CN107603983B - 一种小鼠rbm10基因编辑位点及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小鼠RBM10基因编辑位点及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，以pDR274载体为骨架构建插入有小鼠RBM10基因编辑靶位点T1、T2的Cas9 gRNA表达载体，可高效敲除小鼠RBM10基因的编辑位点T1、T2。这两个编辑位点可用于Cas9介导的小鼠RBM10基因打靶，制备RBM10基因修饰小鼠本发明鉴定小鼠RBM10基因的高效编辑位点，并分析其打靶效率，为构建RBM10基因内源性敲除或定点敲入外源基因的转基因小鼠提供新途径。

Description

一种小鼠RBM10基因编辑位点及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种小鼠RBM10基因编辑位点及其应用，具体地说，涉及一种小鼠RBM10基因编辑位点T1(241-260)、T2(334-353)及其应用。

背景技术

基因转移技术根据外源基因整合的位点特异性可分为两大类，一类是非定点的，即导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的，包括显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀、逆转录病毒载体感染等：另一类则是定点的，即外源基因导入靶细胞后整合到预先确定的位点或对细胞内靶位点进行定点修饰，这就是依赖于同源重组的基因打靶技术。将外源基因精准敲入猪体细胞的基因组中，一直都是极为困难的，因为早期仅基于同源重组的基因打靶技术效率极低，应用受到很大的限制。直到近年来人工核酸内切酶(engineered endonuclease,EEN)的出现，才彻底改变了这一现状。

锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease,ZFN)是第一代人工核酸内切酶。锌指是一类能够结合DNA的蛋白质，很多转录因子中都含有锌指结构。ZFN是将锌指蛋白的DNA结构域和FokI核酸内切酶中的非特异性的DNA切割结构域组合形成的一种嵌合体蛋白，其既具有锌指蛋白结合DNA的能力又具有核酸内切酶FokI切割DNA双链的能力(Kim Y G,ChaJ,Chandrasegaran S.Hybrid restriction enzymes:zinc finger fusions to FokIcleavage domain.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(3):1156-1160.)。利用ZFN可以在各种复杂基因组的特定位置制造DNA的双链切口。到目前为止，ZFN已经成功应用于猪、牛、大鼠、小鼠、斑马鱼、家蚕、果蝇、海胆、拟南芥、烟草、玉米等生物(Urnov F D,Rebar E J,Holmes M C,et al.Genome editing with engineered zinc finger nucleases.Nat RevGenet,2010,11(9):636-646.)。但是，由于ZFN制备流程复杂，成本昂贵，而且其技术专利被少数几家商业公司所控制，所以推广应用十分有限。

2009年，科学家将一种水稻的致病菌(Xanthamonas)编码的类转录激活因子效应物(transcription activator-like effector,TALE)与DNA的碱基对应关系解密(MoscouM J,Bogdanove A J.A simple cipher governs DNA recognition by TALeffectors.Science,2009,326(5959):1501；Boch J,Scholze H,Schornack S,etal.Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type IIIeffectors.Science,2009，326(5959):1509-1512.)。第二代人工核酸酶——类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)应运而生。和ZFN相似，TALEN主要由TALE蛋白的DNA结合结构域和Fok I核酸内切酶结构域组合而成，TALE蛋白含有多个33-35个氨基酸组成的重复肽段，而每一个肽段都能够识别一个碱基。2010年，首次报道TALEN蛋白在酵母中应用成功(Li T,Huang S,Zhao X,et al.Modularlyassembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and genereplacement in eukaryotes.Nucleic acids Res,2011,39(14):6315-6325.)。之后，TALEN在植物、小鼠、斑马鱼、猪、牛等动植物中得到了迅速的推广与应用(Joung J K,Sander J D.TALENs:a widely applicable technology for targeted genomeediting.Nat Rev Mol Cell Biol,2013,14(1):49-55.)。TALEN不仅可以像ZFN一样对复杂的基因组进行精细的修饰，而且其构建更加简单，特异性也更高，因此TALEN出现不久就在很大程度上替代了ZFN。2012年，TALEN被《科学》(Science)杂志评为十大科学突破之一(Breakthrough of the year.The runners-up.Science,2012,338(6114):1525-1532.)。

无论是ZFN还是TALEN,这两种人工核酸酶都是嵌合体，都是由经过人工设计的、序列特异性的DNA结合元件和非特异性的DNA切割结构域结合而成的。TALEN与ZFN的作用机制都是先对DNA双链分子靶序列进行切割，形成DNA双链断裂(double-strand break,DSB)，然后DSB激活细胞自身的DNA损伤修复机制，从而对该DNA进行定点改造。

2013年初，一种继ZFN和TALEN之后的第三代基因定点编辑技术clusteredregularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)闪亮登场。CRISPR/Cas系统主要是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成，细菌利用此系统可以特异性识别入侵的外源DNA并利用Cas蛋白对目标DNA进行断裂和降解，从而抵抗病毒感染。CRISPR/Cas9基因编辑系统的工作原理：crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基互补配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA，产生DNA双链断裂(DSB)，然后DSB激活细胞内的DNA损伤修复机制，通过两种方式对DNA进行修复，即非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)或者同源重组修复(homology-directedrepair,HDR)，从而达到定点改造基因组(包括内源基因的敲除或外源基因的定点敲入)的目的。NHEJ是一种非保真的、容易出现遗传突变的修复机制，往往使得核酸链被剪切的区域发生基因突变，导致编码的基因Knockdown或Knockout。而HDR则是一种高保真的修复机制，不容易出现突变，往往通过供体DNA与基因组DNA之间的同源重组造成靶位点的纠正或者靶向插入外源基因Knockin。

CRISPR/Cas9技术拥有ZFN和TALEN所不具备的独特优势：1.CRISPR/Cas9系统只需合成一个sgRNA(编码sgRNA的序列不超过100bp)即可实现对基因的特异性修饰，所以操作起来更加简单快捷。2.CRISPR/Cas9系统中，sgRNA靶向序列和基因组序列必须完全匹配，Cas9才能对DNA进行剪切，因此其靶向精确性性更高。3.CRISPR/Cas9系统基因修饰率更高，对基因调控方式更多样(敲除、插入、抑制、激活等)。4.CRISPR/Cas9系统的实验周期更短，可节省大量时间和成本。6.CRISPR/Cas9系统更容易得到纯合子突变体，而且可以在不同的位点同时引入多个突变(Mussolino C,Cathomen T.RNA guides genome engineering.NatBiotechnol,2013,31(3):208-209；Wang,H.,et al.(2013)."One-step generation ofmice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genomeengineering."Cell 153(4):910-918.)。

CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，在短短两三年之内，技术不断改进，发展成为生物学领域最受青睐的研究工具之一。基因打靶是通过同源重组技术将外源基因定点整合进靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的，具有技术成熟、修饰准确、效果稳定等优点。基因打靶技术目前已被广泛认为是一种理想的特定修饰与改造生物体遗传物质的最佳方法，其中包括了多种不同的基因敲除和敲入系统，特别是条件性和诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因在时间和空间上的靶位修饰更加明确、效果更加精确可靠。将CRISPR/Cas9技术和基因打靶联合起来，核酸内切酶Cas9定点切割靶DNA后产生DNA断口，再利用打靶载体的同源臂进行精确的同源重组，相对提高了该位点的短片段同源重组的效率。本人于2016年5月12日检索PubMed，以关键词“CRISPR/Cas9”查询，检出文献1680篇，其中2011年仅发表1篇，2012年发表3篇，2013年发表78篇，2014年发表316篇，2015年发表718篇，2016年截止到2016年5月12日已发表564篇。以关键词“RBM10CRISPR/Cas9”查询，检出文献为0篇。

RNA binding motif protein 10(RBM10)基因是X染色体上与细胞凋亡相关的基因有研究表明，该基因的小突变可能与乳腺癌以及TARP综合征的发生有关。TARP综合征是一种可遗传的先天缺陷疾病，其症状表型包括马蹄内翻足，房间隔缺损(ASD)，罗宾序列(小颌畸形、舌下垂和腭裂)，和左上腔静脉永存等。因此，获取RBM10基因修饰动物，可为深入研究该基因功能以及相关疾病的治疗提供可靠的动物模型。随着CRISPR/Cas9技术的不断改进，使得对基因进行编辑变得更为简单快捷。

发明内容

本发明的目的在于提供两种能基于CRISPR技术有效编辑小鼠RBM10基因的基因编辑位点，这两个位点可用于Cas9介导的小鼠RBM10基因打靶，将RBM10基因功能失活，创制RBM10基因缺失转化体。本发明鉴定小鼠RBM10基因的高效编辑位点，并分析其打靶效率，为构建RBM10基因内源性敲除或定点敲入外源基因的转基因小鼠提供新途径。

其技术方案为：

本发明提供了两种能有效编辑小鼠RBM10基因的基因编辑位点T1(241-260)和T2(334-353)，其中，T1(241-260)是一段包含20个脱氧核糖核苷酸的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该位点在小鼠基因组的准确定位是X染色体RBM10基因启动子区，染色体坐标为20617744-20617763，启动子区坐标为241-260；

T2(334-353)是一段包含20个脱氧核糖核苷酸的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示，该位点在小鼠基因组的准确定位是X染色体RBM10基因编码区第一外显子区，染色体坐标为20619837-20619856，编码区第一外显子区坐标为334-353。

具体包括以下步骤：

(1)sgRNA寡核苷酸序列合成

1)在基因库中调出小鼠RBM10基因的序列，根据PAM序列(NGG)选择用于基因敲除的sgRNA靶向的区域；

2)根据靶位点的序列，设计并合成对应的引物序列；

3)引物退火形成寡聚核苷二聚体(oligoduplex)；

4)将寡核苷酸二聚体连接到pDR274载体中，即可获得含有编辑靶位点T1(241-260)、T2(334-353)的sgRNA的表达载体。

(2)体外转录sgRNA并进行纯化；

(3)将纯化的sgRNA和Cas9 mRNA按照一定的摩尔比例混合；

(4)对小鼠受精卵进行显微注射，注射后的受精卵移植代孕；

(5)提取仔鼠DNA并进行PCR鉴定；

(6)测序验证准确序列。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

以小鼠基因组中的两个能特异识别小鼠RBM10基因的编辑位点T1(241-260)、T2(334-353)为前提，利用CRISPR/Cas9介导基因删除技术，成功在小鼠胚胎中实现了RBM10基因序列的大片段删除。结果显示该技术可以在核酸内切酶Cas9的介导下以较高效率进行双链断裂，从而提高目的基因的删除效率。本发明将提供一种方便、高效的策略来构建RBM10基因敲除小鼠，对深入研究RBM10基因生物学功能及相关疾病治疗具有十分重要的作用。

附图说明

图1编辑位点T1(241-260)、T2(334-353)在猪基因组上的准确位置；

小鼠RBM10基因编辑位点T1(241-260)是一段包含20个脱氧核糖核苷酸的DNA序列，序列为：5’-GGTCCCAAAGACCAGGACGA-3’。该位点在小鼠基因组的准确定位是X染色体RBM10基因启动子区。

小鼠RBM10基因编辑位点T2(334-353)是一段包含20个脱氧核糖核苷酸的DNA序列，序列为：5’-GGTGACTGTGGCCGGCTAGG-3’。该位点在小鼠基因组的准确定位是X染色体RBM10基因编码区第一外显子区。

图2插入有引导序列的sgRNA表达载体示意图；

图3sgRNA体外转录结果图；

gRNA-T1和gRNA-T2为体外转录产物，DNA-T1和DNA-T2分别为其转录模板；

图4单细胞PCR检测结果图；

M：100bp DNA Maker；1～14：以显微共注射Cas9 mRNA和sgRNA小鼠受精卵为模板进行单细胞双重巢式PCR扩增的第二轮PCR产物；WT：以野生型小鼠基因组DNA为模板进行双重巢式PCR扩增的第二轮PCR产物；

图5测序结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

本发明是以PDR274载体为骨架构建插入有小鼠RBM10基因编辑靶位点的sgRNA表达载体。体外转录获取sgRNA，纯化回收后按照一定摩尔比例与Cas9 mRNA混合，显微注射小鼠受精卵，并将注射后的小鼠受精卵移植代孕，以获得RBM10基因删除小鼠。以下结合实施例和附图对本发明做详细的阐释。需要指出的是，本实施例仅用于解释本发明，而非对本发明的权利要求做出限制或限定。

实施例1 T1和T2位点插入有小鼠RBM10基因编辑靶位点的sgRNA表达载体的构建

(1)主要试剂与材料来源

pDR274载体购自Addgene。单链oligo由深圳华大基因有限公司合成。Bsa I限制性内切酶购自Fermentas。T4 DNA连接酶购自Fermentas。DH5α感受态细胞购自北京天根生物科技有限公司。重组载体按照北京天根生物科技有限公司提供的小提中量超纯质粒抽提试剂盒说明书进行。DNA割胶回收试剂盒购自Qiagen公司。测序委托深圳华大基因有限公司完成。

(2)操作步骤。

一限制性内切酶Bsa I酶切质粒PDR274载体，反应体系如表1:

表1

成分	初始浓度	用量	终浓度
				FD Buffer	10×	1μl	1×
Bas I	10units/μl	1μl	1unit/μl
				pDR274质粒	XXXng/μl	2μl	XXX unit/μl
ddH2O		6μl
				总体积		10μl

在冰上将以上成分依次加入，充分混匀。放在37℃水浴锅中酶切过夜。按照Qiagen公司DNA回收试剂盒的步骤回收上述酶切产物。

二单链oligo退火形成双链DNA，反应体系如表2：

表2

正向引物(100uM)	0.5ul
		反向引物(100uM)	0.5ul
ddH2O	18ul
		PCR buffer(10×)	2ul
总体积	20ul

混合均匀后瞬时离心，置于PCR仪中95℃孵育3min，然后自然冷却20min。

三T4DNA ligase连接反应，反应体系如表3：

表3

线性化pDR274载体	2ul
		双链DNA	1.75ul
T4 DNA ligase	1ul
		10×T4 DNA Ligase buffer	1ul
ddH2O	4.25ul
		总体积	10ul

在冰上将以上成分依次加入，充分混匀。放在37℃水浴锅中连接过夜。结束后置于冰上，用于转化。

四转化大肠杆菌DH5α，转化体系如表4：

表4

成分	用量
		连接产物	10μl
DH5α感受态细胞	100μl
		总体积	110μl

将以上成分混匀，冰浴30min；42℃热激90s；加入不含有抗生素的液体LB培养基500μl，置于37℃摇床以200rpm/min的转速复苏45min；在台式离心机上以8000rpm/min的转速离心，将菌体沉淀下来，然后去除450μl LB培养基；将剩余的100μl样品涂布在卡那霉素LB平板上，置于37℃温箱过夜培养16h。挑取细菌单克隆送深圳华大测序。测序正确的单克隆大摇后提取质粒，﹣20℃保存。

实施例2sgRNA体外转录

(1)主要试剂与材料来源

PCR引物对由华大基因有限公司合成。DNA割胶回收试剂盒购自Qiagen公司。MEGAshortscript Kit(AM1354)sgRNA体外转录试剂盒购于Ambion公司。Taq酶和10×PCRBuffer购自大连宝生物工程有限公司。

(2)操作步骤

一体外转录gRNA模板准备：

以sgRNA表达质粒为模板做PCR，反应体系如表5：

表5

组分	用量
		10×buffer	2
dNTP	1.6
		上游引物(10μM)	1μl
下游引物(10μM)	1μl
		rTaq酶	0.2
Cas9 gRNA表达质粒	1μl
		DEPC H<sub>2</sub>O	up to 20μl

PCR程序为：95℃3min，(94℃30s+58℃30s+72℃30s)×35cycles，72℃5min，16℃10min。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。PCR产物120bp左右，切胶回收，用DEPC水洗脱DNA后测浓度，作为后续体外转录的DNA模板。

二体外转录sgRNA：

以获得的PCR产物为模板进行体外转录，转录体系如表6：

表6

组分	用量
		T7 10×Reaction buffer	2μl
T7(A++C+G+U)	8μl
		模板DNA	6μl
T7 Enzyme mix	2μl
		无酶水	2μl
	up to 20μl

以上混合后，37℃反应4h(推荐使用37℃恒温培养箱处理，尽量不要使用水浴)，反应结束后，加入2μlTURBO DNase，37℃处理30min，电泳检测后-80℃保存。

三sgRNA纯化：

加入80μL DEPC水和20μL 3mol/L醋酸钠，混匀后加入等体积的1:1苯酚/异戊醇混合物，充分混匀后12000～15000rpm 4℃离心15min，转移上清至新的EP管中；加入等体积氯仿，充分混匀后12000～15000rpm 4℃离心15min，转移上清至新的EP管中；加入等体积异丙醇，-80℃静置30min后，12000～15000rpm 4℃离心30min，此时可见乳白色RNA沉淀；吸弃上清，加入500μL 70％冰乙醇洗涤沉淀，12000～15000rpm 4℃离心10min，吸弃上清；室温自然晾干，待乙醇完全挥发后加入适量DEPC水溶解RNA沉淀，测定OD值及浓度，-80℃保存备用。

四sgRNA与Cas9 mRNA混合：

将sgRNA与Cas9 mRNA按照摩尔比例混合，使其终浓度为sgRNA 30ng/μL、Cas9mRNA 200ng/μL。

实施例3小鼠受精卵显微注射

(1)主要试剂与材料来源

试验动物为购于湖北省医学科学院实验动物中心[生产许可证SCXK(鄂)2003-2005]的SPF级昆明小鼠。孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)购于宁波市三生药业有限公司。透明质酸梅购于上海生物制品厂。M2、M16细胞培养液为自配。

(2)操作步骤

一供体鼠与受体鼠的超排：

选取6周龄、30g以上的母鼠，腹腔注射5～10IU PMSG，注射后46～48h，再注射5～10IU HCG进行超排。注射HCG的当天，供体鼠与种公鼠合笼，受体鼠与结扎公鼠合笼，第二天上午检查阴栓，选取有阴栓的母鼠分别为供体鼠和受体鼠。

二受精卵的获取及培养：

将供体鼠脱颈处死，在无菌操作下迅速取出输卵管置于200ul M2培养液中，在实体显微镜下刺破输卵管膨大部或用钟表镊子轻轻压出包含受精卵的卵丘细胞团，转入含300ug/mL玻璃酸酶的M2液中消化，移出已游离的受精卵于新鲜的M2中，用M2洗涤3次，然后将受精卵转入M16培养液中，采用套皿法培养，置于37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养，选出雌雄原核清晰的受精卵待注射。

三受精卵显微注射：

将已配制好的Cas9 mRNA和sgRNA混合液在电镜下吸入注射针内，选取雌雄原核清晰的受精卵，将注射针快速刺入胞质中，注射2pL基因，迅速退出注射针。

实施例4胚胎样品单细胞PCR检测

一设计引物，序列如表7：

表7

设计好的引物交由深圳华大基因有限公司合成

二样品的消化与模板的制备：

将体外培养48h的小鼠胚胎收集到灭菌PCR管中，残余的培养液应尽量少，加入5μLNP40细胞裂解液(0.45％NP40、0.6％蛋白酶K)瞬时离心后在PCR仪中37℃孵育1h，55℃孵育1h；取出瞬时离心，再将其放入PCR仪中95℃孵育10min；完成上述步骤后吸取上清，转移至新的灭菌PCR管中作为模板保存。

三双重巢式PCR检测：

巢式第一轮PCR检测：20μL rTaq反应体系：在灭菌PCR管中加入0.2μL rTaq酶，2μL10×PCR Buffer，1.6μL dNTP，4μL Template，上、下游引物(第1对引物)各1μL，补加ddH2O至20μL，轻弹混匀后瞬时离心。将混好的反应体系放入PCR仪内进行反应，反应程序为：94℃预变性5min；(94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸1min)×35cycles；72℃总延伸7min。

巢式第二轮PCR检测20μL rTaq反应体系：在灭菌PCR管中加入0.2μL rTaq酶，2μL10×PCR Buffer，1.6μL dNTP，1μL第一轮PCR反应产物，上、下游引物(第2对引物)各1μL，补加ddH2O至20μL，轻弹混匀后瞬时离心。将混好的反应体系放入PCR仪内进行反应，反应程序为：94℃预变性5min；(94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸30s)×35cycles；72℃总延伸7min。完成上述反应后取5μL产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。

实施例5小鼠胚胎移植及分娩

一将当天的同步发情的受体母鼠，后腿部肌肉注射速眠新(10mg/kg)麻醉。采用头左尾右的方式放置，剪去被毛，在最后一根肋骨与脊髓旁1cm处剪开一横切口，用镊子夹住脂肪垫将卵巢、输卵管和子宫角部分拉出，在实体显微镜下避开血管撕开腹膜(有时以防出血，可先滴些肾上腺素)，找到输卵管伞口，勿动。筛选出轮廓清晰，且透明带与卵之间有卵周隙的注射过的受精卵(不少于20枚)吸入移卵管中，从伞口吹入，直到从输卵管中看到气泡为止，将子宫、输卵管和卵巢放回腹腔，抹上青霉素、链霉素粉，缝合，用碘酊消毒，做好耳号标记，放置笼中，苏醒灵按1.5mg/kg量后腿部肌肉注射解麻醉，待其苏醒。

二待母鼠苏醒后转入动物房中饲养，待其分娩，若足日不能顺产，则注射催产素助产。仔鼠产后剪其尾巴编号，进行PCR检测。

统计结果表明，如表8删除效率统计表所示共显微注射受精卵112枚，体外培养存活99枚，其中65枚发育至囊胚。经单细胞PCR检测，存活的99枚胚胎中77枚呈阳性，其删除效率约为77.8％。本发明提供的小鼠RBM10基因编辑位点，为对该基因进行精确编辑提供了有效的靶标，为探明RBM10基因的生物学功能和信号通路提供了可靠的手段和素材。

表8

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种小鼠RBM10基因编辑位点及其应用

<141> 2017-09-06

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtcccaaag accaggacga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtgactgtg gccggctagg 20

Claims (2)

1.一种小鼠RBM10基因编辑位点在Cas9核酸内切酶特异识别过程中的应用，其特征在于，所述小鼠RBM10基因编辑位点，包括T1和T2，其中，T1为20个脱氧核糖核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，该位点在小鼠基因组的准确定位是X染色体RBM10基因启动子区，染色体坐标为20617744-20617763，启动子区坐标为241-260；

T2为20个脱氧核糖核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，该位点在小鼠基因组的准确定位是X染色体RBM10基因编码区第一外显子区，染色体坐标为20619837-20619856，编码区第一外显子区坐标为334-353。

2.根据权利要求1所述的小鼠RBM10基因编辑位点在Cas9核酸内切酶特异识别过程中的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)构建含有编辑靶位点T1 、T2的sgRNA表达载体；

(2)体外转录sgRNA并进行纯化；

(3)将纯化的sgRNA和Cas9 mRNA按照一定的摩尔比例混合；

(4)对小鼠受精卵进行显微注射，注射后的受精卵移植代孕；

(5)提取仔鼠DNA并进行PCR鉴定；

(6)测序验证准确序列。

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