CN116769775A - 一种靶向猪pLEG1abc基因座的sgRNA、重组表达载体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明中公开了一种靶向猪pLEG1abc基因座的sgRNA和包含该sgRNA的重组表达载体及其制备方法和应用；基于该重组表达载体，本发明还公开了删除猪pLEG1abc基因座的猪胎儿成纤维细胞及其制备方法。本发明可以有效、准确地同时删除猪同一条染色体上的pLEG1a、pLEG1b及pLEG1c三基因，获得删除肝富集基因1的猪胎儿成纤维细胞，为后续构建缺失pLEG1的实验猪模型提供技术基础；同时本发明基于CRISPR/Cas9系统，根据sgRNA靶位点设计至少靶向80，000bp的长片段基因，并且成功地删除该长片段基因，实现了基于CRISPR/Cas9系统对长片段基因的高效删除，对于各种动物模型的建立具有重要的指导意义。
Description
技术领域
本发明涉及动物基因工程技术领域，具体涉及一种靶向猪pLEG1abc基因座的sgRNA，含有sgRNA的重组表达载体及其制备方法和应用。
背景技术
肝富集基因1(Liver-enriched gene 1,LEG1)在脊椎动物中进化保守，并编码新型糖基化分泌蛋白LEG1。在猪中，发现LEG1存在三个拷贝——pLEG1a、pLEG1b和pLEG1c，其中pLEG1a和pLEG1b蛋白结构上与斑马鱼肝富集基因1蛋白(zLEG1)、小鼠肝富集基因1蛋白(mLEG1)、人肝富集基因1蛋白(hLEG1)类似，均包括信号肽及特定的结构域，而pLEG1c无信号肽，只包括LEG1结构域。
目前，人们对LEG1在哺乳类动物中的功能仍不清楚。而小型猪由于与人类的相似性而成为最重要的实验动物之一，被广泛用于疾病模型研究以及异种器官移植研究。因此，为了进一步研究该基因在哺乳动物中的功能，需要建立一种可以高效、准确、有效地删除pLEG1的方法，获取删除肝富集基因1的猪成纤维细胞，这对研究该基因在哺乳动物中的功能，以及猪的育种都具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的缺乏同时有效、准确地删除猪pLEG1a、pLEG1b及pLEG1c三基因的方法的问题，提供一种靶向猪pLEG1abc基因座的sgRNA、重组表达载体及其制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种靶向猪pLEG1abc基因座的sgRNA，猪pLEG1abc基因座中pLEG1c、pLEG1a和pLEG1b三基因拷贝依次串联，所述sgRNA包括gRNA1和gRNA2，所述gRNA1靶向pLEG1c起始处的序列，所述gRNA1的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；所述gRNA2靶向pLEG1b起始处序列，所述gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的sgRNA。
优选地，所述重组表达载体的构建方法包括以下步骤：
S1、设计gRNA1的引物为gDNA-pLEG1s-F1和gDNA-pLEG1s-R1，gRNA2的引物为gDNA-pLEG1s-F2和gDNA-pLEG1s-R2；所述gDNA-pLEG1s-F1和gDNA-pLEG1s-R1的核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；所述gDNA-pLEG1s-F2和gDNA-pLEG1s-R2的核苷酸序列分别如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；
S2、利用BbsI限制性内切酶将含有U6启动子驱动的gRNA克隆载体pX459线性化，得到线性化的pX459载体；
S3、将gDNA-pLEG1s-F1和gDNA-pLEG1s-R1、gDNA-pLEG1s-F2和gDNA-pLEG1s-R2分别变性退火连接入线性化的pX459载体中，分别构建得到重组表达载体为pX459-gRNA-1载体和pX459-gRNA-2载体。
本发明还提供了一种删除pLEG1abc基因座的猪胎儿成纤维细胞的制备方法，构建上述重组表达载体，将重组表达载体通过电转染转入猪胎儿成纤维细胞中，通过puromycin抗生素和单克隆有限稀释法进行细胞筛选，对经筛选后的细胞克隆点进行PCR鉴定，得到的阳性细胞克隆点即为删除猪pLEG1abc基因座的猪胎儿成纤维细胞，所述删除猪pLEG1abc基因座为同时删除同一染色体上的猪pLEG1a、pLEG1b及pLEG1c三基因。
优选地，使用引物KO-Primer-F和KO-Primer-R、引物WT-Primer-F和WT-Primer-R对经筛选后的细胞克隆点进行PCR扩增检测，根据PCR扩增结果鉴定阳性细胞克隆点；所述引物KO-Primer-F和KO-Primer-R的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；所述引物WT-Primer-F和WT-Primer-R的核苷酸序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示。
本发明还提供了根据上述制备方法制备得到的删除猪pLEG1abc基因座的猪胎儿成纤维细胞。
优选地，至少包括4个基因型为pLEG1delabc/+的阳性细胞克隆点，所述4个阳性细胞克隆点的核苷酸序列依次如SEQ ID No.11-SEQ ID No.14所示。
本发明同时提供了上述重组表达载体在制备基因删除实验猪模型中的应用。
本发明所具有的有益效果：
(一)本发明可以有效、准确地同时删除猪pLEG1a、pLEG1b及pLEG1c三基因，获得删除肝富集基因1的猪胎儿成纤维细胞，为后续构建缺失pLEG1的实验猪模型提供技术基础；
(二)本发明基于CRISPR/Cas9系统，根据sgRNA靶位点设计至少靶向80，000bp的长片段基因(猪pLEG1a、pLEG1b及pLEG1c三基因拷贝)，成功地删除该长片段基因位点，实现了基于CRISPR/Cas9系统对长片段基因的高效删除，对于各种动物模型的建立具有重要的指导意义。
附图说明
图1为实施例1中重组表达载体的构建图谱；
图2为实施例3中pLEG1基因示意图和KO-Primer-F/R、WT-Primer-F/R引物位置示意图；
图3为实施例3中部分细胞克隆点的基因型鉴定结果；
图4为实施例3中4个阳性细胞克隆点pLEG1abc长片段基因删除的示意图；
图5为实施例3中4个阳性细胞克隆点冻存前的细胞汇合状态；
图6为实施例4中重构胚的图；
图7为实施例4中两头流产胚胎的基因型鉴定结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
载体pX459购自Addgene(Plasmid#62988；Watertown，MA，USA)；32天大的雄性中国实验用小型猪胚胎购自中国农业大学涿州小型猪实验基地；野生型pLEG1基因座序列(pLEG1a:XM_003121211.1,pLEG1b:XM_021074892.1,pLEG1c:XM_021084485.1)。
实施例1重组表达载体pX459-gRNA-1和pX459-gRNA-2载体的构建
1.使用在线gRNA设计工具(http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)设计了靶向猪pLEG1abc基因座两端的gRNA，包括gRNA1和gRNA2。其中gRNA1的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，靶向pLEG1c起始处的5'-TTAAAGATCCATTTCACTAG-3'序列；gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，靶向pLEG1b起始处序列为5'-GTTCTCTCCTGGCTAATGAT-3'。
2.根据gRNA1和gRNA2的序列，设计gRNA1的引物为gDNA-pLEG1s-F1和gDNA-pLEG1s-R1，分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；设计gRNA2的引物为gDNA-pLEG1s-F2和gDNA-pLEG1s-R2，分别如SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6所示。
3.利用BbsI限制性内切酶将含有U6启动子驱动的gRNA克隆载体pX459线性化，得到线性化的pX459载体。
4.将引物gDNA-pLEG1s-F1和gDNA-pLEG1s-R1、gDNA-pLEG1s-F2和gDNA-pLEG1s-R2分别变性退火连接入线性化的pX459载体中，分别构建得到重组表达载体为pX459-gRNA-1载体和pX459-gRNA-2载体，重组表达载体构建图谱如附图1所示。
实施例2删除猪pLEG1abc基因座的猪胎儿成纤维细胞的培养，转染和筛选
猪胎儿成纤维细胞(PFFs)是从32天大的雄性中国实验用小型猪胚胎中分离出来的。这些原代细胞在含20％胎牛血清(FBS,Gibco)的高葡萄糖Dulbecco'sMedium Eagle培养基(Gibco,Gaithersburg,DMEM,USA)中培养。
所有动物实验均根据中国动物保护和协议委员会制定的指南进行，并得到浙江大学实验动物福利委员会(中国浙江省)的批准。
使用Lonza 4D-Nucleofector进行2.5μg pX459-gRNA-1(实施例1制备得到)与2.5μg pX459-gRNA-2(实施例1制备得到)对PFFs的转染。转染前一天，将PFFs解冻并培养。然后使用电转试剂82μL PS solution和18μLsupplement在参数DO-113下进行转染，转染约1×106PFFs细胞。由于pX459-gRNA-1和pX459-gRNA-2载体均携带PuroR抗性基因，故后续筛选采用puromycin抗生素。转染24h后，使用单克隆有限稀释法进行细胞筛选：将细胞按照50cells/孔铺于96孔板中。24h后，将细胞在含2μg/mL的puromycin，20％FBS的DMEM中培养3天后更换无puromycin的含20％ FBS的DMEM培养基直至单个细胞克隆点生长。然后选择单个细胞克隆点并在24孔板中培养。当24孔板中出现克隆点后，消化转入6孔板中继续培养，剩余的少量细胞于24孔板中继续生长，后续进行基因组提取以鉴定突变。待转入6孔板中的细胞达到汇合时进行冷冻保存，用于后续的体细胞核移植操作。
实施例3删除猪pLEG1abc基因座的猪胎儿成纤维细胞的鉴定
利用Genomic DNA Purification Kit(EZBioscoence)提取实施例2中经筛选后的细胞克隆点的基因组DNA，然后使用高保真聚合酶(Thermo Fisher Scientific)进行PCR检测。PCR扩增的引物为KO-Primer-F和KO-Primer-R(核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8所示)、WT-Primer-F和WT-Primer-R(核苷酸序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10)。KO-Primer-F/R位于实施例1中设计的gRNA1和gRNA2位点两侧，中间为长片段pLEG1基因；而WT-Primer-F/R是根据pLEG1基因上约500bp的片段设计的引物。
若长片段pLEG1基因未被删除，由于KO-Primer-F/R引物扩增跨度过大而不能对模版进行完整的扩增以致无特异性条带，而使用WT-Primer-F/R引物能扩增出约500bp的特异性条带；若长片段pLEG1基因被删除，使用KO-Primer-F/R引物能扩增出约500bp的特异性条带，而使用WT-Primer-F/R引物则无特异性条带。pLEG1基因示意图和KO-Primer-F/R、WT-Primer-F/R引物位置示意图如附图2所示。
如附图3所示，由于阳性细胞克隆点存在纯合子和杂合子两种情况，若为纯合子，使用KO-Primer-F/R进行PCR扩增时有500bp左右的条带，而在使用引物WT-Primer-F/R进行PCR扩增时无条带；阳性细胞克隆点若为杂合子(如附图3中泳道3和12所示)，使用KO-Primer-F/R和WT-Primer-F/R引物进行PCR扩增均出现500bp左右的条带。
本实施例以纯水作为阴性对照，PCR鉴定了实施例2中筛选出的179个细胞克隆点，经鉴定这179个克隆点中存在27个阳性细胞克隆点，即正确的长片段删除克隆点，基因型为pLEG1delabc/+，删除率为15.08％。27个阳性细胞克隆点中有4个克隆点生长迅速、状态良好，对其进行测序。经测序这4个阳性细胞克隆点的核苷酸序列依次如SEQ ID No.11-SEQ IDNo.14所示，这4个阳性细胞克隆点pLEG1abc长片段基因删除的示意图如附图4所示。4个阳性细胞克隆点冻存前的细胞汇合状态如附图5所示。测序结果表明本实施例成功获得了正确的删除pLEG1abc长片段基因的猪胎儿成纤维细胞。
实施例4删除猪pLEG1abc基因的猪胎儿成纤维细胞的体细胞核移植
将实施例2中冻存的细胞进行体细胞核移植，共获得了1350重构胚，卵裂率达97％，如图6所示。共胚胎移植了5头母猪，其中1头母猪怀孕，主动流产获得两头流产胚胎进行基因型鉴定(基因型鉴定方法与实施例3一致)。经鉴定，发现其中一头胚胎为野生型，另一头胚胎为pLEG1abc基因删除杂合子。两头流产胚胎的基因型鉴定结果详见图7，图中#1、#2、#3、#4分别为流产胚胎组织块编号，其中#1、#2来自于同一胚胎，#3、#4来自于另一胚胎。
本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的，在本发明基础上，本领域技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中一些技术特征做出一些替换和变形，均在本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种靶向猪pLEG1abc基因座的sgRNA，其特征在于，猪pLEG1abc基因座中pLEG1c、pLEG1a和pLEG1b三基因拷贝依次串联，所述sgRNA包括gRNA1和gRNA2，所述gRNA1靶向pLEG1c起始处的序列，所述gRNA1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述gRNA2靶向pLEG1b起始处序列，所述gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求1所述的sgRNA。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的构建方法包括以下步骤：
S1、设计gRNA1的引物为gDNA-pLEG1s-F1和gDNA-pLEG1s-R1，gRNA2的引物为gDNA-pLEG1s-F2和gDNA-pLEG1s-R2；所述gDNA-pLEG1s-F1和gDNA-pLEG1s-R1的核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；所述gDNA-pLEG1s-F2和gDNA-pLEG1s-R2的核苷酸序列分别如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；
S2、利用BbsI限制性内切酶将含有U6启动子驱动的gRNA克隆载体pX459线性化，得到线性化的pX459载体；
S3、将gDNA-pLEG1s-F1和gDNA-pLEG1s-R1、gDNA-pLEG1s-F2和gDNA-pLEG1s-R2分别变性退火连接入线性化的pX459载体中，分别构建得到重组表达载体为pX459-gRNA-1载体和pX459-gRNA-2载体。
4.一种删除猪pLEG1abc基因座的猪胎儿成纤维细胞的制备方法，其特征在于，构建如权利要求3所述的重组表达载体，将重组表达载体通过电转染转入猪胎儿成纤维细胞中，通过puromycin抗生素和单克隆有限稀释法进行细胞筛选，对经筛选后的细胞克隆点进行PCR鉴定，得到的阳性细胞克隆点即为删除猪pLEG1abc基因座的猪胎儿成纤维细胞，所述删除猪pLEG1abc基因座为同时删除同一条染色体上的猪pLEG1a、pLEG1b及pLEG1c三基因。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，使用引物KO-Primer-F和KO-Primer-R、引物WT-Primer-F和WT-Primer-R对经筛选后的细胞克隆点进行PCR扩增检测，根据PCR扩增结果鉴定阳性细胞克隆点；所述引物KO-Primer-F和KO-Primer-R的核苷酸序列如SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8所示；所述引物WT-Primer-F和WT-Primer-R的核苷酸序列如SEQ IDNo.9和SEQ IDNo.10所示。
6.根据权利要求5所述的制备方法制备得到的删除猪pLEG1abc基因座的猪胎儿成纤维细胞。
7.根据权利要求6所述的删除猪pLEG1abc基因座的猪胎儿成纤维细胞，其特征在于，至少包括4个基因型为pLEG1delabc/+的阳性细胞克隆点，所述4个阳性细胞克隆点的核苷酸序列依次如SEQ ID No.11-SEQ ID No.14所示。
8.根据权利要求2所述的重组表达载体在制备基因删除实验猪模型中的应用。
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