CN109321584A

CN109321584A - 一种简单定性/定量检测单碱基基因编辑技术工作效率的报告系统

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Publication number: CN109321584A
Application number: CN201711447105.1A
Authority: CN
Inventors: 李大力; 张晓辉; 刘明耀
Original assignee: Shanghai Bioray Biotechnology Co Ltd; East China Normal University
Current assignee: Shanghai Bioray Biotechnology Co Ltd; East China Normal University
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2019-02-12
Anticipated expiration: 2037-12-27
Also published as: CN109321584B

Abstract

本发明提供了一种简单定性/定量检测单碱基基因编辑技术工作效率的报告系统，具体地，本发明应用单碱基基因编辑技术(base editor)可在其突变窗口内将带有ACG靶点的单碱基胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)，并可快速、简便、准确的评估sgRNA的活性和突变效率。

Description

一种简单定性/定量检测单碱基基因编辑技术工作效率的报告系统

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种简单定性/定量检测单碱基基因编辑技术工作效率的报告系统。

背景技术

自2013年以来，以CRISPR/Cas9为代表的新一代基因编辑技术进入生物学领域的各个实验室，正改变着传统的基因操作手段。

目前，单碱基基因编辑技术，已被报道可用于高效地进行基因组的基因突变或修复，疾病动物模型制作，基因治疗。现有单碱基基因编辑工具中，以 BE3(base editor 3)(图2),KKH(saKKH-BE3)(图3)应用最为广泛。目前，基于二者的体系优化研究也相应开展。实际工作中，检测BE3或KKH其是否工作方法主要为直接突变内源性基因后进行高通量测序法，或CEL-I nuclease assays；前者时间较长，成本较高，后者操作过程复杂，且易出现假阴性。而常用于检测CRISPR/Cas9工作效率的T7EN1，然而很难检测BE3和KKH的单碱基的突变。

因此，本领域迫切需要开发一种简单定性/定量检测单碱基基因编辑技术工作效率的报告系统。

发明内容

本发明的目的在于提供一种一种简单定性/定量检测单碱基C到T突变效率的reporter，为后续的检测在突变窗口内带有ACG靶点的BE3或KKH突变效率及BE3或KKH技术优化后的工作效率提供了简单定性/定量检测方法。

本发明第一方面提供了一种核酸构建物，所述核酸构建物具有5’-3’的式I结构：

X1-L1-X2-P0-P1-P2-L2-P3-P4 (I)；

其中，

X1为第一启动子序列；

L1为位于X1与X2之间的间隔序列；

X2为ACG序列、或ATG(N)_3mTAG序列(m为0-50的正整数)；

P0为含有基因编码位点的靶序列；

P1为PAM序列；

P2为自剪切蛋白的编码序列；

L2为无或位于X1与X2之间的间隔肽编码序列；

P3为外源蛋白的编码序列，所述编码序列不含起始密码子ATG且含有终止密码子；

P4为任选的PolyA序列；

附加条件：

当X2为ACG序列时，L1、P0和P1均不含ATG和终止密码子；

并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列。

在另一优选例中，所述的核苷酸连接序列长度为1-60nt，优选为3的倍数。

在另一优选例中，在X2-P0-P1-P2-L2-P3中的各“-”为键。

在另一优选例中，所述的(N)_3m不含终止密码子。

在另一优选例中，所述第一启动子序列选自下组：CMV、CAG、PGK、EF1 α、或其组合。

在另一优选例中，所述的PAM序列包括NGG或NNNRRT(R＝A或G)。

在另一优选例中，所述自剪切蛋白选自下组：T2A、P2A、E2A、F2A、或其组合。

在另一优选例中，所述外源蛋白的编码序列来自原核生物、真核生物。

在另一优选例中，所述外源蛋白的编码序列来自动物、植物、病原体。

在另一优选例中，所述外源蛋白的编码序列来自哺乳动物，较佳地灵长动物，啮齿动物，包括人、小鼠、大鼠。

在另一优选例中，所述的外源蛋白的编码序列编码选自下组的外源蛋白：荧光素蛋白、或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白)、或其组合。

在另一优选例中，源自X2的ATG与P2、P3处于同一阅读框架。

在另一优选例中，所述polyA序列选自下组：BGHpolyA、SV40polyA、或其组合。

在另一优选例中，m为0-30，更佳地0-20。

本发明第二方面提供了一种载体产品，其特征在于，所述载体产品包括第一载体，所述第一载体含有本发明第一方面所述的核酸构建物；

第二载体，所述第二载体含有表达Cas9核酸酶的表达盒，所述表达Cas9核酸酶的表达盒具有5’-3’的式II结构：

Y1-S1-L2-S2-S3-S4 (II)

式II中，

Y1为第二启动子序列；

S1为胞嘧啶脱氨酶的编码序列或腺苷脱氨酶的编码序列；

L2为任选的连接序列；

S2为Cas9核酸酶或KKH核酸酶的编码序列；

S3为尿嘧啶糖苷酶抑制剂UGI的编码序列或核定位信号序列，附加条件是当 S1腺苷脱氨酶的编码序列时，S3则为核定位信号序列；

S4为polyA序列；

并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；和

任选的第三载体，所述第三载体含有表达sgRNA的第三表达盒，所述sgRNA 靶向位点使得所述第二载体靶向的位置为ACG序列或ATG(N)_3mTAG序列。

在另一优选例中，所述第一载体、第二载体、第三载体中的任何两个或三个为同一载体。

在另一优选例中，所述第二载体含有表达sgRNA的表达盒。

在另一优选例中，所述表达sgRNA的表达盒为表达sgRNA4的表达盒。

在另一优选例中，当S1为腺苷脱氨酶的编码序列时，S3为核定位信号序列。

在另一优选例中，当S1为胞嘧啶脱氨酶的编码序列时，S3为尿嘧啶糖苷酶抑制剂UGI的编码序列。

在另一优选例中，所述第二启动子选自下组：CMV、CAG、PGK、EF1α、或其组合。

在另一优选例中，所述Cas9核酸酶选自下组：Cas9、Cas9n、或其组合。

在另一优选例中，所述连接序列选自下组：XTEN、GGS、(GGS)₃、(GGS)₇、或其组合。

在另一优选例中，所述胞嘧啶脱氨酶包括Apobec1。

在另一优选例中，所述腺苷脱氨酶包括TadA。

在另一优选例中，所述Cas9核酸酶的来源选自下组：酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、或其组合。

在另一优选例中，所述S2元件中，突变位点在Cas9核酸酶(登录号(Gene ID)：2828055)的D10A。

在另一优选例中，所述S2元件中，突变位点在KKH核酸酶(登录号(Gene ID):2828033)的D10A。

在另一优选例中，所述载体选自下组：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其组合。

在另一优选例中，所述构建物整合到载体的多克隆位点。

在另一优选例中，所述载体是环状的。

本发明第三方面提供了一种基因工程细胞，所述细胞被本发明第二方面所述的载体产品所转化或转染。

在另一优选例中，所述基因工程细胞为原核细胞或真核细胞。

在另一优选例中，所述原核细胞包括大肠杆菌。

在另一优选例中，所述真核细胞选自下组：酵母细胞、植物细胞、哺乳动物细胞(如HEK293T细胞)、人细胞、或其组合。

本发明第四方面提供了一种检测sgRNA活性的方法，包括步骤：

(i)将第一载体、第二载体和第三载体；或将本发明第二方面所述的载体产品导入细胞；

其中，所述第一载体含有本发明第一方面所述的核酸构建物；所述第二载体含有表达Cas9核酸酶的表达盒；和所述第三载体含有表达sgRNA的第三表达盒，所述sgRNA靶向位点使得所述第二载体靶向的位置为ACG序列或ATG(N)_3mTAG 序列，其中m为0-50的正整数；

(ii)检测所述细胞中表达的外源蛋白的表达量和/或信号；

(iii)根据所述外源蛋白的表达量和/信号，从而判断sgRNA的活性。

在另一优选例中，所述外源蛋白选自下组：荧光素蛋白、或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶)、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、或其组合。

在另一优选例中，所述的表达Cas9核酸酶的表达盒具有式II结构。

在另一优选例中，第一载体中的所述核酸构建物具有式I结构。

在另一优选例中，当所述第一载体产品中的X2元件为ACG序列或 ATG(N)_3mTAG序列时，与阴性对照(组)的测试结果相比，所述外源蛋白的表达量 Q1和/或荧光信号S1均显著增强，则表明，所述sgRNA的活性高。

在另一优选例中，所述阴性对照的测试结果是空白对照组的测试结果。

在另一优选例中，所述阴性对照的测试结果是，在与实验组的实验条件相同条件下，仅将相同的第一载体和相同的第二载体导入相同细胞所获得阴性实验组的测试结果。

在另一优选例中，所述的阴性对照的测试结果包括：外源蛋白的表达量Q0和/ 或荧光信号S0。

在另一优选例中，所述显著增强指“Q1/Q0≥100％，较佳地，≥200％，更佳地，≥500％、或≥600％。

在另一优选例中，所述显著增强指“S1/S0≥100％，较佳地，≥200％，更佳地，≥500％、或≥600％。

在另一优选例中，所述的检测为定性检测和定量检测。

在另一优选例中，所述的定量检测包括比较或确定2个或多个sgRNA的活性高低。

在另一优选例中，各sgRNA的活性高低与在各自sgRNA条件下所述外源蛋白的相应表达量和/或荧光信号成正比或正相关。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤(iv)：将外源蛋白的表达量Q1和/或荧光信号S1与阳性对照(组)的结果进行比较。

在另一优选例中，所述的细胞来自以下物种：人、非人哺乳动物、家禽、植物。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、牛、猪、羊、马、狗、猫、非人灵长动物(如猴)。

在另一优选例中，所述的细胞包括：体细胞、干细胞、生殖细胞、非分裂细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述的细胞包括：肾细胞、上皮细胞、内皮细胞、或其组合。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了BE3的工作原理图。

图2显示了BE3工作系统的简图。

图3显示了U6-sgRNA-BE3工作系统的简图。

图4显示了KKH工作系统的简图。

图5显示了U6-sgRNA-KKH工作系统简图。

图6显示了CMV-T2A-GFP/luciferase报告系统简图。

图7显示了U6-sgRNA-EF1α-GFP质粒简图。

图8显示了U6-sgRNA1-BE3与CMV-sgRNA1-T2A-GFP转染72h的荧光照片。

图9显示了U6-sgRNA2-KKH与CMV-sgRNA2-T2A-GFP转染72h后荧光照片。

图10显示了U6-sgRNA1-BE3与CMV-sgRNA1-T2A-GFP转染72h后的流式分析结果。

图11显示了U6-sgRNA2-KKH与CMV-sgRNA2-T2A-GFP转染72h后的流式分析结果。

图12显示了BE3 sgRNA Luciferase活性检测结果。

图13显示了BE3 sgRNA对内源基因EMX1突变效率检测结果。

图14显示了BE3/KKH TS oligo及oligo-pc的序列设计。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种简单定性/定量检测单碱基基因编辑技术工作效率的报告系统，本发明的单碱基基因编辑技术(base editor)或KHH可在其突变窗口内将带有ACG靶点的单碱基胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)，或将带有ATG(N)_3mTAG靶点的A突变为G，并可快速、简便、准确的评估 sgRNA的活性和突变效率。在此基础上，本发明人完成了本发明。

BE3工作系统

BE3，即Base editor 3,即通过胞嘧啶脱氨酶与源于酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的带有D10A突变的spCas9(spCas9n)融合形成，它以NGG作为PAM并并特异结合DNA并在NGG上游16-19位实现胞嘧啶到胸腺嘧啶的单碱基突变(图 1)。

KHH工作系统

KKH,即通过胞嘧啶脱氨酶与葡萄球菌(Staphylococcus aureus)SaCas9 带有D10A突变，同时带有E782K/N968K/R1015H突变的saCas9(以后称为KKH) 融合形成，以NNNRRT(R＝A或G)作为PAM并识别并特异结合DNA并在PAM上游11-16位实现C到T的单碱基突变。

自剪切蛋白

自剪切蛋白2A是一类18-22个氨基酸组成的多肽。当其连接两个或多个蛋白时，其翻译的蛋白产物可以在2A高度保守的C端的甘氨酸与脯氨酸之间发生剪切 (Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-)，从而实现2A两端的蛋白产物各自独立行使功能。本发明所使用的自剪切蛋白来源为明脉扁刺蛾β四体病毒的T2A,另外还有来自于口蹄疫病毒的F2A,马鼻炎病毒的E2A,猪捷申1病毒的P2A。

在一优选实施方式中，自剪切蛋白为2A序列。2A序列是病毒里面来的，是一种18-22个氨基酸的短肽，它通过自我剪接在一个开放阅读框内表达多个蛋白，且自我剪接效率几乎达100％，常用的有T2A,P2A,F2A,E2A。

ACG工作系统

当sgRNA系统工作时，无论是在BE3或KKH情况下，都在胞嘧啶脱氨酶(如 Apobec1)的作用下，会将所述结构中的ACG突变为ATG，从而形成起始密码子，这导致位于ATG之后的核酸序列成功表达，从而造成后续的外源蛋白(如GFP、荧光素酶或其他标记基因)被翻译表达。

在该系统下，GFP、荧光素酶或其他标记基因的表达表达量或活性越高，则表示sgRNA的活性越高；反之，则表示sgRNA的活性越低。

ATG(N)_3mTAG工作系统

当sgRNA系统工作时，无论是在ABE或ABEKKH(A到G的突变系统)情况下，都在腺苷脱氨酶(如TadA)的作用下，会将所述结构中TAG突变为TGG,将终止密码子去除，这导致位于ATG之后的核酸序列成功表达，从而造成后续的外源蛋白(如GFP、荧光素酶或其他标记基因)被翻译表达。

本发明的构建物

本发明提供了一种核酸构建物，其是通过BE或KHH工作系统对核酸构建物的带有ACG靶点的C突变为T，从而可快速、简便、准确的评估sgRNA的活性和突变效率本发明的构建物如本发明第一方面所述。

本发明的构建物中所用的各种元件都是本领域中已知的，因此本领域技术人员可以用常规方法，如PCR方法、全人工化学合成法、酶切方法获得相应的元件，然后通过熟知的DNA连接技术连接在一起，就形成了本发明的构建物。

将本发明的构建物插入外源载体，就构成了本发明的载体。

具体地，本发明的构建物的构建流程和应用如下：

1.设计原理及原则：

根据自剪接短肽-2A的工作原理，即2A前后连接的表达蛋白水平相当，选取了来自明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna)的T2A作为自剪接多肽，设计了如下两个报告系统，分别为CMV-T2A-GFP(图6上)， CMV-T2A-luciferase(图6下)。具体为CMV为启动子，其后无ATG且保留 NheI,BamHI单酶切的多克隆位点，之后为T2A自剪接多肽，最后为无ATG的GFP或luciferse序列。

其使用设计原则为：根据base editor工作原理，将BE3带有PAM的靶点序列(23bp)或KKH带有PAM的靶点的序列(26bp)克隆至用NheI,BamHI双酶切的报告质粒中，且保持ACG在BE3或者KKH的突变窗口内，同时与T2A后的 GFP或luciferase的读码框一致。若不足3的倍数应补足到3的倍数。同时注意ACG保持一致的读码框内其前面不出现ATG,其后不能出现终止密码子 (TAG,TAA,TGA)。

2.根据设计原理设计人的EMX1基因分别设计BE3带ACG的靶点序列 sgRNA1,sgRNA4

KKH带ACG的靶点序列sgRNA2(表1)，且ACG在其突变窗口内，并根据其靶点设计其sgRNA oligo,带有NGG或NNNRRT的靶点Target site oligo (TS-oligo),对应靶点的阳性oligo

(Oligo-pc)(表2,表3,表4)。

3.根据设计原理，首先将BE3(图2)改造成可插入任意sgRNA的 U6-sgRNA-BE3质粒(图3)；将KKH(图4)改造成可插入任意sgRNA的 U6-sgRNA-KKH(图5),可用于插入任意BE3靶点 U6-sgRNA-EF1α-GFP质粒(图7)，以及构建可插入任意带PAM的靶点 CMV-T2A-GFP/luciferase质粒(图6)。同时即可根据设计原则，构建 U6-sgRNA1-BE3,U6-sgRNA4-BE3，U6-sgRNA2-KKH,U6-sgRNA1-EF1α-GFP, U6-sgRNA4-EF1α-GFP以及CMV-sgRNA1(NGG)-T2A-GFP,CMV-sgRNA2(NNNRRT)-T2A-GFP,

CMV-sgRNA1(NGG)-T2A-luciferase,CMV-sgRNA4(NGG)-T2A-luciferase

4.利用以上构建的质粒进行如下组合共转293T细胞，

(1)U6-sgRNA1-EF1α-GFP:CMV-sgRNA1(NGG)-T2A-GFP；

U6-sgRNA1-EF1α-GFP:CMV-sgRNA1(NGG)-T2A-GFP；

分别共转染293T细胞，72小时进行荧光拍照(图8，图9)并进行流式分析 (图10，图11)，

证明CMV-T2A-GFP报告系统可以定性报告BE3,KKH工作以及相对工作效率

(2)U6-sgRNA1-BE3：CMV-sgRNA1(NGG)-T2A-luciferase；

U6-sgRNA4-BE3：CMV-sgRNA4(NGG)-T2A-luciferase；

分别共转染293T细胞，24-48h测luciferase的相对活性(图12)。可得出sgRNA4突突活性大于sgRNA1.

之后将BE3：U6-sgRNA1-EF1α-GFP；BE3：U6-sgRNA4-EF1α-GFP；分别共转293细胞，通过流式分选，测其对内源靶点突变效率sgRNA4突突活性大于 sgRNA1与报告系统的活性相吻合(图13).

证明CMV-T2A-luciferase报告系统既可以定性报告base editor工作，也可定量报告base editor工作效率。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次发现一种简单定性/定量检测单碱基基因编辑技术工作效率的报告系统，本发明的单碱基基因编辑技术(base editor)或KHH可在其突变窗口内将带有ACG靶点的单碱基胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)，并可快速、简便、准确的评估sgRNA的活性和突变效率。

(2)本发明的单碱基基因编辑技术(base editor)或KHH工作系统可实现在其突变窗口内带有ACG靶点单碱基胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)突变效率的定性/ 定量检测和baseeditor(包括BE3,KKH)技术优化后其工作效率的定性/定量检测。

(3)本发明的单碱基基因编辑技术(base editor)或KHH工作系统也可用于胞嘧啶脱氨酶酶活的定性/定量检测。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明中所涉及的实验材料和试剂如无特殊说明均可从市售渠道获得。

实施例1利用CMV-T2A-GFP定性检测BE3，KKH工作及突变效率

1.U6-sgRNA-BE3,U6-sgRNA-KKH,CMV-T2A-GFP质粒载体的构建

1.1EMX1靶序列设计

根据CRISPR/Cas9及BE3,KKH工作原理，设计人的EMX1靶序列，表1 所示

表1人EMX1的带ACG的靶点序列

1.2根据靶向序列设计sgRNA oligo,TS oligo,阳性oligo：

靶序列sgRNA oligo设计原则：CRISPR/Cas9中Cas9识别PAM(NGG), saCas9(KKH)识别PAM(NNNRRT)同时需要20个碱基互补配对sgRNA为导向靶向结合，sgRNA以U6为启动子，需要G作为转录起始位点，同时U6-sgRNA-BE3, U6-sgRNA-KKH以BbsI酶切位点连入靶点，因此,sgRNA oligo-up 5.端需要补充CACC,sgRNA oligo-up 5.端需要补充AAAC,具体设计序列如表-2所示。

表2.EMX1-BE3 sgRNA1 oligo,TS-oligo及oligo-pc设计

靶序列TS oligo及GFP阳性oligo设计原则：CMV-T2A-GFP质粒中，可将靶点序列插入T2A前面,且保持ACG突变为ATG后与其后GFP读码框保持一致。由于T2A前可用NheI,BamHI双酶切后，连入靶点序列。因此，TS oligo-up, 5.端需要补充CTAG,TS oligo-dn,5.端需要补充GATC。同时，GFP阳性oligo 仅是将靶点中ACG突变为ATG,其余设计原则同TSoligo(图14)。具体设计序列如表4

表4.EMX1-KKH sgRNA2 oligo设计

1.3构建1.2中的质粒

合成sgRNA oligo。

1.3.1将oligo用纯水溶解，终浓度为100μM。

1.3.2退火。两条互补oligo各取10μL混合，并放入沸水浴煮5min后自然降温

至室温，约2小时。

1.3.3连接。将U6-sgRNA-BE3(BbsI),U6-sgRNA-KKH(BbsI), CMV-T2A-GFP(NheI+BamhI)载体与分别与annealed oligo按以下反应体系进行连接反应。

以碧云天的快速DNA连接试剂盒(D7006)为例。

室温连接60min后，取5μL转化至50μL感受态细菌中，U6-sgRNA1-BE3(氨苄抗性),U6-sgRNA2-KKH(氨苄抗性),CMV-T2A-GFP(卡那霉素抗性),培养过夜。

1.3.4从过夜培养的培养板中，挑取2个克隆，接种于4-5mL培养液，摇床37℃，220r/min培养过夜。

1.3.5摇菌培养过夜后，提取质粒，并测序验证，测序正确质粒。

2.BE3，KKH工作及相对突变效率的检测

2.1.质粒转染

第1天用293T细胞铺种24孔板

(1)消化HEK293T细胞，按照2.0×10⁵cell/孔接种24孔板。

注：细胞复苏后，一般需传代2次后方可用于转染实验。

第2天转染

(2)观察各孔细胞状态。

注：要求转染前细胞密度应为80％-95％，且状态正常。

(3)为保证数据的准确性和实验的可重复性，用无菌水稀释质粒，将各组质

粒浓度稀释至一致，或保证各组之间的质粒样品体积相同。组别设置如下：对于BE3组，Blank:空白对照，仅包括培养的细胞和培养基；处理组每孔 U6-sgRNA1-BE3:CMV-sg1-T2A-GFP＝250ng:250ng,并设置单转质粒作为对照，设置n＝3孔/组。如下表。

同样对于KKH组，与KKH组别设置类似，如下表所示。

(4)向1.5mL EP管中加入DMEM(无血清，无抗生素)。

(5)将DNA质粒加入到第(4)步的EP管中，混匀。

(6)将PEI加入到上一步的EP管中，混匀，室温静置20分钟。

(7)将转染混合液加到24孔板中。轻轻敲击24孔板以混匀。

(8)37℃，5％CO2，培养72h后，进行荧光拍照及流式分析。

2.2.分析GFP阳性细胞的比率

第5天

(9)72h后，对各组用荧光显微镜拍照(图8)(图9)，并进行流式分析

(10)用GraphPad Prism 6统计每组的流式分析结果(图10)(图11)。

实施例2利用CMV-T2A-luciferase定量检测BE3编辑效率

I.利用CMV-T2A-luciferase检测BE3带ACG靶点luciferase活性

1.U6-sgRNA-BE3,CMV-T2A-Luciferase,U6-sgRNA-EF1α-GFP质粒载体的构建

1.1EMX1靶序列设计

根据CRISPR/Cas9及BE3工作原理，设计人的EMX1靶序列，表1所示。

1.2根据靶向序列设计sgRNA oligo,luciferase oligo,luciferase阳性oligo：

靶序列sgRNA oligo设计原则：CRISPR/Cas9中Cas9识别PAM(NGG),同时需要20个碱基互补配对sgRNA为导向靶向结合，sgRNA以U6为启动子，需要 G作为转录起始位点，同时U6-sgRNA-BE3以BbsI酶切位点连入靶点，因此, sgRNA oligo-up 5.端需要补充CACC,sgRNA oligo-up 5.端需要补充AAAC, 具体设计序列如表2。

靶序列luciferase oligo及luciferase阳性oligo设计原则： CMV-T2A-luciferase质粒中，可将靶点序列插入T2A前面,且保持ACG突变为 ATG后与其后luciferase读码框保持一致。由于T2A前可用NheI,BamHI双酶切后，连入靶点序列。因此，luciferase oligo-up,5.端需要补充CTAG, luciferase oligo-dn,5.端需要补充GATC。同时，luciferase阳性oligo仅是将靶点中ACG突变为ATG,其余设计原则同luciferaseoligo(如图14)。具体设计序列如表3。

表3.EMX1-BE3-sgRNA4 oligo,TS-oligo及oligo-pc设计

U6-sgRNA-EF1α-GFP质粒设计原则：sgRNA以U6为启动子，需要G作为转录起始位点.同时BbsI酶切位点，连入sgRNA oligosgRNA oligo-up 5.端需要补充CACC,sgRNAoligo-up 5.端需要补充AAAC,具体设计序列与靶序列 sgRNA oligo相同，见表2。

1.3构建1.2中的质粒

合成sgRNA oligo。

1.3.1将oligo用纯水溶解，终浓度为100μM。

至室温，约2小时。

1.3.3连接。将U6-sgRNA-BE3(BbsI),CMV-T2A-Luciferase(NheI+BamhI), U6-sgRNA-EF1α-GFP(BbsI)载体与分别与annealed oligo按以下反应体系进行连接反应。

以碧云天的快速DNA连接试剂盒(D7006)为例。

室温连接60min后，取5μL转化至50μL感受态细菌中， U6-sgRNA-BE3(氨苄抗性),CMV-T2A-Luciferase(卡那霉素抗性), U6-sgRNA-EF1α-GFP(卡那霉素抗性)培养过夜。

1.3.6摇菌培养过夜后，提取质粒，并测序验证，测序正确质粒。

2.BE3sgRNA活性检测(Luciferase)

2.1质粒转染

第1天用293T细胞铺种96孔板

(1)消化HEK293T细胞，按照3×10⁴cell/孔接种96孔板。

注：细胞复苏后，一般需传代2次后方可用于转染实验。

第2天转染

(2)观察各孔细胞状态。

注：要求转染前细胞密度应为80％-95％，且状态正常。

(3)为保证数据的准确性和实验的可重复性，用无菌水稀释质粒，将各组质粒浓度稀释至一致，或保证各组之间的质粒样品体积相同。组别设置如下：

Blank:空白对照，仅包括培养的细胞和培养基；Con：阴性对照；PC：阳性对照。

设置n＝3孔/组。CMV-T2A-luciferase,CMV-T2A-luciferase(pc)质粒20ng/ 孔，U6-sgRNA-BE3质粒180ng/孔。每个96孔质粒为200ng，不足用无关质粒补齐至200ng。Con组用无关质粒补齐至200ng/孔。

(4)向1.5mL EP管中加入DMEM(无血清，无抗生素)。

(5)将DNA质粒加入到第(4)步的EP管中，混匀。

(6)将PEI加入到上一步的EP管中，混匀，室温静置20分钟。

(7)将转染混合液加到96孔板中。轻轻敲击96孔板以混匀。

(8)37℃，5％CO2，培养24-48h后检测荧光素酶活性。

2.2Luciferase活性检测

第3天进行荧光素酶活性检测

(9)配制Luciferase反应液底物，避光保存。

使用Promega公司的双荧光素酶报告系统试剂(E1960)，将200μL 50x stop &Substrate加入10ml stop&Buffer中，分装于不透明的棕色的EP 管中。

(10)24h后，从转染的96孔板中吸取30μL上清至白色不透明96孔板中。用排枪迅速加入Luciferase反应液底物，每孔25μL。迅速检测luciferase反应值，并记录

注：此步骤可在无菌条件下操作，吸出30μL培养液待检测，再补加30μL培养液至培养板继续培养，可用于检测转染48h后的荧光素酶表达水平。

3.数据分析

用GraphPad Prism 6计算每组的平均值。将CMV-ACG-T2A-luciferase组作为数值1，计算出各组的Relative luciferase activity(图12)，结果如表5和表6所示。

表5

说明：EMX1-BE3-sg1+ACG-Luciferase代表质粒EMX1-BE3-sg1与质粒ACG—T2A-Luciferase共转组的 luciferase值；EMX1-BE3-sg1代表质粒EMX1-BE3-sg1单转组的luciferase值；ACG-T2A-Luciferase代表质粒ACG-T2A-Luciferase单转的luciferase值；pc代表质粒ATG-T2A-luciferase单转的luciferase 值；每组3个复孔。数据处理时，均取各组luciferase的平均值，并将各组平均值除以EMX1-BE3-sg1组(阴性对照)的luciferase的平均值，进行对比分析，作出图11。

表5的结果表明，共转组对荧光素酶(luciferase)活性是约是阴性对照的 10倍。

表6

EMX1-BE3-sg4+ACG-Luciferase	EMX1-BE3-sg4	ACG-T2A-Luciferase	pc
					26460	235	420	78542	94
29098	497	491	80292	78
					24364	361	414	76793	73

说明：EMX1-BE3-sg4+ACG-Luciferase代表质粒EMX1-BE3-sg4与质粒ACG—T2A-Luciferase共转组的 luciferase值；EMX1-BE3-sg4代表质粒EMX1-BE3-sg4单转组的luciferase值；ACG-T2A-Luciferase代表质粒ACG-T2A-Luciferase单转的luciferase值；pc代表质粒ATG-T2A-luciferase单转的luciferase 值；每组3个复孔。数据处理时，均取各组luciferase的平均值，并将各组平均值除以EMX1-BE3-sg4组的luciferase的平均值，进行对比分析，得出图11。

表6的结果表明，共转组的相对荧光素酶(luciferase)活性是约是阴性对照的60倍。

II.利BE3靶向人EMX1基因突变效率的检测

1.质粒转染

第1天用293T细胞铺种24孔板

(1)消化HEK293T细胞，按照2.0×10⁵cell/孔接种24孔板。

注：细胞复苏后，一般需传代2次后方可用于转染实验。

第2天转染

(2)观察各孔细胞状态。

注：要求转染前细胞密度应为80％-95％，且状态正常。

粒浓度稀释至一致，或保证各组之间的质粒样品体积相同。组别设置如下：

Blank:空白对照，仅包括培养的细胞和培养基；处理组每孔BE3: U6-sgRNA-EF1α-GFP＝250ng:250ng,设置n＝3孔/组。

(4)向1.5mL EP管中加入DMEM(无血清，无抗生素)。

(5)将DNA质粒加入到第(4)步的EP管中，混匀。

(6)将PEI加入到上一步的EP管中，混匀，室温静置20分钟。

(7)将转染混合液加到24孔板中。轻轻敲击24孔板以混匀。

(8)37℃，5％CO2，培养72h后，通过FACS分选GFP阳性细胞。

2.分选GFP阳性细胞及突变效率检测

第5天

(9)72h后，流式分选GFP阳性细胞

(10)用天根细胞基因组提取试剂盒(DP304)提取分选的GFP阳性细胞基因组 DNA

(11)对提取的细胞基因组PCR包括有目的靶点约400bp,PCR产物回收后连接pEasy-blunt载体，转化，涂板，挑克隆100个，送测序，统计目标区域C突变为T效率(图13)，结果表明，对于目标区域sg1,sg4的C突变为T的突变效率分别为29.3％，47％。

实施例3

采用实施例1的方法，不同在于，GFP前无T2A元件。

实验结果表明：在GFP前无T2A元件的情况下(即不存在式I结构的P2 元件)，虽然在相应sgRNA实验下仍可检测到荧光信号，但是在不同的sgRNA 条件下，不同实验组的荧光强度或发光强度均一性较低，导致各组之间的可比性较低。

这提示，直接将靶点克隆至GFP之前，会导致GFP表达强度存在差异，导致实验结果的不均一性。尤其是插入不同的靶点序列时，阳性对照(ACG突变为ATG的阳性对照组)之间荧光强度或发光强度不一，这导致各组之间不具备可比性，无法对比各组之间的靶点效率。因此，在本发明的构建物(如式I结构)中包含自剪切蛋白元件是优选的。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 华东师范大学

上海邦耀生物科技有限公司

<120> 一种简单定性/定量检测单碱基基因编辑技术工作效率的报告系统

<130> P2017-1921

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

aaggacggcg gcaccggcgg ggg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

actacgtggt gggcgccgag cgg 23

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

ccgagacgca ggtaatcacc cccggt 26

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

caccggggac ggcggcaccg gcgg 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

aaacccgccg gtgccgccgt cccc 24

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

ctagaaggac ggcggcaccg gcggggg 27

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

gatccccccg ccggtgccgc cgtcctt 27

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

ctagaaggat ggcggcaccg gcggggg 27

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

gatccccccg ccggtgccgc catcctt 27

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

caccggccga gacgcaggta atcacc 26

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

aaacggtgat tacctgcgtc tcggcc 26

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

ctagccgaga cgcaggtaat cacccccggt c 31

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

gatcgaccgg gggtgattac ctgcgtctcg g 31

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

ctagccgaga tgcaggtaat cacccccggt c 31

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

gatcgaccgg gggtgattac ctgcatctcg g 31

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

caccgactac gtggtgggcg ccgag 25

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 17

aaacctcggc gcccaccacg tagtc 25

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 18

ctagactacg tggtgggcgc cgagcggaa 29

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 19

gatcttccgc tcggcgccca ccacgtagt 29

<210> 20

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 20

ctagactatg tggtgggcgc cgagcggaa 29

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 21

gatcttccgc tcggcgccca ccacatagt 29

Claims

1.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物具有5’-3’的式I结构：

X1-L1-X2-P0-P1-P2-L2-P3-P4 (I)；

其中，

X1为第一启动子序列；

L1为位于X1与X2之间的间隔序列；

X2为ACG序列、或ATG(N)_3mTAG序列(m为0-50的正整数)；

P0为含有基因编码位点的靶序列；

P1为PAM序列；

P2为自剪切蛋白的编码序列；

L2为无或位于X1与X2之间的间隔肽编码序列；

P4为任选的PolyA序列；

附加条件：

当X2为ACG序列时，L1、P0和P1均不含ATG和终止密码子；

并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列。

2.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述第一启动子序列选自下组：CMV、CAG、PGK、EF1α、或其组合。

3.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述自剪切蛋白选自下组：T2A、P2A、E2A、F2A、或其组合。

4.一种载体产品，其特征在于，所述载体产品包括第一载体，所述第一载体含有权利要求1所述的核酸构建物；

Y1-S1-L2-S2-S3-S4 (II)

式II中，

Y1为第二启动子序列；

S1为胞嘧啶脱氨酶的编码序列或腺苷脱氨酶的编码序列；

L2为任选的连接序列；

S2为Cas9核酸酶或KKH核酸酶的编码序列；

S3为尿嘧啶糖苷酶抑制剂UGI的编码序列或核定位信号序列，附加条件是当S1腺苷脱氨酶的编码序列时，S3则为核定位信号序列；

S4为polyA序列；

并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；和

任选的第三载体，所述第三载体含有表达sgRNA的第三表达盒，所述sgRNA靶向位点使得所述第二载体靶向的位置为ACG序列或ATG(N)_3mTAG序列。

5.如权利要求4所述的载体产品，其特征在于，所述第二载体含有表达sgRNA的表达盒。

6.如权利要求4所述的载体产品，其特征在于，所述第二启动子选自下组：CMV、CAG、PGK、EF1α、或其组合。

7.如权利要求4所述的载体产品，其特征在于，所述连接序列选自下组：XTEN、GGS、(GGS)₃、(GGS)₇、或其组合。

8.如权利要求4所述的载体产品，其特征在于，所述Cas9核酸酶的来源选自下组：酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、或其组合。

9.一种基因工程细胞，其特征在于，所述细胞被权利要求4所述的载体产品所转化或转染。

10.一种检测sgRNA活性的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)将第一载体、第二载体和第三载体；或将权利要求4所述的载体产品导入细胞；

其中，所述第一载体含有权利要求1所述的核酸构建物；所述第二载体含有表达Cas9核酸酶的表达盒；和所述第三载体含有表达sgRNA的第三表达盒，所述sgRNA靶向位点使得所述第二载体靶向的位置为ACG序列或ATG(N)_3mTAG序列，其中m为0-50的正整数；

(ii)检测所述细胞中表达的外源蛋白的表达量和/或信号；