MJ Research (Watertown, Maine) usando-se reagentes fornecidos juntamente com o kit GenomeWalker™, exceto que foi usada a mistura de polimerases de 2 DNAs Advantage™, adquirida da mesma empresa, em vez da mistura de polimerases Tth fornecida com o kit. Foram usados os seguintes parâmetros de ciclização: sete ciclos de 94°C durante 2 segundos, em seguida a 72°C durante 3 minutos, em seguida 28 ciclos de 94 °C por 2 segundos, e 67°C durante 3 minutos. Finalmente as amostras foram mantidas a 67°C durante 7 minutos, em seguida a 4°C até uma análise subseqüente. Conforme descrito no Manual do usuário, o DNA proveniente da primeira série de PCR foi então diluído e serviu como um molde em uma segunda série de PCR usando o primer Clontech AP2 (SEQ ID NO: 9) e gsp2 (SEQ ID NO: 10) . Os parâmetros de ciclagem para a segunda série eram: 5 ciclos a 94°C durante 2 segundos, em seguida a 72°C durante 3 minutos, em seguida 20 ciclos a 94°C durante 2 segundos, e a 67°C durante 3 minutos e finalmente 7 minutos a 67°C. Aproximadamente 8 pL de cada reação foram usados em um gel de agarose a 1,0%, e as faixas foram excisadas e purificadas com o kit Sephaglas™ BandPrep Kit (Amersham Biosciences) e clonadas dentro de um vetor TA (Invitrogen, San Diego, Calif.). Os clones foram seqüenciados para verificação.

Exemplo 6: Ensaio transitório de inflorescência feminina A indicação inicial da atividade do promotor 3419 foi observada nos ensaios transitórios usando-se um sistema transitório de inflorescência feminina. 0 promotor 419 de 949 pb e o 5' UTR de 152 pb (SEQ ID NO: 1) foram operacionalmente conectados na frente tanto do gene de beta-glicuronidase (doravante GUS) e do gene de Zs-Amarelo (BD BioSciences}. As construções foram também preparados ligando operacionalmente o intron Adhl 3' do promotor 419/UTR e 5' do gene de GUS ou de Zs-Amarelo.

As espigas provenientes de uma linhagem de milho extremamente transformável foram colhidas da estufa no estágio do desenvolvimento indicado (a partir de 0 a 2 dias após a polinização). A casca teve a superfície esterilizada com etanol a 70% e as folhas foram retiradas, revelando as inflorescências femininas ligadas à espiga. 0 comprimento da espiga foi medido e os explantes foram preparados dentro de uma hora após a colheita da espiga. Foram preparadas placas de explantes destacados de inflorescência feminina usando-se fragmentos de 4 cm de 10 a 15 inflorescência feminina (cortados a 1 cm da base da inflorescência) , colocadas na superfície do meio. Os explantes de inflorescência feminina fixados eram constituídos por fragmentos de 1 cm de sabugo dividido ao meio, sendo as inflorescências femininas aparadas até 5 cm a partir da base da inflorescência. O meio consistia em agar em água a 0,7%, com ou sem ácido ascórbico a 10 mg/L. Os explantes foram bombardeados dentro de duas horas após a colheita usando-se um sistema PDS-1000/He (DuPont Company, Wilmington, Del., USA). Para cada construção de marcador usada nestes experimentos, precipitou-se 5 pL de DNA (1 pg/pL) com 50 pL de CaCl2 a 2,5M e 20 pL de espermidina a 0,1M em 50 pL de partículas de tungstênio (1,0 pm a uma densidade de partículas de 15 mg/mL).

Aproximadamente 600 ng de DNA por detonação foram fornecidos a 650 psi sob 27 polegadas de Hg de vácuo, a uma distância de 5 cm da placa de detenção. Duas a três réplicas por espiga e uma a duas espigas por estágio desenvolvimental foram tratadas para cada construção. As placas foram lacradas depois do bombardeio e armazenadas a 28-30°C no escuro durante 48 horas. Quarenta e oito horas depois do bombardeio, os explantes foram examinados para a expressão transgênica. Os explantes bombardeados com construções de GUS foram tingidos com tampão de McCabe contendo DMSO e x-glicuronidase (McCabe, D.E. et al. (1988) Bio/Technology 6: 923-926) durante 24 horas à temperatura ambiente antes de se fazerem as observações. Os explantes bombardeados com ZsAmarelo (Clontech) foram observados com grande amplificação usando-se um microscópio Leica ligado a uma fonte de luz de xenônio, usando-se um filtro 30 para ZsAmarelo. Foram obtidas micrografias que representavam a resposta observada média.

As inflorescências femininas destacadas foram bombardeadas com ubi:GUS usando-se um protocolo padrão e colocados sobre agar em água a 0,7%, mais ou menos 10 mg/L de ácido ascórbico. Depois de 48 horas sobre o meio, as inflorescências femininas foram tingidas com Tampão de McCabe contendo DMSO e x-glucuronidase durante 24 horas antes de se fazerem as observações. O número total de manchas azuis por inflorescência foi registrado para todas as inflorescências femininas por placa, quatro placas por tratamento. O número médio de manchas azuis por inflorescência destacada era significativamente maior usando-se meio de ágar me água contendo o ácido ascórbico (11 manchas por inflorescência), em comparação com as inflorescências femininas destacadas (3,5 manchas por inflorescência). As manchas tinham também tamanhos maiores e eram de aparência mais escura.

Deixando-se as inflorescências femininas ligadas ao sabugo no meio de ágar em água contendo ácido ascórbico verificou-se um aumento significativo na transformação em relação as inflorescências femininas destacadas (19 a 23 manchas por inflorescência contra 11 manchas por inflorescência). No entanto, a comparação entre inflorescências femininas aparadas e não aparadas, ou a adição de sacarose a 1,0% ao meio não apresentou nenhuma alteração significativa na transformação de inflorescência feminina ligadas ao sabugo.

Exemplo 7: Teste dos fragmentos truncados do promotor Três fragmentos truncados do promotor 419 foram usados para análises transitórias. Em cada caso, o fragmento de promotor foi fundido a 5' da região 5' UTR de 419 + proteína fluorescente ZsAmarelo. Estas construções de DNA foram bombardeadas com plasmídeos. 0 promotor 419 de comprimento total tendo 949 pb a montante de 5'UTR, foi analisado, assim como 3 fragmentos truncados de 602 pb (TR1, SEQ ID NO: 4), 350 pb (TR2, SEQ ID NO: 5), e 129 pb (TR3, SEQ ID NO: 6). Este teste foi conduzido para se demonstrar que os fragmentos do promotor eram funcionais. Os bombardeios foram conduzidos conforme descrito nos métodos abaixo em três experimentos separados com resultados análogos de cada vez. Os resultados de um experimento representativo são mostrados na tabela 1. O controle negativo que consistia na construção de ZsAmarelo sozinho, continha a seqüência de codificação para a proteína fluorescente sem nenhum elemento regulador conhecido 5' . Um outro controle negativo consistia em um explante que não tinha sido atingido com nenhuma construção. A versão TR3 do promotor 419 proporcionou somente 7% da expressão do promotor de comprimento total provido.

Materiais e Métodos Espigas não polinizadas de sete a dez centímetros de uma linhagem de milho extremamente transformável foram colhidas da estufa. A casca teve a superfície esterilizada com etanol a 70% e foi descascado, revelando as inflorescências femininas ligadas à espiga. O comprimento da espiga foi medido e os explantes foram preparados dentro de uma hora depois da colheita da espiga. As placas de explantes de inflorescência feminina ligados consistiam em fragmentos de 1 cm do sabugo com inflorescência feminina fixados aparados até 5 cm a partir da base da inflorescência. Os explantes foram colocados em um meio de agar em água a 0,7% contendo 10 mg/L de ácido ascórbico.

Para cada construção marcadora usada nestes experimentos fez-se precipitar 5 pL de DNA + água com 50 pL de CaCl2 a 2,5M e 20 pL de espermidina a 0,1M sobre 50 pL de particulas de tungstênio (1,0 pm com uma densidade de partículas de 15 mg/mL) . Aproximadamente 3,8 x 108 nmol de DNA foi usado por detonação, fornecido ao tecido a 650 psi (4481,59 kPa), a 5 cm da placa de detenção. Para cada experimento, foram usadas 3 a 4 réplicas por espiga para cada construção. As placas foram lacradas depois do bombardeio e armazenadas a 28-30°C no escuro durante 48 a 72 horas.

Observações e Coleta de Dados Quarenta e oito a 72 horas depois do bombardeio, os explantes foram examinados para a expressão transgênica. Os explantes bombardeados com ZsYellow foram observados com alta ampliação usando-se um microscópio Leica ligado a uma fonte de luz de xenônio usando-se um filtro de ZS Yellow (500/530) . As micrografias foram tiradas com tempos de exposição em que não ocorria nenhuma fluorescência de fundo de controle. 0 número de manchas foi contado e registrado uma resposta média.

Tabela 1: Resultados do ensaio por Bombardeio para os fragmentos truncados de promotor_______________________________ Exemplo 8: Transformação de Milho por Bombardeio de partículas e Regeneração de Plantas Transgênicas Foram bombardeados embriões imaturos de milho, provenientes de plantas de casa de vegetação doadoras, com uma molécula de DNA contendo um promotor da invenção ligado operacionalmente a um gene de interesse. Um marcador de seleção é provido no mesmo vetor de transformação, ou alternativamente, o gene de marcador de seleção é provido em uma molécula de DNA separada. A transformação é conduzida do seguinte modo. As receitas dos meios seguem abaixo.

Preparação do Tecido Alvo As espigas são descascadas e têm a superfície esterilizada em alvejante Clorox™ a 30% acrescido de detergente Micro a 0,5% durante 20 minutos, sendo então enxaguadas duas vezes com água estéril. Os embriões imaturos são excisados e colocados com o lado do eixo do embrião voltado para baixo (lado do escutelo voltado para cima), 25 embriões por placa sobre meio 560Y durante 4 horas alinhando-se então dentro de uma zona alvo de 2,5 cm em preparação para o bombardeio.

Preparação de DNA

Prepara-se um vetor de plasmídeo compreendendo uma seqüência de promotor da invenção. 0 vetor contém ainda um gene marcador de seleção PAT acionado por um promotor de CAMV35S e inclui um terminador de CAMV35S. Opcionalmente o marcador de seleção pode residir em um plasmídeo separado. Uma molécula de DNA compreendendo uma seqüência de promotor da invenção assim como um marcador de seleção PAT é precipitado sobre grânulos de tungstênio de 1,1 pm (diâmetro médio) usando-se um procedimento de precipitação por CaCl2 conforme segue: 100 pL de partículas de tungstênio preparado em água 10 pL (1 pg) de DNA em tampão de Tris EDTA (1 pg total de DNA) 100 pL de CaCl2 a 2,5M

10 pL de espermidina a 0,1M

Cada reagente é acrescentado em seqüência a uma suspensão de partículas de tungstênio, mantendo-se o mesmo sobre um vortex multitubos. A mistura final é rapidamente sonicada e deixa-se que se incube com uma rotação em ciclone constante durante 10 minutos. Depois do período de precipitação, rapidamente centrifugam-se os tubos, remove-se o líquido, lava-se com 500 mL de etanol a 100% e centrifuga-se durante 30 segundos. Novamente remove-se o líquido e acrescentara-se 105 pL de etanol a 100% ao pélete de partículas de tungstênio final. Para o bombardeio com pistola de partículas, as partículas de tungstênio/DNA são rapidamente sonicadas e 10 pL pingados sobre o centro de cada macrocarreador e colocadas para secar durante aproximadamente 2 minutos antes do bombardeio.

Tratamento com Pistola de Partículas As placas de amostras são bombardeadas a nível #4 na pistola de partículas #HE34-1 ou #HE34-2. Todas as amostras receberam um único impacto a 650 psi (4481,59 kPa) com um total de dez alíquotas tomadas de cada tubo de partícula preparadas/DNA.

Tratamento Subseqüente Depois do bombardeio, os embriões são mantidos em meio 560 Y durante 2 dias, sendo então transferidos para meio de seleção 560R contendo 3 mg/L de Bialafos, e sub-cultivados a cada 2 semanas. Depois de aproximadamente 10 semanas de seleção, os clones de calo resistência a seleção são transferidos para meio 288J para iniciar a regeneração da planta. Depois da maturação somática do embrião (2-4 semanas) , os embriões somáticos bem desenvolvidos são transferidos para o meio para germinação e transferidos para um recinto de cultura iluminado. Aproximadamente 7-10 dias mais tarde, as plântulas em desenvolvimento são transferidas para meio 272V isento de hormônio em tubos durante 7-10 dias até as plântulas estarem bem estabelecidas. As plantas são então transferidas para inserções em bandejas (equivalente a um vaso de 2,5" contendo solo para vasos e cultivadas durante 1 semana em uma câmara de cultura, sendo subsequentemente cultivadas durante outras 1-2 semanas na casa de vegetação, sendo então transferidas para vasos clássicos 600 (1,6 galões) e cultivadas até maturidade. As plantas são monitoradas e recebem uma contagem para a expressão por ensaios conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, imunoensaios e western blot com um anticorpo que se liga à proteína de interesse.

Bombardeio e Meios de Cultura 0 meio de bombardeio (560Y) compreende 4,0 g/L de sais basais N6 (SIGMA O 1416), 1,0 mL/L de Eriksson's Vitamin Mix (1000 x SIGMA-1511) , 0,5 mg/L de tiamina HCl, 120,0 g/L de sacarose, 1,0 mg/L de 2,4-D, e 2,88 g/L de L-prolina (levado ao volume com H2O dl depois do ajuste do pH para 5,8 com KOH) ; 2,0 g/L de Gelrite™ (acrescentado depois de se ter levado ao volume com H2O dl); e 8,5 mg/L de nitrato de prata (acrescentado depois da esterilização do meio e resfriamento até a temperatura ambiente). O meio de seleção (560R) compreende 4,0 g/L de sais basais N6 (SIGMA C-1416), 1,0 mL/L de Eriksson's Vitamin Mix (1000 x SIGMA-1511), 0,5 mg/L de tiamina HCl, 30.0 g/L de sacarose e 2,0 mg/L 2,4-D (levado ao volume com H2O dl depois de se ter ajustado o pH para 5.8 com KOH); 3,0 g/L Gelrite™ (acrescentado depois de se ter chegado ao volume com H20 dl); e 0,85 mg/L de nitrato de prata e 3,0 mg/L Bialafos (ambos acrescentados depois de se ter esterilizado o meio e se ter resfriado até a temperatura ambiente). 0 meio de regeneração de planta (288J) compreende 4,3 g/L de sais MS (GIBCO 11117-074), 5, 0 mL/L de solução de estoque de vitaminas em MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/L de tiamina HCl, 0,10 g/L de piridoxina HCl, e 0,40 g/L de glicina levado a volume com H20 deionizada) (Murashige e Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/L de mio-inositol, 0,5 mg/L de zeatina, 60 g/L de sacarose, e 1,0 mL/L de ácido abscisico a 0,1 mM (levado ao volume com H2O deionizada depois de se ter ajustado o pH para 5,6); 3,0 g/L de Gelrite™ (acrescentado depois de se levar ao volume com H20 deionizada); e 1,0 mg/L de ácido indolacético e 3,0 mg/L Bialafos (acrescentado depois da esterilização do meio e do resfriamento até 60°C). O meio isento de hormônio (272V) compreende 4,3 g/L de sais MS (GIBCO 11117-074), 5,0 mL/L de solução de estoque de vitaminas MS (0,100 g/L de ácido nicotinico, 0,02 g/L de tiamina HC1, 0,10 g/L de piridoxina HC1, e 0,40 g/L de glicina levada a volume com H2O deionizada), 0,1 g/L de mio-inositol, e 40,0 g/L de sacarose (levado ao volume com H20 deionizada depois de se ter ajustado o pH para 5,6); e 6 g/L de Bacto-agar (acrescentado depois de se levar ao volume com H20 deionizada), e esterilizado e resfriado até 60°C.

Exemplo 9: Transformação do Milho Mediada por Agrobacterium e Regeneração de Plantas Transgênicas Para a transformação do milho mediada por Agrobacterium com uma seqüência de promotor da invenção, foi empregado o método de Zhao (patente US 5.981.840 e publicação de patente PCT W098/32326; cujo conteúdo é incorporado ao presente documento a titulo de referência). Resumindo, embriões imaturos foram isolados do milho e colocados em contato com uma suspensão de Agrobacterium em condições em que a bactéria seria capaz de transferir a seqüência de promotor da invenção para pelo menos uma célula de pelo menos um dos embriões imaturos (etapa 1: a etapa de infecção). Nesta etapa, os embriões imaturos foram imersos em uma suspensão de Agrobacterium para a iniciação da inoculação. Os embriões foram co-cultivados durante um tempo com o Agrobacterium (etapa 2: a etapa de co-cultivo). Os embriões imaturos foram cultivados em meio sólido depois da etapa de infecção. Depois do período de co-cultivo, foi conduzida uma etapa opcional de "repouso". Nesta etapa de repouso, os embriões foram incubados na presença de pelo menos um antibiótico conhecido como inibindo o crescimento de Agrobacterium sem a adição de um agente seletivo para transformantes vegetais (etapa 3: etapa de repouso). Os embriões imaturos foram cultivados sobre meio sólido com antibiótico, mas sem um agente seletor, para a eliminação de Agrobacterium e para uma fase de repouso para as células infectadas. Em seguida, os embriões inoculados foram cultivados sobre meio contendo um agente seletivo e o calo transformado em crescimento foi recuperado (etapa 4: a etapa de seleção). Os embriões imaturos foram cultivados sobre meio sólido com um agente seletivo resultando no crescimento seletivo de células transformadas. 0 calo foi então regenerado em plantas (etapa 5: a etapa de regeneração), e calos cultivados sobre meio seletivo foram cultivados sobre meio sólido para regenerar as plantas.

Exemplo 10: Atividade transgênica estável do promotor "419" e 5' UTR <SEQ ID #1) no milho A fim de se determinar a atividade temporal e espacial do promotor 419 acrescido de 5'UTR (SEQ ID NO: 1) em tecido diferenciado em desenvolvimento foram introduzidas duas construções de expressão GUS (GUS1 e GUS2) contendo o promotor 419 e 5'UTR separadamente em uma linhagem extremamente transformável do milho, usando-se Agrobacterium (veja Exemplo 9): Uma das duas construções (GUS2) continha o intron ADHI do milho. A construção UBI:GUS foi usada como controle.

Aproximadamente 20 eventos TO do calo foram gerados usando-se cada construção. Embriões somáticos foram de tal modo escolhidos que fossem regeneradas por evento três plantas, pressupôstamente clonais. Para a maioria dos eventos uma planta teve uma amostra tirada de modo destrutivo no estágio V10 (pré-floração), um no RI (de floração) e um foi auto-polinizado para a produção de sementes Tl. Foram conduzidos ensaios histoquimicos e bioquímicos (veja métodos de ensaio MUG, abaixo). A atividade do promotor 419 no estágio V10 é apresentada na Figura 1 em termos de atividade MUG. Em todos os casos, a atividade MUG é apresentada como uma taxa de acúmulo de produto normalizada para o teor de proteína do ensaio. As taxas mostradas na Figura 1 são médias de amostras tiradas de tantos dos 20 eventos gerados por construção quantos eram possíveis, geralmente de 15-18; as barras de erro representam erro padrão.

Em comparação com a expressão acionada por promotor de ubiquitina bem caracterizado constitutivo do milho, o promotor 419 é muito ativo na bainha da folha, na língula e na aurícula, com níveis muito inferiores na lâmina da folha, a presença do íntron ADHI do milho resultou em uma atividade acentuada do promotor, variando de aproximadamente 0,5 a 3 vezes, dependendo do tecido. A expressão das construções GUS1 e GUS2 no estágio RI (de floração) é observada na Figura 2. A expressão neste estágio ocorre principalmente nos tecidos da língula, das cascas e do caule. A análise de TI quanto a atividade do promotor 419 se concentrou na construção GUS contendo o íntron ADHI devido à acentuação observada neste material a partir de experimentos de expressão anteriores. As amostras de 2 ou 3 plantas Tl (isto é, irmãs) provenientes de 3 ou 4 eventos TO diferentes que expressavam foram testadas nos estágios V10, RI e durante a maturação dos grãos. Foram observados altos níveis de atividade de promotor 419 na raiz, no nó do caule, na bainha da folha e na junta da folha (aurícula e língula juntas) no estágio V10 conforme mostrado na Figura 3. No estágio rl, conforme mostrado na Figura 4, a atividade do promotor é caracterizada por expressão forte no nó do caule, na bainha da folha e na raiz. Quando analisado por evento, observa-se alguma variabilidade entre eventos e plantas irmãs na geração Tl. A atividade do promotor 419 no tecido reprodutor foi determinada histoquimicamente. Nos cachos pré-meióticos contendo a construção GUS2, as paredes das anteras se tingem de azul e o tecido das glumas circundante não se tinge. No desprendimento de pólen, o padrão é invertido. As glumas se tingem com uma cor escura. Nenhuma expressão foi observada nas anteras nem no pólen. A atividade de promotor 419 em órgãos femininos no estágio RI é restrita as inflorescências femininas, aumentando a níveis muito altos na base da inflorescência, nas pontas dos glumes circundantes e em manchas de tecido do sabugo na periferia do sabugo, na região entre o pedicelo (ou base) de cada ovário. A atividade do promotor nos grãos em desenvolvimento atinge máximos ao redor de 21 dap e é restrita ao pericarpo na base do grão.

Protocolos de Ensaio MUG

Amostras de tecido foram coletadas em tubos de microtitulação e armazenadas a -80°C até o dia do ensaio. No dia do ensaio, acrescentou-se a cada tubo 200 pL de tampão de lise (fosfato de sódio a 50mM, EDTA a lOmM, Triton a 1% e beta-mercapto-etanol a 0,07 %) e um BB de 1/16" (0,16 cm). Depois do tecido ter sido triturado durante 60 segundos a 800 golpes por minuto, coletou-se aproximadamente 150 pL depois de 15 minutos de centrifugação a 5200 rpm. Os ensaios MUG em placas de microtitulação foram conduzidos em duplicata para cada extrato de amostras usando-se um volume de reação de 100 pL contendo 25 pL do extrato e MUG a lmM (Sigma) para cada ponto no tempo. As placas foram incubadas em Fluorskan Ascent® FL (Thermo Labsystems) durante 55 minutos, em que as reações foram interrompidas depois de 10, 25 e 55 minutos com o tampão de interrupção (Na2C03 a 0,2M) e a fluorescência para todas as amostras foi lida depois do ponto no tempo de 55 minutos (filtro ajustado: 355 nm de excitação, 460 nm de emissão) . A concentração de MUG foi determinada por uma curva padrão contendo seis padrões de MU preparados em água. A atividade de GUS foi calculada tirando-se a média da inclinação da produção de MU a partir de reações das amostras. Veja, por exemplo, Gallagher, S. R. (1992) GUS Protocols. Using the GFUS gene as a Repórter of Gene expression. (Boston: Academic Press, p. 221).

As concentrações de proteina foram determinadas usando-se o kit Bio-Rad Bradford Protein Assay kit (Bio-Rad) misturando-se 1 pL de extrato de amostras em um volume de reação de 200 pL, e fazendo-se a leitura em um espectrofotômetro padrão, juntamente com padrões de proteina de BSA. As amostras foram preparadas para incidir dentro dos limites lineares do ensaio.

Todas as publicações e pedidos de patentes mencionados no presente relatório são indicadores do nível dos versados na técnica a que esta invenção pertence. Todas as publicações e pedidos de patentes são incorporados ao presente documento a título de referência na mesma medida em que seriam se cada publicação individual ou pedido de patente individual tivesse sido específica e individualmente indicada ou indicado como sendo incorporado ao presente documento a título de referência.

Embora a invenção anterior tenha sido descrita em alguns detalhes como ilustração e exemplo para fins de clareza da compreensão, será obvio que certas mudanças e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações em anexo.

REIVINDICAÇÕES

Claims (28)

1. Molécula de ácido nucléico isolada caracterizada por compreender uma sequência de nucleotideo compreendendo a sequência definida em SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, em que a referida sequência de nucleotideo está operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotideos heteróloga de interesse.

2. Vetor caracterizado por compreender a molécula de ácido nucléico isolada da reivindicação 1.

3. Método para obter uma célula vegetal caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) transformar uma célula vegetal, incorporando estavelmente em seu genoma a molécula de ácido nucléico isolada da reivindicação 1; b) cultivar a célula transformada sob condições de cultura de célula vegetal.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida célula vegetal é de uma monocotiledônea.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida monocotiledônea é milho.

6. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida célula vegetal é de uma dicotiledônea.

7. Método para obter uma planta caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) transformar uma célula vegetal, incorporando estavelmente em seu genoma a molécula de ácido nucléico isolada da reivindicação 1; b) cultivar a célula transformada sob condições de cultura de célula vegetal, e c) regenerar uma planta transformada.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma monocotiledônea.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a referida monocotiledônea é milho.

10. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma dicotiledônea.

11. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotideo heteróloga de interesse codifica um produto gênico que confere resistência a herbicida, sal, frio, seca, patógeno ou inseto.

12. Método para expressar uma sequência de nucleotideo em uma planta, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende introduzir um construto de DNA em uma planta, o referido construto de DNA compreendendo um promotor e operacionalmente ligada ao referido promotor uma sequência de nucleotideo heteróloga de interesse, onde o referido promotor compreende uma sequência de nucleotídeo compreendendo a sequência definida em SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de nucleotídeo heteróloga de interesse é seletivamente expressa em raiz, nós de talo, epiderme interna da bainha foliar, glumas de inflorescência, inflorescência feminina, e em tecido vascular de sabugo abaixo dos pontos de fixação.

14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma dicotiledônea.

15. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma monocotiledônea.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a referida monocotiledônea é milho.

17. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeo heteróloga de interesse codifica um produto gênico que confere resistência a herbicida, sal, frio, seca, patógeno ou inseto.

18. Método para expressar uma sequência de nucleotídeo em uma célula vegetal, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende introduzir em uma célula vegetal, um construto de DNA compreendendo um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeo heteróloga de interesse, onde o referido promotor compreende uma sequência de nucleotídeo compreendendo a sequência definida em SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a referida célula vegetal é de uma monocotiledônea.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a referida monocotiledônea é milho.

21. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a referida célula vegetal é de uma dicotiledônea.

22. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeo heteróloga codifica um produto gênico que confere resistência a herbicida, sal, frio, seca, patógeno ou inseto.

23. Método de expressão seletiva, caracterizado por expressar seletivamente uma sequência de nucleotídeo em raiz vegetal, nós de talo, epiderme interna da bainha foliar, glumas de inflorescência, inflorescência feminina, e em tecido vascular de sabugo abaixo dos pontos de fixação, o referido método compreendendo introduzir um construto de DNA em uma célula vegetal, e regenerar uma planta transformada a partir da referida célula vegetal, o referido construto de DNA compreendendo um promotor e uma sequência de nucleotídeo heteróloga operacionalmente ligada ao referido promotor, onde o referido promotor compreende uma sequência de nucleotídeo compreendendo a sequência definida em SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO: 5.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a expressão da referida sequência de nucleotideo heteróloqa altera o fenótipo da planta.

25. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a planta é uma monocotiledônea.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a monocotiledônea é milho.

27. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a planta é uma dicotiledônea

28. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotideo heteróloga codifica um produto gênico que confere resistência a herbicida, sal, frio, seca, patógeno ou inseto.