CN103911392A

CN103911392A - 具有改善生长特征的木本植物以及使用转录因子制备它们的方法

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Publication number: CN103911392A
Application number: CN201410108913.5A
Authority: CN
Inventors: 芒努斯·赫茨贝里; 里希凯希·巴勒劳; 大卫·约恩森; 利努斯·默勒; 帕埃尔·琼森
Original assignee: SweTree Technologies AB
Current assignee: SweTree Technologies AB
Priority date: 2007-12-28
Filing date: 2008-12-18
Publication date: 2014-07-09
Also published as: CL2014000946A1; AU2014203225B2; CL2014000937A1; CL2014000943A1; JP5701610B2; CL2014000944A1; EP2235185A4; US20150106967A1; BR122017021070B1; EP2235185A1; WO2009084999A1; NZ601188A; EP2770060A2; CL2014000941A1; CA2710543A1; AU2008344053A1; ZA201005322B; CL2014000945A1; AU2017200172A1; CL2014000938A1

Abstract

本发明涉及用于从使用生物信息学工具、来自EST测序和DNA阵列的数据鉴定的大量候选基因中选择具有可能的商业价值表型的基因的新型大规模分析平台。本发明的一个方面提供了产生相比于野生型具有提高的生长的转基因植物的方法。所述方法包括在植物中改变在木质形成的不同阶段中特异性表达的至少一种基因的基因产物水平。这可以使用转基因方法或特定杂交方法进行。本发明的另一些方面提供了具有根据本发明调节的基因表达的植物细胞或植物后代和木材。另一些方面涉及包含本发明核苷酸序列的DNA构建体以及包含所述DNA构建体的植物细胞或植物后代。

Description

具有改善生长特征的木本植物以及使用转录因子制备它们的方法

本申请是申请日为2008年12月18日、申请号为“200880127543.2”、发明名称为“具有改善生长特征的木本植物以及使用转录因子制备它们的方法”的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT／SE2008／051495的中国国家阶段申请。

发明领域

本发明一般地涉及分子生物学领域，还涉及改善植物生长特征的方法。更具体地说，本发明涉及用于表型修饰植物和转基因植物以及通过特定杂交方法获得的植物的方法，所述植物具有改变的基因表达，其导致改变的生长表型。本发明还提供了可用于本发明方法的构建体。另外，本发明涉及所述植物的植物细胞或植物后代，以及本发明的植物产生的木材。

背景技术

目前，林木工程和分子育种的主要目标是改进木材的品质和产量。全球对木制品的需要每年增长约1.7％，尽管已经达到或超过全球森林的最大可持续收获率，但是木材消耗量仍在增加。因此，需要提高全世界的种植木材生产。作为对日益增加的大气CO₂的响应，林业栽植还具有作为碳回收作物(carbon sequestration crop)的优点。类似地，希望来自非木本植物的生物质生产的增加，例如以满足对能源生产原料的需要。因此，改变高等植物细胞发育过程中的特定过程具有很大的商业价值，这不仅是指改善树木的特性，还包括其它植物。

通过顶端分生组织实现的植物生长使得一系列初生组织发育，还使得茎和根伸长。除了初生生长外，木本物种还发生次生生长，从形成层产生次生组织“木质”。次生生长提高了茎和根的周长。

多年生植物例如长寿树种具有显著不同于一年生植物例如拟南芥(Arabidopsis)的生活方式，因为多年生植物例如树具有无限的生长，而诸如拟南芥的植物在植物开花时生长终止。拟南芥植株的最终尺寸在许多方面取决于从萌芽到开花和结籽的发育程序。一个实例是这些事件发生时间的任何变化可显著改变植物的大小。

多年生植物还在活跃生长期和休眠期之间循环。在活跃生长期间，叶进行光合作用，捕获能量，然后其用于驱动多种细胞过程。转化为蔗糖的固定碳输送到茎组织和顶芽，在休眠状态期间存储在这里，最初作为淀粉，后来作为蔗糖。随着休眠解除之后生长重新开始，该蔗糖转移至活跃生长的组织，因为复苏的早期阶段在光合作用开始之前进行。类似地，对于氮，氨基酸也转移到茎和顶端组织，在休眠期间储存为贮藏蛋白，随着生长的开始发生分解。因此，长寿树种的生活周期与一年生作物有显著差异，一年生作物经常将碳和氮转移到种子中。由于一年生作物和多年生植物例如树的这些差异，产量的决定因素和测量它们的能力很可能有很大差异。事实上，在许多情况下，模式系统(如欧美杨(Populus tremula×tremuloides))更可靠地发现可用于增加生物质生产的基因。例如，对于一年生作物，已经提出将种子大小/产量作为植物大小和生产力的度量，但是情况不太可能是这样，因为多年生植物例如树木要花费数年才能开花，因此，种子产量(即便是的话)仅仅是在植物开花的年份中占优势的生长条件指示。所以，直接转用一年生作物中的研究和发现不太可能对树木有用。

树木生物质中非常重要的一部分存在于茎组织中。此生物质的积累是叶的光合作用和氮获得以及营养再分配到多种细胞过程的结果。因此，叶的大小、叶光合作用、根系获得氮能力的大小都可以是决定植物生产力和生物质生产的重要因素。但是，仅用它们自身并不能解释整个生物质生产。例如，叶大小并不总是与生物质相关，因为叶大小可存在显著的变化。此外，作物应对胁迫的能力是生物质生产的重要决定因素。因此，为了提高树木的生物质生产，需要改变几种因素。

此外，木质密度是生物质生产提高的重要性状，木质密度的提高使得运输体积减少，并且单位体积中含有更多的能量含量。因此，即使总生物质不增加，增加密度也是有意义的。密度的重要性还在于其显示出，高度和直径可测量生长的提高并不与木质密度的减少相偶联。

一种增加生长的方式是了解更多的基因功能并且使用这些信息增加生长和生物质生产。这些基因功能的知识和使用这些知识的方法描述于本专利中。

大多数基因已在许多植物中得到鉴定，例如拟南芥(Arabidopsisthaliana)(Arabidopsis Genome Initiative2000)和欧美杨(Populustremula×tremuloides)(Sterky等2004)以及毛果杨(Populustrich ocarpa)(Tuskan等2006)。

Hertzberg等2001和Schrader等2005已经使用转录谱分析来显示木质部发育过程中数千个基因的转录序位(transcriptional hierarchy)并提供表达数据。这些数据可利于进一步阐明具有未知功能的许多基因White等1999；Aharoni等2000。

仍存在的一个问题是如何鉴定参与调节细胞分裂以及其它生长相关过程的可能最重要的基因。在本发明中，我们检测了许多转录因子的用途，在过表达时其导致出人意料的生长增加。选择转录因子进行分析的原因是已知它们在活生物(包括植物)中是许多(如果不是大多数的话)过程的部分调节子。预计，拟南芥含有1500种不同的转录因子，根据序列同源性其可分为约30个亚类(Riechmann等2000)。某些转录因子在植物中的功能与所调节的基因紧密相关，例如，尽管转录因子亚类(如MYB类)中的转录因子是相似的，但是已知它们调节植物中若干不同的过程。转录因子是通过抑制或活化特定基因或含有不同基因的基因组区域的转录起始来调节基因转录的蛋白质。

特别地，以前已经有过在植物中靶向转录因子，以发现可用于改变植物特征的基因。例如在WO02／15675中，分析了很多转录因子，并提到了它们中许多的可能应用。US2007／0039070描述并列出了很多桉树(Eucalyptus)和辐射松(Pinus radiata)的转录因子基因，并推测了这些基因的用途。本文中，我们给出了在显著增加生长方面具有工业意义效果的特定转录因子，并有实验数据的支持。

尽管，从使用DNA阵列技术进行的表达研究、基因组测序和EST程序得到的结果显然可验证基因在何处何时表达，但是仅从这些类型的分析工具不太可能阐明基因的生物和/或技术功能。为了分析和验证基因功能，必须进行功能表征，例如通过基因失活和/或基因过表达来实现。但是，为了能够鉴定目的基因以及最出人意料的商业特征，必须基于功能性分析以及用多种标准测量生长增加来评价候选基因。

MYB转录因子。本文给出的基因之一(SEQ ID NO：12)属于MYB类转录因子。在拟南芥中，MYB转录因子家族预计有约180个成员(Riechmann等2000)。在植物中已经发现了MYB基因的几种不同功能(Jin和Martin1999)。更具体地说，就我们所知，与SEQ ID NO：12密切相关的基因未显示出参与调节生长速度和生物质生产。密切相关的基因AT2G01060和AB192880显示参与生物胁迫应答，US2003101481和Katou等2005。

SET结构域转录因子(Ng等2007)。本文给出的基因之一SEQ IDNO：11属于SET结构域类转录因子。SET结构域蛋白质通过调节染色质结构来调节转录。已知拟南芥基因组含有至少29种有活性的set结构域蛋白。就我们所知，与SEQ ID NO：11密切相关的基因未显示出参与调节生长速度和生物质生产。

bHLH类转录调节子在植物中是一个大的转录因子类别，例如在拟南芥中，预计有约139个成员(Riechmann等2000)。bHLH蛋白已经显示参与了许多不同的过程，有关水稻中的综述参见Xiaoxing等2006。本文给出的基因之一SEQ ID NO：10属于bHLH类转录因子。就我们所知，与SEQ ID：10密切相关的基因未显示出参与调节生长速度和生物质生产。

基因SEQ ID：9属于同源盒(Homeobox)类基因。与使用构建体TF0013过表达的基因最接近的拟南芥同源物预计为AT1G23380。与使用构建体TF0013过表达之基因相关的马铃薯(Solarium tuberosum)同源物的过表达降低了生长、节间长度和叶片大小(US7265263)。过表达与构建体TF0013过表达之基因相关的拟南芥同源物改变了叶片形态(US7265263，US20070022495和WO01036444)。通过改变构建体TF0013过表达的基因的表达水平来提高产量和生物质生产，这在之前是未知的。

IAA／AUX类转录因子是主要发现于植物中的一小类转录因子(预计在拟南芥中有26个成员，Riechmann等2000)。对应于SEQID：13的基因属于该类，其由Moyle等2002描述。就我们所知，与SEQ ID：13密切相关的基因未显示参与调节生长速度和生物质生产。

WRKY基因家族。WRKY转录因子家族在植物中是一个大的基因家族。预计水稻中有超过90个成员，预计拟南芥有74个成员(Ulker和Somssich2004)。与WRKY基因最相关的功能之一是伤口和病原体防御信号转导，以及与非生物胁迫相关的信号转导，和针对非生物和生物胁迫的抗性。

本文给出的基因中有八个属于WRKY类转录因子。

SEQ ID：4和SEQ ID：7属于WRKY基因的一个亚类。就我们所知，与SEQ ID：4和SEQ ID：7密切相关的基因未显示出参与调节生长速度和生物质生产。

SEQ ID：1属于WRKY基因的另一个亚类。与基因SEQ ID：1密切相关的拟南芥同源物(AT2G23320)被认为参与C／N感受(US20060272060)、改变叶片大小(US7238860、US20030226173、US20040019927和WO02015675)以及改变种子蛋白质含量(US20030226173)。根据专利申请WO04087952，还认为AT2G23320参与对过氧化物胁迫的反应和适应。US20040019927、US7238860、US20030226173、WO02015675提到基因AT2G23320涉及叶片大小提高和树高增加，并推测该基因的过表达可用于增加生长和生物质生产。在本文中我们显示，SEQ ID：1可用于树木中，从而以工业显著程度增加生长。

SEQ ID：6属于WRKY基因的一个亚类，该亚类与SEQ ID：1所属亚类相关，但是明显不同于这一基因类别。与该基因密切相关的基因已知在拟南芥中是基础抗性的负调节物。Journot-Catalino等2006。认为密切相关的基因AT4G31550与种子异戊二烯基脂类和种子叶黄素水平相关(US20060195944和US20070022495以及WO01035727)。另一个预测的SEQID：6的拟南芥同源物AT2G24570被认为参与C／N感受(US20070022495和20060272060)。就我们所知，与SEQ ID：6密切相关的基因未显示出参与调节生长速度和生物质生产。

SEQ ID：2属于WRKY基因的另一个亚类。就我们所知，与SEQ ID：2密切相关的基因未显示出参与调节生长速度和生物质生产。

SEQ ID：3和SEQ ID：5属于一个大的含有2个WRKY结构域的WRKY基因类别。根据专利申请WO2007003409，SEQ ID：3和SEQ ID：5的许多含有两个WRKY结构域的相关同源物被认为在水稻(Oryza sativa)中参与改变种子产量和花数。通过改变表达水平来提高生长和生物质生产的用途之前是未知的。

SEQ ID：8属于WRKY基因的另一个亚类。密切相关的拟南芥基因AT4G23810已知减少植物大小，并参与改变种子蛋白质含量(US20030226173)。另一个相关的拟南芥同源物(ATSG24110)已知参与改变种子蛋白质含量和诱导早开花(US20030226173)。就我们所知，与SEQID：8密切相关的基因未显示出参与调节生长速度和生物质生产。

发明内容

本发明涉及可用于增加生长的新基因。通过使用着眼于基于多种标准的组合来分析生长行为的分析平台发现了所述基因。本发明提供了产生转基因植物的方法，其通过改变选自满足所述标准的一组基因的一种或多种基因的表达来实现。因此，本发明涉及用于表型修饰植物和转基因植物以及通过特异性杂交方法获得的植物的方法，所述植物具有改变的基因表达，从而导致修饰的生长表型。本发明还提供了用于本发明方法的构建体。另外，本发明涉及所述植物的植物细胞或植物后代，以及本发明植物产生的具有出人意料的优良性能的木材。

使用该分析平台分析的许多基因显示令人感兴趣的并且经常是出人意料的商业特性。因此，本发明的一个方面提供了产生与其野生型相比具有出人意料高生长的植物的方法，其包括改变(增加)植物中属于转录因子序列SEQ ID：1-13、97-115之一的至少一种基因的基因产物的水平。

可通过将在温室中在18小时光周期、22℃／15℃(白天／夜晚)的温度下培养八周且每周用1：100稀释的Weibulls Rika S NPK7-1-5施肥的一组转基因植物与相同条件下培养的一组野生型植物进行比较，来观察所述生长的增加。

本发明的另一个方面提供了本发明的转基因植物或者有意改变(增加)了SEQ ID：1-13、97-115之一种基因的水平并包含重组多核苷酸的植物的植物细胞或植物后代。

本发明的另一个方面提供了由具有如上所述特征的目的植物产生的生物质和其产物。

本发明的另一个方面提供了包含至少一种本文所述序列的DNA构建体。

最后，本发明的一方面提供了包含根据本发明的DNA构建体的植物细胞或植物后代。

附图说明

图1显示了具有所示四种不同数据点线性回归线的高度生长曲线实例，黑色回归线显示最大高度生长速度。

发明详述

定义

在详细讨论本发明之前，首先定义下列术语和习惯用语：

术语“转基因植物”指含有在相同物种、变种或栽培种的野生型植物中不存在的遗传物质的植物。所述遗传物质可包括转基因、插入诱变事件(例如通过转座子或T-DNA插入诱变)、活化标签序列、突变序列、同源重组事件或通过嵌合修复术(chimeraplasty)修饰的序列。通常，外源遗传材料是通过人为操纵引入植物中的。该术语还指已经插入遗传物质作为选择标记的植物。这些选择标记的实例包括卡那霉素、潮霉素、膦丝菌素、氯磺隆、甲氨蝶呤、庆大霉素、大观霉素、咪唑啉酮、d-氨基酸和草甘膦。

在本发明上下文中，术语“生长”包括初生生长，其包括茎和根的延长，还包括植物的次生生长，其包括从形成层产生次生组织——“木质”，以及茎和根周长的增加。因此，“提高的生长”这一表述在上下文中涉及在相同生长条件下生长时，转基因植物与转基因植物所来源的野生型植物相比生长的提高。如下所述，如果植物满足下文实施例中所定义的“生长差异选择标准”至少之一的话，则转基因植物表征为具有提高的生长。

术语“表型”在本文上下文中指单个植物的总体物理表现，例如生长。上下文中所用的不同生长表型的实例列于下表1.2中。

术语“基因”广义地表示与生物学功能相关的任何DNA区段。基因包括编码序列和/或其表达所需的调节序列。基因还包括非表达DNA核酸区段，其例如形成其它蛋白质的识别序列(例如启动子、增强子或其它调节区)。可从多种来源获得基因，包括从目的来源克隆或者从已知或预测的序列信息合成，并且可包括设计具有所需参数的序列。

“过表达”表示由引入宿主细胞的SEQ ID NO：1-13、97-115的DNA或类似序列编码的多肽或蛋白质的表达，其中所述多肽或蛋白质通常不存在于宿主细胞中，或者其中所述多肽或蛋白质以高于通常编码所述多肽或蛋白质的内源基因所表达的水平存在于所述宿主细胞中。

本发明蛋白质的过表达可通过下述方式实现，首先构建嵌合基因，其中编码区与能够指导基因在所需发育阶段在所需组织中表达的启动子有效连接。嵌合基因可包含来源于相同基因的启动子序列和翻译前导序列。还可提供编码转录终止信号的3′非编码序列。本嵌合基因还可包含一个或多个内含子以利于基因表达。合适的启动子可以是CaMV35S启动子，其可与作为载体的农杆菌(Agrobacterium)一起使用。

术语“RNA干扰”或“RNAi”一般表示双链RNA分子或短发夹RNA改变与其具有显著同源性或完全同源性的核酸序列之表达的方法。

术语“RNAi下调”表示一种或多种RNAi物质介导的核酸序列表达减少。术语“RNAi物质”表示引发RNAi的独特RNA序列。

术语“光周期”指每天的光照和黑暗周期。

术语“核酸构建体”、“DNA构建体”和“载体”表示用于转化植物或其它生物的基因序列。核酸构建体或DNA构建体可以能在转化植物中指导蛋白质或核酸序列的表达，例如反义RNA。通常，这些核酸构建体或DNA构建体至少包含与5′和3′翻译调节元件有效连接的预期基因产物编码区或者预期核酸产物。在一些实施方案中，这些核酸构建体或DNA构建体是嵌合的，即由来自不同来源的序列混合物组成。但是，非嵌合核酸构建体或DNA构建体也可用于本发明。

在与例如细胞、核苷酸、载体、蛋白质或多肽一起使用时，术语“重组的”通常表示所述细胞、核苷酸或载体已通过引入异源(或外源)核酸或者改变天然核酸而被修饰，或者表示所述蛋白质或多肽已通过引入异源氨基酸而被修饰，或者所述细胞来源于经这些修饰的细胞。重组细胞表达在天然(非重组)形式细胞中不存在的核酸序列(例如基因)，或者表达异常低表达或者根本不表达的天然核酸序列(例如基因)。术语“重组的”在修饰细胞时表示该细胞复制异源核酸，或者表达异源核酸所编码的肽或蛋白质。重组细胞可含有天然(非重组)形式细胞中不存在的基因。重组细胞还可含有天然形式细胞中存在的基因，其中所述基因通过人工手段进行了修饰并重新引入细胞中。该术语还涵盖下列细胞，其含有经修饰的细胞内源核酸，而不从该细胞除去所述核酸；这些修饰包括通过基因替换、定点突变和相关技术获得的修饰。

术语“核酸序列”表示单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的多聚体。除非具体限定，否则该术语涵盖含有已知天然核苷酸类似物的核酸序列，所述类似物具有与参考核酸相似的结合特性，并且以类似于天然核苷酸的方式代谢。除非另有陈述，否则特定的核酸序列还暗示涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子替换)和互补序列以及明确显示的序列。

“多核苷酸”是包含多个聚合的核苷酸残基的核酸序列，例如至少约15个连续的聚合核苷酸残基，任选地至少约30个连续核苷酸，至少约50个连续核苷酸。在许多情况中，多核苷酸包括编码多肽(或蛋白质)或其结构域或片段的核苷酸序列。另外，所述多核苷酸可包含启动子、内含子、增强子区、多腺苷酸化位点、翻译起始位点、5′或3′非翻译区、报告基因、选择标记等。多核苷酸可以是单链或双链DNA或RNA。多核苷酸任选地包含修饰碱基或经修饰主链。多核苷酸可以是例如基因组DNA或RNA、转录本(例如mRNA)、cDNA、PCR产物、克隆的DNA、合成的DNA或RNA等。多核苷酸可包括有义或反义方向的序列。

术语“多肽”广义地用于定义直链氨基酸残基，包括天然的及其合成类似物。

在本发明上下文中，“互补”表示两个核苷酸序列彼此精确配对的能力。例如，如果寡核苷酸某些位置的核苷酸能够与DNA或RNA分子对应位置的核苷酸形成氢键，则该寡核苷酸和DNA或RNA被认为在该位置彼此互补。在寡核苷酸中足够个数的核苷酸可与靶DNA或RNA中对应核苷酸形成氢键使得形成稳定复合物时，认为DNA或RNA链彼此互补。

因此，在上下文中，表述“互补序列”或“互补”还表示将在严格条件下与本发明的核酸分子退火的核苷酸序列。

术语“严格条件”指高严格、弱严格或低严格的一般条件。

术语“严格度”是本领域中公知的，用于表示进行核酸杂交的条件(温度、离子强度以及其他化合物例如有机溶剂的存在情况)。与“弱”或“低”严格度条件相比，使用“高严格度”条件时，仅在具有高频率互补碱基序列的核酸片段之间会发生核酸碱基配对。测试杂交的合适条件包括在5×SSC中预浸泡，以及在20％甲酰胺、5×Denhardt溶液、50mM磷酸钠、pH6.8和50mg变性超声处理的小牛胸腺DNA的溶液中在约40℃下预杂交1小时，然后在添加了100mM ATP的相同溶液中在约40℃下杂交18小时，之后用2×SSC、0.2％SDS在40℃下清洗滤膜30分钟(低严格度)，优选50℃(中严格度)，更优选65℃(高严格度)，甚至更优选约75℃(非常高的严格度)。有关杂交方法的更多细节可见于Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor,1989。

术语“杂交”广义地用于表示互补或部分互补的核酸序列之间的结合，例如使其分离的变性过程的反转。杂交通过互补核苷或核苷酸碱基之间的氢键键合发生，其可以是Watson-Crick、Hoogsteen、反Hoogsteen氢键键合等。DNA中常见的四种核苷碱基是G、A、T和C，其中G与C配对，A与T配对。在RNA中，T被尿嘧啶(U)代替，其与A配对。核苷碱基中参与形成标准双链体的化学基团组成Watson-Crick面。数年之后，Hoogsteen显示嘌呤核苷碱基(G和A)除了沃森-克里克面之外还具有Hoogsteen面，其可从双链体外被识别，并且用于通过氢键键合结合嘧啶寡核苷酸，由此形成三螺旋结构。

“子序列”或“片段”是完整序列的任何一部分。因此，片段或子序列指分别包含较长氨基酸序列(例如多肽)或核酸(例如多核苷酸)的一部分的氨基酸或核酸序列。

在本文上下文中，术语“同源性”表示两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相似性，其由参数“序列同一性”描述。

术语“序列同一性”表示相同长度的两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间同源性程度的定量测量。如果比较不同长度的两个序列，则它们必须将其进行比对以给出最佳可能匹配，允许插入缺口或者在多肽序列或核苷酸序列末端截短。序列同一性可以通过进行计算，其中N_dif是比对时两个序列中不同残基的总数，其中N_ref是序列之一的残基数。因此，DNA序列AGTCAGTC与序列AATCAATC具有75％的序列同一性(N_dif=2，N_ref=8)。对缺口作为不相同的特定残基计算，即DNA序列AGTGTC与DNA序列AGTCAGTC具有75％的序列同一性(N_dif=2，N_ret=8)。

对于本发明有关核苷酸序列的全部实施方案，一个或多个序列之间的序列同一性百分比也可基于使用clustalW软件(http：／www.ebi.ac.uk／clustalW／index.html)以默认设置进行比对。对于核苷酸序列的比对，这些设置为：比对=3Dfull，缺口开放10.00，缺口延伸0.20，缺口间隙距离4，DNA权重矩阵：同一性(IUB)。或者，可使用程序DNASIS Max分析序列，可在http：／／www.paralign.org／对序列进行比较。该服务是基于称为Smith-Waterman(SW)和ParAlign的两种比较算法。第一种算法由Smith和Waterman(1981)公开，是寻找两个序列的最佳局部比对的成熟方法。另一种算法ParAlign是用于序列比对的探索性方法；其细节由Rognes(2001)公开。使用得分矩阵和缺口罚分以及E值的默认设置。

在涉及两个核酸或多肽时，短语“基本相同”或“显著同一性”分别指，在以最高对应性进行比较和比对时，具有至少约60％、70％、75％，优选80％或85％，更优选90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高的核苷酸或氨基酸残基百分比同一性的两个或更多个序列或子序列，使用下述序列比较算法之一或目测检查测量。在某些方面中，显著同一性存在于至少约50个残基长(例如至少约100、110、120、125、130、135、140、145、150、155、160或165个氨基酸残基)的氨基酸序列区域上。在某些方面中，显著同一性存在于至少约150个核酸残基，例如至少约200、250、300、330、360、375、400、425、450、460、480、500、600、700、800个(例如至少约900个)核苷酸或者例如至少约1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb或者例如至少约3kb的核酸序列区域上。在一些方面中，氨基酸或核酸序列在多肽序列或相应编码区的全长上是基本相同的。

术语“保守性替换”是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸)、芳香族胺基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸)各组内进行的。一般不改变特异性活性的氨基酸替换是本领域中已知的，其描述与例如Neurath和Hill，1979中。最常见的替换有Ala／Ser、Val／Ile、Asp／Glu\Thr／Ser\Ala／Gly\Ala／Thr\Ser／Asn、Ala／Val\Ser／Gly、Tyr／Phe、Ala／Pro、Lys／Arg、Asp／Asn、Leu／Iie、Leu／Val、Ala／Glu和Asp／Gly以及其反向替换。

本文使用的术语“保守性替换变体”指包含一个或多个保守性替换的核苷酸序列变体。

一般来说，在本文中，术语“沉默替换”指不影响密码子意义并且因此对多肽结构没有影响的碱基替换。本领域技术人员了解，由于遗传密码的简并性，沉默替换是可能的。

术语“保守结构域”指多个物种中类似的多肽之氨基酸序列或DNA或RNA之核苷酸序列。已知的保守序列组由共有序列代表。氨基酸基序经常由保守序列构成。另外，术语“保守序列”指在进化中基本上保持不变的核酸序列分子之碱基序列或者蛋白质之氨基酸序列。“共有序列”定义为理想序列，表示核酸序列中每个位置上最常出现的碱基，或者蛋白质中每个位置上最常出现的氨基酸。通过比对所有已知核酸序列或蛋白质实例以使其序列同一性最高来鉴定“共有序列”。对于视作共有序列的序列，每个特定碱基或氨基酸必须在其位置上适度地占优势，即多数序列必须与该共有序列相关，仅存在少数替换，例如1个或2个。

同源物也可是蛋白质“插入变体”的形式，即，向蛋白质预定位点插入一个或多个氨基酸残基。插入可包括一个或多个氨基酸的N端和/或C端融合以及序列内插入。一般地，氨基酸序列内的插入将小于N或C端融合，约为1至10个残基的数量级。N端或C端融合蛋白或肽的实例包括用于酵母双杂交系统的转录活化物的结合结构域或活化结构域、噬菌体衣壳蛋白、六组氨酸标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag-100表位、c-myc表位、表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。

蛋白质“缺失变体”形式的同源物特征是从蛋白质中缺失一个或多个氨基酸。

蛋白质“添加变体”形式的同源物特征是向蛋白质中添加一个或多个氨基酸，其中所述添加可以在序列的末端。

蛋白质的氨基酸变体可使用本领域中公知的肽合成技术(例如固相肽合成等)或通过重组DNA操作而容易地制备。操作DNA序列以产生蛋白质的替换、插入或缺失变体的方法是本领域中公知的。例如，在DNA中的预定位点产生替换突变的方法是本领域技术人员公知的，其包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)、QuickChange定点诱变(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介导的定点诱变或者其它定点诱变方案。

术语“直系同源物”和“旁系同源物”序列也是如上所述同源序列的类型。本领域技术人员已知几种不同的鉴定和定义这些功能性同源序列的方法。描述了定义直系同源物和旁系同源物的三种一般方法；可通过如下所述一种或多种方法鉴定直系同源物、旁系同源物或同源物。

直系同源物和旁系同源物是具有相似序列和相似功能的进化上相关的基因。直系同源物是不同物种中的结构相关基因，其来自于物种形成事件。旁系同源物是单个物种内的结构相关基因，其来自复制事件。

在单个植物物种内，基因复制可产生特定基因的两个拷贝，导致具有相似序列并经常具有相似功能的两个或更多个基因，称为旁系同源物。因此，旁系同源物是由同一物种内的复制而形成的相似基因。在使用程序例如CLUSTAL分析基因家族系统发生时，旁系同源物通常聚集成簇或者在相同进化枝中(一组相似基因)(Thompson等；Higgins等)。相似基因的组也可通过成对BLAST分析来鉴定(Feng和Doolittle)。例如，来自拟南芥的非常相似的MADS结构域转录因子的进化枝都在开花时间方面具有共同的功能(Ratcliffe等)，拟南芥中一组非常相似的AP2结构域转录因子参与植物对冰冻的耐受(Gilmour等)。对属于一个进化枝的具有相似功能的相似基因的组进行分析可得到该进化枝特有的子序列。这些子序列(称共有序列)不仅仅可用于定义每个进化枝内的序列，还可定义这些基因的功能；进化枝内的基因可含有具有相同功能的旁系同源物序列或者直系同源物序列。(另外参见，例如Mount(2001)，Bioinformatics：Sequenceand Genome Analysis Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor,N.Y.，543页)。

物种形成(从亲本物种产生新的物种)也可以产生具有相似序列和相似功能的两种或更多种基因。这些基因(称为直系同源物)在其宿主植物内经常具有相同的功能，并且在物种之间经常可互换而不丧失功能。因为植物具有共同的祖先，所以任何植物物种中的许多基因都将在另一个植物物种中具有对应的直系同源基因。一旦使用程序例如CLUSTAL构建了一个物种中基因家族的系统发生树，则可将可能的直系同源序列置于系统树内，并可确定它们与目的物种基因的关系。直系同源序列还可通过双向BLAST策略鉴定。一旦鉴定了直系同源序列，则可从参考序列所鉴定的功能推出直系同源物的功能。

来自不同生物的直系同源基因具有高度保守的功能，经常是基本上相同的功能(Lee等和Remm等)。通过基因复制而分出的旁系同源基因可保持所编码蛋白质的相似功能。在此情况下，旁系同源物可互换地用于本发明的某些实施方案(例如，编码序列的转基因表达)。这种高度相关旁系同源物的实例有CBF家族，在拟南芥中其具有三个明确定义的成员，在欧洲油菜(Brassica napus)中具有至少一个直系同源物，它们均控制涉及冰冻和干旱胁迫的途径(Gilmur等和Jaglo等)。

下列参考文献代表许多研究的一小部分，其证明了来自多个物种的保守转录因子基因很可能具有相似的功能(即，调控相似的靶序列并控制相同的性状)，可将转录因子转化进不同物种中以赋予或改善性状。

(1)拟南芥NPR1基因调节系统性获得抗性(systemic acquiredresistance，SAR)；NPR1的过表达导致拟南芥中增强的抗性。拟南芥NPR1或水稻NPR1直系同源物在水稻(其为单子叶植物，与拟南芥不同)中过表达时，用水稻白叶枯病病原体水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv.Oryzae)攻击转基因植物显示增强的抗性(Chern等)。NPR1通过活化转录因子基因(例如TGA2)的表达起作用(Fan和Dong)。

(2)E2F基因参与增殖性细胞核抗原(proliferating cell nuclearantigen，PCNA)植物基因的转录。植物E2F在单子叶植物和双子叶植物之间具有高度的氨基酸序列相似性，甚至与动物E2F的保守结构域也相似。这种保守性提示了植物和动物E2F之间的功能相似性。调节分生组织发育的E2F转录因子通过共同的顺式元件起作用，并调节相关的(PCNA)基因(Kosugi和Ohashi)。

术语“密切相关的”基因用于表示直向同源或旁系同源的基因。

本文使用的术语“启动子”指位于基因转录起点上游的序列决定子区，其参与识别和结合RNA聚合酶以及其它引发和调节转录的蛋白质。植物中可用的启动子不一定是植物来源的。“基本启动子”是组装转录起始所需的转录复合物必需的最小序列。基本启动子往往包含TATA盒元件，其通常位于转录起始位点上游15至35个核苷酸之间。基本启动子有时还包含CCAAT盒元件(通常为序列CCAAT)和/或GGGCG序列，通常位于转录起点上游的40至200核苷酸之间，优选60至120核苷酸之间。

本文中称为“组成型启动子”的启动子在大多数(但不一定全部)环境条件以及发育或细胞分化状态下活跃启动转录。组成型启动子的实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区和来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA的1′或2′启动子，以及本领域技术人员已知的来自多种植物基因的其它转录起始区域，例如玉米泛素-1启动子。器官特异性启动子可以是例如来自贮存组织例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子，或者来自代谢库组织例如分生组织的启动子，种子特异性启动子例如来自水稻的谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白的启动子，来自豆球蛋白B4的蚕豆(Vicia faba)启动子和来自蚕豆的未知种子蛋白基因的启动子，来自种子油小体蛋白的启动子，来自欧洲油菜(Brassicanapus)的贮藏蛋白napA启动子，或者本领域已知的任何其它种子特异性启动子，如WO91／14772中所述。此外，所述启动子可以是叶特异性启动子，例如来自水稻或番茄的rbcs启动子，小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子，或者来自水稻的aldP基因启动子，或者损伤诱导型启动子，例如马铃薯pin2启动子。

本发明上下文中的“诱导型启动子”指受一定条件调控的启动子，例如光，生物、细胞或细胞器中的化学物质浓度、蛋白质浓度、状态等。诱导型启动子的实例有HSP启动子和PARSK1——来自编码丝氨酸-苏氨酸激酶的拟南芥基因的启动子——其由脱水、脱落酸和氯化钠诱导。基本上，诱导型启动子控制下的表达应答于所施加的刺激而“打开”或提高。刺激的性质依启动子而不同，可包括上述环境因素。不论在没有刺激时的表达水平如何，在正确刺激存在下任何诱导型启动子的表达都增加。

本文使用的术语“组织特异性”指特定组织的特征，其一般不在所有组织中存在，或者仅在目的组织中存在。在本申请中，“组织特异性”用于表示基因调节元件(启动子或启动子加增强子和／或沉默子)、其编码的基因或者这些基因的多肽产物。在基因调节元件或“组织特异性启动子”的上下文中，该术语表示在特定谱系、组织或细胞类型的细胞中指导所连接序列转录、但是在非该谱系、组织或细胞类型的细胞或组织中基本上没有活性的启动子(以及其它调节元件例如增强子和／或沉默子元件)。可用于本发明的组织特异性启动子在特定组织中在转录产生方面的活性与其它组织的细胞或者相同谱系的转化或恶性细胞相比至少为5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、500倍或甚至1000倍。在基因或基因之多肽产物的上下文中，术语组织特异性表示该基因多肽产物在特定组织或细胞类型的细胞中是可检出的，但是在某些其它细胞类型中基本不可检出。特别地，相应的组织特异性启动子包括在植物的木质部形成组织中特异性表达或有活性的启动子序列。这些启动子的实例有Lmp1、Lmx2、Lmx3、Lmx4和Lmx5启动子，其描述于WO2004097024。

“终止子序列”表示标志着基因组DNA中基因或操纵子转录终点的基因序列部分。终止子序列由在多腺苷化信号处共转录地切割初生RNA的蛋白质因子识别，停止RNA聚合酶对转录本的进一步延长。在与另一个核酸序列处于功能性关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果其提高了编码序列的转录，那么启动子或增强子与编码序列有效连接。有效连接表示连接的DNA序列通常是邻接的，并且在需要时，连接两个蛋白质编码区使其邻接并且在同一读码框中。但是，因为增强子一般在与启动子相隔数千碱基时发挥功能，其间的序列可以有不同的长度，因此一些多核苷酸元件可以是有效连接但不邻接的。

在本发明的上下文中，术语“转化”和“转化的”可互换地使用，分别作为“转染”和“转染的”同义词，以表示将DNA引入细胞的过程。DNA构建体(至少包括目的基因或启动子的一部分)可引入至宿主细胞中，如前所述，其可以是单独的细胞、培养物中的细胞、作为宿主生物一部分的细胞、受精的卵母细胞配子体或者胚胎细胞。涉及宿主细胞时，术语“引入”意为表示本领域已知用于将重组载体DNA引入靶宿主细胞的标准程序。这些方法包括但不限于转染、感染、转化、自然摄入、电穿孔、生物射弹和农杆菌。

“可再生细胞”表示可再生为完整植物的植物细胞。应理解，可再生细胞是保持其遗传潜力的细胞，在本领域也称为“全能性”。应理解，可再生细胞在培养物中培养时，可能需要适当的刺激来表现亲本植物的全部遗传潜力。

产生转基因植物的方法

在本发明的一些具体实施方案中，通过与相应野生型植物相比修饰已经根据上述标准评价和选择的候选基因的表达水平而产生有利的植物表型。根据这些方面，提供了一种方法，其包括改变植物中至少一种基因的基因产物水平，所述基因包含选自下列的核苷酸序列：

a)SEQ ID NO：1-13、97-115的核苷酸序列；

b)与SEQ ID NO：1-13、97-115的核苷酸序列有至少60％同一性的核苷酸序列；

c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。

这可通过下列技术经过改良的杂交方法来实现，所述方法包括

i)选择表达选自下列的至少一种核苷酸序列的植物物种

a)SEQ ID NO：1-13、97-115的核苷酸序列；

c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段，

ii)将i)中选择的植物物种与i)中选择的相同或另一植物物种杂交，

iii)选择与i)中选择的植物物种相比，选自下列的至少一种核苷酸序列的表达受到调节的植物

a)SEQ ID NO：1-13、97-115的核苷酸序列；

c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段，

iv)任选地，将iii)中得到的植物回交一次或多次，并选择与i)中所用任何植物物种和/或iii）中所得植物相比，选自下列的至少一种核苷酸序列的表达受到调节的植物

a)SEQ ID NO：1-13、97-115的核苷酸序列；

c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。

根据本发明的一个方面，提供包括以下步骤的方法：

(i)提供包含选自下列的核苷酸序列的表达载体

a)SEQ ID NO：1-13、97-115的核苷酸序列；或

b)与SEQ ID NO：1-13、97-115的核苷酸序列有至少60％同一性的核苷酸序列；或

c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段，和

d)与所述多核苷酸序列有效连接的至少一个调节元件，其中所述至少一个调节元件控制所述多核苷酸序列在靶植物中的表达；

(ii)将所述表达载体引入至少一种植物中；和

(iii)选择与野生型相比，生长和/或生物质受到调节的至少一种转基因植物。

SEQ ID NO1-13、97-115所示序列代表从毛果杨中预测的候选基因的序列，SEQ ID NO73-95克隆自杂交白杨。本领域技术人员会理解，这些基因中SEQ ID NO：73-95所述序列的5′和3′的其它序列可使用常规克隆方法容易地获得，例如Sambrook等所述。

根据一个实施方案，通过引入遗传修饰来实现对表达的调节，优选在编码包含SEQ ID NO：1-13、97-115的多肽或这些多肽的同源物的基因座中引入。

通过下列之一实现修饰：使用SEQ ID NO：1-13、97-115的一个或多个作为所述方法任何步骤中的标记物而进行的T-DNA活化、TILLING、同源重组、定点诱变或定向育种。

所述调节的影响可以是增加生长和/或生物质的产量。

核酸构建体

根据本发明更具体的一些实施方案，所述方法包括提供核酸构建体(例如重组DNA构建体)的步骤，所述核酸构建体包含选自下列的核苷酸序列：

a)包含选自SEQ ID NO：1-13、97-115之序列的核苷酸序列；

b)与核苷酸序列a)互补的核苷酸序列；

c)核苷酸序列b)或c)的子序列或片段；

d)与a)、b)和c)中任一序列具有至少60％同一性的核酸序列；和

e)在严格条件下与核苷酸序列a)、b)或c)杂交的核苷酸序列。

在本发明的另一些实施方案中，核酸序列c)或g)与a)、c)、d)、e)或f)中任一序列具有至少65％的同一性，例如与a)、c)、d)、e)或f)中任一序列有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少87％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或者至少99.5％同一性。

在本发明该方面的一些优选实施方案中，核苷酸序列a)选自SEQ IDNO：1、4、6、7、9、10、101、102、104、106和107。

本领域中存在多种用于产生本发明的核酸序列和核酸／DNA构建体的方法。鉴定和分离DNA克隆的方法是本领域技术人员公知的，描述于例如Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第二版)，Vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York，1989。或者，本发明的核酸序列可通过适于本发明的多种体外扩增方法由适当选择的特异性或简并引物来产生。足以指导本领域技术人员通过体外扩增方法产生本发明同源核酸的方案实例(包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、Qβ复制酶扩增和其它RNA聚合酶介导的技术(例如NASBA))可见于Sambrook(同上)。

或者，本发明的核酸构建体可从固相合成法产生的片段组装而成。通常，分别合成最多约100个碱基的片段，然后通过酶法或化学法连接产生所需序列，例如编码转录因子的全部或一部分的多核苷酸。例如，使用亚磷酰胺的化学合成是本领域技术人员公知的。根据这些方法，合成寡核苷酸，纯化，与其互补链退火，连接，然后任选地克隆进合适的载体。本发明还涉及包含所述DNA构建体的载体。

如所述，上述序列来自杂种白杨和毛果杨。如本领域技术人员了解地，所述序列的同源物可分离自其它物种，其非限制性实例包括刺槐(acacia)、桉树、角树、山毛榉、桃花心木、胡桃、橡树、岑树、山核桃树、桦树、栗树、桤木(alder)、枫树、悬铃木(sycamore)、银杏、棕榈树、香枫(sweetgum)、柏树、花旗松(Douglas fir)、枞树(fir)、红杉、铁杉、雪松、杜松(juniper)、落叶松、松树、红杉(redwood)、云杉和紫杉、苹果、李子、梨、香蕉、柑橘、猕猴桃、柠檬、樱桃、葡萄树、无花果、棉花、竹、柳枝稷(switch grass)、草芦(red canary grass)和橡胶植物。所述序列的可用同源物还可分离自杨柳科(Salicaceae)的硬木植物，例如分离自柳属(salix)和杨属(populus genus)。该属的成员通用名称为：柳树、杨树和白杨。

适用于本文所述本发明任一方面的其他植物的实例包括单子叶植物、双子叶植物、裸子植物和藻类、蕨类植物和苔藓。特别感兴趣的有转基因高等植物，特别是农作物，例如谷类和花卉，其已经改造带有如上所述的异源核酸，包括烟草、葫芦、胡萝卜、食用甘蓝、瓜类、辣椒、葡萄、莴苣、草莓、油用甘蓝、甜菜、小麦、大麦、玉米、水稻、甘蔗、大豆、豌豆、高粱、向日葵、番茄、马铃薯、胡椒、菊、康乃馨、亚麻子、大麻和黑麦。

在一些优选实施方案中，所述植物是多年生植物，例如多年生木本植物。多年生木本植物是生活周期长于2年的植物，其包含长的幼年期，其中仅发生营养生长。这与一年生或草本植物(例如拟南芥或番茄)不同，它们的生活周期在一年内完成。

特别地，本发明的方法可包括提供核酸构建体的步骤，例如根据本发明可提供和使用重组DNA构建体，其包含的核苷酸序列与所述特定序列相比包含保守性改变，仅改变编码多肽中的一个或几个氨基酸。因此，提供和使用包含编码多肽的核苷酸序列的重组DNA构建体在本发明的范围之内，所述多肽包含a)之多肽的保守替换变体。

不改变由多核苷酸编码的氨基酸序列的序列变化称为“沉默”替换。除了分别编码甲硫氨酸和色氨酸的密码子ATG和TGG之外，相同氨基酸的任何可能密码子可通过本领域中可用的多种方法进行替换，例如定点诱变。因此，本发明还可提供重组核酸构建体，其中核苷酸序列包含核苷酸序列中的沉默替换。

在本发明的某些另外的实施方案中，子序列或片段与上文a)项或d)项所述核苷酸序列的保守结构域具有至少65％的序列同一性，例如与上文a)项或d)项所述核苷酸序列的保守结构域具有至少70％同一性，至少75％同一性，至少80％同一性，至少85％同一性，至少87％同一性，至少90％同一性，至少95％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，至少99％同一性，或者至少99.5％同一性。

因此，有方法可用于鉴定与本文所述一种或多种多核苷酸或者所述多核苷酸编码的一种或多种靶多肽或者本文所述其它分子相似或旁系同源或直向同源或同源的序列的方法，并且可包括将给定的植物表型或基因功能与序列相连或关联。在所述方法中，提供序列数据库(本地或通过因特网或内部网)，使用本文的相关序列以及相关植物表型或基因功能对序列数据库进行查询。

获得改变的基因产物水平的方法

通过提高某些基因的表达来使用本发明，在本文中给出了如何进行的非限制性实例。如上所述的核酸构建体或重组DNA构建体可用于鉴定与野生型相比具有改变的生长特征的植物。这些植物可以例如是天然变体或经遗传修饰而显示出生长特性改变的植物。出于这些目的，本发明的核酸构建体或重组DNA构建体可用作例如常规杂交测定中的探针或者核酸片段特异性扩增的引物。

尽管本发明的主要部分是基因产物的上调如何带来期望的效果。但是，还显示了改变本文所述基因的表达可用于改变期望的特性，这是看待数据的另一种方式，从这一角度看减少植物中的基因产物也是改变所需性状的方式。有不同的方法来提高基因产物水平，在下文中将它们与上调基因产物的方法一起描述。

基因SEQ ID NO：1-13、97-115之一也可用作协助育种的标志物靶标，因为基因调节序列的变化可改变表达模式，编码序列的改变可改变基因功能，我们已经显示出操纵这些基因改变了所需的性状。这通常称为，基因SEQ ID NO：1-13、97-115可用作候选基因Brady和Provart2007和Varshney等2005。

使用本发明的一个具体方法是测定基因SEQ ID NO：1-13、97-115中一种或多种的表达，这使用例如在天然群体中进行定量RT-PCR来实现，选择所测基因特别高表达的，使用这些植物作为育种方案中的亲本，这可在每个育种周期中重复进行。定量基因表达的方法(包括实时PCR)描述于Sambrook等。

本文所述基因还可用于基于候选基因的结合研究，随后这些研究的结果可用于标志物辅助育种中。Burke等2007。

基因的上调或过表达可通过下述方式实现，将基因的完整读码框置于合适启动子(在本文另有描述)之后，通常将终止子和多腺苷化信号序列置于待过表达基因的3′端。

另外，本发明的核酸构建体或重组DNA构建体可用于基因替换的目的，以修饰植物的生长表型。

内源基因表达的抑制可以例如通过使用核酶来实现。核酶是具有高特异性核糖核酸内切酶活性的RNA分子。核酶的生产和使用公开于US4987071和US5543508。下文讨论了反义技术，但应注意，包含反义RNA的合成核酶序列可用于赋予反义RNA以RNA切割活性，使得与反义RNA杂交的内源mRNA分子被切割，继而导致对内源基因表达的反义抑制提高。

载体(其中相关基因同源物所编码的RNA过表达)也可用于获得相应内源基因的共抑制，例如，以Jorgensen的US5231020中所述的方式。这些共抑制(也称为有义抑制)不需要将完整的基因序列引入植物细胞，也不需要所引入的序列与内源目的序列完全相同。但是，抑制效率随着杂交特异性的提高(例如，所引入序列的延长和/或引入序列与内源转录因子基因之间序列相似性的提高)而提高。

表达非翻译形式基因的载体(例如包含一个或多个终止密码子或无义突变的序列)也可用于抑制内源转录因子的表达，由此降低或消除其活性并改变一个或多个性状。产生这些构建体的方法描述于美国专利No.5,583,021。特别地，这些构建体可通过向基因中引入提前终止密码子来产生。

进行靶向DNA插入的一种方法是通过使用逆转录病毒DNA整合机器，如WO2006078431所述。此技术基于通过将整合酶与DNA结合蛋白(束缚蛋白(tethering protein))有效偶联以改变逆转录病毒和逆转座子整合酶的整合位点特异性的可能性。整合酶的改造优选在核酸水平上进行，通过用PCR改变整合酶的野生型编码序列。因此，整合酶复合物可被引导至期望的部分或者引导至远离不希望的基因组DNA部分，从而产生所需的整合位点特征。

可用于改变(在本发明中优选提高)基因表达的另一种技术是“靶向诱导基因组中的局部损伤”，其为以靶向方式改变基因功能的非转基因方法。该方法包括例如用甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate，EMS)诱变植物，然后定位已经改变了特定的预期基因的个体。该技术描述于例如Slade和Knauf，2005和Henikoff等。

一种消除基因表达的方法是通过使用根癌农杆菌T-DNA进行的插入诱变。在产生插入突变体之后，可筛选所述突变体，以鉴定在合适基因中含有插入的那些。可将期望的基因中含有单转基因插入事件的植物进行杂交，以产生所述突变的纯合植物。

如本领域技术人员了解地，还可通过使用cre-lox系统改变植物性状。可修饰植物基因组以使其包含第一和第二lox位点，其随后与Cre重组酶相接触。如果lox位点为相同方向，则两个位点之间的间插DNA序列被切除。如果lox位点为相反方向，则间插序列被倒置。

通过用其它方式操纵内源基因的活性或表达水平，本发明的多核苷酸和多肽还可在没有表达盒的情况下在植物中表达，例如通过用T-DNA活化标记来异位表达基因，Ichikawa等(1997)；Kakimoto等(1996)。该方法包括用含有多个转录增强子的基因标签转化植物，一旦所述标签插入到基因组中，侧翼的基因编码序列的表达就失去调节。在另一个实施例中，可修饰植物中的转录机器以提高本发明多核苷酸的转录水平(参见，例如PCT公开WO96／06166和WO98／53057，其描述了改变DNA结合基序中的特定氨基酸来修饰锌指蛋白的DNA结合特异性)。

表达的反义抑制

然而，包含上述核苷酸序列的重组DNA构建体尤其可用于表达的有义和反义抑制，例如用于下调特定基因的表达，从而得到生长提高的植物表型。也就是说，本发明的核苷酸序列或其子序列或反义序列可用于阻断天然同源核酸的表达。多种常规的有义和反义技术是本领域中已知的，例如Lichtenstein和Nellen(1997)所述。反义方法的目的是使用与靶基因互补的序列来阻断其表达，并产生突变细胞系或生物，其中单个选定蛋白的水平被选择性降低或消除。

用于植物细胞中的基因表达反义调节的更详细内容参照US5107065，其内容以整体并入本文。

RNA干扰

由双链RNA诱导的基因沉默通常称为RNA干扰或RNAi。RNA干扰是这样的分子机制：双链核糖核酸(dsRNA)片段干扰与所述dsRNA具有同源序列的特定基因的表达。该过程由加工microRNA的相同细胞机器(称为RNA诱导的沉默复合物(RISC))介导。该过程由核糖核酸酶蛋白Dicer引发，其结合并切割外源双链RNA分子，产生20-25个碱基对的双链片段，其每一端具有少数的未配对突出碱基。Dicer产生的短双链片段(称为小干扰RNA(siRNA))彼此分开并整合进活性RISC复合物中。如果RNAi分子或构建体靶向RNA转录本的一部分，则整个转录本下调。

植物中通过转录dsRNA进行的RNAi基因抑制的更详细描述参照US6506559、US2002／0168707和WO98／53083、WO99／53050和WO99／61631，所有这些通过引用以整体并入本文。

载体的构建

一般说来，本领域技术人员能够构建本发明的载体并设计重组基因表达的方案。制备载体的一般方案的细节参照：Molecular Cloning：aLaboratory Manual：第二版，Sambrook等，1989，Cold Spring HarborLaboratory Press。用于基因的启动子可影响过表达的水平、时间、组织、特异性或可诱导性。

一般来说，基因的过表达可使用重组DNA构建体来实现，所述重组DNA构建体含有与DNA元件有效连接的启动子，所述DNA元件包含所述基因的基因组DNA或eDNA的区段的有义元件，例如，所述区段应含有足以产生功能性蛋白的开放读码框，优选全部开放读码框。

在本发明的相关实施方案中，核酸构建体或重组DNA构建体还包含与所述核苷酸序列有效连接的组成型、诱导型或组织特异性启动子。

在本发明的一个优选实施方案中，所述核酸构建体或重组DNA构建体包含SEQ ID NO：96载体序列。

本发明优选的过表达核酸构建体是称为pK2GW7的载体。所述载体描述于：Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plantstransformation，Karimi，2002。

植物细胞的转化

根据本发明，所述方法包括用所述核酸构建体或重组DNA构建体转化植物可再生细胞以及从所述转化细胞再生转基因植物的另外步骤。在将上述DNA构建体或载体引入植物细胞时，必须考虑本领域技术人员公知的某些因素。如上所述，待插入的核酸应组装在含有驱动转录之有效调节元件的构建体中。必须提供将所述构建体转移进细胞的方法。构建体一旦处于细胞之内，将整合或不整合进内源染色体物质中。

可使用本领域技术人员公知的转化技术将DNA构建体和载体引入植物细胞，以产生植物生长改善的转基因植物，特别是转基因树木。

本领域技术人员会了解，多种宿主细胞可用作本发明DNA构建体和载体的接受者。宿主细胞的非限制性实例包括以下组织中的细胞：胚组织，愈伤组织类型I、II和III，胚轴，分生组织，根组织，韧皮部中表达的组织。

如上所述，农杆菌转化是本领域技术人员广泛使用的转化树木物种特别是硬木物种例如杨树的一种方法。产生稳定的可育转基因植物是目前本领域中的常规技术。其它方法可用于农杆菌转化低效或无效的情况(例如在某些裸子植物物种中)，例如微射弹或颗粒轰击、电穿孔、显微注射、直接DNA摄入、脂质体介导DNA摄入或者涡旋(vortexing)法。

或者，可使用不同技术的组合来提高转化过程的效率，例如用涂覆有农杆菌的微粒轰击或微射弹轰击来诱导创口，然后与农杆菌共培养。

应理解，转化技术的具体选择将由转化某些植物物种的效率以及实施本发明的人的经验和对特定选择方法的喜好来确定。对于本领域技术人员来说显而易见的是，将核酸引入植物细胞的转化系统的具体选择对本发明而言不是关键的，也不是本发明的限制，对植物再生技术的选择也是如此。

在转化之后，优选使用并入转化载体中的显性选择标记来选择转基因植物。通常，这些标记将赋予转化植物以抗生素或除草剂抗性，转化体的选择可通过将植物暴露于合适浓度的抗生素或除草剂来实现。使用D型氨基酸(基于植物仅可容许L型这一事实)的新型选择标记物提供了快速、高效且对环境友好的选择系统。此选择系统的一个诱人特征是使得选择和反向选择均可使用。

随后，可再生植物，例如从单个细胞、愈伤组织或叶盘再生，按照本领域中的标准方法进行。几乎任何植物均可从该植物的细胞、组织和器官完全再生。可用技术综述于Vasil等1984。

在选择转化植物并培养至成熟后，鉴定显示生长表型提高的那些植物。另外，为了证实该表型是由于本文公开的多肽或多核苷酸表达水平或活性改变所致，可通过使用Northern印迹、RT-PCR或微阵列分析mRNA表达或者使用免疫印迹或Western印迹或凝胶迁移测定分析蛋白质表达对其进行测定。

植物物种

根据本发明，本方法产生了与其所来源的野生型植物相比生长提高的转基因植物。在本方法的一个实施方案中，所述转基因植物是多年生植物，即生存多于两年的植物。在一个具体实施方案中，所述多年生植物是木本植物，其可定义为有高度木质化的茎(或多于一个茎)的具维管束植物。

在一个优选实施方案中，所述木本植物是硬木植物，即阔叶或被子植物树木，其可选自：刺槐、桉树、角树、山毛榉、桃花心木、胡桃、橡树、岑树、柳树、山核桃树、桦树、栗树、杨树、桤木、枫树、悬铃木、银杏、棕榈树和香枫。来自杨柳科的硬木植物(例如柳树、杨树和白杨，包括其变体)是特别有意义的，因为这两组包括了快速生长的树木物种或木质灌木，它们被特别地栽培用于提供木材和加热用的生物燃料。用于生物能的纤维质草本植物(如柳枝稷和草芦)也是有意义的。

在另一些实施方案中，所述木本植物是软木或针叶树，其可选自柏树、花旗松、枞树、红杉、铁杉、雪松、杜松、落叶松、松树、红杉、云杉和紫杉。

在一些有用的实施方案中，所述木本植物是出产果实的植物，其可选自苹果、李子、梨、香蕉、柑橘、猕猴桃、柠檬、樱桃、葡萄树和无花果树。

可用于本方法的其它木本植物也可选自棉花、竹和橡胶植物。

DNA构建体

根据本发明的第二个主要方面，提供包含至少一个如上所述序列的DNA构建体，例如重组DNA构建体。特别地，所述重组DNA构建体可包含选自下列的核苷酸序列：

a)包含选自SEQ ID NO：1-13、97-115的序列的核苷酸序列；

b)与核苷酸序列a)互补的核苷酸序列；

c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段；

d)与a)、b)和c)中任一序列具有至少60％同一性的核酸序列；和

e)在严格条件下与核苷酸序列a)、b)或c)杂交的核苷酸序列。

在本发明的一些选定的实施方案中，d)的核酸序列与a)、b)和c)中任一序列具有至少65％的同一性，例如与a)、b)和c)中任一序列具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少87％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或者至少99.5％同一性。

另外，根据以上的讨论，所述核苷酸序列编码包含(a)多肽的保守性替换变体的多肽。另外，所述核苷酸序列包含核苷酸序列中的沉默替换。

在本发明此方面的另一些实施方案中，子序列或片段与如上文a)项所述核苷酸序列的保守结构域具有至少65％的序列同一性，例如与如上文a)项所述核苷酸序列的保守结构域具有至少70％同一性，至少75％同一性，至少80％同一性，至少85％同一性，至少87％同一性，至少90％同一性，至少95％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，至少99％同一性，或者至少99.5％同一性。

在另一些实施方案中，根据上述说明，所述重组DNA构建体还包含与所述核苷酸序列有效连接的组成型、诱导型或组织特异性启动子。特别地，所述重组DNA构建体还可包含转录盒之前的强组成型启动子，所述转录盒由完整的基因读码框组成，其后是终止子序列。这些盒可包含权利要求7和18页(本申请PCT公开文本第21页及21-22页跨页段)所定义的核苷酸序列。

在本发明目前的示例性实施方案中，所述重组DNA构建体包含SEQID NO：96的序列。

转基因植物

本发明的第三方面提供了包含重组多核苷酸(DNA构建体)的转基因植物，其包含能够改变植物中基因SEQ ID1-13、97-115至少之一的基因产物水平的核苷酸序列。在温室中在18小时光周期、22℃/15℃(白天／夜晚)的温度下培养8周并且每周用N84g／l、PI2g／l、K56g／l施肥的所述转基因植物组与相同条件下培养的野生型组比较时，得到生长的提高。

根据本发明的一些具体实施方案，包含选自下列的核苷酸序列的至少一种基因的基因产物水平与相应野生型植物中的水平相比发生了变化：

a)SEQ ID NO：1-13、97-115的核苷酸序列；

c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。

根据本发明的另一个实施方案，转基因植物包含重组多核苷酸(DNA构建体)，其包含选自下列的核苷酸序列：

a)包含选自SEQ ID NO：1-13、97-115的序列的核苷酸序列；

b)与核苷酸序列a)互补的核苷酸序列；

c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段；

d)与a)、b)和c)中任一序列具有至少60％同一性的核酸序列；和

e)在严格条件下与核苷酸序列a)、b)或c)杂交的核苷酸序列。

在本发明该方面的另一些实施方案中，c)或g)的核酸序列与a)、b)、c)、d)或e)中任一序列具有至少65％的同一性，例如与a)、b)、c)、d)或e)中任一序列有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少87％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或者至少99.5％同一性。所述转基因植物还可包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含a)或b)之多肽的保守性替换变体。所述核苷酸序列可在核苷酸序列中包含沉默替换。另外，子序列或片段可与保守结构域具有至少65％的序列同一性。

如上所述，本领域技术人员会了解，本领域中存在多种产生本发明核酸序列和多核苷酸构建体的方法，例如通过克隆技术，组装固相合成产生的片段。同样，如本领域技术人员了解地，所述序列的同源物可分离自其它物种，其非限制性实例包括刺槐、桉树、角树、山毛榉、桃花心木、胡桃、橡树、岑树、山核桃树、桦树、栗树、桤木、枫树、悬铃木、银杏、棕榈树、香枫、柏树、花旗松、枞树、红杉、铁杉、雪松、杜松、落叶松、松树、红杉、云杉和紫杉、苹果、李子、梨、香蕉、柑橘、猕猴桃、柠檬、樱桃、葡萄树、无花果、棉花、竹、柳枝稷、草芦和橡胶植物。所述序列的可用同源物还可分离自杨柳科的硬木植物，例如柳树、杨树或白杨。

特别地，根据本发明也可提供和使用本发明的可包含重组DNA构建体的转基因植物，其可包含与所述具体序列相比包含保守性改变的核苷酸序列，所述变化仅改变编码多肽中的一个或几个氨基酸。因此，提供包含重组DNA构建体的转基因植物在本发明的范围之内，所述重组DNA构建体包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含多肽a)或d)的保守性替换变体。

因此，本发明还可提供重组DNA构建体，其中核苷酸序列包含核苷酸序列中的沉默替换，即所述重组DNA构建体可包含不改变所述多核苷酸编码的氨基酸序列的序列变化。

在本发明的某些另外的实施方案中，子序列或片段与如上文a)项或d)项所述核苷酸序列的保守结构域具有至少65％序列同一性，例如与如上文a)项或d)项所述核苷酸序列的保守结构域具有至少70％同一性，至少75％同一性，至少80％同一性，至少85％同一性，至少87％同一性，至少90％同一性，至少95％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，至少99％同一性，或者至少99.5％同一性。

在本发明举例说明的特定实施方案中，c)中的子序列或片段包含SEQ ID NO：18-34的序列。

在另一些实施方案中，本发明的转基因植物包含重组体多核苷酸构建体，所述重组多核苷酸构建体还包含与所述核苷酸序列有效连接的组成型、诱导型或组织特异性启动子。

在另一些实施方案中，重组多核苷酸构建体还包含位于转录盒之前的强组成型启动子。所述盒可包含核苷酸序列，其中通过引入遗传修饰来实现经调节的表达，所述遗传修饰优选在编码包含SEQ ID NO：1-13、97-115的多肽或者这些多肽同源物的基因座中，其后是植物功能性内含子，其后是以反方向编码包含多肽a)或d)之保守性替换变体的多肽的核苷酸序列。

在本发明目前的一个优选实施方案中，本发明的转基因植物包含重组DNA构建体，其包含SEQ ID NO：96的序列。

植物物种

根据本发明，转基因植物可以是多年生植物，其优选为木本植物或木本物种。在一个有用实施方案中，所述木本植物是硬木植物，其可选自：刺槐、桉树、角树、山毛榉、桃花心木、胡桃、橡树、岑树、柳树、山核桃树、桦树、栗树、杨树、桤木、枫树、悬铃木、银杏、棕榈树和香枫。来自杨柳科的硬木植物(例如柳树、杨树和白杨，包括其变种)是特别有意义的，因为这两组包括了快速生长的树木物种或木质灌木，它们被特别地栽培用于提供木材和加热用的生物燃料。

在另一些实施方案中，所述木本植物是针叶树，其可选自柏树、花旗松、枞树、红杉、铁杉、雪松、杜松、落叶松、松树、红杉、云杉和紫杉。

本发明扩展至通过本文所述方法获得的上述转基因植物的任何植物细胞，以及所有植物部分，其包括植物的可收获部分、其种子和繁殖体，以及植物外植体或植物组织。本发明还涵盖包含本发明DNA构建体的植物、其部分、植物细胞或植物后代。本发明还扩展到涵盖通过上述任意方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的后代，唯一的要求是后代与根据本发明方法在亲本中产生的那些显示相同的基因型和／或表型特征。

应注意，本发明方面之一的上下文所述的实施方案和特征也适用于本发明的另一个方面。因此，一个实施方案的定义经过必要的变更适用于包含或涉及所述这个实施方案的所有其它实施方案。例如在给出有关DNA构建体或序列的定义时，这些定义也适用于例如产生包含DNA构建体的植物、载体、植物细胞、植物、生物质和木材的方法，反之亦然。有关植物所述的DNA构建体也适用于所有其它实施方案。

本申请引用的所有专利和非专利参考文献通过引用以整体并入本文。

下面，在以下非限制性实施例中更详解地描述本发明。

实施例

引言

为了寻找和阐明涉及生长之基因的功能，进行广泛的基因发掘方案，鉴定到了具有工业应用的可用于提高生长的基因。

材料和方法

基因选择

此基因发掘方案中的第一步是从大的基因库中选择许多基因，从而缩小待测试其功能的基因的范围。

我们决定测试转录因子。选择转录因子进行分析的原因是，长期以来已知它们在活生物植物中是许多(如果不是大多数的话)过程的部分调节子。

尽管选择待分析功能的基因是以经济有效的方式发现具有林业生物技术意义之功能的基因的重要组成部分，但是发现其在工业应用中用途的关键步骤是实际测试所选基因的基因功能。

通过针对数据库(例如http：／／plntfdb.bio.uni-potsdam.de／v2.0／，在Riano-Pachon等2007有述和http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／)中注释为转录因子的植物基因，对杨树数据库中存在的基因进行BLAST分析来鉴定转录因子基因，Sterky等2004。在一些情况下，还基于在木质形成过程中具有差异性表达模式来选择基因(对应于构建体TFSTT019、035、047和051的基因)。

克隆所选基因

使用BLAST分析从来自毛果杨基因组测序的数据中提取所选基因的对应基因模型，Tuskan等2006。将基因模型与拟南芥和其它植物物种中同源基因的公开信息进行比较，并在一些情况下基于该信息进行修正。这是用数据库例如http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／和http：／／www.arabidopsis.org／进行。随后将所选基因克隆进CaMV35S启动子控制下的过表达载体中。就cDNA的分离而言，总RNA分离自从杂种白杨克隆T89植株取样的茎、叶和树皮组织，使用Superscript III第一链合成系统(Invitrogen)逆转录成cDNA。然后，通过PCR使用基因特异性正反向引物和Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes)扩增cDNA。按照如下所述选择PCR引物，5′引物位于起始密码子，3′反向引物位于翻译终止位点的3′。通过在每个靶基因的上游紧挨着起始密码子处引入Kozak序列(5′-AGAACC-3′)来修饰正向引物。将扩增的cDNA插入Gateway进入载体pENTR／D-TOPO(Invitrogen)，然后使用Gateway LR重组反应(Invitrogen)将所述基因转移进表达载体pK2GW7(SEQ IDNO：96)。使用标准技术对克隆基因进行对照测序，与所选基因进行比较，然后亚克隆进植物载体pK2GW7。

所述基因的序列、多肽序列和PCR引物列于表A至C。

表A：PCR克隆引物

表B：过表达的基因cDNA和多肽序列

表C：所克隆cDNA的对照序列

植物转化

CaMV35S：将过表达DNA构建体转化进农杆菌，随后转化进杂交白杨中，其中基本如Nilsson等(1992)所述转化并再生了欧美杨Populustremula L.x P.tremuloides Minch克隆T89，下文称为“杨树”。每个构建体产生大约3-8个独立的品系。使用一个构建体产生的一组这样的转基因树木在下文称为“构建组”，例如，不同的转基因树木来源于一个构建体。每个构建组中的每个转基因品系(例如TF0555-2B、TF0555-3A等)是不同的转化事件，因此很可能具有插入到植物基因组中不同位置的重组DNA。这使得一个构建组中不同的品系存在部分差异。例如，已知不同的转化事件会产生具有不同过表达基因水平的植物。含有个体例如TF055RP-2B的名为TF0555RP的构建组与没有RP部分的组相同。RP指这是与没有rp部分的构建组相同的构建组的重新种植。RP2表示第二次重新种植，RP3是第三次重新种植等等。

植物生长

将转基因杨树品系与其野生型对照(wt)树木一起在温室中在18h光周期和22℃／15℃(白天／夜晚)温度下进行培养。每周用1：100稀释的Weibulls Rika S NPK7-1-5给植物施肥(终浓度NO₃，55g／l；NH₄，29g／l；P，12g/l；K，56g/l；Mg7.2g／l；S，7.2g/l；B，0.18g/l；Cu，0.02g／l；Fe，0.84g／l；Mn，0.42g／l；Mo，0.03g／l；Zn，0.13g／L)。植物在收获前生长8-9周。在这期间，每周一至两次测量高度和直径。在生长组中，许多野生型树(通常35-45棵树)和包含几个构建组(通常6-20个构建组)的许多转基因树平行生长于温室中与上述相同的条件下。在每个生长组中进行野生型树木和构建组之间的全部比较。

取样

进行两种主要类型的收获和取样。一个通用类型设计用于例如化学分析、木材形态分析、基因表达分析、木材密度分析和代谢分析。第二种类型设计用于树皮、木材、树叶和根的干重测量。

构建组的选择

在特定基因过表达的每组树(即构建组)的第一轮生长中，进行下列大量分析：生长测量和在许多情况下的木材密度。分析这些数据，以挑选显示表型变异的构建组，例如与野生型对照树木相比的生长提高。

再种植和再培养

根据第一轮温室培养的生长数据，选择具有特定基因过表达的树木组(即构建组)，再种植，并在与第一轮培养相同的条件下再培养。每个构建组中选择的转基因杨树品系一式三份进行再培养。将再种植轮数和植物品系个体重复数添加到构建组品系名称中，以使其具有惟一性，例如TF0555rp1-2B-1、TF0555rp1-2B-2、TF0555rp1-2B-3，其中rp1表示构建组TF0555品系2B的第一轮再种植，-1、-2、-3表示植物品系个体重复。类似地，rp2表示第二轮再种植。在种植未包含在第一轮温室培养中的新构建组的情况下，向构建组名称添加后缀(.2nd)以表示。

基于生长数据，进行多种分析并计算生长速度因子，以选择构建组，由此选择可用于改变生长特征的基因。选择标准和方法如下所述。

实施例1

生长分析

最大高度生长速度

高度生长速度测量(本文称为“最大高度生长速度”)定义为以四个连续高度数据点拟合的线性函数的斜率。以逐步的方式，针对数据点1-4、数据点2-5等计算高度生长速度值，实例参见图1。最大高度生长速度定义为针对每个植物所计算的逐步线性回归分析产生的最大值。检查各转化体高最大高度生长速度值的原始数据，以确定它们不是基于坏值。由图1(显示高度生长曲线的实施例)可以看出，高度生长速度在生长的第一部分中提高，接着植物达到其最大高度生长速度，然后随着植物变得更大，生长速度下降。因为这些阶段在不同的植物中具有不同的时间，并且测量植物存在一些噪音，所以我们上述的使用速率法的最大高度生长可用于不同树木个体在这些条件下的最大生长速度的计算。

直径生长速度

在上文定义的生长条件下，茎宽度显示出随时间相对线性的提高，由式d(t)=c*t+d₀表述，其中d₀是初始宽度，c是直径生长速度(斜率)。使用直径数据的线性回归来估计直径生长速度。

最终高度和直径

最终高度和直径也用于选择生长特征改变的构建组。这些值同时考虑了树的生长能力以及树在从组织培养物转移到土壤中并置于温室时开始生长的能力。

选择参数

显示与野生型群体相比上述生长参数(即直径生长速度、最大高度生长速度、最终高度和最终直径)显著或明显提高的构建组被鉴定为生长特性改变的构建组。因此，对应的基因可用于改变这些特性。选择标准如下所述。使用两个不同的选择标准水平，一个基本水平，一个用于给予额外有意义的生长表型的构建体。

生长差异选择标准

表1.2列出了当用于描述构建组表型时不同生长参数所用的缩写。

表1.2：用于不同表型的缩写

AFH：野生型群体和每个构建组群体的平均最终高度

AFD：野生型群体和每个构建组群体的平均最终直径

AMHGR：野生型群体和每个构建组群体的平均最大高度生长速度

ADGR：野生型群体和每个构建组群体的平均直径生长速度

MFH：野生型群体和每个构建组群体的最大最终高度

MFD：野生型群体和每个构建组群体的最大最终直径

MMHGR：野生型群体和每个构建组群体的最大高度生长速度的最大值

MDC：野生型群体和每个构建组群体的最大直径生长速度

生长差异选择标准如下：

1.如果构建组的AFH、MFH、AMHGR和MMHGR比相应野生型组的AFH、MFH、AMHGR和MMHGR高至少5％(或在另一更严格水平下为高8％)，或者

2.如果构建组的AFD、MFD、ADGR和MDC比相应野生型组的AFD、MFD、ADGR和MDC高至少5％(或在另一更严格水平下为高8％)，或者

3.如果构建组的AFH、AFD、AMHGR或ADGR比相应野生型组的AFH、AFD、AMHGR或ADGR高至少18％(或在另一更严格水平下为高22％)，或者

4.如果构建组的MFH、MFD、MMHGR或MDC比相应野生型组的MFH、MFD、MMHGR或MDC高至少18％(或在另一更严格水平下为高22％)。

运行大规模功能基因组程序，在所得到的数据中产生了一定量的变异和不确定性。在该设置中，变异来自诸如以下来源：构建组中的不同品系具有不同的过表达水平，导致构建组中的一个至全部所测品系可显示表型；实验过程中发生的生长变化，其由于在植物从组织培养物转移到温室时植物状态的微小变化以及基于生长周期中不同时间点温室中不同位置的变化所致。在分析数据时必须对这些变化进行处理。基于这一点，我们使用两个不同的阈值(提高5％和18％)来选择生长提高的构建组。选择标准1和2使用5％提高，然而这种提高必须在对应于高度生长的AFH、MFH、AMHGR和MMHGR所有表型中均存在，或者在对应于直径生长的AFD、MFD、ADGR和MDC所有表型中均存在。在表型仅可在植物中的一些或之一中观察到以及仅在表型类别之一中观察到的情况中，使用较高的18％提高来选择阳性构建组，从而不选择基于随机变化的构建组(选择标准3和4分别对平均值和最大个体值进行选择)。

选择满足这些标准中一项或多项的构建组。

过表达水平分析

使用实时RT PCR来比较重组过表达构建组与相应野生型组的构建体基因表达水平。使用26S蛋白酶体调节亚基S2的表达水平作为构建体基因表达归一化的参照。使用比较CT法计算相对构建体基因表达水平，其中构建体与参照基因表达水平的比值由(1+E_靶标)^-CT靶标／(I+E_参照)^-CT参照来描述，其中E_靶标和E_参照分别是构建体和参照基因PCR扩增的效率，CT_靶标和CT_参照分别是构建体和参照基因扩增所算出的阈值循环。随后，针对野生型组平均比值对构建体与参照基因表达水平之间的比值进行归一化。

对于总RNA的提取，从温室培养的植物收获茎样品(约50mg)，在液氮中速冻。用砂磨机(Retsch MM301)研磨冷冻样品。使用E-Z96植物RNA试剂盒根据制造商的建议(Omega Bio-Tek)提取总RNA。使用iScript cDNA合成试剂盒根据制造商的建议(Bio-Rad)进行cDNA合成。测量RNA浓度，使用相同的量进行cDNA合成，以确保等量的cDNA用于PCR反应。在实时PCR之前，将cDNA稀释12.5倍。

使用Beacon Designer6(PREMIER Biosoft International)设计实时PCR引物，其利用所包含的工具使得引物退火位点处的模板二级结构的干扰尽可能小。

对于实时PCR，将cDNA模板与对应的构建体基因特异性引物(SEQID NO：53-61和SEQ ID NO：63-71)、内参基因特异性引物(SEQ ID NO：62和72)和SYBR Green Supermix(Bio-Rad)相混合。实时PCR反应利用MyiQ PCR热循环仪(Bio-Rad)进行，使用所包含的软件iQ5进行分析。一式三份设置反应，对于每个样品，使用构建体基因特异性引物进行三遍，使用参照基因特异性引物进行三遍，之后将每组一式三份的平均阈值循环用于计算相对构建体基因表达水平。

用微膜覆盖96孔板，将其置于热循环仪中以开始反应循环。作为说明，反应循环可包括以下步骤：95℃先变性3分30秒，然后扩增40轮，其包含以下步骤：95℃10秒，55℃30秒以及72℃40秒。

表1.3：实时RT-PCR引物

结果

具体构建组和相应野生型组的生长原始数据示于1.4至1.16中。表中每行含有特定构建组(名为″TF″)和对应的野生型组(名为″T89″)中个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头中。

使用实时RT-PCR来证实构建体的过表达。实时RT-PCR数据表含有构建体基因与参照基因表达相比的基因表达水平。相对于野生型组的平均比值，对所示的构建体与参照基因表达水平之间的比值进行归一化。

构建组TF0002

此构建体诱导提高的生长。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终高度高12％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最大高度生长速度高31％。TF0002构建组满足生长差异选择标准(3)的更严格水平，如表1.4d所示。

表1.4a和1.4b含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有特定构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表1.4a：TF0002的高度生长数据

表1.4b：TF0002的直径生长数据

使用实时RT-PCR证实构建体TF0002的过表达。表1.4c含有构建体基因相对于参照基因表达的基因表达水平。相对于野生型组的平均比值，对所示的构建体与参照基因表达水平之间的所有比值进行归一化。根据目前的RT-PCR数据，构建组TF0002的全部个体均过表达。

表1.4c：TF0002的实时RT-PCR数据

在总结表1.4d中详细说明了生长分析的结果。具体构建组的所测生长效果以构建组与野生型组之间的AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表1.4d：构建体TF0002的生长作用的总结表

构建组TF0052

此构建体诱导提高的生长。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终高度高24％。TF0052构建组满足生长差异选择标准(4)的更严格水平，如表1.5c所示。

表1.5a和1.5b含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表1.5a：TF0052的高度生长数据

表1.5b：TF0052的直径生长数据

在总结表1.5c中详细说明了生长分析的结果。所述构建组的所测生长作用以所述构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表1.5c：构建体TF0052的生长作用的总结表

构建组TF0065

此构建体诱导提高的生长。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终高度高8％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最大高度生长速度高11％。TF0065构建组满足生长差异选择标准(1)，如表1.6c所示。

表1.6a和1.6b含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表1.6a：TF0065的高度生长数据

表1.6b：TF0065的直径生长数据

在总结表1.6c中详细说明了生长分析的结果。所述构建组的所测生长作用以所述构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表1.6c：构建体TF0065的总结表

构建组TF0076

此构建体诱导生长增加。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终高度高10％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终高度高18％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最大高度生长速度高13％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最大高度生长速度高18％。TF0076构建组满足生长差异选择标准(1)的更严格水平，以及生长差异选择标准(4)较低严格程度的水平，如表1.7d所示。

表1.7a和1.7b含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表1.7a：TF0076的高度生长数据

表1.7b：TF0076的直径生长数据

实时RT-PCR用于证实构建体TF0076的过表达。表1.7c含有相对于参照基因表达的构建体基因的基因表达水平。相对于野生型组的平均比值，对所示的构建体与参照基因表达水平之间的所有比值进行归一化。根据目前的RT-PCR数据，构建组TF0076中6个个体中有4个过表达。

表1.7c：TF0076的实时RT-PCR数据

在总结表1.7d中详细说明了生长分析的结果。所述构建组的所测生长作用以所述构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表1.7d：构建体TF0076生长作用的总结表

构建组TF0089

此构建体诱导提高的生长。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终高度高7％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终高度高17％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最大高度生长速度高12％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最大高度生长速度高17％。TF0089构建组满足生长差异选择标准(1)，如表1.8c所示。

表1.8a和1.8b含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表1.8a：TF0089的高度生长数据

表1.8b：TF0089的直径生长数据

在总结表1.8c中详细说明了生长分析的结果。所述构建组的所测生长作用以所述构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表1.8c：构建体TF0089生长作用的总结表

构建组TF0109

此构建体诱导提高的生长。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终高度高24％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终高度高39％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最大高度生长速度高27％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最大高度生长速度高44％。TF0109构建组满足生长差异选择标准(1)、(3)和(4)的更严格水平，如表1.9d所示。

表1.9a和1.9b含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表1.9a：TF0109的高度生长数据

表1.9b：TF0109的直径生长数据

实时RT-PCR用于证实构建体TF0109的过表达。表1.9c含有构建体基因与参照基因表达相比的基因表达水平。相对于野生型组的平均比值，对所示的构建体和参照基因表达水平之间的所有比值进行归一化。根据目前的RT-PCR数据，构建组TF0109的7个个体中有4个过表达。根据目前的RT-PCR数据，构建组TF0109的7个个体中有2个下调。具有较高构建体TF0109表达水平的个体相应地高且生长快，而具有较低构建体TF0109表达水平的个体较矮。

表1.9c：TF0109的实时RT-PCR数据

在总结表1.9d中详细说明了生长分析的结果。所述构建组的所测生长作用以所述构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表1.9d：构建体TF0109生长作用的总结表

构建组TF0132

此构建体诱导提高的生长。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终高度高13％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终高度高26％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最大高度生长速度高18％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最大高度生长速度高18％。TF0132构建组满足生长差异选择标准(1)和(4)的更严格水平，如表1.10c所示。

表1.10a和1.10b含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表1.10a：TF0132的高度生长数据

表1.10b：TF0132的直径生长数据

在总结表1.10c中详细说明了生长分析的结果。所述构建组的所测生长作用以所述构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表1.10c：构建体TF0132生长作用的总结表

构建组TFSTT051

此构建体诱导提高的生长。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终高度高7％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终高度高11％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最大高度生长速度高5％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最大高度生长速度高10％。TFSTT051构建组满足生长差异选择标准(1)，如表1.11d所示。

表1.11a和1.11b含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表1.11a：TFSTT051的高度生长数据

表1.11b：TFSTT051的直径生长数据

实时RT-PCR用于证实构建体TFSTT051的过表达。表1.11c含有构建体基因与参照基因表达相比的基因表达水平。相对于野生型组的平均比值，对所示的构建体与参照基因表达水平之间的所有比值进行归一化。根据目前的RT-PCR数据，构建组TFSTT051的8个个体中有1个过表达。表1.11c：TFSTT051的实时RT-PCR数据

在总结表1.11d中详细说明了生长分析的结果。所述构建组的所测生长作用以所述构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表1.11d：构建体TFSTT051生长作用的总结表

构建组TF0013

此构建体诱导提高的生长。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终高度高12％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终高度高6％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最大高度生长速度高20％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最大高度生长速度高33％。TF0013构建组满足生长差异选择标准(4)的更严格水平，以及生长差异选择标准(1)和(3)较低严格程度的水平，如表1.12d所示。

表1.12a和1.12b含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表1.12a：TF0013的高度生长数据

表1.12b：TF0013的直径生长数据

实时RT-PCR用于证实构建体TF0013的过表达。表1.12c含有构建体基因与参照基因表达相比的基因表达水平。相对于野生型组的平均比值，对所示的构建体与参照基因表达水平之间的所有比值进行归一化。根据目前的RT-PCR数据，构建组TF0013的8个个体中有3个过表达。

表1.12c：TF0013的实时RT-PCR数据

在总结表1.12d中详细说明了生长分析的结果。所述构建组的所测生长作用以所述构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表1.12d：构建体TF0013生长作用的总结表

1.3.10构建组TF0097

此构建体诱导提高的生长。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终高度高10％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终高度高16％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最大高度生长速度高15％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最大高度生长速度高15％。构建组与野生型对照组的平均值相比，直径生长速度高7％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，直径生长速度高21％。TF0097构建组满足生长差异选择标准(1)的更严格水平，以及生长差异选择标准(4)较低严格程度的水平，如表1.13d所示。

表1.13a和1.13b含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表1.13a：TF0097的高度生长数据

表1.13b：TF0097的直径生长数据

实时RT-PCR用于证实构建体TF0097的过表达。表1.13c含有构建体基因与参照基因表达相比的基因表达水平。相对于野生型组的平均比值，对所示的构建体与参照基因表达水平之间的所有比值进行归一化。根据目前的RT-PCR数据，构建组TF0097的9个个体中有2个过表达。

表1.13c：TF0097的实时RT-PCR数据

在总结表1.13d中详细说明了生长分析的结果。所述构建组的所测生长作用以所述构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表1.13d：构建体TF0097生长作用的总结表

1.3.11构建组TFSTT019

此构建体诱导提高的生长。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终直径高11％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终直径高8％。构建组与野生型对照组的平均值相比，直径生长速度高18％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，直径生长速度高9％。TFSTT019构建组满足生长差异选择标准(2)，如表1.14c所示。

表1.14a和1.14b含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表1.14a：TFSTT019的高度生长数据

表1.14b：TFSTT019的直径生长数据

在总结表1.14c中详细说明了生长分析的结果。所述构建组的所测生长作用以所述构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表1.14c：构建体TFSTT019生长作用的总结表

1.3.12构建组TFSTT035

此构建体诱导提高的生长。构建组与野生型对照组平均值相比，最终直径高8％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终直径高11％。构建组与野生型对照组的平均值相比，直径生长速度高12％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，直径生长速度高8％。TFSTT035构建组满足生长差异选择标准(2)，如表1.15c所示。

表1.15a和1.15b含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表1.15a：TFSTT035的高度生长数据

表1.15b：TFSTT035的直径生长数据

在总结表1.15c中详细说明了生长分析的结果。所述构建组的所测生长作用以所述构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表1.15c：构建体TFSTT035生长作用的总结表

1.3.13构建组TFSTT047

此构建体诱导提高的生长。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终直径高8％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终直径高11％。构建组与野生型对照组的平均值相比，直径生长速度高12％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，直径生长速度高8％。TFSTT047构建组满足生长差异选择标准(3)，如表1.16c所示。

表1.16a和1.16b含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表1.16a：TFSTT047的高度生长数据

表1.16b：TFSTT047的直径生长数据

在总结表1.16c中详细说明了生长分析的结果。所述构建组的所测生长作用以所述构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表1.16c：构建体TFSTT047生长作用的总结表

实施例2

构建组TF0002Rp2

此构建体诱导提高的生长。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终高度高29％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终高度高27％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最大高度生长速度高36％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最大高度生长速度高38％。构建组与野生型对照组的平均值相比，直径生长速度高10％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，直径生长速度高9％。TF0002Rp2构建组满足生长差异选择标准(1)、(3)和(4)的更严格水平，如表2.3所示。

表2.1和2.2含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.1：TF0002Rp2的高度生长数据

表2.2：TF0002Rp2的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.3中。所述构建组的所测生长作用以所述构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.3：构建体TF0002Rp2生长作用的总结表

构建组TF0003

表2.4和2.5含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.4：TF0003的高度生长数据

表2.5：TF0003的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.6中。所述构建组的所测生长作用以所述构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.6：构建体TF0003生长作用的总结表

构建组TF0011

表2.7和2.8含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.7：TF0011的高度生长数据

表2.8：TF0011的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.9中。所述构建组的所测生长作用以所述构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.9：构建体TF0011生长作用的总结表

构建组TF0013rp2

表2.10和2.11含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.10：TF0013rp2的高度生长数据

表2.11：TF0013rp2的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.12中。所述构建组的所测生长作用以所述构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.12：构建体TF0013rp2生长作用的总结表

构建组TF0045

此构建体诱导提高的生长。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终高度高6％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终高度高11％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最大高度生长速度高9％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最大高度生长速度高12％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终直径高10％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终直径高9％。TF0045构建组满足生长差异选择标准(1)，如表2.15所示。

表2.13和2.14含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.13：TF0045的高度生长数据

表2.14：TF0045的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.15中。所述构建组的所测生长作用以所述构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.15：构建体TF004S生长作用的总结表

构建组TF0052Rp1

表2.16和2.17含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.16：TF0052Rp1的高度生长数据

表2.17：TF0052Rp1的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.18中。所述构建组的所测生长作用以所述构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.18：构建体TF0052Rp1生长作用的总结表

构建组TF0076Rp2

此构建体诱导提高的生长。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终高度高13％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终高度高13％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最大高度生长速度高13％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最大高度生长速度高18％。TF0076Rp2构建组满足生长差异选择标准(1)的更严格水平，如表2.21所示。

表2.19和2.20含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.19：TF0076Rp2的高度生长数据

表2.20：TF0076Rp2的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.21中。所述构建组的所测生长作用以所述构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.21：构建体TF0076Rp2生长作用的总结表

构建组TF0096

此构建体诱导提高的生长。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终高度高11％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终高度高8％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最大高度生长速度高18％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最大高度生长速度高14％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终直径高15％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终直径高8％。构建组与野生型对照组的平均值相比，直径生长速度高27％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，直径生长速度高14％。TF0096构建组满足生长差异选择标准(3)的更严格水平，以及生长差异选择标准(1)和(2)较低严格程度的水平，如表2.24所示。

表2.22和2.23含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.22：TF0096的高度生长数据

表2.23：TF0096的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.24中。所述构建组的所测生长作用以所述构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.24：构建体TF0096生长作用的总结表

构建组TF0097Rp1

此构建体诱导提高的生长。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终高度高33％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终高度高43％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最大高度生长速度高32％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最大高度生长速度高41％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终直径高11％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终直径高13％。构建组与野生型对照组的平均值相比，直径生长速度高20％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，直径生长速度高26％。TF0097Rp1构建组满足生长差异选择标准(1)、(2)、(3)和(4)的更严格水平，如表2.27所示。

表2.25和2.26含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.25：TF0097Rp1的高度生长数据

表2.26：TF0097Rp1的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.27中。所述构建组的所测生长作用以所述构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.27：构建体TF0097Rp1生长作用的总结表

构建组TF0104

此构建体诱导提高的生长。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终高度高15％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终高度高12％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最大高度生长速度高16％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最大高度生长速度高14％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终直径高23％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终直径高20％。构建组与野生型对照组的平均值相比，直径生长速度高20％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，直径生长速度高10％。TF0104构建组满足生长差异选择标准(1)、(2)和(3)的更严格水平，以及生长差异选择标准(4)较低严格程度的水平，如表2.30所示。

表2.28和2.29含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.28：TF0104的高度生长数据

表2.29：TF0104的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.30中。所述构建组的所测生长作用以所述构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.30：构建体TF0104生长作用的总结表

构建组TF0109Rpl

此构建体诱导提高的生长。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终高度高22％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终高度高32％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最大高度生长速度高26％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最大高度生长速度高40％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终直径高15％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终直径高14％。构建组与野生型对照组的平均值相比，直径生长速度高25％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，直径生长速度高27％。TF0l09Rp1构建组满足生长差异选择标准(1)、(2)、(3)和(4)的更严格水平，如表2.33所示。

表2.31和2.32含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.31：TF0109Rp1的高度生长数据

表2.32：TF0109Rp1的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.33中。所述构建组的所测生长作用以所述构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.33：构建体TF0109Rp1生长作用的总结表

构建组TF0116

表2.34和2.35含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.34：TF0116的高度生长数据

表2.35：TF0116的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.36中。所述构建组的所测生长作用以所述构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.36：构建体TF0116生长作用的总结表

构建组TF0132.2nd

此构建体诱导提高的生长。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终高度高27％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终高度高32％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最大高度生长速度高38％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最大高度生长速度高41％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终直径高12％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终直径高9％。构建组与野生型对照组的平均值相比，直径生长速度高15％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，直径生长速度高8％。TF0132.2nd构建组满足生长差异选择标准(1)、(3)和(4)的更严格水平，以及生长差异选择标准(2)较低严格程度的水平，如表2.39所示。

表2.37和2.38含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.37：TF0132.2nd的高度生长数据

表2.38：TF0132.2nd的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.39中。所述构建组的所测生长作用以构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.39：构建体TF0132.2nd生长作用的总结表

构建组TF0132rp1

此构建体诱导生长提高。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终高度高29％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终高度高28％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最大高度生长速度高31％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最大高度生长速度高23％。

TF0132Rp1构建组满足生长差异选择标准(1)、(3)和(4)的更严格水平，如表2.42所示。

表2.40和2.41含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.40：TF0132rp1的高度生长数据

表2.41：TF0132rp1的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.42中。所述构建组的所测生长作用以构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.42：构建体TF0132rp1生长作用的总结表

构建组TF0146

此构建体诱导生长提高。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终高度高13％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终高度高16％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最大高度生长速度高18％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最大高度生长速度高25％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终直径高8％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终直径高8％。TF0146构建组满足生长差异选择标准(1)和(4)的更严格水平，如表2.45所示。

表2.43和2.44含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.43：TF0146的高度生长数据

表2.44：TF0146的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.45中。所述构建组的所测生长作用以构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.45：构建体TF0146生长作用的总结表

构建组TF0173

此构建体诱导生长提高。构建组与野生型对照组的平均值相比，直径生长速度高19％。TF0173构建组满足生长差异选择标准(3)，如表2.48所示。

表2.46和2.47含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.46：TF0173的高度生长数据

表2.47：TF0173的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.48中。所述构建组的所测生长作用以构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.48：构建体TF0173生长作用的总结表

构建组TF0247

此构建体诱导生长提高。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终高度高7％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终高度高10％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最大高度生长速度高5％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最大高度生长速度高7％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终直径高18％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终直径高9％。构建组与野生型对照组的平均值相比，直径生长速度高22％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，直径生长速度高18％。TF0247构建组满足生长差异选择标准(2)的更严格水平，以及生长差异选择标准(1)、(3)和(4)的较低严格程度水平，如表2.51所示。

表2.49和2.50含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.49：TF0247的高度生长数据

表2.50：TF0247的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.51中。所述构建组的所测生长作用以构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.51：构建体TF0247生长作用的总结表

构建组TF0405

此构建体诱导生长提高。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终高度高10％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终高度高9％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最大高度生长速度高13％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最大高度生长速度高15％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终直径高15％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终直径高10％。构建组与野生型对照组的平均值相比，直径生长速度高22％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，直径生长速度高19％。TF0405构建组满足生长差异选择标准(1)和(2)的更严格水平，以及生长差异选择标准(3)和(4)的较低严格程度水平，如表2.54所示。

表2.52和2.53含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.52：TF0405的高度生长数据

表2.53：TF0405的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.54中。所述构建组的所测生长作用以构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.54：构建体TF0405生长作用的总结表

构建组TFSTT004

表2.55和2.56含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.55：TFSTT004的高度生长数据

表2.56：TFSTT004的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.57中。所述构建组的所测生长作用以构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.57：构建体TFSTT004生长作用的总结表

构建组TFSTT013

在针对Joint Genome Institute的网页(http：／／genome.igi-Dsf.org／cgi-bin／runAlignment?db=PoDtr11)上毛果杨Jamboree Gene Model数据库使用BLAST检索时，使用构建体TFSTT013过表达的基因与使用构建体TFSTT038过表达的基因产生相同的最高命中结果，显示这两个基因之间的高同源性。

表2.58和2.59含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.58：TFSTT013的高度生长数据

表2.59：TFSTT013的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.60中。所述构建组的所测生长作用以构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.60：构建体TFSTT013生长作用的总结表

构建组TFSTT016

表2.61和2.62含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.61：TFSTT016的高度生长数据

表2.62：TFSTT016的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.63中。所述构建组的所测生长作用以构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.63：构建体TFSTT016生长作用的总结表

构建组TFSTT019Rp1

表2.64和2.65含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.64：TFSTT019Rp1的高度生长数据

表2.65：TFSTT019Rp1的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.66中。所述构建组的所测生长作用以构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.66：构建体TFSTT019Rp1生长作用的总结表

构建组TFSTT036

此构建体诱导生长提高。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终高度高10％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终高度高8％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最大高度生长速度高14％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最大高度生长速度高12％。构建组与野生型对照组的平均值相比，最终直径高7％。构建组与野生型对照组的最大个体相比，最终直径高14％。TFSTT036构建组满足生长差异选择标准(1)，如表2.69所示。

表2.67和2.68含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.67：TFSTT036的高度生长数据

表2.68：TFSTT036的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.69中。所述构建组的所测生长作用以构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.69：构建体TFSTT036生长作用的总结表

构建组TFSTT038

在针对Joint Genome Institute的网页(http：／／genome.igi-psf.org／cgi-bin／runAlignment?db=Poptr11)上毛果杨Jamboree Gene Model数据库使用BLAST检索时，使用构建体TFSTT038过表达的基因与使用构建体TFSTT013过表达的基因产生相同的最高命中结果，显示了两个基因之间的高同源性。

表2.70和2.71含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.70：TFSTT038的高度生长数据

表2.71：TFSTT038的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.72中。所述构建组的所测生长作用以构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.72：构建体TFSTT038生长作用的总结表

构建组TFSTT045

表2.73和2.74含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.73：TFSTT045的高度生长数据

表2.74：TFSTT045的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.75中。所述构建组的所测生长作用以构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.75：构建体TFSTT045生长作用的总结表

构建组TFSTT051Rp1

表2.76和2.77含有所述构建组和相应野生型组的生长数据。表中每行含有所述构建组和相应野生型组的个体的高度和直径测量值。以温室中天数计的测量时间显示于表头。

表2.76：TFSTT051Rp1的高度生长数据

表2.77：TFSTT051Rp1的直径生长数据

来自生长分析的结果显示于总结表2.78中。所述构建组的所测生长作用以构建组与野生型组之间AFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR和MDC的比值显示。

表2.78：构建体TFSTT051Rp1生长作用的总结表

实施例3

体积生长计算

使用圆锥体体积，由最终高度和最终直径测量值来估算每一植物个体茎的体积。

茎体积估算

V = \frac{π * h * r^{2}}{3}

其中V=体积

h=高度(最终高度)

r=半径(最终直径／2)

随后计算每个构建组群体和相应野生型群体的平均最终体积。应用体积生长选择标准，其中如果构建组平均最终体积比相应野生型组平均最终体积高25％(或者在另一更严格的水平中为50％)，则认为构建组与野生型组相比具有显著的或明显的体积提高。

体积估算得到的结果在总结表3.1中具体说明。所确定的生长作用以构建组与野生型组之间平均最终体积AFV的比值显示。

以下构建组满足体积生长标准。构建组TF0002Rp2的平均最终体积提高36％；构建组TF0013的平均最终体积提高27％；构建组TF0045的平均最终体积提高33％；构建组TF0096的平均最终体积提高44％；构建组TF0109的平均最终体积提高44％；构建组TF0116的平均最终体积提高31％；构建组TF0132Rp1的平均最终体积提高46％，而构建组TF0132Rp1-4AC平均最终体积提高70％(+／-20％)；构建组TF0146的平均最终体积提高34％；构建组TF0247的平均最终体积提高49％；构建组TF0405的平均最终体积提高45％；构建组TFSTT016的平均最终体积提高36％；构建组TFSTT036的平均最终体积提高28％；构建组TFSTT038的平均最终体积提高32％；构建组TFSTT045的平均最终体积提高38％。

下列构建组满足体积生长标准(5)的更严格水平，如表3.1所示。构建组TF0097Rp1的平均最终体积提高68％，而构建组品系TF097Rp1-3A的平均最终体积提高116％(+／-37％)；构建组TF0104的平均最终体积提高79％；构建组TF0109Rp1的平均最终体积提高58％，而构建组品系TF0109Rp1-4A的平均最终体积提高92％(+／-5％)；构建组TF0132.2nd的平均最终体积提高65％；构建组TFSTT004的平均最终体积提高51％。这些构建组满足体积生长标准(5)的更严格水平，如表3.1所示。

表3.1

实施例4

干重测量

对再种植的构建组进行干重测量。根据标准程序收获植物：收集茎、树皮、五个充分发育的叶、其余叶和根作为独立的样品。测量五个充分发育的叶的叶面积，测量20个充分发育的节间的长度。将植物材料的独立样品放入烘干箱中超过48小时。测量干重，并根据与相应野生型组的差异进行分析。用于干重分析的缩写和参数如表4.1所示。

表4.1与干重有关的缩写和参数

干重实验结果

构建组TF0013

此构建体诱导生物质生产的提高。所述构建组的干重测量值显示，相比于相应野生型组，茎平均值提高20％，树皮平均值提高14％，叶平均值提高14％，总计平均值提高16％。所述构建组品系之一显示，相比于相应野生型组，茎平均值提高48％，树皮平均值提高37％，叶平均值提高31％，总计平均值提高36％。

表4.2含有所述构建组和相应野生型组的干重数据。

表4.2

表4.3含有所述构建组相对于相应野生型组的茎平均值、树皮平均值、根平均值、叶平均值和总计平均值的干重比。表4.3还显示所述构建组相对于相应野生型组的平均SLA和平均节间长度的比值。

表4.3

表4.4含有所述构建组相对于相应野生型组的茎最大值、树皮最大值、根最大值、叶最大值和总计最大值的干重比。

表4.4

表4.5含有所述构建组品系相对于相应野生型组的茎平均值、树皮平均值、根平均值、叶平均值和总计平均值的干重比。表4.5还显示所述构建组品系相对于相应野生型组的平均SLA和平均节间长度的比值。

表4.5

构建组TF0132

此构建体诱导生物质生产的提高。所述构建组的干重测量显示，相比于相应野生型组，茎平均值提高83％，树皮平均值提高58％，叶平均值提高34％，总计平均值提高49％。所述构建组品系之一显示，相比于相应野生型组，茎平均值提高119％，树皮平均值提高82％，叶平均值提高53％，总计平均值提高73％。对于测量根干重的品系，观察到了茎根比(shot-rootratio)的提高。

表4.6含有所述构建组和相应野生型组的干重数据。

表4.6

表4.7含有所述构建组相对于相应野生型组的茎平均值、树皮平均值、根平均值、叶平均值和总计平均值的干重比。表4.7还显示所述构建组品系相对于相应野生型组的平均SLA和平均节间长度的比值。

表4.7

表4.8含有所述构建组相对于相应野生型组的茎最大值、树皮最大值、根最大值、叶最大值和总计最大值的干重比。

表4.8

表4.9含有所述构建组品系相对于相应野生型组的茎平均值、树皮平均值、根平均值、叶平均值和总计平均值的干重比。表4.9还显示所述构建组品系相对于相应野生型组的平均SLA和平均节间长度的比值。

表4.9

构建组TF0002

此构建体诱导生物质生产的提高。所述构建组的干重测量显示，相比于相应野生型组，茎平均值提高50％，树皮平均值提高52％，叶平均值提高6％，总计平均值提高20％。所述构建组品系之一显示，相比于相应野生型组，茎平均值提高72％，树皮平均值提高61％，叶平均值提高20％，总计平均值提高35％。对于测量根干重的品系，观察到了茎根比的提高。

表4.10含有所述构建组和相应野生型组的干重数据。

表4.10

表4.11含有所述构建组相对于相应野生型组的茎平均值、树皮平均值、根平均值、叶平均值和总计平均值的干重比。表4.11还显示所述构建组品系相对于相应野生型组的平均SLA和平均节间长度的比值。

表4.11

表4.12含有所述构建组相对于相应野生型组的茎最大值、树皮最大值、根最大值、叶最大值和总计最大值的干重比。

表4.12

表4.13含有所述构建组品系相对于相应野生型组的茎平均值、树皮平均值、根平均值、叶平均值和总计平均值的干重比。表4.13还显示所述构建组品系相对于相应野生型组的平均SLA和平均节间长度的比值。

表4.13

构建组TF0052

此构建体诱导生物质生产的提高。所述构建组品系之一的干重测量显示，相比于相应野生型组，茎平均值提高49％，树皮平均值提高64％，叶平均值提高32％，总计平均值提高38％。

表4.14含有所述构建组和相应野生型组的干重数据。

表4.14

表4.15含有所述构建组相对于相应野生型组的茎平均值、树皮平均值、根平均值、叶平均值和总计平均值的干重比。表4.15还显示所述构建组品系相对于相应野生型组的平均SLA和平均节间长度的比值。

表4.15

表4.16含有所述构建组相对于相应野生型组的茎最大值、树皮最大值、根最大值、叶最大值和总计最大值的干重比。

表4.16

表4.17含有所述构建组品系相对于相应野生型组的茎平均值、树皮平均值、根平均值、叶平均值和总计平均值的干重比。表4.17还显示所述构建组品系相对于相应野生型组的平均SLA和平均节间长度的比值。

表4.17

构建组TF0076

此构建体诱导生物质生产的提高。所述构建组的干重测量显示，相比于相应野生型组，茎平均值提高16％，树皮平均值提高11％，叶平均值提高4％，总计平均值提高7％。所述构建组品系之一显示，相比于相应野生型组，茎平均值提高42％，树皮平均值提高29％，叶平均值提高16％，总计平均值提高23％。对于测量根干重的品系，观察到了茎根比的提高。

表4.18含有所述构建组和相应野生型组的干重数据。

表4.18

表4.19含有所述构建组相对于相应野生型组的茎平均值、树皮平均值、根平均值、叶平均值和总计平均值的干重比。表4.19还显示所述构建组品系相对于相应野生型组的平均SLA和平均节间长度的比值。

表4.19

表4.20含有所述构建组相对于相应野生型组的茎最大值、树皮最大值、根最大值、叶最大值和总计最大值的干重比。

表4.20

表4.21含有所述构建组品系相对于相应野生型组的茎平均值、树皮平均值、根平均值、叶平均值和总计平均值的干重比。表4.21还显示所述构建组品系相对于相应野生型组的平均SLA和平均节间长度的比值。

表4.21

构建组TF0097

此构建体诱导生物质生产的提高。所述构建组的干重测量显示，相比于相应野生型组，茎平均值提高74％，树皮平均值提高82％，叶平均值提高28％，总计平均值提高43％。所述构建组品系之一显示，相比于相应野生型组，茎平均值提高136％，树皮平均值提高141％，叶平均值提高63％，总计平均值提高87％。对于测量根干重的品系，观察到了茎根比的提高。

表4.22含有所述构建组和相应野生型组的干重数据。

表4.22

表4.23含有所述构建组相对于相应野生型组的茎平均值、树皮平均值、根平均值、叶平均值和总计平均值的干重比。表4.23还显示所述构建组品系相对于相应野生型组的平均SLA和平均节间长度的比值。

表4.23

表4.24含有所述构建组相对于相应野生型组的茎最大值、树皮最大值、根最大值、叶最大值和总计最大值的干重比。

表4.24

表4.25含有所述构建组品系相对于相应野生型组的茎平均值、树皮平均值、根平均值、叶平均值和总计平均值的干重比。表4.25还显示所述构建组品系相对于相应野生型组的平均SLA和平均节间长度的比值。

表4.25

构建组TF0109

此构建体诱导生物质生产的提高。所述构建组的干重测量显示，相比于相应野生型组，茎平均值提高57％，树皮平均值提高56％，叶平均值提高34％，总计平均值提高40％。所述构建组品系之一显示，相比于相应野生型组，茎平均值提高82％，树皮平均值提高62％，叶平均值提高10％，总计平均值提高31％。对于测量根干重的品系，观察到了茎根比的提高。

表4.26含有所述构建组和相应野生型组的干重数据。

表4.26

表4.27含有所述构建组相对于相应野生型组的茎平均值、树皮平均值、根平均值、叶平均值和总计平均值的干重比。表4.27还显示所述构建组品系相对于相应野生型组的平均SLA和平均节间长度的比值。

表4.27

表4.28含有所述构建组相对于相应野生型组的茎最大值、树皮最大值、根最大值、叶最大值和总计最大值的干重比。

表4.28

表4.29含有所述构建组品系相对于相应野生型组的茎平均值、树皮平均值、根平均值、叶平均值和总计平均值的干重比。表4.29还显示所述构建组品系相对于相应野生型组的平均SLA和平均节间长度的比值。

表4.29

构建组TFSTT019

此构建体诱导生物质生产的提高。所述构建组品系之一的干重测量显示，相比于相应野生型组，茎平均值提高19％，树皮平均值提高12％，叶平均值提高10％，总计平均值提高11％。此基因还在许多品系中带来SLA的提高，其在许多情况下与高效生长偶联。

表4.30含有所述构建组和相应野生型组的干重数据。

表4.30

表4.31含有所述构建组相对于相应野生型组的茎平均值、树皮平均值、根平均值、叶平均值和总计平均值的干重比。表4.31还显示所述构建组品系相对于相应野生型组的平均SLA和平均节间长度的比值。

表4.31

表4.32含有所述构建组相对于相应野生型组的茎最大值、树皮最大值、根最大值、叶最大值和总计最大值的干重比。

表4.32

表4.33含有所述构建组品系相对于相应野生型组的茎平均值、树皮平均值、根平均值、叶平均值和总计平均值的干重比。表4.33还显示所述构建组品系相对于相应野生型组的平均SLA和平均节间长度的比值。

表4.33

构建组TFSTT051

此构建体诱导生物质生产的提高。所述构建组品系之一的干重测量显示，相比于相应野生型组，茎平均值提高22％，树皮平均值提高30％，叶平均值提高29％，总计平均值提高26％。

表4.34含有所述构建组和相应野生型组的干重数据。

表4.34

表4.35含有所述构建组相对于相应野生型组的茎平均值、树皮平均值、根平均值、叶平均值和总计平均值的干重比。表4.35还显示所述构建组品系相对于相应野生型组的平均SLA和平均节间长度的比值。

表4.35

表4.36含有所述构建组相对于相应野生型组的茎最大值、树皮最大值、根最大值、叶最大值和总计最大值的干重比。

表4.36

表4.37含有所述构建组品系相对于相应野生型组的茎平均值、树皮平均值、根平均值、叶平均值和总计平均值的干重比。表4.37还显示所述构建组品系相对于相应野生型组的平均SLA和平均节间长度的比值。

表4.37

实施例5

密度测定

收获后，将每株植物的5cm长的蒸汽段(steam section)(距土壤36cm至41cm的部分)保存于冰箱中(-20℃)。首先，对进行密度测定的样品除霜，去皮，然后除去中心部分(central core)。使用天平测量重量(w)，使用阿基米德原理测定体积(v)，将树木样品推入(使用针)有水的烘炉(置于天平上)中，重量的提高等于树木样品排出的水的重量，因为水的密度是1g／cm³，所以等于树木样品的体积。然后，将样品在45℃的烘箱中干燥>48h。测定干重(dw)，根据(1)计算密度(d)。

(1)d=dw／v

将每个构建体的样品与来自同一培育轮次的野生型样品(T89)进行比较。每个构建体必须满足将构建组视为有密度改变的两条标准。

1.根据t检验，平均密度具有显著差异(p值<0.01)。t检验是两侧的，并假设为不等方差。

2.两个或更多个个体在野生型群体的95％置信区间之外(同侧)。密度总结表

*)构建组TF0109(再种植1)不满足密度改变的标准，但是构建组品系TF0109Rp1-2B(+18％)和TF0109Rp1-4A(-16％)满足。

构建组密度总结表格的解释

所有密度以g／cm³给出

下列构建组未产生任何数据：TF0089、TF0097、TF0109、TF0132和TFSTT047。

构建组TF0002(再种植2)

TF002Rp2密度原始数据

TF0002Rp2	密度
		个体名：	(g／cm³)
TF0002Rp2-1B-1	0，317
		TF0002Rp2-1B-2	0,360
TF0002Rp2-1B-3	0,323
		TF0002Rp2-2A-1	0,322
TF0002Rp2-2A-2	0,323
		TF0002Rp2-2A-3	0,366
TF0002Rp2-3B-1	0,330
		TF0002Rp2-3B-2	0,321
TF0002Rp2-3B-3	0,352

TF002Rp2密度总结

与相应的T89组相比，TF0002Rp2具有显著更高的密度(根据标准1和2)(平均+18％)。构建组TF0002Rp2的3个品系(每个品系3个个体)TF0002Rp2-1B(平均+17％)、TF0002Rp2-2A(平均+19％)和TF0002Rp2-3B(平均+18％)的密度改变(与T89相比)。品系TF0002Rp2-3B自身满足标准1和2。

构建组TF0003

TF0003密度原始数据

TF0003	密度
		个体名：	(g/cm³)
TF0003-1A	0，318
		TF0003-1B	0，323
TF0003-2A	0，242
		TF0003-3A
TF0003-3B
		TF0003-4A
TF0003-4B	0，282

TF0003密度总结

与相应的T89组相比，构建组TF0003具有显著更高的密度(根据标准1和2)(平均+14％)。

构建组TF0011

TF0011密度原始数据

TF0011	密度
		个体名：	(g/cm³)
TF0011-1A-1	0，308
		TF0011-1A-2	0，360
TF0011-1B	0，264
		TF0011-2A-1	0，337
TF0011-2A-2	0，298
		TF0011-3A-1	0，326
TF0011-3A-2	0，350
		TF0011-3B-1	0，333
TF0011-3B-2	0，303
		TF0011-4A	0，261

TF0011密度总结

与相应的T89组相比，构建组TF0011具有显著更高的密度(根据标准1和2)(平均+11％)。

构建组TF0013

TF0013密度原始数据

TF0013	密度
		个体名：	(g/cm³)
TF0013-1A-1	0，246
		TF0013-1A-2	0，236
TF0013-2A
		TF0013-2B	0，265
TF0013-3A	0，258
		TF0013-3BA	0，254
TF0013-3BB	0，245
		TF0013-4BA	0，258
TF0013-4BB	0，253

TF0013密度总结

与相应的T89组相比，构建组TF0013的密度没有显著差异(根据标准1和2)。

构建组TF0045

TF0045密度原始数据

TF0045	密度
		个体名：	(g/cm³)
TF0045-1A-1	0，344
		TF0045-1A-2
TF0045-1A-3	0，270
		TF0045-1B-1	0，320
TF0045-1B-2	0，323
		TF0045-1B-3	0，328
TF0045-2B-1	0，303
		TF0045-2B-3	0，255

TF0045密度总结

与相应的T89组相比，TF0045具有显著更高的密度(根据标准1和2)(平均+12％)。TF0045的3个构建组品系TF0045-1A(平均+12％(2个测量个体))、TF0045-1B(平均+18％(3个个体))和TF0045-3B(平均+2％(2个个体))的密度改变(与T89相比)。

构建组TF0052

TF0052密度原始数据

TF0052	密度
		个体名：	(g/cm³)
TF0052-1A	0，241
		TF0052-1B	0，346
TF0052-2A	0，323
		TF0052-2B	0，251
TF0052-3A	0，393
		TF0052-3B	0，278
TF0052-4A	0，261
		TF0052-4B	0，322

TF0052密度总结

与相应的T89组相比，构建组TF0052的密度没有显著差异(根据标准1)。尽管TF0052平均密度提高(+10％)，满足标准2。

构建组TF0065

TF0065密度原始数据

TF0065	密度
		个体名：	(g/cm³)
TF0065-1AA	0，333
		TF0065-1AB	0，245
TF0065-1BA	0，267
		TF0065-1BB	0，253
TF0065-2B	0，278
		TF0065-3A	0，262
TF0065-4B	0，272

TF0065密度总结

与相应的T89组相比，构建组TF0065的密度没有显著差异(根据标准1和2)。

构建组TF0076

TF0076密度原始数据

TF0076	密度
		个体名：	(g/cm³)
TF0076-2AA	0，250
		TF0076-2AB	0，253
TF0076-3BA	0，252
		TF0076-3BB	0，257
TF0076-4B
		TF0076-5BA	0，288
TF0076-5BB	0，300

TF0076密度总结

与相应的T89组相比，构建组TF0076的密度没有显著差异(根据标准1和2)。

构建组TF0076(再种植2)

TF0076Rp2密度原始数据

TF0076Rp2	密度
		个体名：	(g/cm³)
TF0076Rp2-3BB-1	0，237
		TF0076Rp2-3BB-2	0，311
TF0076Rp2-3BB-3	0，274
		TF0076Rp2-4B-1	0，304
TF0076Rp2-4B-2	0，293
		TF0076Rp2-4B-3	0，301
TF0076Rp2-5BA-1	0，262
		TF0076Rp2-5BA-2	0，288
TF0076Rp2-5BA-3	0，259
		TF0076Rp2-5BB-1	0，267
TF0076Rp2-5BB-2	0，263
		TF0076Rp2-5BB-3	0，356

TF0076密度总结Rp2

与相应的T89组相比，构建组TF0076Rp2的密度没有显著差异(根据标准1和2)。

构建组TF0096

TF0096密度原始数据

TF0096	密度
		个体名：	(g/cm³)
TF0096-2A	0，296
		TF0096-2B	0，249
TF0096-3A	0，321
		TF0096-3B	0，308
TF0096-4A	0，363

TF0096密度总结

与相应的T89组相比，构建组TF0096的密度没有显著差异(根据标准1和2)。

构建组TF0097(再种植1)

TF0097Rp1密度原始数据

TF0097Rp1	密度	TF0097Rp1	密度
				个体名：	(g/cm³)	个体名：	(g/cm³)
TF0097Rp1-1A-1	0，327	TF0097Rp1-2B-2	0，351
				TF0097Rp1-1A-2	0，335	TF0097Rp1-2B-3	0，309
TF0097Rp1-1A-3	0，344	TF0097Rp1-3A-1	0，309
				TF0097Rp1-2A-1	0，275	TF0097Rp1-3A-2	0，268
TF0097Rp1-2A-2	0，284	TF0097Rp1-3A-3	0，297
				TF0097Rp1-2A-3	0，308	TF0097Rp1-4A-1	0，333
TF0097Rp1-2B-1	0，328	TF0097Rp1-4A-2	0，325
						TF0097Rp1-4A-3	0，319

TF0097Rp1密度总结

与相应的T89组相比，TF0097Rp1具有显著更高的密度(根据标准1和2)(平均+11％)。TF0097Rp1的5个构建组品系(每个品系3个个体)TF0097Rp1-1A(平均+18％)、TF0097Rp1-2A(平均+2％)、TF0097Rp1-2B(平均+16％)、TF0097Rp1-3A(平均+3％)和TF0097Rp1-4A(平均+15％)的密度改变(与T89相比)。品系TF00097Rp1-1A、TF00097Rp1-2B和TF00097Rp1-4A自身满足标准1和2。

构建组TF0104

TF0104密度原始数据

TF0104	密度
		个体名：	(g/cm³)
TF0104-1A	0，282
		TF0104-1B	0，282
TF0104-2A	0，297
		TF0104-3A	0，298
TF0104-3B	0，261

TF0104密度总结

与相应的T89组相比，构建组TF0104的密度没有显著差异(根据标准1和2)。

构建组TF0109(再种植1)

TF0109Rp1密度原始数据

TF0109Rp1	密度	TF0109Rp1	密度
				个体名：	(g／cm³)	个体名：	(g／cm³)
TF0109Rp1-2A-1	0,301	TF0109Rp1-3B-1	0，279
				TF0109Rp1-2A-2	0,294	TF0109Rp1-3B-2	0，279
TF0109Rp1-2A-3	0,284	TF0109Rp1-3B-3	0，271
				TF0109Rp1-2B-1	0,329	TF0109Rp1-4A-1	0，253
TF0109Rp1-2B-2	0,342	TF0109Rp1-4A-2	0，238
				TF0109Rp1-2B-3	0,336	TF0109Rp1-4A-3	0，222

TF0109Rp1密度总结

与相应的T89组相比，构建组TF0109Rp1的密度没有显著差异(根据标准1和2)。TF0109Rp1的4个构建组品系(每个品系3个个体)TF0109Rp1-2A(平均+3％)、TF0109Rp1-2B(平均+18％)、TF0109Rp1-3B(平均-3％)以及TF0109Rp1-4A(平均-16％)的密度改变(与T89相比)。品系TF0109Rp1-2B和TF0109Rp1-4A自身满足标准1和2。

构建组TF0116

TF0116密度原始数据

TF0116	密度
		个体名：	(g/cm³)
TF0116-1B
		TF0116-2A	0，306
TF0116-2B-1	0，293
		TF0116-2B-2	0，263
TF0116-4A	0，292
		TF0116-5B	0，247
TF0116-6A	0，271
		TF0116-6B	0，268

TF0116密度总结

与相应的T89组相比，构建组TF0116的密度没有显著差异(根据标准1和2)。

构建组TF0132(第二组构建组品系)

TF0132.2nd密度原始数据

TF0132，2nd	密度
		个体名：	(g/cm³)
TF0132，2nd-1A	0，263
		TF0132，2nd-1B	0，284
TF0132，2nd-2A	0，350
		TF0132，2nd-4B	0，315
TF0132，2nd-5A	0，271
		TF0132，2nd-5B	0，286
TF0132，2nd-6B	0，285
		TF0132，2nd-7A	0，294

TF0132.2nd密度总结

与相应的T89组相比，构建组TF0132.2nd的密度没有显著差异(根据标准1和2)。

构建组TF0132(再种植1)

TF0132rp1密度原始数据

TF0132rp1	密度	TF0132rp1	密度
				个体名：	(g／cm³)	个体名：	(g／cm³)
TF0132Rp1-1B-1	0，274	TF0132Rp1-4AC-3	0，278
				TF0132Rp1-1B-2	0，265	TF0132Rp1-4B-1	0，291
TF0132Rp1-1B-3	0，265	TF0132Rp1-4B-2	0，260
				TF0132Rp1-3BB-1	0，260	TF0132Rp1-4B-3	0，282
TF0132Rp1-3BB-2	0，265	TF0132Rp1-6B-1	0，270
				TF0132Rp1-3BB-3	0，267	TF0132Rp1-6B-2	0，281
TF0132Rp1-4AC-1	0，283	TF0132Rp1-6B-3	0，269
				TF0132Rp1-4AC-2	0，275

TF0132rp1密度总结

与相应的T89组相比，构建组TF0132Rp1具有显著更高的密度(根据标准1和2)(平均+7％)。TF0132Rp1的5个构建组品系(每个品系3个个体)TF0132Rp1-1B(平均+5％)、TF0132Rp1-3BB(平均+4％)、TF0132Rp1-4AC(平均+9％)、TF0132Rp1-4B(平均+9％)和TF0132Rp1-6B(平均+7％)的密度改变(与T89相比)。品系TF0132Rp1-4B自身满足标准1和2。

构建组TF0146

TF0146密度原始数据

TF0146	密度
		个体名：	(g/cm³)
TF0146-1A	0，341
		TF0146-1B	0，314
TF0146-2A	0，303
		TF0146-2B	0，300
TF0146-3A	0，333
		TF0146-3B	0，313
TF0146-4A	0，374
		TF0146-4B	0，269

TF0146密度总结

与相应的T89组相比，构建组TF0146具有显著更高的密度(根据标准1和2)(平均+16％)。

构建组TF0173

TF0173密度原始数据

TF0173	密度
		个体名：	(g/cm³)
TF0173-3A-1	0，232
		TF0173-3A-2	0，291
TF0173-3B-1	0，239
		TF0173-3B-2	0，242
TF0173-4A-1	0，251
		TF0173-4A-2	0，231
TF0173-4B-1	0，256
		TF0173-4B-2	0，305

TF0173密度总结

与相应的T89组相比，构建组TF0173的密度没有显著差异(根据标准1和2)。

构建组TF0247

TF0247密度原始数据

TF0247	密度
		个体名：	(g/cm³)
TF0247-1A	0，257
		TF0247-3A	0，250
TF0247-3B	0，309
		TF0247-4A	0，288
TF0247-6B	0，366

TF0247密度总结

与相应的T89组相比，构建组TF0247的密度没有显著差异(根据标准1和2)。

构建组TF0405

TF0405密度原始数据

TF0405	密度
		个体名：	(g/cm³)
TF0405-2A-1	0，271
		TF0405-2A-2	0，291
TF0405-2B-2
		TF0405-3A-1	0，275
TF0405-3A-2	0，309
		TF0405-3B-1	0，295
TF0405-3B-2	0，279

TF0405密度总结

与相应的T89组相比，构建组TF0405的密度没有显著差异(根据标准1和2)。

构建组TFSTT004

TFSTT004密度原始数据

TFSTT004	密度
		个体名：	(g／cm³)
TFSTT004-1A	0，300
		TFSTT004-2A-1	0，285
TFSTT004-2A-2	0，283
		TFSTT004-2B-1	0，272
TFSTT004-2B-2	0，262
		TFSTT004-3B	0，329
TFSTT004-4B-1	0，266
		TFSTT004-4B-2	0，274

TFSTT004密度总结

与相应的T89组相比，构建组TFSTT004的密度没有显著差异(根据标准1和2)。

构建组TFSTT013

TFSTT013密度原始数据

TFSTT013	密度
		个体名：	(g/cm³)
TFSTT013-1A	0，323
		TFSTT013-1B	0，328
TFSTT013-2B	0，288
		TFSTT013-3A	0，345
TFSTT013-3B	0，291
		TFSTT013-4A	0，304
TFSTT013-4B	0，324
		TFSTT013-5B	0，346

TFSTT013密度总结

与相应的T89组相比，构建组TFSTT013具有显著更高的密度(根据标准1和2)(平均+12％)。

构建组TFSTT016

TFSTT016密度原始数据

TFSTT016	密度
		个体名：	(g／cm³)
TFSTT016-1A	0,306
		TFSTT016-1B	0，254
TFSTT016-2A	0，249
		TFSTT016-2B	0，279
TFSTT016-3A-1	0，272
		TFSTT016-3A-2	0，274
TFSTT016-4A	0，252

TFSTT016密度总结

与相应的T89组相比，构建组TFSTT016的密度没有显著差异(根据标准1和2)。

构建组TFSTT019

TFSTT019密度原始数据

TFSTT019	密度
		个体名：	(g／cm³)
TFSTT019-1A
		TFSTT019-1BA	0，216
TFSTT019-1BB	0，283
		TFSTT019-2A	0，265
TFSTT019-2B	0，231
		TFSTT019-3A	0，277
TFSTT019-4BA	0，244
		TFSTT019-4BB	0，282

TFSTT019密度总结

与相应的T89组相比，构建组TFSTT019的密度没有显著差异(根据标准1和2)。

构建组TFSTT035

TFSTT035密度原始数据

TFSTT035	密度
		个体名：	(g／cm³)
TFSTT035-1A	0，236
		TFSTT035-1BA	0，260
TFSTT035-1BB	0，265
		TFSTT035-2AA	0，247
TFSTT035-2AB	0，257
		TFSTT035-2B	0，217
TFSTT035-3B	0，240
		TFSTT035-4B	0，267

TFSTT035密度总结

与相应的T89组相比，构建组TFSTT035的密度没有显著差异(根据标准1和2)。

构建组TFSTT036

TFSTT036密度原始数据

TFSTT036	密度
		个体名：	(g/cm³)
TFSTT036-1B	0，291
		TFSTT036-2A	0，306
TFSTT036-2B	0，365
		TFSTT036-3A	0，322
TFSTT036-4A	0，274
		TFSTT036-4B	0，331
TFSTT036-5B	0，254

TFSTT036密度总结

与相应的T89组相比，构建组TFSTT036具有显著更高的密度(根据标准1和2)(平均+12％)。

构建组TFSTT038

TFSTT038密度原始数据

TFSTT038	密度
		个体名：	(g／cm³)
TFSTT038-1A-1	0，256
		TFSTT038-1A-2	0，292
TFSTT038-1B	0，312
		TFSTT038-2A	0，308
TFSTT038-2B	0，264
		TFSTT038-3A	0，301
TFSTT038-3B	0，343
		TFSTT038-4B	0，284

TFSTT038密度总结

与相应的T89组相比，构建组TFSTT038的密度没有显著差异(根据标准1和2)。

构建组TFSTT045

TFSTT045密度原始数据

TFSTT045	密度
		个体名：	(g／cm³)
TFSTT045-1B	0，231
		TFSTT045-2B	0，243
TFSTT045-3A	0，258
		TFSTT045-3B	0，257
TFSTT045-4A	0，258
		TFSTT045-4B	0，349
TFSTT045-7B	0，324

TFSTT045密度总结

与相应的T89组相比，构建组TFSTT045的密度没有显著差异(根据标准1和2)。

构建组TFSTT051

TFSTT051密度原始数据

TFSTT051	密度
		个体名：	(g／cm³)
TFSTT051-1B	0，315
		TFSTT051-2A	0，318
TFSTT051-2B	0，292
		TFSTT051-3A	0，289
TFSTT051-3B	0，270
		TFSTT051-4A	0，240
TFSTT051-4B-1	0，269
		TFSTT051-4B-2	0，234

TFSTT051密度总结

与相应的T89组相比，构建组TFSTT051的密度没有显著差异(根据标准1和2)。

实施例6

纤维测量

在茎的33至36cm高度处对样品进行纤维测量。从茎块上剪下一块约1.5mm×1.5mm×15mm的纯木质。进行浸渍制备(Franklin等1945)，从小块木质得到单纤维浸渍物。然后，使用Metso Automation的KajaaniFibreLab^TM测量样品，得到纤维长度平均值、纤维宽度平均值和纤维细胞壁厚度的估计值。通过所提供的计算机软件根据生产商的下式计算这些数值。

纤维长度

纤维长度平均值L(n)，其使用沿中线测量的纤维实际长度：

L (n) = \frac{Σ (n_{i} * l_{i})}{Σ n_{i}} - - - [mm]

其中

n_i=i组中的纤维数

i=1......152，

l_i=(0.05*i)-0.025

l_i=i组的长度

纤维宽度

纤维宽度平均值W；其基于横截面测量：

W = \frac{Σ (n_{i} * w_{i})}{Σ n_{i}} - - - [μm]

其中

n_i=i组中的纤维数

i=1......100，

w_i=kw*(i-0.5)，

w_i=i组的宽度，

kw=宽度校准因子。

细胞壁厚度

细胞壁厚度平均值CWT，其基于横截面测量：

CWT = \frac{Σ (n_{i} * {CWT}_{i})}{Σ n_{i}} - - - [μm]

其中

n_i=i组中的纤维数

i=1......100，

CWT_i=kt*(i-0.5)，

CWT_i=i组的细胞壁厚度，

kt=细胞壁宽度校准因子

根据下列选择标准，将具有纤维长度或宽度至少提高10％或降低15％之纤维的构建组选为受到可用于改变纤维尺寸的基因的影响。

纤维参数选择标准

在表6.1中，列出了用于纤维选择标准的表型中所用的缩写。

表6.1：用于表型的缩写

AFL：野生型群体和每个构建组群体的平均纤维长度

AFW：野生型群体和每个构建组群体的平均纤维宽度

maxFL：野生型群体和每个构建组群体的最大纤维长度

maxFW：野生型群体和每个构建组群体的最大纤维宽度

minFL：野生型群体和每个构建组群体的最小纤维长度

minFW：野生型群体和每个构建组群体的最小纤维宽度

将在上述任何纤维参数中显示与野生型群体有差异的构建组评价为生长特性改变的构建组，因此相应的基因可用于改变这些特性。

纤维尺寸提高10％或减少15％具有工业意义，因此使用下文的选择标准来选择可用于改变纤维尺寸的基因。

纤维参数选择标准如下：

1.如果构建组AFL比相应的野生型组AFL至少高10％，或

2.如果构建组AFW比相应的野生型组AFW至少高10％，或

3.如果构建组maxFL比相应的野生型组maxFL至少高10％，或

4.如果构建组maxFW比相应的野生型组maxFW至少高10％，或

5.如果构建组AFL比相应的野生型组AFL至少低15％，或

6.如果构建组AFW比相应的野生型组AFW至少低15％，或

7.如果构建组minFL比相应的野生型组minFL至少低15％，或

8.如果构建组minFW比相应的野生型组minFW至少低15％。

选择满足这些标准中一项或多项的构建组。

根据构建组给出下列结果。

构建组TF0002

该构建体诱导纤维参数的变化。最大纤维宽度比相应的最大野生型高16％。TF0002构建组满足纤维参数选择标准(4)。

表6.2含有所述构建组和相应野生型组的纤维测量数据。

表6.2

表6.3中给出了纤维测量的结果：所述构建组相比于相应野生型组的平均纤维长度(AFL)、平均纤维宽度(AFW)、最大纤维长度(maxFL)、最大纤维宽度(maxFW)、最小纤维长度(minFL)、最小纤维宽度(minFW)的比值。

表6.3

构建组TF0052

该构建体诱导纤维参数的变化。平均纤维宽度比相应的平均野生型高13％。最大纤维宽度比相应的最大野生型高22％。TF0052构建组满足纤维参数选择标准(2)和(4)。

表6.4含有所述构建组和相应野生型组的纤维测量数据。

表6.4

表6.5中给出了纤维测量的结果：所述构建组相比于相应野生型组的平均纤维长度(AFL)、平均纤维宽度(AFW)、最大纤维长度(maxFL)、最大纤维宽度(maxFW)、最小纤维长度(minFL)、最小纤维宽度(minFW)的比值。

表6.5

构建组TF0058

该构建体诱导纤维参数的变化。平均纤维宽度比相应的野生型高16％。最大纤维宽度比相应的最大野生型高23％。TF0058构建组满足纤维参数选择标准(2)和(4)。

表6.6含有所述构建组和相应野生型组的纤维测量数据。

表6.6

表6.7中给出了纤维测量的结果：所述构建组相比于相应野生型组的平均纤维长度(AFL)、平均纤维宽度(AFW)、最大纤维长度(maxFL)、最大纤维宽度(maxFW)、最小纤维长度(minFL)、最小纤维宽度(minFW)的比值。

表6.7

构建组TF0097

该构建体诱导纤维参数的变化。最大纤维宽度比相应的最大野生型高13％。TF0097构建组满足纤维参数选择标准(4)。

表6.8含有所述构建组和相应野生型组的纤维测量数据。

表6.8

表6.9中给出了纤维测量的结果：所述构建组相比于相应野生型组的平均纤维长度(AFL)、平均纤维宽度(AFW)、最大纤维长度(maxFL)、最大纤维宽度(maxFW)、最小纤维长度(minFL)、最小纤维宽度(minFW)的比值。

表6.9

构建组TF0109

该构建体诱导纤维参数的变化。平均纤维长度比相应的野生型高11％。最大纤维长度比相应的最大野生型高25％。最大纤维宽度比相应的最大野生型高23％。TF0109构建组满足纤维参数选择标准(1)、(3)和(4)。

表6.10含有所述构建组和相应野生型组的纤维测量数据。

表6.10

表6.11中给出了纤维测量的结果：所述构建组相比于相应野生型组的平均纤维长度(AFL)、平均纤维宽度(AFW)、最大纤维长度(maxFL)、最大纤维宽度(maxFW)、最小纤维长度(minFL)、最小纤维宽度(minFW)的比值。

表6.11

构建组TF0116

该构建体诱导纤维参数的变化。平均纤维宽度比相应的野生型高11％。最大纤维宽度比相应的最大野生型高20％。TF0116构建组满足纤维参数选择标准(2)和(4)。

表6.12含有所述构建组和相应野生型组的纤维测量数据。

表6.12

表6.13中给出了纤维测量的结果：所述构建组相比于相应野生型组的平均纤维长度(AFL)、平均纤维宽度(AFW)、最大纤维长度(maxFL)、最大纤维宽度(maxFW)、最小纤维长度(minFL)、最小纤维宽度(minFW)的比值。

表6.13

构建组TFSTT001

该构建体诱导纤维参数的变化。平均纤维宽度比相应的野生型低14％。最小纤维长度比相应的最小野生型低17％。最小纤维宽度比相应的最小野生型低30％。TFSTT001构建组满足纤维参数选择标准(7)和(8)。

表6.14含有所述构建组和相应野生型组的纤维测量数据。

表6.14

表6.15中给出了纤维测量的结果：所述构建组相比于相应野生型组的平均纤维长度(AFL)、平均纤维宽度(AFW)、最大纤维长度(maxFL)、最大纤维宽度(maxFW)、最小纤维长度(minFL)、最小纤维宽度(minFW)的比值。

表6.15

构建组TFSTT004

该构建体诱导纤维参数的变化。平均纤维宽度比相应的野生型高15％。最大纤维宽度比相应的最大野生型高29％。TFSTT004构建组满足纤维参数选择标准(2)和(4)。

表6.16含有所述构建组和相应野生型组的纤维测量数据。

表6.16

表6.17中给出了纤维测量的结果：所述构建组相比于相应野生型组的平均纤维长度(AFL)、平均纤维宽度(AFW)、最大纤维长度(maxFL)、最大纤维宽度(maxFW)、最小纤维长度(minFL)、最小纤维宽度(minFW)的比值。

表6.17

构建组TFSTT017

该构建体诱导纤维参数的变化。最小纤维长度比相应的最小野生型低17％。TFSTT017构建组满足纤维参数选择标准(7)。

表6.18含有所述构建组和相应野生型组的纤维测量数据。

表6.18

表6.19中给出了纤维测量的结果：所述构建组相比于相应野生型组的平均纤维长度(AFL)、平均纤维宽度(AFW)、最大纤维长度(maxFL)、最大纤维宽度(maxFW)、最小纤维长度(minFL)、最小纤维宽度(minFW)的比值。

表6.19

构建组TFSTT038

该构建体诱导纤维参数的变化。平均纤维宽度比相应的野生型高16％。最大纤维宽度比相应的最大野生型高21％。TFSTT038构建组满足纤维参数选择标准(2)和(4)。

表6.20含有所述构建组和相应野生型组的纤维测量数据。

表6.20

表6.21中给出了纤维测量的结果：所述构建组相比于相应野生型组的平均纤维长度(AFL)、平均纤维宽度(AFW)、最大纤维长度(maxFL)、最大纤维宽度(maxFW)、最小纤维长度(minFL)、最小纤维宽度(minFW)的比值。

表6.21

实施例7

用于烟草转化的所选构建体

烟草转化

基于来自杨树实验的生长数据，使用一组所选构建体(即CaMV35S：过表达DNA构建体TF0097、TF0132和TFSTT019)转化进烟草(Nicotiana tabacum cV.SR1)中。转化植物，基本上如Nilsson等(1992)所述进行再生，不同在于使用叶盘外植体。

每种构建体产生约10-15个独立的品系。使用一种构建体产生的一组这样的转基因植物下文称为“构建组”，例如，不同的转基因植物来源于同一构建体。每个构建组中的每个转基因品系(例如TF0555-01、TF0555-02、TF0555-03等)是不同的转化事件，因此很可能具有插入到植物基因组中不同位置的重组DNA。这使得同一构建组中不同的品系有部分差异。例如，已知不同的转化事件会产生具有不同水平的基因过表达的植物。

植物培养

将转基因烟草(包含三个构建组，各具有9-15个独立的品系)与14个野生型对照植物一起培养在温室中，18h的光周期，温度为22℃／18℃(白天／夜晚)。用1：100稀释的Weibulls Rika S NPK7-1-5(终浓度NO₃，55g／l；NH₄，29g／l；P，12g／l；K，56g／l；Mg7.2g／l；S，7.2g／l；B，0.18g／l；Cu，0.02g／l；Fe，0.84g／l；Mn，0.42g／l；Mo，0.03g／l；Zn，0.13g／L)给植物施肥。在温室培养过程中定期测量植物高度和直径。

在烟草转化体中观察到的生长作用包括用构建体TF0132转化的烟草植物更快的再生，其中再生的小植株在早期组织培养阶段中具有明显更大的叶。另外，在用任何所选构建体(即TF0097、TF0132或TFSTT019)转化的烟草植物中，观察到了比野生型SR1更长时期的营养生长，因此开花更晚。

以下内容对应于原申请的权利要求书：

1.产生与其野生型相比生长和/或生物质受到调节的植物的方法，其包括改变该植物中至少一种基因的基因产物水平，所述基因包含选自下列的核苷酸序列：

a)SEQ ID NO：1-13、97-115的核苷酸序列；

b)与SEQ ID NO：1-13、97-115的核苷酸序列具有至少60％同一性的核苷酸序列；

c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。

2.根据实施方案1的方法，所述方法步骤包括：

(i)提供包含选自下列的核苷酸序列的表达载体

a)SEQ ID NO：1-13、97-115的核苷酸序列；或

b)与SEQ ID NO：1-13、97-115的核苷酸序列具有至少60％同一性的核苷酸序列；或

c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段，以及

(ii)将所述表达载体引入至少一种植物中；和

(iii)选择与其野生型相比生长和/或生物质受到调节的至少一种转基因植物。

3.根据实施方案1的方法，其包括

i)选择表达选自下列的至少一种核苷酸序列的植物物种

a)SEQ ID NO：1-13、97-115的核苷酸序列；

c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段，

ii)将i)中选择的植物物种与i)中选择的相同或另一植物物种进行杂交，

iii)选择与i)中所选植物物种相比至少一种选自下列的核苷酸序列的表达受到调节的植物

a)SEQ ID NO：1-13、97-115的核苷酸序列；

c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段，

iv)任选地，将iii)中所得植物回交一次或多次，并选择与任何i)中所用植物物种和/或iii)中所得植物相比至少一种选自下列的核苷酸序列的表达受到调节的植物

a)SEQ ID NO：1-13、97-115的核苷酸序列；

c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。

4.根据实施方案1-3中任一项的方法，其中所述受到调节的表达通过引入遗传修饰来实现，优选在编码包含SEQ ID NO：1-13、97-115多肽或这些多肽之同源物的基因座中引入。

5.根据实施方案4的方法，其中所述修饰通过下列之一来实现：使用SEQ ID NO：1-13、97-115中一种或多种作为该方法任何步骤中的标记物的T-DNA活化、TILLING、同源重组、定点诱变或定向育种。

6.根据实施方案1-4中任一项的方法，其中所述调节是生长和/或生物质的产量提高。

7.根据实施方案1、2、4-6中任一项的方法，其包括提供重组DNA构建体的步骤，所述构建体包含选自下列的核苷酸序列：

a)包含选自SEQ ID NO：1-13、97-115之序列的核苷酸序列；

b)与核苷酸序列a)互补的核苷酸序列；

c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段；

d)与a)、b)和c)中任一序列具有至少60％同一性的核酸序列；和

e)在严格条件下与核苷酸序列a)、b)或c)杂交的核苷酸序列。

8.根据实施方案l、2、4-7中任一项的方法，其中所述核苷酸序列编码包含多肽(a)的保守性替换变体的多肽。

9.根据实施方案1、2、4-8中任一项的方法，其中所述核苷酸序列包含核苷酸序列中的沉默替换。

10.根据实施方案1、2、4-9中任一项的方法，其中所述子序列或片段与实施方案7的(a)中所述核苷酸序列的保守结构域具有至少65％的序列同一性。

11.根据实施方案7至10中任一项的方法，其中所述重组DNA构建体还包含与所述核苷酸序列有效连接的组成型、诱导型或组织特异性启动子。

12.根据实施方案7至10中任一项的方法，其中所述重组DNA构建体在包含实施方案7所定义核苷酸序列的转录盒之前还包含强组成型启动子，所述转录盒之后是植物功能性内含子，之后是反向的实施方案4中所定义核苷酸序列。

13.根据实施方案7至12中任一项的方法，其中所述方法还包括用所述重组DNA构建体转化植物的可再生细胞以及从所述转化细胞再生转基因植物的步骤。

14.与其野生型相比生长和/或生物质受到调节的植物，其包含能够改变该植物中至少一种基因的基因产物水平的核苷酸，其中所述至少一种基因包含选自下列的核苷酸序列：

a)SEQ ID NO：1-13、97-115的核苷酸序列；

c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。

15.转基因植物，其包含重组多核苷酸(DNA构建体)，所述重组多核苷酸(DNA构建体)包含选自下列的核苷酸序列：

a)包含选自SEQ ID NO：1-13、97-115之序列的核苷酸序列；

b)与核苷酸序列a)互补的核苷酸序列；

c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段；

d)与a)、b)和c)中任一序列具有至少60％同一性的核酸序列；和

e)在严格条件下与核苷酸序列a)、b)或c)杂交的核苷酸序列。

16.根据实施方案15的转基因植物，其中所述核苷酸序列编码包含a)或d)多肽之保守性替换变体的多肽。

17.根据实施方案15至16中任一项的转基因植物，其中核苷酸序列包含核苷酸序列中的沉默替换。

18.根据实施方案15至17中任一项的转基因植物，其中所述子序列或片段与实施方案16所述核苷酸序列的保守结构域具有至少65％的序列同一性。

19.根据实施方案15至18中任一项的转基因植物，其中所述重组DNA构建体还包含与所述核苷酸序列有效连接的组成型、诱导型或组织特异性启动子。

20.根据实施方案14至19中任一项的转基因植物，其中所述重组DNA构建体在包含实施方案4中所定义核苷酸序列的转录盒之前还包含强组成型启动子，所述转录盒之后是植物功能性内含子，之后是反向的实施方案16中所定义核苷酸序列。

21.植物的植物细胞或植物后代，所述植物可以是根据实施方案14至20中任一项的转基因植物。

22.植物生产的木材，所述植物可以是根据实施方案14至20中任一项的转基因植物。

23.DNA构建体，其包含实施方案7至10所述的至少一种序列。

24.植物细胞或植物后代，其包含实施方案23的DNA构建体。

25.实施方案1-24中任一项的核苷酸序列，其中所述a)的序列选自SEQ ID NO：1、4、6、7、9、10、101、102、104、106和107。参考文献：

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WO96／06166

WO98／53057

WO98／53083

WO99／53050

WO99／61631

Claims

1.产生与其野生型相比生长和／或生物质受到调节的植物的方法，其包括改变该植物中至少一种基因的基因产物水平，所述基因包含选自下列的核苷酸序列：

a)SEQ ID NO：1-10、12、13、97-115的核苷酸序列；

b)与SEQ ID NO：1-10、12、13、97-115的核苷酸序列具有至少60％同一性的核苷酸序列；

c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。

2.根据权利要求1的方法，所述方法步骤包括：

(i)提供包含选自下列的核苷酸序列的表达载体

a)SEQ ID NO：1-10、12、13、97-115的核苷酸序列；或

b)与SEQ ID NO：1-10、12、13、97-115的核苷酸序列具有至少60％同一性的核苷酸序列；或

c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段，以及

(ii)将所述表达载体引入至少一种植物中；和

3.根据权利要求1的方法，其包括

i)选择表达选自下列的至少一种核苷酸序列的植物物种

a)SEQ ID NO：1-10、12、13、97-115的核苷酸序列；

c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段，

a)SEQ ID NO：1-10、12、13、97-115的核苷酸序列；

c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段，

a)SEQ ID NO：1-10、12、13、97-115的核苷酸序列；

c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。

4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述受到调节的表达通过引入遗传修饰来实现，优选在编码包含SEQ ID NO：1-10、12、13、97-115多肽或这些多肽之同源物的基因座中引入。

5.根据权利要求4的方法，其中所述修饰通过下列之一来实现：使用SEQ ID NO：1-10、12、13、97-115中一种或多种作为该方法任何步骤中的标记物的T-DNA活化、TILLING、同源重组、定点诱变或定向育种。

6.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述调节是生长和/或生物质的产量提高。

7.根据权利要求1、2、4-6中任一项的方法，其包括提供重组DNA构建体的步骤，所述构建体包含选自下列的核苷酸序列：

a)包含选自SEQ ID NO：1-10、12、13、97-115之序列的核苷酸序列；

b)与核苷酸序列a)互补的核苷酸序列；

c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段；

d)与a)、b)和c)中任一序列具有至少60％同一性的核酸序列；和

e)在严格条件下与核苷酸序列a)、b)或c)杂交的核苷酸序列。

8.根据权利要求1、2、4-7中任一项的方法，其中所述核苷酸序列编码包含多肽(a)的保守性替换变体的多肽。

9.根据权利要求1、2、4-8中任一项的方法，其中所述核苷酸序列包含核苷酸序列中的沉默替换。

10.根据权利要求1、2、4-9中任一项的方法，其中所述子序列或片段与权利要求7的(a)中所述核苷酸序列的保守结构域具有至少65％的序列同一性。

11.根据权利要求7至10中任一项的方法，其中所述重组DNA构建体还包含与所述核苷酸序列有效连接的组成型、诱导型或组织特异性启动子。

12.根据权利要求7至10中任一项的方法，其中所述重组DNA构建体在包含权利要求7所定义核苷酸序列的转录盒之前还包含强组成型启动子，所述转录盒之后是植物功能性内含子，之后是反向的权利要求4中所定义核苷酸序列。

13.根据权利要求7至12中任一项的方法，其中所述方法还包括用所述重组DNA构建体转化植物的可再生细胞以及从所述转化细胞再生转基因植物的步骤。

14.与其野生型相比生长和／或生物质受到调节的植物，其包含能够改变该植物中至少一种基因的基因产物水平的核苷酸，其中所述至少一种基因包含选自下列的核苷酸序列：

a)SEQ ID NO：1-10、12、13、97-115的核苷酸序列；

b)与SEQ ID NO：1-10、12、13、97-115的核苷酸序列有至少60％同一性的核苷酸序列；

c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段。

a)包含选自SEQ ID NO：1-10、12、13、97-115之序列的核苷酸序列；

b)与核苷酸序列a)互补的核苷酸序列；

c)核苷酸序列a)或b)的子序列或片段；

d)与a)、b)和c)中任一序列具有至少60％同一性的核酸序列；和

e)在严格条件下与核苷酸序列a)、b)或c)杂交的核苷酸序列。

16.根据权利要求15的转基因植物，其中所述核苷酸序列编码包含a)或d)多肽之保守性替换变体的多肽。

17.根据权利要求15至16中任一项的转基因植物，其中核苷酸序列包含核苷酸序列中的沉默替换。

18.根据权利要求15至17中任一项的转基因植物，其中所述子序列或片段与权利要求16所述核苷酸序列的保守结构域具有至少65％的序列同一性。

19.根据权利要求15至18中任一项的转基因植物，其中所述重组DNA构建体还包含与所述核苷酸序列有效连接的组成型、诱导型或组织特异性启动子。

20.根据权利要求14至19中任一项的转基因植物，其中所述重组DNA构建体在包含权利要求4中所定义核苷酸序列的转录盒之前还包含强组成型启动子，所述转录盒之后是植物功能性内含子，之后是反向的权利要求16中所定义核苷酸序列。

21.植物的植物细胞或植物后代，所述植物可以是根据权利要求14至20中任一项的转基因植物。

22.植物生产的木材，所述植物可以是根据权利要求14至20中任一项的转基因植物。

23.DNA构建体，其包含权利要求7至10所述的至少一种序列。

24.植物细胞或植物后代，其包含权利要求23的DNA构建体。

25.权利要求1-24中任一项的核苷酸序列，其中所述a)的序列选自SEQID NO：1、4、6、7、9、10、101、102、104、106和107。