JP2018537979A - タバコ遺伝子ＮｔＴＣＴＰの、植物における抗ジャガイモＹウイルスへの応用 - Google Patents
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本発明は、タバコ遺伝子ＮｔＴＣＴＰの、植物における抗ジャガイモＹウイルス（ＰＶＹ）への応用に関するものである。前記タバコ遺伝子ＮｔＴＣＴＰの全長が５０７ｂｐであり、１６８個のアミノ酸を含む一つのタンパク質をコードし、その活性はタバコのＰＶＹに対する抵抗性に密接に関係している。タバコにおいて当該遺伝子をサイレンシングさせると、タバコはＰＶＹに対してより強い抵抗性を示し、免疫レベルにまで到達でき、タバコにおいて当該遺伝子を過剰に発現させると、タバコはＰＶＹに対してより敏感になる。当該遺伝子は、抗ＰＶＹタバコなどの植物の育種に使用できる。
【選択図】なし
【選択図】なし
Description
本願は、２０１５年１２月１日に提出された、出願番号が２０１５１０８５８８５９．０である中国特許出願の優先権を主張し、参照により前記出願で開示された全ての内容を本願に援用する。
本発明は植物遺伝子工学の分野に属すものであり、具体的には、タバコ遺伝子ＮｔＴＣＴＰの、植物における抗ジャガイモＹウイルスへの応用に関するものである。
翻訳制御された腫瘍タンパク質（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＴＣＴＰ）はｐ２１またはｐ２３とも呼ばれ、真核生物において一般的に発現し、分布する一種のタンパク質である。ＴＣＴＰは最初に哺乳動物の腫瘍細胞で発見され、そのレベルは転写後に調節される。
複数種類の生物に対する大量の研究により、ＴＣＴＰが、例えば、ヒスタミン放出の促進、アポプトーシス、微小管の集合、イオンバランスなどの複数種類の細胞学的過程に関与するもので、ポロキナーゼ、チューブリン、アクチン及びナトリウムカリウムＡＴＰアーゼ酵素などの一連のタンパク質と相互作用するものであることが見出された。動物において、ＴＣＴＰは細胞の増殖と分化、悪性形質転換、ストレス耐性及びアポプトーシスなどに関与するものである。ＴＣＴＰ遺伝子がノックアウトされたマウスは、細胞分化の欠如と過度なアポプトーシスのため、マウスの胚胎に致死現象が現れる。ショウジョウバエにおいて、ある特定の器官におけるＴＣＴＰの発現が中断された後、当該器官の細胞数が低下し、細胞の増殖に欠陥が生じ、その結果、当該器官が小さくなる。植物において、ＴＣＴＰ ｍＲＮＡの発現は有糸分裂と密接に関係し、暗闇はアサガオにおけるｍＲＮＡの蓄積を誘導できる。なお、ＴＣＴＰタンパク質は、師部タンパク質の長距離輸送及び花粉管の成長を調節する過程において、重要な役割を果たしている。近来の研究では、シロイヌナズナにおいて、ＴＣＴＰが有糸分裂による増殖の正の調節因子として、細胞周期の時間を特異的に調節できることが見出された。ＴＣＴＰはＴＯＲ（Ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ）による増殖の調節径路により細胞の分化を調節する。キャベツに対する研究では、ＴＣＴＰが成長および発達を制御するとともに、外部環境によって誘導されることが見出された。これら既存の研究によって、ＴＣＴＰが有機体の成長と発達を制御できるだけでなく、植物の専属的な機能も有することが示され、よって、この種類の遺伝子のＰＶＹに対する抵抗性の研究は、重要な意義を持つ。
植物ゲノムにおける抗ジャガイモＹウイルス（ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ、ＰＶＹ）の遺伝子を探究することは、抗ウイルス植物の育種の鍵である。
本発明の目的は、タバコ遺伝子ＮｔＴＣＴＰの、植物における抗ジャガイモＹウイルスへの応用を提供することである。
本発明の目的を実現するため、本発明のタバコ遺伝子ＮｔＴＣＴＰの活性はタバコのＰＶＹに対する抵抗性に密接に関係し、遺伝子配列は下記のとおりである。
i）配列番号１で表されるヌクレオチド配列；または
ii）配列番号１で表されるヌクレオチド配列の一つ又は複数のヌクレオチドが置換、欠失及び/または付加され、かつ同じ機能タンパク質を発現するヌクレオチド配列；または
iii）０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＰＥまたは０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ溶液において、６５℃でハイブリダイズし、当該溶液で膜を洗浄するというストリンジェントな条件下で、配列番号１で表される配列とハイブリダイズし、かつ同じ機能タンパク質を発現するヌクレオチド配列；または
iv）i）、ii）またはiii）のヌクレオチド配列と９０％以上の相同性を有し、かつ同じ機能タンパク質を発現するヌクレオチド配列。
i）配列番号１で表されるヌクレオチド配列；または
ii）配列番号１で表されるヌクレオチド配列の一つ又は複数のヌクレオチドが置換、欠失及び/または付加され、かつ同じ機能タンパク質を発現するヌクレオチド配列；または
iii）０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＰＥまたは０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ溶液において、６５℃でハイブリダイズし、当該溶液で膜を洗浄するというストリンジェントな条件下で、配列番号１で表される配列とハイブリダイズし、かつ同じ機能タンパク質を発現するヌクレオチド配列；または
iv）i）、ii）またはiii）のヌクレオチド配列と９０％以上の相同性を有し、かつ同じ機能タンパク質を発現するヌクレオチド配列。
また、本発明は前記遺伝子ＮｔＴＣＴＰがコードするタンパク質を提供し、そのアミノ酸配列は配列番号２に示すとおりである。
また、本発明は前記遺伝子ＮｔＴＣＴＰの、タバコにおける抗ジャガイモＹウイルス（ＰＶＹ）への応用を提供する。即ち、タバコ遺伝子ＮｔＴＣＴＰをタバコのＰＶＹに対する抵抗性の調節に用いる。前記ジャガイモＹウイルスはＰＶＹ壊死株系（Ｎ株系）を含む。
前記の応用はＲＮＡｉ技術によりタバコにおける遺伝子ＮｔＴＣＴＰをサイレンシングさせるものである。例えば、配列番号３で表されるヌクレオチド配列を植物発現ベクターにクローニングした後、アグロバクテリウム媒介形質転換方法で組み換え発現ベクターをタバコに導入し、トランスジェニックタバコ株をスクリーニングすることができる。前記植物発現ベクターがｐＢｉｎ４３８であることが好ましい。
また、本発明はトランスジェニックタバコ株の構築方法を提供し、当該方法は、まず、前記遺伝子ＮｔＴＣＴＰのＲＮＡｉ発現ベクターを構築し、次に、アグロバクテリウム媒介形質転換方法により組み換え発現ベクターをタバコに導入し、トランスジェニックタバコ株をスクリーニングするものである。開始ベクター（ｓｔａｒｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）がｐＢｉｎ４３８であることが好ましい。
また、本発明は前記遺伝子ＮｔＴＣＴＰのタバコ品種の改良への応用を提供する。
また、本発明は前記遺伝子ＮｔＴＣＴＰの抗ＰＶＹタバコの育種への応用を提供する。
さらに、本発明はタバコ遺伝子ＮｔＴＣＴＰを抑制する発現カセットを有する発現ベクターを提供する。
前記発現ベクターが、配列番号３で表されるヌクレオチド配列を有することが好ましい。
本発明では、クローニングにより、タバコから全長が５０７ｂｐであり、１６８個のアミノ酸を含む一つのタンパク質をコードする翻訳制御された腫瘍タンパク質遺伝子ＮｔＴＣＴＰを得、さらに、タバコの抗ＰＶＹ過程における当該遺伝子の役割について研究した。栽培したタバコにおいて当該遺伝子をサイレンシングさせると、タバコはＰＶＹに対してより強い抵抗性を示し、免疫レベルにまで達成でき、栽培したタバコにおいて当該遺伝子を過剰に発現させると、タバコはＰＶＹに対してより敏感になる。これにより、タバコの抗ＰＶＹ過程において、当該遺伝子が重要な役割を果たし、抗ＰＶＹタバコなどの植物の育種に用いられることが実証されている。
本発明は、遺伝子ＮｔＴＣＴＰのＲＮＡｉ発現ベクターを構築し、アグロバクテリウム媒介形質転換によりタバコに対して遺伝子の形質転換を行い、その結果により、当該遺伝子がタバコにおいてサイレンシングされた後、タバコのＰＶＹに対する抵抗性が向上し、抵抗性が５０％〜８０％向上できることが実証されている。
以下の実施例により本発明を説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。特に断りがない限り、実施例はいずれも通常の実験条件、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなどの分子クローニング実験ハンドブック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ ＤＷ、 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２００１）、或いはメーカーの説明書に記載される推奨条件に基づくものである。
実施例１ タバコ遺伝子ＮｔＴＣＴＰのクローニング
一、材料と方法
１．実験材料
１．１ 栽培したタバコの品種は「山西煙」であり、貴州省タバコ科学研究院育種工程センターより提供されたものである。
１．２ 試薬
タカラバイオ株式会社から購入したＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと制限エンドヌクレアーゼ。ＴＩＡＮＧＥＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入したＤＮＡゲル精製回収キット。ニュー・イングランド・バイオラボ社から購入したＴ４ ＤＮＡリガーゼ。プロメガ社から購入したｐＧＥＭ−Ｔ ｖｅｃｔｏｒ。アプライドバイオシステムズ社から購入したＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６−Ｗｅｌｌ Ｒｅａｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅｓ、Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃａｐｓ。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＥＨＡ１０５、植物発現ベクターｐＢｉｎ４３８はいずれも市販品である。ＤＮＡの合成及び塩基配列決定はＢＧＩ Ｔｅｃｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により完成された。
一、材料と方法
１．実験材料
１．１ 栽培したタバコの品種は「山西煙」であり、貴州省タバコ科学研究院育種工程センターより提供されたものである。
１．２ 試薬
タカラバイオ株式会社から購入したＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと制限エンドヌクレアーゼ。ＴＩＡＮＧＥＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入したＤＮＡゲル精製回収キット。ニュー・イングランド・バイオラボ社から購入したＴ４ ＤＮＡリガーゼ。プロメガ社から購入したｐＧＥＭ−Ｔ ｖｅｃｔｏｒ。アプライドバイオシステムズ社から購入したＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６−Ｗｅｌｌ Ｒｅａｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅｓ、Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃａｐｓ。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＥＨＡ１０５、植物発現ベクターｐＢｉｎ４３８はいずれも市販品である。ＤＮＡの合成及び塩基配列決定はＢＧＩ Ｔｅｃｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により完成された。
２．実験の方法
ＮＣＢＩにログインし、ＧｅｎｂａｎｋにおけるタバコＴＣＴＰ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ：ＫＭ５０７３２７．１）の全長配列に基づき、遺伝子の全長を増幅させるプライマーを設計し、酵素切断部位であるＢａｍＨ IとＳａｌ Iを添加した。設計されたプライマーの配列は下記のとおりである。
ＮＣＢＩにログインし、ＧｅｎｂａｎｋにおけるタバコＴＣＴＰ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ：ＫＭ５０７３２７．１）の全長配列に基づき、遺伝子の全長を増幅させるプライマーを設計し、酵素切断部位であるＢａｍＨ IとＳａｌ Iを添加した。設計されたプライマーの配列は下記のとおりである。
２．２ タバコ遺伝子ＮｔＴＣＴＰの全長の増幅
「山西煙」の葉の全ＲＮＡを抽出し、逆転写でｃＤＮＡの第一鎖を合成して、０．２ｍｌの遠心チューブに下記の試薬を添加し、ＰＣＲ反応を行った。
「山西煙」の葉の全ＲＮＡを抽出し、逆転写でｃＤＮＡの第一鎖を合成して、０．２ｍｌの遠心チューブに下記の試薬を添加し、ＰＣＲ反応を行った。
ＰＣＲ反応の手順：蓋を加熱し、９５℃で初期変性を５分間行った；その後、９５℃での３０秒間の変性、５５℃での３０秒間のアニーリング、７２℃での３０秒間の伸長を、３５サイクル行った。
増幅により得られたＤＮＡフラグメントの塩基配列決定を行い、その結果は配列番号１に示すとおりである。
実施例２ タバコ遺伝子ＮｔＴＣＴＰのトランスジェニック株系の構築
１．過剰発現遺伝子ＮｔＴＣＴＰベクターの構築
１．１ 植物発現ベクターｐＢｉｎ４３８と全長が増幅したＰＣＲ産物をそれぞれＳａｌ IとＢａｍＨ Iで二重消化させ、酵素消化システムは下記のとおりである。
１．過剰発現遺伝子ＮｔＴＣＴＰベクターの構築
１．１ 植物発現ベクターｐＢｉｎ４３８と全長が増幅したＰＣＲ産物をそれぞれＳａｌ IとＢａｍＨ Iで二重消化させ、酵素消化システムは下記のとおりである。
１．２ 酵素消化産物を１％アガロースゲル電気泳動で検出し、ＰＣＲ酵素消化産物及びベクターｐＢｉｎ４３８の大きなフラグメントを回収して連結させた。回収した産物を下記の割合で一定方向にて連結させた。連結システムは下記のとおりである。
連結の効率を向上させるため、連結を１６℃で１６時間または１６時間以上行った。
１．３ 組み換えプラスミドによるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの形質転換
１）０．５〜１．０μＬのＤＮＡを取り出し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのコンピテント細胞に加え、軽く混合させ、５分間氷浴を行い、速やかに液体窒素に投入し、５分間冷凍させた；
２）３７℃の水浴で融解させた後、８００μＬのＹＥＢ液体培地を加え、２８℃、１００ｒ／ｍｉｎで４時間の振とう培養を行った；
３）４０００ｒ／ｍｉｎで５分間遠心させ、１００μＬ程度残るように大部分の上清を除去し、菌体を懸濁させた；
４）４０ｍｇ／Ｌのリファンピシン（Ｒｉｆ）、５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン（Ｓｍ）、及び１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン（Ｋｍ）を含有する固体ＹＥＢ培地に塗布し、２８℃で４８〜９６時間培養した。
１．３ 組み換えプラスミドによるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの形質転換
１）０．５〜１．０μＬのＤＮＡを取り出し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのコンピテント細胞に加え、軽く混合させ、５分間氷浴を行い、速やかに液体窒素に投入し、５分間冷凍させた；
２）３７℃の水浴で融解させた後、８００μＬのＹＥＢ液体培地を加え、２８℃、１００ｒ／ｍｉｎで４時間の振とう培養を行った；
３）４０００ｒ／ｍｉｎで５分間遠心させ、１００μＬ程度残るように大部分の上清を除去し、菌体を懸濁させた；
４）４０ｍｇ／Ｌのリファンピシン（Ｒｉｆ）、５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン（Ｓｍ）、及び１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン（Ｋｍ）を含有する固体ＹＥＢ培地に塗布し、２８℃で４８〜９６時間培養した。
２．サイレンシングベクターの構築
タバコ遺伝子ＮｔＴＣＴＰにおける第１ｂｐから３３０ｂｐまでの３３０ｂｐのフラグメントの順方向配列と逆相補鎖配列を中間配列により連結させ、ＢａｍＨ IとＳａｌ Iの酵素切断部位を添加し、設計された配列はＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により合成され、合成された配列は配列番号３に示すとおりである。合成フラグメントをＢａｍＨ IとＳａｌ Iで酵素消化させ、それを同じように酵素消化されたｐＢｉｎ４３８ベクターと連結させ、最終のサイレンシングベクターを構築した。
タバコ遺伝子ＮｔＴＣＴＰにおける第１ｂｐから３３０ｂｐまでの３３０ｂｐのフラグメントの順方向配列と逆相補鎖配列を中間配列により連結させ、ＢａｍＨ IとＳａｌ Iの酵素切断部位を添加し、設計された配列はＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により合成され、合成された配列は配列番号３に示すとおりである。合成フラグメントをＢａｍＨ IとＳａｌ Iで酵素消化させ、それを同じように酵素消化されたｐＢｉｎ４３８ベクターと連結させ、最終のサイレンシングベクターを構築した。
３．Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介形質転換によるタバコの遺伝子形質転換
タバコのリーフディスクに対して２〜３日の前培養を行った後、植物発現ベクターを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＥＨＡ１０５でそれぞれ感染させた。３〜４日の共培養を行った後、リーフディスクを取り出し、除菌剤を含む液体培地で２〜３時間の除菌を行った後、スクリーニング培地に移してスクリーニング及び分化培養を行い、約３週間後分化し始め、抵抗性のある芽が出た。抵抗性のある芽が３〜４ｃｍの高さに成長した際に、それを外植片の基部から切り取って、発根培地に接種し、発根培養を行った。小植物の根が発達した後、順化・移植を行った。移植後にも生存する大量の、抵抗性を有する植物を得た。種を得るまで、ＰＣＲ検出の結果が陽性である植物を大きな植木鉢に移植した。
タバコのリーフディスクに対して２〜３日の前培養を行った後、植物発現ベクターを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＥＨＡ１０５でそれぞれ感染させた。３〜４日の共培養を行った後、リーフディスクを取り出し、除菌剤を含む液体培地で２〜３時間の除菌を行った後、スクリーニング培地に移してスクリーニング及び分化培養を行い、約３週間後分化し始め、抵抗性のある芽が出た。抵抗性のある芽が３〜４ｃｍの高さに成長した際に、それを外植片の基部から切り取って、発根培地に接種し、発根培養を行った。小植物の根が発達した後、順化・移植を行った。移植後にも生存する大量の、抵抗性を有する植物を得た。種を得るまで、ＰＣＲ検出の結果が陽性である植物を大きな植木鉢に移植した。
最小培地：ＭＳ培地、ｐＨ５．８、０．８％寒天
スクリーニング培地：最小培地＋２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍ＋１００ｍｇ／Ｌセファロスポリン
分化培地：最小培地+１．０ｍｇ／Ｌ ６−ＢＡ＋０．１ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ、ｐＨ５．８、０．７５％寒天
発根培地：ＭＳ培地＋０．５ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ、ｐＨ５．８、０．７５％寒天
遺伝子組み換え材料として、ＴＣＴＰ遺伝子過剰発現株系Ｏ２、Ｏ７；ＴＣＴＰ遺伝子サイレンシング株系Ｒｉ１６、Ｒｉ２０を得た。
スクリーニング培地：最小培地＋２５ｍｇ／Ｌ Ｋｍ＋１００ｍｇ／Ｌセファロスポリン
分化培地：最小培地+１．０ｍｇ／Ｌ ６−ＢＡ＋０．１ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ、ｐＨ５．８、０．７５％寒天
発根培地：ＭＳ培地＋０．５ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ、ｐＨ５．８、０．７５％寒天
遺伝子組み換え材料として、ＴＣＴＰ遺伝子過剰発現株系Ｏ２、Ｏ７；ＴＣＴＰ遺伝子サイレンシング株系Ｒｉ１６、Ｒｉ２０を得た。
実施例３ トランスジェニックタバコ株系のＰＶＹに対する抵抗性の研究
１．材料と方法
１．１ 実験の材料
実施例２で構築した遺伝子ＮｔＴＣＴＰが過剰に発現したトランスジェニックタバコ株系Ｏ２、Ｏ７。
実施例３で構築した遺伝子ＮｔＴＣＴＰがサイレンシングされたトランスジェニックタバコ株系Ｒｉ１６、Ｒｉ２０。
ＰＶＹ株はＰＶＹ壊死株系（Ｎ株系）である。
１．材料と方法
１．１ 実験の材料
実施例２で構築した遺伝子ＮｔＴＣＴＰが過剰に発現したトランスジェニックタバコ株系Ｏ２、Ｏ７。
実施例３で構築した遺伝子ＮｔＴＣＴＰがサイレンシングされたトランスジェニックタバコ株系Ｒｉ１６、Ｒｉ２０。
ＰＶＹ株はＰＶＹ壊死株系（Ｎ株系）である。
１．２ 実験の方法
１．２．１ ＰＶＹ接種物の調製：新鮮な病葉を破砕機に投入し、少量のリン酸緩衝液を入れて粉砕させ、病葉の残渣をガーゼでろ過し、新鮮な汁液を採取し、ＰＶＹ接種物を調製した。
１．２．２ ＰＶＹ接種：接種の時期がタバコの４葉期であり、接種待ちのタバコ株から２〜３枚の若葉を選び、サンドペーパーで軽く摩擦し、微小な傷を発生させた。そして、摩擦された葉にブラシでＰＶＹ接種物をブラッシングした。
１．２．３ データの調査：発病が最も重篤な時期を選び、ＰＶＹの罹患率及び病害レベルを調査した。
１．２．１ ＰＶＹ接種物の調製：新鮮な病葉を破砕機に投入し、少量のリン酸緩衝液を入れて粉砕させ、病葉の残渣をガーゼでろ過し、新鮮な汁液を採取し、ＰＶＹ接種物を調製した。
１．２．２ ＰＶＹ接種：接種の時期がタバコの４葉期であり、接種待ちのタバコ株から２〜３枚の若葉を選び、サンドペーパーで軽く摩擦し、微小な傷を発生させた。そして、摩擦された葉にブラシでＰＶＹ接種物をブラッシングした。
１．２．３ データの調査：発病が最も重篤な時期を選び、ＰＶＹの罹患率及び病害レベルを調査した。
病害レベルを以下の基準に従って調査した。
レベル０：株全体に病害がなく、または葉に極めてわずかな斑が現れた。
レベル１：１／１０〜１／３の葉において、軽微な小葉脈の壊死または点刻状条斑（ｓｔｉｐｐｌｅ ｓｔｒｅａｋ）の症状及びわずかな変形が現れたが、株全体における他の葉には症状がなく、植物には明らかな矮小化がなかった。
レベル２：１／３〜１／２の葉において点刻状条斑または葉脈の壊死が現れ、病葉の大部分の小葉脈が壊死し、その結果、葉において比較的に大きな面積の黄化、枯死が起こり、植物が正常な植物の高さの２／３以上までに矮小化した。
レベル３：１／２〜２／３の葉において比較的に深刻な葉脈の壊死が現れ、または２／３以上の葉において点刻状条斑の壊死が現れ、単一の葉において比較的に大きい面積の枯死が発生し、少部分の葉が落ちてしまった。あるいは、株全体の葉が黄色になり始めた。
レベル４：株全体の葉において深刻な葉脈の壊死または葉の変形、萎縮が現れ、２／３程度の葉が萎れ落ち、罹病株は正常なタバコ株の高さの１／２〜１／３までに矮小化し、若しくは株全体が枯れてしまった。
レベル０：株全体に病害がなく、または葉に極めてわずかな斑が現れた。
レベル１：１／１０〜１／３の葉において、軽微な小葉脈の壊死または点刻状条斑（ｓｔｉｐｐｌｅ ｓｔｒｅａｋ）の症状及びわずかな変形が現れたが、株全体における他の葉には症状がなく、植物には明らかな矮小化がなかった。
レベル２：１／３〜１／２の葉において点刻状条斑または葉脈の壊死が現れ、病葉の大部分の小葉脈が壊死し、その結果、葉において比較的に大きな面積の黄化、枯死が起こり、植物が正常な植物の高さの２／３以上までに矮小化した。
レベル３：１／２〜２／３の葉において比較的に深刻な葉脈の壊死が現れ、または２／３以上の葉において点刻状条斑の壊死が現れ、単一の葉において比較的に大きい面積の枯死が発生し、少部分の葉が落ちてしまった。あるいは、株全体の葉が黄色になり始めた。
レベル４：株全体の葉において深刻な葉脈の壊死または葉の変形、萎縮が現れ、２／３程度の葉が萎れ落ち、罹病株は正常なタバコ株の高さの１／２〜１／３までに矮小化し、若しくは株全体が枯れてしまった。
２．実験の結果
（１）異なるタバコ株系におけるＮｔＴＣＴＰ遺伝子の発現の検証
ウエスタンブロット検証により、２つのサイレンシング株系であるＲｉ１６とＲｉ２０において、ＴＣＴＰ遺伝子が発現していないことが証明され、よって、ＴＣＴＰ遺伝子をサイレンシングさせることに成功したことが実証された。一方、２つの過剰発現株系であるＯ２とＯ７の発現量がいずれもコントロール群（ＷＴ）を超えたため、ＴＣＴＰ遺伝子の過剰発現の構築にも成功したことが実証された。
（１）異なるタバコ株系におけるＮｔＴＣＴＰ遺伝子の発現の検証
ウエスタンブロット検証により、２つのサイレンシング株系であるＲｉ１６とＲｉ２０において、ＴＣＴＰ遺伝子が発現していないことが証明され、よって、ＴＣＴＰ遺伝子をサイレンシングさせることに成功したことが実証された。一方、２つの過剰発現株系であるＯ２とＯ７の発現量がいずれもコントロール群（ＷＴ）を超えたため、ＴＣＴＰ遺伝子の過剰発現の構築にも成功したことが実証された。
（２）ＮｔＴＣＴＰ遺伝子過剰発現株系とＮｔＴＣＴＰ遺伝子サイレンシング株系の耐病性の鑑定結果
接種した１４日後に、病状を調査した結果、サイレンシング株系であるＲｉ１６とＲｉ２０はいずれも免疫性を表し、発病しておらず、病状の指数が０であり、耐病性が大幅に向上した。一方、過剰発現株系であるＯ２とＯ７において、いずれも野生型コントロール群（ＷＴ）より深刻な壊死症状が現れ、病状がより深刻であった（図２）。そのうち、株系Ｏ２の病状の指数が９６．９７であり、Ｏ７の病状の指数が９１．９２であり、コントロール群である野生タバコの病状の指数が８５．８６であった。
接種した１４日後に、病状を調査した結果、サイレンシング株系であるＲｉ１６とＲｉ２０はいずれも免疫性を表し、発病しておらず、病状の指数が０であり、耐病性が大幅に向上した。一方、過剰発現株系であるＯ２とＯ７において、いずれも野生型コントロール群（ＷＴ）より深刻な壊死症状が現れ、病状がより深刻であった（図２）。そのうち、株系Ｏ２の病状の指数が９６．９７であり、Ｏ７の病状の指数が９１．９２であり、コントロール群である野生タバコの病状の指数が８５．８６であった。
以上の結果により、タバコにおいて、ＴＣＴＰ遺伝子をサイレンシングさせることで、ＰＶＹに対する植物の耐病性を向上でき、当該遺伝子が重要な応用価値を有することが実証されている。
上記において、一般的な説明及び具体的な実施形態により本発明を詳しく説明したが、本発明に基づいて補正や改善を行い得るのは当業者にとって自明なことである。よって、本発明の趣旨から逸脱しない上で行ったこれらの補正や改善は全て、本発明の保護範囲に属すものである。
本発明が提供するタバコ遺伝子ＮｔＴＣＴＰの活性は、タバコのＰＶＹに対する抵抗性に密接に関係している。遺伝子ＮｔＴＣＴＰのＲＮＡｉ発現ベクターを構築し、アグロバクテリウム媒介形質転換方法でタバコの遺伝子形質転換を行った結果、当該遺伝子がタバコにおいてサイレンシングされた後、タバコのＰＶＹに対する抵抗性が向上し、抵抗性が５０％〜８０％向上できることが実証された。
Claims (10)
- i）配列番号１で表されるヌクレオチド配列；または
ii）配列番号１で表されるヌクレオチド配列の一つ又は複数のヌクレオチドが置換、欠失及び/または付加され、かつ同じ機能タンパク質を発現するヌクレオチド配列；または
iii）０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＰＥまたは０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ溶液において、６５℃でハイブリダイズし、当該溶液で膜を洗浄するというストリンジェントな条件下で、配列番号１で表される配列とハイブリダイズし、かつ同じ機能タンパク質を発現するヌクレオチド配列；または
iv）i）、ii）またはiii）のヌクレオチド配列と９０％以上の相同性を有し、かつ同じ機能タンパク質を発現するヌクレオチド配列
であるタバコ遺伝子ＮｔＴＣＴＰの、タバコにおける抗ジャガイモＹウイルスへの応用。 - ＲＮＡｉ技術によりタバコにおける遺伝子ＮｔＴＣＴＰをサイレンシングさせることを特徴とする、請求項１に記載の応用。
- 配列番号３で表されるヌクレオチド配列を植物発現ベクターにクローニングした後、アグロバクテリウム媒介形質転換方法により組み換え発現ベクターをタバコに導入し、トランスジェニックタバコ株をスクリーニングし、前記植物発現ベクターがｐＢｉｎ４３８であることが好ましいことを特徴とする、請求項２に記載の応用。
- 前記ジャガイモＹウイルスが、ジャガイモＹウイルス壊死株系であるＮ株系を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の応用。
- まず、遺伝子ＮｔＴＣＴＰのＲＮＡｉ発現ベクターを構築し、次に、アグロバクテリウム媒介形質転換方法により組み換え発現ベクターをタバコに導入し、トランスジェニックタバコ株をスクリーニングすることを特徴とする、トランスジェニックタバコ株の構築方法。
- 使用する開始ベクターがｐＢｉｎ４３８であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
- タバコ遺伝子ＮｔＴＣＴＰのタバコ品種の改良への応用。
- タバコ遺伝子ＮｔＴＣＴＰの抗ＰＶＹタバコの育種への応用。
- タバコ遺伝子ＮｔＴＣＴＰを抑制する発現カセットを有することを特徴とする、発現ベクター。
- 配列番号３で表されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項９に記載の発現ベクター。
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