CN111621508A

CN111621508A - 烟草萜类合成酶NtTPS7基因及其载体与应用

Info

Publication number: CN111621508A
Application number: CN202010526836.0A
Authority: CN
Inventors: 张建铎; 邓乐乐; 宋春满; 许力; 蒋佳芮; 杨文武; 向海英; 曾婉俐; 高茜; 贾凌; 杨光宇; 李雪梅; 陈章玉; 夏庆友
Original assignee: China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Current assignee: China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Priority date: 2020-06-11
Filing date: 2020-06-11
Publication date: 2020-09-04
Anticipated expiration: 2040-06-11
Also published as: CN111621508B

Abstract

本发明公开了一种烟草萜类合成酶基因NtTPS7及其应用，所述烟草萜类合成酶基因NtTPS7的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；本发明首次克隆烟草萜类合成酶基因NtTPS7，并构建得到了克隆载体及敲除载体；通过基因编辑载体构建NtTPS7基因缺失的转基因突变株，从而使烟草叶片颜色由正常的绿色变成浅绿，从而形成花白叶片；因此可以利用基因编辑载体使NtTPS7基因不表达，进行植物品种育种，获得植物花叶的观赏植物品种。

Description

烟草萜类合成酶NtTPS7基因及其载体与应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种烟草萜类合成酶NtTPS7基因及其应用。

背景技术

烟草NtTPS7蛋白参与萜类生物合成途径，是一种萜类合成酶，能催化相关萜类化合物的合成，但是其对叶片颜色的功能尚不清楚。

在植物中，烟草是一种重要的模式生物，也是重要的经济作物。烟草叶片的颜色，直接影响烟草烘烤后的烟丝色泽，其为衡量烟叶品质的一个重要指标。但是目前尚未有萜类生物合成途径相关基因在叶片颜色方面的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种烟草萜类合成酶基因NtTPS7，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明另一目的是提供一种包含上述的烟草萜类合成酶基因NtTPS7的重组载体。

所述的重组载体包括克隆载体和表达载体；所述的克隆载体的制备方法包括：以烟草的cDNA为模板，采用如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物进行PCR扩增；将所得PCR产物连接到T载体上，转化大肠杆菌获得克隆载体。

本发明另一目的是提供一种基因敲除载体，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对烟草NtTPS7基因设计靶位点敲除序列后基因编辑获得，靶位点敲除序列的核苷酸序列如SEQID NO:5所示，在靶位点敲除序列两侧加上人工合成的接头序列，得到核苷酸序列如SEQ IDNO:6和SEQ ID NO:7所示的引物对，引物对经退火后，连接到经BsaI酶切的载体pORE-Cas9上，获得基因敲除载体pORE-Cas9/NtTPS7。

本发明另一目的是提供一种转基因植物，转基因植物的制备方法包括：将基因敲除载体pORE-Cas9/NtTPS7转化农杆菌感受态细胞，再转化侵染植物即得。

所述转基因植物为转基因烟草；转化侵染转基因烟草时采用pORE-Cas9/NtTPS7载体转化农杆菌感受态，利用农杆菌介导的烟草叶盘转化法对烟草进行遗传转化，获得不同颜色的烟草植株。具体地，其叶片颜色部分由绿色变成浅绿色。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

本发明首次克隆烟草萜类合成酶基因NtTPS7，并构建得到了克隆载体及敲除载体；通过基因编辑载体构建NtTPS7基因缺失的转基因突变株，从而使烟草叶片颜色由正常的绿色变成浅绿，从而形成花白叶片。因此可以利用基因编辑载体使NtTPS7基因不表达，进行植物品种育种，获得植物花叶的观赏植物品种。

附图说明

图1为本发明实施例中NtTPS7基因在不同组织中的表达水平图；

图2为本发明实施例中NtTPS7基因敲除的靶位点设计示意图；

图3为本发明实施例中T0代转基因株系NtTPS7突变体的表型图；其中A、B、C图均为不同角度下烟草植株NtTPS7-4的表型图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。

生物材料：

烟草品种：红花大金元，其种子由西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室提供。

载体：CRISPR/Cas9基本敲除载体由西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室提供。

-Blunt Zero Cloning Kit载体，购自北京全式金生物技术有限公司。

菌株：Trans1-T1化学感受态细胞、LBA4404农杆菌化学感受态细胞，均购自北京全式金生物技术有限公司。

引物和测序：引物合成以及DNA测序均由北京华大基因完成。

实验试剂：植物DNA提取试剂盒EasyPure Plant Genomic DNA Kit(含RNase A)和DNA纯化试剂盒

PCR Purification Kit PCR均购自北京全式金公司；RNA提取用

reagent(Invitrogen,USA)；反转录试剂盒，

One-Step gDNA Removaland cDNA Synthesis SuperMix，购自北京全式金公司；T4连接酶、限制性内切酶BsaI(NEB)、DNA扩增酶，购自NEB公司；PrimeSTAR Max DNA polymerase购自Takara公司。

实验设备：PCR扩增仪器Veriti(基因有限公司)；凝胶成像系统紫外凝胶成像仪(BIO-RAD)；定量PCR仪器，ABI 7500fast real-time PCR system(赛默飞)。

实施例1：烟草萜类合成酶基因NtTPS7的克隆与序列分析

本发明人基于烟草全基因组测序、进行大量生物信息学分析筛选获得的了烟草萜类合成酶基因NtTPS7；接着以烟草LT1534全基因组cDNA为模板克隆烟草萜类合成酶基因NtTPS7，具体地：

1、cDNA模板制备

按照制造商的说明，使用试剂(美国Invitrogen公司)从烟草植物的新鲜组织中提取总RNA。使用

One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(中国全式金公司)将总RNA反转录为cDNA。

2、PCR产物扩增及回收

用Primer5设计引物，引物序列如下：

CDS-F：5’-ATGGGAAGTTCAGGAGATGCATGGAAATT-3’(SEQ ID NO:3所示)

CDS-R：5’-CTAGTTGTCAACAACCTCAATCAAGCTTG-3’(SEQ ID NO:4所示)

以步骤1中制备的cDNA为模板，并利用设计的引物进行PCR扩增，条件是：98℃2min，28个循环(98℃ 5s，55℃ 15s，72℃ 15s)，72℃ 5min。

3、连接

将PCR产物用

PCR Purification Kit PCR试剂盒纯化回收，连接到

-Blunt Zero载体；体系(5μL)：T载体1μL，片段4μL；反应条件：轻轻混合，25℃反应10min。

4、转化

转化到Trans1-T1感受态细胞(冰浴30min→42℃热激30s→冰浴2min)，加250μL无抗LB液体培养基，220rpm、37℃培养1h。1500转离心1min，弃部分上清，取100-150μL涂板。

5、挑斑

取1.5mL的离心管，加10μL ddH₂O，挑斑将白枪头打到离心管中，然后左右前后晃动板子，弃白枪头，从10μL ddH₂O中吸4μL ddH₂O做菌落PCR。

6、测序验证

菌落PCR阳性克隆菌液摇混后，送华大基因测序验证。

经过公司测序后，分析得到NtTPS7基因序列全长1650bp，其核苷酸序列为SEQ IDNO:1所示，所编码的烟草NtTPS7蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

实施例2：烟草NtTPS7基因在不同组织中的表达模式特征分析

利用荧光定量qRT-PCR方法检测NtTPS7基因在烟草不同组织(根、茎、叶、花)表达模式。采用FastStart UniversalSYBR Green Master(ROX)Realtime试剂盒(Roche)。选用相对定量的方法，以烟草EF1α基因作为内参基因(内参基因的qRT-PCR引物序列如SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:11所示)，模板为上述不同组织下得到的cDNA，每个样品设置3个重复，同时设置阴性对照和阳性对，反应体系如表1所示；

表1

qRT-PCR引物序列：

NtTPS7-qRT-F：5’-AGCCCATTCATACAAATCTACC-3’如SEQ ID NO:8所示；

NtTPS7-qRT-R：5’-CAAGATCTTTCCACCAGTACCT-3’如SEQ ID NO:9所示；

NtEF1α-qRT-F：5’-GCATTGCTTGCTTTCACCCTT-3’如SEQ ID NO:10所示；

NtEF1α-qRT-R：5’-AACCTCCTTCACGATTTCATCATACC-3’如SEQ ID NO:11所示；

反应体系充分混匀后放入ABI7500荧光定量PCR系统进行PCR反应，采用的三步法的PCR反应程序，利用2^-ΔΔCt方法确定目标基因的相对表达量；

结果如图1所示，结果表明，NtTPS7基因在根中表达量最高。

实施例3：基因编辑载体的构建

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对烟草NtTPS7基因靶位点进行设计，构建NtTPS7基因敲除载体；对烟草品种进行遗传转化，获得转基因烟草植株；

1、设计靶位点：

Target：ACAAAGGCATTACATGTCTT(如SEQ ID NO:5所示)

人工合成加接头序列

Target-F：GATTgACAAAGGCATTACATGTCTT(如SEQ ID NO:6所示)

Target-R：aaacAAGACATGTAATGCCTTTGTc(如SEQ ID NO:7所示)

2、敲除载体构建

①单链oligo DNA退火形成双链DNA

将合成的2条单链的引物(Target-F以及Target-R)稀释成50μM，然后退火，退火反应体系如表2所示；

表2

将反应体系PCR仪中95℃孵育3min，孵育后自然冷却至室温。

②表达载体的酶切

表达载体：pORE-Cas9/gRNA，用Bsa Ⅰ酶切表达载体，酶切体系如表3所示，37℃酶切1h，回收酶切产物；

表3

③靶位点连接到表达载体上，连接体系如表4所示，25℃连接10min。

表4

④连接产物转化感受态细胞，经PCR验证获得阳性克隆。经测序并比对后表明克隆成功。

实验例4：烟草NtTPS7基因敲除植株的获得

1、将构建好的pORE-Cas9/NtTPS7载体转化农杆菌感受态LBA4404，利用农杆菌介导的烟草叶盘转化法对栽培烟草品种K326进行了遗传转化，获得了具有抗卡那霉素的T0代阳性转化苗。具体转化步骤为：

(1)农杆菌转化

①将构建好的敲除载体加到100μL农杆菌感受态细胞LBA-4404中；

②冰浴30min后液氮速冻1min，再37℃水浴5min；

③加入1mLYEB液体无抗培养基，28℃、200rpm下处理3h，取出；

④3000rpm离心3min后，去部分上清，取150μL涂到含有利福平，链霉素和卡那霉素的平板上；

⑤28℃，黑暗倒置培养2-3天；

(2)烟草遗传转化

用MS液体培养基悬浮农杆菌至OD值为0.6-0.8，侵染烟草叶盘10min，后黑暗共培养3天，选择培养至生长出愈伤组织并切芽；

2、分子检测

用特异性引物扩增再生烟草基因组中sgRNA附近的基因组序列是否发生编辑，具体地：提取阳性烟苗叶片基因组DNA，采用如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的引物，以基因组DNA为模板，对目的片段进行PCR扩增，对PCR产物进行纯化回收，连接克隆载体进行测序，用以检测靶位点片段突变形式。

收取靶位点被编辑的T0代转基因阳性植株种子，本发明实验中T0代转基因株系敲除靶位点的基因编辑情况图如表5所示；

表5

由上可知，烟草植株NtTPS7-4和NtTPS7-8中NtTPS7基因均已被成功编辑，NtTPS7-4植株中检测到NtTPS7靶区区段有一个碱基“C”插入；NtTPS7-8植株中检测到NtTPS7靶区区段有一个碱基“A”替换成了“T”；NtTPS7-7植株未成功编辑。

3、转基因株系NtTPS7表型观察

图3为本发明实验中T0代转基因株系NtTPS7突变体的表型图，由图3可知，NtTPS7基因敲除的突变株系，其叶片颜色部分变成浅绿色。

综上可知，本实施例中基于基因编辑载体CRISPR/Cas9，利用叶盘遗传转化方法将该基因敲除载体转化到烟草叶盘中，获得了NtTPS7基因的敲除株系，该突变株系叶片部分位置颜色变浅，展现出花叶的表型；获得了植物花叶的烟草植株。

所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 云南中烟工业有限责任公司

<120> 烟草萜类合成酶基因NtTPS7及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1650

<212> DNA

<213> 烟草(Nicotiana tabacum L.)

<400> 1

atggatgata atactttcag cagtagtatt agtactacta atattgaacg tccattggca 60

aattttcact caagtgtctg gggagactat ttcctctcct acactcctca actcacggaa 120

attagtagcc aagaaaaagt tgaatttgaa gagttgaaag aaaaagtcag gcaaatgcta 180

gttgaaacac ctgataataa aacacaaaaa cttgaattga ttgatacaat ccaacgattg 240

ggagttgcat atcatttcga aaatgagatt caaacatcca ttaagaacat ctttgatgca 300

tcccaacaga gtgaaaataa agatgacaac ctttacgttg ttgctcttcg ttttcgacta 360

atgagacaac aaaggcatta catgtcttcg gatgtgttca agaaattcac caacaaagat 420

ggaaggttca aggaaactct taccaaagat gtacaaggat tattaagttt atatgaagca 480

gcacatctaa gagtacatgg ggaagaaatt cttgaacaag ctatgagttt tacactcact 540

aatttggagt caatgggccc taaattgagc aactcattac ttaaggccca agttagtgaa 600

gccttaagcc agcccattca tacaaatcta ccaagagttg gagcaaagaa atacatgtct 660

atgtatgagg aaaatgaatc acataatgat ttgcttttga aatttgcaaa attggatttt 720

aacattgcgc aaaaggtgta ccaaagcgag ctttacgagt tcacaaggta ctggtggaaa 780

gatcttgatt atgcaaataa atttccatat gcaagagaca gattggtgga gtgttactat 840

ggggcagtgg gagtgttatt tgagcctcaa tatagtcgta caagaaaaat tcaagcaaaa 900

ttaatcaaca tcatcaccat ggttgatgat acttttgatg cttatgcaac ctttgacgaa 960

attgtggctt tcacaaatgc gatagagaga tgcgacatta gtgccatgga tttagtaccg 1020

cccaatttga gacatgctta tcaagtctta atagattttt tcaatgaaat ggaacaagaa 1080

ttggcaaaag aaggtaaagc ataccgtgtc tactatgcaa aatttgtgat gaaaaaatgt 1140

atcagagcct atttcaagga agcccaatgg ttgagtgctg gctatattcc aaaatgtgat 1200

gagtatttga aaaatggaag tgcaagcatt ggcattatat tgatggcagt aacttctttg 1260

gttggtttgg aggaatttat aaccaaagaa actttagaat gggtgataaa tgatcctttg 1320

attcttcgag cttcaggagt aataagcaga ttaaaggatg acattattgg acataatttt 1380

gagcaacaaa gaggacatgt agcttcaatc attgaatgct acatgaaaga acatggagtt 1440

tcgaagcaag aggcatatgc tgcggttgac aaggaaatgg ctaatgcatg gaaagacata 1500

aacacagaat tcttccgccc ttctcaagta ccaacgtttg tcctcgaacg aattataaat 1560

cctacaccac tggagaatga ttttataaat actcaaggcg aatataaaga caaaatcacc 1620

tcattgcttg ttgactccat gaaaatatga 1650

<210> 2

<211> 501

<212> PRT

<213> 烟草(Nicotiana tabacum L.)

<400> 2

Met Leu Val Glu Ile Pro Asp Asn Ser Ile Gln Lys Leu Glu Leu Ile

1 5 10 15

Asp Thr Ile Gln Arg Leu Gly Val Ala Tyr His Phe Lys Asn Asp Ile

20 25 30

Lys Thr Ser Ile Arg Asn Ile Ser His Ala Ser Gln Gln Ser Glu Asn

35 40 45

Glu Asp Asp Asn Leu Tyr Ala Val Ala Leu Arg Phe Arg Leu Leu Arg

50 55 60

Gln Gln Arg His His Met Ser Tyr Asp Val Phe Lys Lys Phe Thr Asn

65 70 75 80

Lys Asp Gly Lys Phe Lys Glu Thr Leu Thr Lys Asp Ile Gln Gly Leu

85 90 95

Leu Ser Leu Tyr Glu Ala Ala His Leu Arg Val His Gly Glu Glu Ile

100 105 110

Leu Glu Gln Ala Leu Ser Phe Thr Leu Thr Asn Leu Glu Ser Met Gly

115 120 125

Pro Lys Leu Ser Asn Ser Ser Leu Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Leu

130 135 140

Ser Gln Pro Ile His Thr Asn Leu Pro Arg Met Thr Ala Arg Asn Tyr

145 150 155 160

Ile Ser Met Tyr Glu Asn Asn Glu Ser His Asn Asn Leu Asp Leu Leu

165 170 175

Leu Lys Phe Ala Lys Leu Asp Phe Asn Ile Val Gln Lys Val His Gln

180 185 190

Arg Glu Leu Gly Glu Leu Thr Arg Trp Trp Lys Asp Leu Asn Phe Ala

195 200 205

Lys Lys Phe Pro Tyr Ala Arg Asp Arg Leu Val Glu Cys His Phe Tyr

210 215 220

Thr Val Gly Ile Tyr Phe Glu Pro Gln Tyr Ser Arg Ala Arg Glu Met

225 230 235 240

Met Thr Lys Leu Leu Thr Ile Tyr Thr Val Ile Asp Asp Thr Tyr Asp

245 250 255

Ala Tyr Ala Thr Tyr Asp Glu Leu Val Pro Phe Thr Asp Ala Ile Asp

260 265 270

Lys Cys Gly Cys Asp Ile Ser Ala Ile Ser Ser Val Pro Pro Ser Leu

275 280 285

Lys Pro Ala Tyr Gln Ala Leu Val Asp Leu Tyr Ala Gln Ile Glu Glu

290 295 300

Lys Phe Ile Arg Glu Gly Lys Leu Asp Arg Leu Cys Phe Ala Lys Tyr

305 310 315 320

Glu Met Lys Lys Leu Ala Arg Ala Phe Phe Lys Glu Ala Glu Trp Leu

325 330 335

Asn Ala Gly Tyr Ile Pro Lys Cys Asp Glu Tyr Met Lys Asn Ala Asn

340 345 350

Ile Thr Thr Thr Cys Met Met Val Ala Thr Thr Ser Leu Ser Phe Met

355 360 365

Glu Glu Ser Ile Ala Lys Glu Thr Phe Glu Trp Met Ile Asp Glu Pro

370 375 380

Leu Ile Leu Arg Ala Ser Ser Ala Ile Asn Arg Leu Lys Gly Asp Cys

385 390 395 400

Ile Gly His Asn Leu Glu Gln Gln Arg Lys His Ile Ala Ser Phe Ile

405 410 415

Glu Cys Tyr Val Lys Glu Tyr Gly Gly Ser Lys Gln Asp Ala Tyr Ala

420 425 430

Glu Ala Gln Lys Lys Ile Thr Asn Ala Trp Lys Asp Met Asn Lys Asp

435 440 445

Phe Leu Cys Ser Thr His Asn Glu Val Pro Thr Phe Val Leu Glu Leu

450 455 460

Val Ile Asn Ile Ala Arg Leu Ala Tyr Ile Phe Glu Glu Asn Asp Phe

465 470 475 480

Ala Ser Ala Gln Ser Glu Phe Lys Asp Lys Ile Thr Met Leu Phe Val

485 490 495

Glu Pro Val Asn Leu

500

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggaagtt caggagatgc atggaaatt 29

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctagttgtca acaacctcaa tcaagcttg 29

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acaaaggcat tacatgtctt 20

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gattgacaaa ggcattacat gtctt 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaacaagaca tgtaatgcct ttgtc 25

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agcccattca tacaaatcta cc 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caagatcttt ccaccagtac ct 22

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcattgcttg ctttcaccct t 21

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aacctccttc acgatttcat catacc 26

Claims

1.一种烟草萜类合成酶基因NtTPS7，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的烟草萜类合成酶基因NtTPS7，其特征在于：该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种基因敲除载体，其特征在于：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对烟草NtTPS7基因设计靶位点敲除序列后基因编辑获得。

4.根据权利要求3所述的基因敲除载体，其特征在于：靶位点敲除序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，在靶位点敲除序列两侧加上人工合成的接头序列，得到核苷酸序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的引物对，引物对经退火后，连接到经BsaI酶切的载体pORE-Cas9上，获得基因敲除载体pORE-Cas9/NtTPS7。

5.权利要求1所述的烟草萜类合成酶基因NtTPS7，或权利要求3或4所述的基因敲除载体在制备不同颜色叶片的植物品种中的应用。