CN115044620B - 微卫星重复序列敲除突变体的构建方法和应用 - Google Patents
微卫星重复序列敲除突变体的构建方法和应用 Download PDFInfo
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- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
Abstract
本发明公开了微卫星重复序列敲除突变体的构建方法和应用，利用CRISPR技术敲除基因组微卫星重复序列NGGN，包括设计gRNA位点‑PCR‑纯化‑体外转录和纯化‑显微注射‑产生表型‑胚胎死亡‑表型分析的步骤。本发明首次利用CRISPR系统设计针对微卫星重复序列NGGN新的gRNA靶点，通过敲除或结合微卫星重复序列NGGN对斑马鱼基因组中包含微卫星NGGN的重复序列产生作用，产生胚胎爆裂表型，同时发现不同切割效果的Cas9蛋白与sgRNA共注射斑马鱼胚胎都能产生表型。该重复序列突变体的细胞骨架异常且P53信号通路受到影响，可作为动物模型用于研究微卫星在基因组中功能和其与疾病关系。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及微卫星重复序列敲除突变体的构建方法和应用，具体是利用CRISPR技术在斑马鱼中敲除基因组微卫星重复序列NGGN。
背景技术
CRISPR被称为规律成簇间隔短回文重复，是最初在原核生物中发现的重复片段，CRISPR和CRISPR相关(Cas)蛋白质是古细菌和细菌中适应性免疫系统的一部分，用于抵御来自质粒和噬菌体的入侵核酸。后来，研究人员发现，它似乎是一种精确的万能基因工具，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因。目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型即I型、II型和III型，它们存在于大约40％已测序的真细菌和90％已测序的古细菌中，其中II型的组成较为简单，也是目前研究中最深入的类型。CRISPR/Cas9系统由Cas9蛋白、crRNA和tracrRNA 3部分组成，将crRNA和tracrRNA结合成一个单一的指导RNA(sgRNA)进一步简化系统，系统中的sgRNA将Cas9蛋白定向到与sgRNA序列匹配的DNA靶点，与该靶点结合后，Cas9蛋白通过切割两条链上的DNA产生双链断裂(DSB)。CRISPR/Cas9的剪切位点位于crRNA互补序列下游邻近的PAM区的5'-N20-NGG-3'特征区域中的NGG位点，而这种特征的序列在每128bp的随机DNA序列中就重复出现一次。CRISPR/Cas9系统在基因组编辑上凭借其效率高、成本低和操作简单等优势受到广大科研工作者的青睐，已经在基因功能研究、生物医疗、植物遗传改良和分子育种等方面发挥着重要的作用。
目前，CRISPR/Cas系统的应用迅速发展，远远超出最初在所需位点诱导DSB的功能。突变Cas9的两个核酸酶结构域中的一个或两个，分别导致Cas9切口酶(Cas9n)和催化死亡Cas9(dCas9)的产生，前者只诱导单链缺口，后者则不具有核酸酶活性。dCas9可以通过物理占据基因来阻断转录，或者它可以作为荧光团(例如绿色荧光蛋白(GFP))、转录激活剂或抑制剂(即CRISPRa或CRISPRi)以及去甲基化酶和碱基编辑器等表观遗传修饰剂的支架发挥作用。
现有文献报道CRISPR/Cas技术可以在基因的转录因子结合位点、启动子区、外显子(编码序列)、内含子(非编码序列)和非翻译区实现定点基因敲除、特异突变引入及定点修饰。但还没有利用CRISPR编辑基因组高频重复序列的报道，而人类基因组中重复序列的比例约占45％，在真核生物和原核生物基因组中均存在许多DNA重复序列，这些DNA重复序列大多数是非编码的DNA序列，长期以来，该DNA被认为是“垃圾DNA”或者“寄生DNA”，微卫星DNA就是这其中的一员。微卫星，也称为简单序列重复序列(SSR)或短串联重复序列(STR)，由1-6bp核苷酸的串联重复序列组成，在人类基因组中约占3％。在真核基因组中，微卫星DNA分为单核苷酸、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体核苷酸重复序列，研究表明三聚体核苷酸致病性最高，与很多人类疾病相关，但是大多数致病机制还不清楚。微卫星还因其在多达40种神经系统疾病中的致病作用而广为人知，包括亨廷顿氏病、弗里德里希共济失调(FRDA)、几种脊柱脊髓共济失调(SCA)、强直性肌营养不良症1型(DM1)和2型(DM2)。迄今为止，已经鉴定出超过25个具有串联重复序列扩增的人类基因与这些疾病相关，这些致病重复序列可以出现在编码区或非编码区，研究表明在这些疾病中，三核苷酸微卫星的自由基扩增是致病的。
目前，研究发现大部分与人类疾病相关的微卫星是三核苷酸重复的，四核苷酸重复与人类疾病相关的报道还比较少，并且很多疾病的致病机制都尚不清楚。模式动物斑马鱼适合于微卫星重复序列NGGN功能研究，首先斑马鱼胚胎透明，便于观察和研究其发育过程，斑马鱼生殖周期短，胚胎发育时间短，利于实验操作观察；其次微卫星重复序列NGGN在斑马鱼基因组中分布广泛，符合CRISPR/Cas9编辑基因的PAM序列要求，利于实验进行，通过CRISPR技术研究NGGN重复序列在斑马鱼基因组中的功能机制，可以进一步阐述微卫星在基因组中的功能及其重要性，同时探究微卫星DNA与癌症发生的关系，找到其中存在的机制，可以为癌症治疗提供更多的方案，对于基因组中微卫星重复序列的研究知之甚少，目前还没有利用CRISPR技术研究重复序列的报道。
发明内容
本发明的主要目的是提供微卫星重复序列敲除突变体的构建方法，首次利用CRISPR技术设计一段微卫星重复序列NGGN的sgRNA序列，通过显微注射的方式对斑马鱼基因组中包含微卫星NGGN的重复序列产生作用，使斑马鱼基因组产生变化，构建微卫星重复序列NGGN敲除突变体斑马鱼系。
本发明的另一目的是提供上述微卫星重复序列敲除突变体作为动物模型在研究微卫星在基因组中功能和其与疾病关系中的应用。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供微卫星重复序列敲除突变体的构建方法，包括设计gRNA位点-PCR-纯化-体外转录和纯化-显微注射-产生表型-胚胎死亡-表型分析，包括以下步骤：
S1、通过CRISPR/Cas9设计针对微卫星重复序列NGGN的靶点sgRNA序列，如SEQ IDNO:1所示；
S2、设计并合成gRNA引物，序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；
S3、以上述gRNA引物和gRNA骨架质粒为模板进行PCR反应，电泳检测PCR产物，纯化；
S4、上述PCR纯化产物RNase-Free条件下体外转录得到gRNA，转录体系中加入T7聚合酶和NTP进行反应，纯化；
S5、纯化后的gRNA和Cas9蛋白混合后显微注射到单细胞期的胚胎中；
S6、不同切割效果的Cas9蛋白分别与sgRNA混合后显微注射到单细胞期的胚胎中；
S7、微卫星重复序列NGGN的Morpholino反义寡核苷酸用RNase-Free的水溶解，合成的NGGN重复序列的mRNA构建到PXT7表达载体上体外转录，转录后的NGGN mRNA和NGGN MO分别注射到受精卵中；
S8、将P53 MO和NGGN MO注射到胚胎中，观察发现微卫星重复序列敲除突变体的表型缓解现象。
优选地，按照所述的构建方法构建斑马鱼微卫星重复序列NGGN敲除突变体，包括以下步骤：
(1)通过CRISPR/Cas9设计针对微卫星重复序列NGGN的靶点sgRNA序列，如SEQ IDNO:1所示；
(2)设计并合成gRNA引物，序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；
(3)以上述gRNA引物和gRNA骨架质粒为模板进行PCR反应，电泳检测PCR产物后，进行纯化；
(4)RNase-Free条件下，将上述PCR纯化产物进行体外转录得到gRNA，转录体系中加入T7聚合酶和NTP，37℃反应1.5h，进行纯化；
(5)纯化后的gRNA和Cas9蛋白混合后显微注射到斑马鱼单细胞期的胚胎中，2h后开始观察并记录表型，4h表型出现时检测基因组完整性；
(6)分别将不同切割效果的Cas9蛋白与sgRNA混合后显微注射到斑马鱼单细胞期的胚胎中，观察胚胎的发育情况；
(7)微卫星重复序列NGGN的Morpholino反义寡核苷酸用RNase-Free的水进行溶解，合成的NGGN重复序列的mRNA构建到PXT7表达载体上进行体外转录，将转录后的NGGNmRNA和浓度为12ng/μL NGGN MO分别注射到鱼卵中，观察胚胎发育情况；
(8)将浓度为20ng/μL的P53 MO和NGGN MO注射到胚胎中，观察胚胎的表型并统计死亡率；
(9)用鬼笔环肽对斑马鱼胚胎的细胞骨架进行染色，观察细胞骨架形态，观察发现斑马鱼微卫星重复序列NGGN敲除突变体的细胞骨架异常。
作为优选，步骤(3)中，所述PCR反应的条件为：预变性94℃3min；变性94℃30s，退火65℃30s，延伸72℃30s进行35个循环，再72℃10min，最后保温在12℃。
作为优选，步骤(6)中，所述Cas9蛋白包括切割双链的HiFi Cas9蛋白、切割单链的D10A Nickase Cas9以及只结合到序列上不切割的dCas9蛋白。
作为优选，步骤(6)中，不同切割效果的Cas9蛋白注射后都产生胚胎爆裂表型。
作为更优选，步骤(6)中，sgRNA与切割双链的HiFi Cas9蛋白注射后出现胚胎爆裂表型，具体是：注射NGGN sgRNA后的胚胎发育到sphere时期出现出泡现象，随着发育的进行出泡变严重，并且胚胎发育停滞在sphere时期，直到50％epiboly时期时胚胎发生爆裂死亡。
作为优选，步骤(7)中，当NGGN MO注射后在50％epiboly时胚胎出泡严重；当NGGNmRNA注射后在70％epiboly时，胚胎出泡严重且发育迟缓，最终胚胎爆裂死亡。
作为优选，步骤(8)中，P53 MO可以部分缓解NGGN MO所产生的表型，出现缓解发育延缓现象。
作为优选，步骤(9)中，在50％epiboly表型严重时出现细胞骨架发生紊乱现象。
本发明还提供微卫星重复序列敲除突变体作为动物模型在研究微卫星在基因组中功能和其与疾病关系中的应用，其中所述微卫星重复序列敲除突变体通过上述微卫星重复序列敲除突变体的构建方法得到，且产生胚胎爆裂表型。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明首次利用CRISPR/Cas9系统设计针对微卫星重复序列NGGN新的gRNA靶点，通过敲除微卫星重复序列NGGN对斑马鱼基因组造成改变，对斑马鱼基因组中包含微卫星NGGN的重复序列产生作用，产生胚胎爆裂表型，可作为动物模型用于研究微卫星在基因组中功能和其与疾病关系，本发明建立CRISPR敲除重复序列的方法具有重要意义，构建的微卫星重复序列敲除突变体作为动物模型为后续功能研究和人类相关疾病的探索提供良好基础。
(2)本发明将不同切割效果的Cas9蛋白(包括切割双链的HiFi Cas9蛋白、切割单链的D10A Nickase Cas9以及只结合到序列上不切割的dCas9蛋白)与合成的NGGN靶点sgRNA混合后显微注射斑马鱼单细胞期的胚胎都能产生爆裂表型，说明即使不用切割序列，斑马鱼突变体胚胎也会出现表型，方式方法上有一定的开创性。
(3)本发明对注射后的胚胎进行细胞骨架的检测，发现胚胎表型出现时细胞骨架紊乱，表型出现前则没有，说明细胞骨架紊乱是表型出现后引起的，还发现P53 MO可以部分缓解NGGN MO所产生的表型，缓解发育延缓现象。本发明还首次报道重复序列NGGN的表型，及影响的分子信号通路。
附图说明
图1为微卫星重复序列NGGN在人类、斑马鱼、非洲爪蟾、线虫和果蝇基因组中的数量。
图2为微卫星重复序列NGGN在斑马鱼基因组中的分析结果；其中：(A)NGGN在斑马鱼染色体上的分布；(B)斑马鱼染色体上符合CRISPR/Cas9技术打靶的靶点个数；(C)NGGN在基因组中分布位置分析图；(D)NGGN在基因组中存在的靶点长度及数目。
图3为微卫星重复序列NGGN的sgRNA合成结果；其中：(A)注射靶点成功合成；(B)注射NGGN靶点后基因组完整性检测结果。
图4为NGGN靶点与切割双链的HiFi Cas9蛋白注射后的爆裂表型，其中标尺：0.1mm。
图5为NGGN靶点与不同切割效果的Cas9蛋白(包括切割双链的HiFi Cas9蛋白、切割单链的D10A Nickase Cas9以及只结合到序列上不切割的dCas9蛋白)混合后注射斑马鱼胚胎的表型分析结果，其中标尺：0.1mm。
图6为P53 MO部分挽救NGGN MO所导致的表型；其中：(A)20ng浓度下P53 MO挽救NGGN MO所导致的表型结果图；(B)20ng浓度下P53 MO挽救NGGN MO的存活曲线图，标尺：0.1mm。
图7为50％epiboly时期细胞骨架染色结果，其中标尺：0.2mm。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
(1)实验对象
使用的斑马鱼为野生型斑马鱼AB品系，来源于上海海洋大学水产与生命学院斑马鱼平台，按照上海海洋大学动物伦理相关规定进行(IACUC SHOU-DW-2021-042)，斑马鱼生活的环境是经过UV及曝气处理过的循环水系统，水温为28.5℃，pH值和电导率均在正常指标内，光照也是严格按照要求每天黑暗10h，光照14h。斑马鱼在专门的产卵缸中交配产卵，将收集的斑马鱼鱼卵放于28.5℃的恒温培养箱培养。斑马鱼一般在48h左右开始破膜，5天后投喂草履虫，20天后开始喂丰年虫，一个月左右进入循环系统中饲养，一个半月分缸饲养，注意性别分化。
(2)所用试剂
本实施例中所用的引物均由上海生工生物公司合成，所用的gRNA骨架质粒来自于文献：Chang N,Sun C,Gao L,Zhu D,Xu X,Zhu X,Xiong JW,Xi JJ.Genome editing withRNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos，Cell Res,2013,23(4):465-472。Cas9购自南京金斯瑞生物公司，PCR反应的酶购自北京全式金生物公司，其余无机(NaOH，Tris-HCl等)及有机试剂(乙醇等)购自国药集团化学试剂有限公司。
(3)主要仪器
紫外分光光度计(Thermo Scientific company——Nanodrop 2000C)、纯水仪(默克密理博company——Milli-Q Direct 8)、-40℃低温冰箱(Haier——DW-40L508)、大离心机(eppendorf company——Centrifuge 5810R)、恒温培养箱(SANYO company——MIR-262)、高压蒸汽灭菌锅(SANYO company——MLS-3780)、电泳仪(BIO-RAD——PowerPacBasic)、4℃冰箱(Haier——HYC-610)、照胶仪(BIORAD company——Gel Doc EZ Imager)、震荡混匀仪(VORTEX-GENIE company——G560E)、PCR扩增仪(BIO-RAD company——C1000Touch)、-80℃超低温冰箱(Panasonic company——MDF-U53V)、制冰机、恒温水浴锅。
本实施例通过CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼微卫星重复序列NGGN，技术路线为：设计gRNA位点-PCR-纯化-体外转录和纯化-显微注射-产生表型-胚胎死亡-表型分析，具体为：
(1)通过GGGenome对斑马鱼基因组中所有的微卫星进行数量分析，发现微卫星NGGN在斑马鱼基因组中数目较多(表1)，其中较为常见的NGGNNGGNNGGNNGGNNGGN重复序列在斑马鱼中有56241个(图1)。随后将数据通过TBtools软件作图，得出该重复序列在斑马鱼染色体上的分布情况图，颜色越深的地方说明分布的越多，发现其在斑马鱼基因组中分布较为均匀，每条染色体上都有很多微卫星NGGN(图2，A)。基于此设计gRNA序列：5’-NGGNNGGNNGGNNGGNNGGN-3’(SEQ ID NO:1)，同时设计一段无义的sgRNA作为对照，其序列为5'-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3'。
表1
此外，通过基因组分析得到微卫星NGGN在基因组的位置分布特点等信息，根据CRISPR识别PAM区(NGG)的特点，找出所有符合的打靶位点，统计斑马鱼基因组中每条染色体上符合打靶的位点的数目(图2，B)，统计后发现可以打靶的位点有1万多处，说明微卫星NGGN在斑马鱼基因组中大量存在，含量丰富。通过分析靶点所处序列中的位置，发现这些靶点中有大约53.69％分布在基因间隔区，有大约43.65％分布在内含子中，只有极少部分分布在染色体的其他地方(图2，C)。由于微卫星NGGN是个串联重复序列，靶点长度不固定，统计可能存在的靶点长度以及所对应的靶点数目，得出随着靶点长度的变长符合敲除的靶点数目在不断变少，表明在基因组中长串联的NGGN不多，主要以短串联序列存在，集中在100bp以下，串联长度达到100bp以上的极为少数(图2，D)。
(2)设计并合成gRNA引物，引物序列为：
F1：5’-TAATACGACTCACTATANGGNNGGNNGGNNGGNNGGNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(SEQ ID NO:2)；
R1：5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’(SEQ ID NO:3)。
(3)以上述gRNA引物和gRNA骨架质粒为模板进行PCR反应，反应体系为：
PCR反应条件为：预变性94℃3min；变性94℃30s，退火65℃30s，延伸72℃30s进行35个循环，再72℃10min，最后保温在12℃；电泳检测PCR产物后，利用DNA纯化试剂盒进行纯化，用RNase-Free的水进行溶解洗脱，Nanodrop分光光度计检测浓度。
(4)RNase-Free条件下，将上述的PCR纯化产物进行体外转录得到gRNA，转录体系为：
反应条件为：37℃-1.5h，后加入DNase 1μL，37℃-15min。体外转录后用LiCl沉淀法对gRNA进行纯化，具体方法为：向上述反应液中加入2.5μL的4M LiCl,再加入100μL的100％乙醇；放置-80℃冰箱孵育至少2小时(也可以过夜处理)；4℃、12000rpm、15min，弃上清；用预冷的70％乙醇洗两次，4℃、8000rpm、10min，弃上清，目的是为了去除杂质；超净台中室温通风晾干5min；最后加入15μL RNase-free水溶解，Nanodrop检测浓度。150V，15min，1％琼脂糖凝胶电泳检测合成质量。
(5)将前述纯化后的gRNA和Cas9蛋白混合后显微注射到斑马鱼单细胞期的胚胎中，注射时Cas9蛋白终浓度800ng/μL，gRNA终浓度100ng/μL，注射1nL，2h后观察并记录表型，进行表型分析，注射时需要留有一部分未注射的鱼卵作为对照。4h表型出现时取3组，5枚胚胎一组放入PCR小管中，利用碱裂法提取基因组：向每管中加入30μL 50mM NaOH溶液，95℃，10min后取出，在震荡仪上充分震碎组织后；继续95℃，10min；加入3μL 1M Tris-HCl(pH＝8)后，震荡混匀，离心10000rpm，5min，将提取的基因组进行琼脂糖凝胶电泳检测基因组完整性。
(6)分别将不同切割效果的Cas9蛋白(HiFi Cas9蛋白：切割双链；D10A NickaseCas9：切割单链；dCas9蛋白：只结合到序列上，并不切割)与sgRNA混合后显微注射到斑马鱼单细胞期的胚胎中，观察胚胎的发育情况。
(7)NGGN微卫星重复序列的Morpholino反义寡核苷酸来自北京四正柏生物科技公司，用RNase-Free的水进行溶解，终浓度为20mM；NGGN重复序列的mRNA在南京金斯瑞生物科技有限公司合成，后构建到PXT7表达载体上，再进行体外转录，将转录后的NGGN mRNA和浓度为12ng/μL NGGN MO分别注射到鱼卵中，观察胚胎发育情况。
(8)将浓度为20ng/μL的P53 MO和NGGN MO注射到胚胎中，观察胚胎的表型并统计死亡率。
(9)鬼笔环肽染色：
a.胚胎预处理
收集不同时期的胚胎，用PBST清洗干净，4％PFA-PBS 1mL/管，4℃轻摇固定过夜，之后用PBST清洗两遍，一次5min，然后进行乙醇脱水处理：依次用30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、100％乙醇进行梯度脱水，每次5min，需要在摇床上进行脱水，最后放在-20℃的冰箱中进行保存，需要时取出进行梯度复水。
b.染色
染色试剂购自Solarbio公司，以溶于甲醇的20uM储存液形式提供，推荐工作浓度为80-200nM，现配现用，使用浓度为100nM，用1×PBS缓冲液进行稀释200倍，每管500μL，37℃避光轻摇孵育1h。
c.移去反应液，将斑马鱼鱼卵转移至2mL离心管(注意避光)，PBST 1mL/管，室温轻摇洗涤3次/5min。
d.稀释33342solution in PBS获得/>33342solution(终浓度5μg/mL)，取1mL/管，37℃轻摇孵育30min。
e.移去33342solution，PBST 1mL/管，室温轻摇洗涤5次/5min。
f.1％低熔点胶固定，进行共聚焦拍照。
结果
(1)微卫星NGGN重复序列sgRNA的合成
微卫星NGGN重复序列的sgRNA合成结果如图3A所示，成功合成注射靶点。
(2)注射NGGN靶点后基因组完整性的检测
将合成的gRNA与Cas9蛋白混合后显微注射到斑马鱼中，检测其基因组是否有断裂，因为该靶点在斑马鱼基因组中大量存在，是一个非特异的靶点，如果靶点产生作用，将会引导Cas9蛋白对其基因组进行切割，使完整的基因组产生断裂，从而使基因组出现片段化。但是提取基因组，琼脂糖凝胶电泳检测发现，基因组并没有片段化(图3，B)。
(3)不同条件下打靶微卫星NGGN胚胎的表型
切割双链的Cas9蛋白注射后胚胎表型如图4所示，比对WT和control鱼卵的发育过程，发现注射了NGGN sgRNA后的胚胎发育到sphere时期会出现出泡现象，随着发育的进行，出泡变的严重，并且胚胎发育会停滞在sphere时期，直到50％epiboly时期时，胚胎发生爆裂死亡。将三种不同切割效果的Cas9蛋白与sgRNA共注射时都出现胚胎爆裂表型，且都在sphere出现表型，50％epiboly时期死亡。注射NGGN MO的胚胎在50％epiboly也出现相似表型，胚胎出现箭头所指的凋亡小泡。注射NGGN mRNA进行过表达实验的胚胎会在70％epiboly时期出现严重表型，且发育迟缓，最终也会爆裂死亡(图5)。结果表明微卫星NGGN在斑马鱼基因组中具有某种重要功能作用，即使不用切割序列，胚胎也会出现表型。
(4)注射浓度为20ng/μL的P53 MO和NGGN MO的胚胎表型观察和死亡率统计
当注射20ng/μL NGGN MO时，胚胎在12h 6-somite时期产生表型，动物极会有凋亡小泡出现，胚胎死亡并且整个胚胎动物极变黑，且发育延迟将近2小时。注射P53的MO的胚胎发育正常，将NGGN MO和P53 MO一起注射，浓度各为20ng/μL，发现其表型得到缓解，并且发育也得到缓解(图6，A)。通过对其各自的生存率进行统计，得出在2h时表型出现。到16h时，注射NGGN MO的胚胎的生存率要远低于注射NGGN MO和P53 MO的生存率。16h-18h期间也是如此，注射NGGN MO的胚胎几乎全部死亡(图6，B)。由此可见，P53 MO可以部分缓解NGGN MO所产生的表型，缓解发育延缓现象。
(5)鬼笔环肽染色表明表型发生时细胞骨架紊乱
如图7所示，当胚胎发育至50％epiboly时，NGGN KO的胚胎仍然处于sphere时期，发育停滞，且细胞骨架已经紊乱，进一步验证其爆裂表型。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海海洋大学
<120> 微卫星重复序列敲除突变体的构建方法和应用
<141> 2022-06-30
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
nggnnggnng gnnggnnggn 20
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
taatacgact cactatangg nnggnnggnn ggnnggngtt ttagagctag aaatagc 57
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
aaaaaaagca ccgactcggt gccac 25
Claims (8)
1.微卫星重复序列敲除突变体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、通过CRISPR/Cas9设计针对斑马鱼微卫星重复序列NGGN的靶点gRNA序列，如SEQ IDNO:1所示；
S2、设计并合成gRNA引物，序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；
S3、以所述gRNA引物和gRNA骨架质粒为模板进行PCR反应，电泳检测PCR产物，纯化，得到PCR纯化产物；
S4、所述PCR纯化产物在RNase-Free条件下体外转录得到gRNA，转录体系中加入T7聚合酶和NTP进行反应，纯化；
S5、纯化后的gRNA和Cas9蛋白混合后显微注射到斑马鱼单细胞期的胚胎中；
S6、不同切割效果的Cas9蛋白分别与gRNA混合后显微注射到斑马鱼单细胞期的胚胎中；
S7、微卫星重复序列NGGN的Morpholino反义寡核苷酸用RNase-Free的水溶解，合成的NGGN重复序列的mRNA构建到PXT7表达载体上体外转录，转录后的NGGN mRNA和NGGN MO分别注射到斑马鱼受精卵中；
S8、将P53 MO和NGGN MO注射到斑马鱼胚胎中，观察发现斑马鱼微卫星重复序列敲除突变体的表型缓解现象；
S9、用鬼笔环肽对斑马鱼胚胎的细胞骨架进行染色，观察细胞骨架形态，发现斑马鱼微卫星重复序列NGGN敲除突变体的细胞骨架出现异常。
2.根据权利要求1所述的微卫星重复序列敲除突变体的构建方法，其特征在于，按照权利要求1所述微卫星重复序列敲除突变体的构建方法构建斑马鱼微卫星重复序列NGGN敲除突变体，还包括以下步骤：
（1）权利要求1所述纯化后的gRNA和Cas9蛋白混合后显微注射到斑马鱼单细胞期的胚胎中，观察并记录表型，表型出现时检测基因组完整性；
（2）不同切割效果的Cas9蛋白分别与gRNA混合后显微注射到斑马鱼单细胞期的胚胎中；
（3）微卫星重复序列NGGN的Morpholino反义寡核苷酸用RNase-Free的水溶解，合成的NGGN重复序列的mRNA构建到PXT7表达载体上体外转录，转录后的NGGN mRNA和NGGN MO分别注射到斑马鱼鱼卵中；
（4）P53 MO和NGGN MO注射到斑马鱼胚胎中，观察表型变化；
（5）用鬼笔环肽对斑马鱼胚胎的细胞骨架进行染色并观察细胞骨架形态，观察斑马鱼微卫星重复序列NGGN敲除突变体的细胞骨架表型。
3.根据权利要求1所述的微卫星重复序列敲除突变体的构建方法，其特征在于，步骤S3中，所述PCR反应的条件为：预变性94℃3min；变性94℃30s，退火65℃30s，延伸72℃30s进行35个循环，再72℃10min，最后保温在12℃。
4.根据权利要求2所述微卫星重复序列敲除突变体的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，所述不同切割效果的Cas9蛋白为切割双链的HiFi Cas9蛋白、切割单链的D10A NickaseCas9以及只结合到序列上不切割的dCas9蛋白。
5.根据权利要求4所述微卫星重复序列敲除突变体的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，不同切割效果的Cas9蛋白注射后均产生胚胎爆裂表型。
6.根据权利要求4所述微卫星重复序列敲除突变体的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，gRNA与切割双链的HiFi Cas9 蛋白注射后出现胚胎爆裂表型，具体是：注射NGGN gRNA后的胚胎发育到sphere时期出现出泡现象，随着发育的进行出泡变严重，并且胚胎发育停滞在sphere时期，直到50%epiboly时期时胚胎发生爆裂死亡。
7.根据权利要求2所述微卫星重复序列敲除突变体的构建方法，其特征在于，步骤（3）中，当NGGN MO注射后在50% epiboly时胚胎出泡严重；当NGGN mRNA注射后在70% epiboly时，胚胎出泡严重且发育迟缓，最终胚胎爆裂死亡。
8.根据权利要求2所述微卫星重复序列敲除突变体的构建方法，其特征在于，
步骤（4）中，P53 MO部分缓解NGGN MO产生的表型，出现缓解发育延缓现象；
步骤（5）中，当胚胎发育至50% epiboly时，出现细胞骨架发生紊乱现象。
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